CZ131594A3

CZ131594A3 - Single- or multilayer epithelium and process for preparing thereof

Info

Publication number: CZ131594A3
Application number: CZ941315A
Authority: CZ
Inventors: Pavel Mudr Csc Brychta; Jana Komarkova; Jiri Doc Mudr Csc Adler
Original assignee: Lekarska Fakulta Masarykovy Un
Priority date: 1994-05-31
Filing date: 1994-05-31
Publication date: 1995-12-13
Also published as: CZ282711B6

Abstract

This cultivated epidermal transplant, intended for treating burns and dermal defects, can be prepared from the initial embryonic and/or foetal epidermis, which is separable from the dermis, which is fragmented, and the cell suspension obtained is cultivated into at least a one-layer system of a mutually bonded epithelia.<IMAGE>

Description

Jedna- a vícevrstevný epite‘1 aj způsob jeho přípravy _π, ' íThe single- and multi-layered epithelium and the process for its preparation _π , '

Oblast techniky ; I ! I 4 τ,Technical field; I! I 4 τ,

2‘ ί > σ· ί 67 C > CL Γ<2 ‘ί C 67 C> CL Γ <

Vynález se týká jedno- a vícevrstevného epitelu, zejména kultivovaného lidského epidermálního epitelu, a způsobu jeho přípravy.The invention relates to mono- and multilayer epithelium, in particular to cultured human epidermal epithelium, and to a process for its preparation.

Dosavadní stav technikyBACKGROUND OF THE INVENTION

Kůže je důležitý orgán, který pokrývá povrch lidského těla a tvoří rozhraní mezi živým systémem a okolním prostředím. Kůže zabezpečuje řadu funkcí, jako například ochranu před fyzikálními a chemickými faktory, termoregulaci a obranu organismu před inf ekc f . _Kůže_ses tává_z_-pokožky—nebol-i—ep i derm i s-,—ská-ry—— neboli dermis a podkoží neboli stratům subcutaneum. Z hlediska integrity povrchu kůže má nejdůležitější úlohu epidermis.Skin is an important organ that covers the surface of the human body and forms the interface between the living system and the environment. The skin provides a number of functions, such as protection from physical and chemical factors, thermoregulation and defense against infection. The skin melts from the skin, or the epidermis, or the dermis, and the subcutaneous tissue, or the stratum subcutaneum. The epidermis plays the most important role in skin surface integrity.

Epidermis sestává ze dvou částí, přičemž každá z nich je vícevrstevná. Vnitřní část obsahuje keratinocyty, buňky pojmenované podle vláknitých bílkovin - keratinů, které jsou v nich tvořeny. Basální vrstva vnitřní části epidermis je tvořena malými dělícími se buňkami, které se ve vyšších vrstvách diferencují. Zevní část epidermis je tvořena korneocyty. odumřelými buňkami, které zabezpečují mechanickou odolnost kůže. Basální membrána odděluje epidermis od dermis. Dermis je tvořena pojivovou tkání s fibroblasty. které vytvářejí kolagen a elastin. Jsou zde také vlasové váčky, potní a mazové žlázy a cévní kapiláry.The epidermis consists of two parts, each of which is multilayered. The inner part contains keratinocytes, cells named after the fibrous proteins - keratin, which are formed in them. The basal layer of the inner part of the epidermis consists of small dividing cells that differentiate in the higher layers. The outer part of the epidermis is made up of corneocytes. dead cells that provide mechanical resistance to the skin. The basement membrane separates the epidermis from the dermis. The dermis is formed by connective tissue with fibroblasts. that produce collagen and elastin. There are also hair follicles, sweat and sebaceous glands and vascular capillaries.

S ohledem na uvedenou nezastupitelnou úlohu kůže je její poškození popálením považováno za jeden z nejzávažnějších úrazů člověka. Toto poranění s ohledem na rozsah postižení je ve velkém počtu smrtelné, léčba je velmi zdlouhavá a bolestivá, často s trvalými následky tělesnými i psychickými.Given the irreplaceable role of the skin, burn damage is considered to be one of the most serious human injuries. This injury is fatal due to the extent of the disability, the treatment is very lengthy and painful, often with permanent physical and psychological consequences.

Zásadní pokrok v léčbě těžkých popálenin přineslo zavedení kultivace lidských, adultních keratinocytů in vitro za účelem přípravy epiteliální tkáně. V této souvislosti je třeba především uvést práce prof. Howarda Greena a jeho spolupracovníků, věnované optimalizaci a standardizaci podmínek sériové kultivace lidských adultních keratinocytů na výživné vrstvě fibroblastů stabilní linie 3T3. Jejich základní principy jsou obsaženy v US patentovém spisu č. 4 016 036 a návazně v US patentovém spisu č. 4 304 866. Touto metodou jsou keratinocyty preparovány pomocí trypsinu z malé kožní biopsie, veliké řádově několik centimetrů čtverečních, a kultivovány v médiu s růstovými faktory na výživné vrstvě fibroblastů, inhibovaných letálním ozářením. Proliferace a dělení keratinocytů vede ke tvorbě jejich kolonií. Postupně se vytváří souvislá vrstva buněk, spojených desmosomy. V další fází této kultivace se tvoří vícevrstevný epitel, který lze od růstové podložky oddělit pomocí enzymu dispásy. Epitel, vytvořený metodou podle prof. Greena, je fixován na vhodný nosič a je připraven k transplantaci na postižené místo. Bylo experimentálně prokázáno, že pomocí takto uskutečňované kultivace lze z původní biopsie o ploše dvou centimetrů čtverečních získat během tří týdnů epidermis o ploše jednoho metru čtverečního. Použití kultivovaných epidermálních transplantátů přineslo tímto v léčbě popálenin a kožních defektů zásadní pokrok, což jednoznačně prokazují více jak desetileté zkušenosti z této oblasti, jak jsou například shrnuty v práci:A major advance in the treatment of severe burns has been the introduction of in vitro cultivation of human, adult keratinocytes to prepare epithelial tissue. In this context it is necessary to mention the work of prof. Howard Green and his collaborators, dedicated to optimizing and standardizing conditions for serial cultivation of human adult keratinocytes on the 3T3 stable lineage fibroblast layer. Their basic principles are contained in U.S. Pat. No. 4,016,036 and consequently in U.S. Pat. No. 4,304,866. By this method keratinocytes are prepared using trypsin from a small skin biopsy size of several centimeters in size and cultured in growth medium. factors on the nutrient layer of fibroblasts inhibited by lethal radiation. Proliferation and division of keratinocytes leads to their colony formation. Gradually, a continuous layer of cells connected by desmosomes is formed. In the next phase of this culture, a multilayered epithelium is formed which can be separated from the growth mat by the enzyme dispase. Epithelium, created by the method of prof. Green is fixed to a suitable carrier and ready to be transplanted to the affected area. It has been experimentally demonstrated that with this cultivation, an epidermis of one square meter can be obtained within three weeks from the original biopsy of two square centimeters. The use of cultured epidermal transplants has thus brought significant progress in the treatment of burns and skin defects, as clearly demonstrated by more than ten years of experience in this field, as summarized in the work:

Carolyn C. Compt-on - Vound healing potential of cultured epithlelium. 1993, 5: 95-111.Carolyn C. Compt-on - Vound healing potential of cultured epithelium. 1993, 5: 95-111.

Tyto již mnohaleté zkušenosti však současně prokázaly, že sériová kultivace lidských adultních keratinocytů jiz prakticky dospěla do své optimální fáze a pomocí této metody se už nedaří výrazněji urychlit vývin takovéto epidermální tkáně, což má zejména praktický nepříznivý důsledek v jejích značných pořizovacích nákladech.At the same time, these years of experience have shown that serial cultivation of human adult keratinocytes has practically reached its optimum stage, and this method is no longer able to significantly accelerate the development of such epidermal tissue, which in particular has a practical adverse effect on its considerable cost.

Podstata vynálezuSUMMARY OF THE INVENTION

Výše uvedenou problematiku řeší a nedostatky známých vytvoření a způsobu přípravy epidermálních transplantátů, zejména lidských, odstraňuje jedno- a vícevrstevný epitel v provedení podle předmětného vynálezu. jehož podstata spočívá v tom i že alespoň jedna z Vrstev epitelu je tvořena nejméně jednovrstevnou soustavou embryonálních a/nebo fetálních epitelií vzájemně vázaných. Podle vynálezu je tato nejméně jednovrstevná soustava epitelií charakterizována tím, že je enzymaticky že epiteliemi odlučitelná od růstové podložky, představované převážně dnem kultivační nádoby. Podle vynálezu je také výhodný způsob přípravy jedno- a vícevrstevného epitelu, který je charakterizován tím, výchozí embryonální a/nebo fetální tvořená epřdermis se nejprve oddělí od dermis, poté se fragmentu je a následně se získaná buněčná suspenze kultivuje do nejméně jednovrstevné soustavy vzájemně vázaných epitelií. Dále je způsob přípravy jedno- a vícevrstevného epitelu podle vynálezu charakterizován tím, že jednotlivé epitelie výchozí embryonální a/nebo fetální epiderrais a/nebo jejich kolonie se kultivují s fibroblasty, jejichž dělení se předem inhibuje. Podle vynálezu je pak způsob přípravy jedno- a vícevrstevného epitelu ještě výhodně charakterizován tím, že z kultivovaných jednotlivých epitelií a/nebo jejich kolonií se uvolňují růstové proteiny.The aforementioned problem is solved and the deficiencies of the known embodiments and method for the preparation of epidermal transplants, especially human, are overcome by the monolayer and multilayer epithelium in the embodiment of the present invention. characterized in that at least one of the epithelial layers is formed by at least a monolayer system of embryonic and / or fetal epithelia bound together. According to the invention, the at least one-layered system of epithelium is characterized in that it is enzymatically separable from the epithelium from the growth substrate, represented predominantly by the bottom of the culture vessel. Also preferred according to the invention is a process for the preparation of monolayer and multilayer epithelium characterized in that the starting embryonic and / or fetal epithelium formed is first separated from the dermis, then the fragment is cultured and subsequently the cell suspension obtained is cultured into at least monolayer systems . Further, the process for the preparation of monolayer and multilayer epithelium according to the invention is characterized in that the individual epithelium of the parent embryonic and / or fetal epiderrais and / or their colonies are cultured with fibroblasts whose division is pre-inhibited. According to the invention, the process for preparing monolayer and multilayer epithelium is still advantageously characterized in that growth proteins are released from the cultured individual epitheliums and / or colonies thereof.

Výhoda vytvoření jednovícevrstevného epitelu oproti užívaným takovéto médium, podle vynálezu, u něhož alespoň jedna z vrstev je tvořena alespoň jednovrstevnou soustavou embryonálních a/nebo fetálních epitelií vzájemně vázaných, spočívá především v jejich potenci produkovat do kultivačního média významně větší množství růstových faktorů adultním epidermálním epiteliím. Navíc lze obsahující růstové faktory, uvolněné v průběhu kultivace embryonálních a/nebo fetálních epitelií způsobem přípravy podle vynálezu využít jako tzv. kondicionované médium ke kultivaci jiných, například právě adultních epiteliálních buněk. Kromě toho lze využitím tohoto kondicionovaného média nahradit některé růstové faktory, například růstový epidermální faktor. Protože růstový potenciál embryonálních a/nebo fetálních epitelií je oproti porovnatelným adultním epiteliím vyšší.The advantage of forming a monolayered epithelium over the use of such a medium according to the invention, in which at least one of the layers consists of at least a monolayer system of embryonic and / or fetal epithelium bound together, lies primarily in their ability to produce significantly more growth factors into adult epidermal epithelium. In addition, the growth factors released during the cultivation of embryonic and / or fetal epithelium can be used as a conditioned medium for the cultivation of other, for example adult epithelial cells, by the method according to the invention. In addition, some growth factors, such as growth epidermal factor, may be substituted for this conditioned medium. Because the growth potential of embryonic and / or fetal epithelia is higher than comparable adult epitheliums.

dochází k tvorbě jednozpBsobem jeho přípravy což umožňuje statisticky k přípravě kultivovaných a vícevrstevného epitelu výhodným podle vynálezu zřetelně rychleji, významně zkrátit dobu. potřebnou epidermálních transplantátů a tedy i dobu mezi odběrem kožní biopsie a transplantací. Praktickým důsledkem této skutečnosti je. že při použití embryonálních a/nebo fetálních epidermálních transplantátů je u hlubokých popálenin II.b stupně, kterých je většina, dosaženo epitelizace rány za statisticky významně kratší dobu. což má značný příznivý vliv na fyzický i psychický stav postiženého člověka. Rovněž ekonomické výsledky jsou zde příznivější, nebot dochází ke znatelnému snížení nákladů embryonálních a/nebo fetálních oproti stávajícím značným nákladům na přípravu adultních epidermálních transplantátů. Navíc >it is produced by a simple method of its preparation, which enables statistically significantly faster, significantly shortened time for the preparation of cultured and multilayered epithelium advantageous according to the invention. needed epidermal transplants and thus the time between skin biopsy collection and transplantation. The practical consequence of this is. that using embryonic and / or fetal epidermal transplants, wound epithelialization is achieved in a statistically significantly shorter time in the most severe grade IIb burns. which has a significant positive impact on the physical and mental condition of the affected person. Also, the economic results are more favorable here, since there is a noticeable reduction in the cost of embryonic and / or fetal compared to the current significant cost of preparing adult epidermal transplants. Plus>

způsobem přípravy jedno- a vícevrstevného epitelu podle vynálezu izolovat od kultivovaných jednotlivých epitelií a/nebo jejich kolonií vytvářené růstové proteiny, které samy o sobě mohou sloužit k podpoře růstu a množení epiteliálních buněk in vitro nebo in vivo.by the method of preparation of the monolayer and multilayer epithelium according to the invention, to isolate the growth proteins produced from the cultured individual epitheliums and / or their colonies, which themselves can serve to promote the growth and multiplication of epithelial cells in vitro or in vivo.

na přípravu kultivovaných epidermálních transplantátů kultivovaných lze výhodnýmfor the preparation of cultured epidermal transplants cultured can be advantageous

Přehled obrázků na výkresechBRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS

Vynález bude dále blížeji objasněn pomocí přiložených výkresů, na nichž znázorňuje obr. 1 mikrofotografi i kolonií embryonálních epitelií po dvou dnech kultivace, obr. 2 mikrofotografi i jednovrstevného embryonálního epitelu po sedmi dnech kultivace, obr. 3 mikrofotografi i řezu vícevrstevným embryonálním epitelem po dvanácti dnech kultivace, obr. 4 mikrofotografi i ultratenkého řezu vícevrstevným epitelem po dvanácti dnech kultivace a obr. 5 mikrofotografi i ultratenkého řezu vícevrstevným embryonálním epitelem po dvanácti dnech kultivace v oblasti mezibuněčných spojení.BRIEF DESCRIPTION OF THE DRAWINGS FIG. 1 is a photomicrograph of embryonic epithelial colonies after two days of cultivation; FIG. 2 is a photomicrograph of single-layer embryonic epithelium after seven days of cultivation; Fig. 4 is a photomicrograph of an ultrathin section of a multilayered epithelium after twelve days of cultivation, and Fig. 5 is a photomicrograph of an ultrathin section of a multilayered embryonic epithelium after twelve days of culturing in the region of intercellular junctions.

Příklad provedeni vynálezuDETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION

Nejprve byly získány kožní biopsie z embryí a/nebo fetů po indukovaném matky. Kožní po abortu a s antibiotiky.First, skin biopsies were obtained from embryos and / or fetuses after the induced mother. Skin abortion and antibiotics.

indikace ze strany nejpozději 12 hodin esenciálního média abortu z důvodu zdravotní biopsie byly odebírány uloženy do minimálníhoindications from the latest 12 hours of essential abort media due to medical biopsy were collected and stored to a minimum

Kožní biopsie byly promyty fosfátovým pufrem s antibiotiky, převedeny do roztoku enzymů, například trypsinu, a inkubovány 12 až 18 hodin při teplotě 4 °C. Působení enzymu bylo inhibováno přidáním minimálního esenciálního media s fetálním bovinním šerem. Dále byly kožní biopsie mechanicky preparovány tak, že se embryonální a/nebo fetální epidermis oddělí od derrois. Embryonální a/nebo fetální epidermis byla mechanicky f ragmentována a získaná buněčná_suspen-ze—zf-fTtrovana.Skin biopsies were washed with phosphate buffered antibiotics, transferred to an enzyme solution such as trypsin, and incubated at 4 ° C for 12-18 hours. Enzyme activity was inhibited by the addition of minimal essential medium with fetal bovine twilight. Further, skin biopsies were mechanically prepared by separating the embryonic and / or fetal epidermis from the derrois. The embryonic and / or fetal epidermis was mechanically phagmented and the cell suspension obtained was filtered.

Potébyla buněčná suspenze centrifugována, sediment resuspendován z' a inokulován v hustotě 10⁶ buněk/lahev 75 cm² do minimálního esenciálního media s fetálním bovinním sérem, růstovými faktory a antibiotiky. Embryonální a/nebo fetální epidermální epitelie byly kultivovány na výživné vrstvě fibroblastů linie 3T3, jejichž dělení bylo inhibováno mitomycinem C při teplotě 37 °C po dobu 2 týdnů, jejichž průběžný stav kultivace je patrný na obr. 1 a 2. V průběhu kultivace embryonálních a/nebo fetálnxch epitelií se pak vytváří nejméně jednovrstevná soustava vzájemně vázaných epitelií podle vynálezu, jak je názorně patrno na obr. 3, 4 a 5. Při tomto průběhu kultivace embryonálních a/nebo fetálních epitelií uvedeným způsobem přípravy podle vynálezu jsou do kultivačního roztoku rovněž uvolňovány růstové faktory, například epidermální růstový faktor. Takovýto kultivační roztok s růstovými faktory lze použít ke stimulaci růstu a množení epiteliálních buněk in vitro nebo in vivo, například při léčbě kožních defektů.Subsequently, the cell suspension was centrifuged, the sediment resuspended from and inoculated at a density of 10 ⁶ cells / 75 cm ² flask into minimal essential medium with fetal bovine serum, growth factors and antibiotics. The embryonic and / or fetal epidermal epitheliums were cultured on a nutrient layer of fibroblasts of line 3T3, the division of which was inhibited by mitomycin C at 37 ° C for 2 weeks, the progress of which is evident in Figures 1 and 2. and / or fetal epitheliums then form at least a monolayer system of interconnected epitheliums according to the invention, as illustrated in FIGS. 3, 4 and 5. During this course of culturing embryonic and / or fetal epithelium by the method of preparation according to the invention they are also released into the culture solution. growth factors such as epidermal growth factor. Such a growth factor culture solution can be used to stimulate the growth and multiplication of epithelial cells in vitro or in vivo, for example in the treatment of skin defects.

Průmyslová využitelnostIndustrial applicability

Předmětný jedno- a vícevrstevný epitel je zejména využitelný jako kultivovaný epidermální transplantát při léčbě těžkých popálenin a kožních defektů.The single- and multi-layered epithelium is particularly useful as a cultured epidermal transplant in the treatment of severe burns and skin defects.

Claims

PATENT REQUIREMENTS characterized by layers is formed at least and / or fetal

1. Monolayer and multilayered epithelium by at least one of the monolayer systems of embryonic epithelium bound together.

Monolayer and multilayer epithelium according to claim 1, characterized in that the monolayer system of epithelium is enzymatically separable from the growth mat.

Process for preparing monolayer and multilayered epithelium according to claims 1 and 2, characterized in that the epithelial-forming starting embryonic and / or fetal epidermis is separated from the dermis, then fragmented and the cell suspension obtained is cultured in at least a monolayer system of mutually bound epitheliums.

Method according to claim 3, characterized in that the individual epithelium and / or its colonies are embryonic and / or fetal epidermis with fibroblasts whose division is inhibited in advance.

epithelium by starting to cultivate

Process for the preparation of monolayer and multilayered epithelium according to claims 3 and 4, characterized in that growth proteins are released from the cultured individual epitheliums and / or colonies thereof.