CZ280693B6 - Analogy lidského insulinu a způsob jejich přípravy - Google Patents
Analogy lidského insulinu a způsob jejich přípravy Download PDFInfo
- Publication number
- CZ280693B6 CZ280693B6 CS921750A CS175092A CZ280693B6 CZ 280693 B6 CZ280693 B6 CZ 280693B6 CS 921750 A CS921750 A CS 921750A CS 175092 A CS175092 A CS 175092A CZ 280693 B6 CZ280693 B6 CZ 280693B6
- Authority
- CZ
- Czechia
- Prior art keywords
- human insulin
- ethylphenylalanine
- insulin
- reaction mixture
- analogs
- Prior art date
Links
Landscapes
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Analogy lidského insulinu obsahující v pozici B-24 stereoisomerní formy p-ethylfenylaleninu a mající .SIGMA.-aminoskupinu lysinu v pozici B-29 volnou nebo substituovanou fenylacetylovou skupinou. Připraví se kondenzací desoktapeptidu insulinu s karboxyterminálním oktapeptidem, který má v pozici B-24 L-p-ethylfenylalanin nebo D-p-ethylfenylalanin a .SIGMA.-aminoskupinu lysinu B-29 chráněnou fenylacetylovou skupinou, za katalýzy trypsinem v částečně nevodném prostředí (látky I a III). Chráněné analogy insulinu (látky I až III) se oddělí od reakční směsi například chromatografickými metodami, s výhodou vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií, a podrobí se štěpení penicilinamidohydrolasou, s výhodou zakotvenou na inertním nosiči, za vzniku nechráněných analogů lidského insulinu (látky II a IV), které se od ostatních komponent reakční směsi oddělí, například chromatografickými metodami.ŕ
Description
Analogy lidského inzulínu a způsob jejich přípravy
Oblast techniky
Vynález se týká nových analogů lidského inzulínu a jejich přípravy semisyntetickým způsobem.
Dosavadní stav techniky
Poloha 24 podobně jako 25 B řetězce lidského inzulínu patří k těm pozicím karboxyterminální sekvence lidského inzulínu, ve kterých je možné výrazně ovlivnit jeho biologickou aktivitu vhodnou substitucí (R. A. Pullen et al., Nátuře 269, 369 až 373,
1976; R. C. Mirmira et al., J. Biol Chem. 266, 1428 až 1436, 1991; H. Tager et al., Proč. Nati. Acad. Sci. USA 77, 3181 až 3185, 1980; K. Inouye et al., Experientia 37, 811 až 813, 1981,
L. M. Keefer et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 100, 1229 až 1236, 1981). Vedle obměn vedoucím ke zvýšené afinitě k jednotlivým typům receptorů je žádoucí připravit látky, jejichž distribuce bude pozměněna ve smyslu rychlosti transportu k jednotlivým místům účinku.
Podstata vynálezu
Předmětem vynálezu jsou analogy lidského inzulínu obsahující v pozici B-24 jednu ze stereoisomerních forem p-ethylfenylalaninu, kde e-aminoskupina lysinu v pozici B-29 má vzorec NH-X, kde X je fenylacetyl (látka I a III) nebo vodík (látka II a IV).
Nové analogy lidského inzulínu podle vynálezu se připraví kondenzací desoktapepetidu inzulínu s karboxyterminálním oktapeptidem B-řetězce inzulínu, který má v pozici B-24 L-p-ethylfenylalanin nebo D-p-ethylfenylalanin a e-aminoskupinu lysinu B-29 chráněnou fenylacetylovou skupinou, za katalýzy trypsinem v částečně nevodném prostředí obsahujícím maximálně 50 % hmot, vody (látky I a III).
Chráněné analogy inzulínu (látky I a III) se oddělí od reakční směsi například chromatografickými metodami, s výhodou vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií, a podrobí se štěpení penicilinamidohydrolazou, s výhodou zakotvenou na inertním nosiči, za vzniku nechráněných analogů lidského inzulínu (látky II a IV), které se od ostatních komponent reakční směsi oddělí, například chromatografickými metodami.
Penicilinamidohydrolaza je s výhodou chemicky vázána na porézním skle prostřednictvím organokřemičité skupiny obsahující primární aminoskupinu aktivovanou glutaraldehydem (čs. patent č. 275 449).
-1CZ 280693 B6
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava L-p-EtPhe24, N6-fenylacetyl-Lys B-29 lidského inzulínu (látka I) mg oktapeptidu o sekvenci
Gly-(L-p-EtPhe)-L-Phe-L-Tyr-L-Thr-L-Pro-L-Lys(pac)-L-Thr (Pac - fenylacetylová skupina) a 30 mg desoktapeptid lidského inzulínu (DOI) bylo rozpuštěno v 120 μΐ dimethylformamidu a přidáno 60 μΐ H20.
K reakčni směsi bylo přidáno 1,5 mg hovězího trypsinu v 30 μΐ 0,1 M CaCl2 a pH bylo upraveno 4-methylmorfolinem na hodnotu (měřeno kombinovanou skleněnou a kalomelovou elektrodou) na pH 7 (cca 6 až 10 μΐ). Reakčni směs byla slabě třepána při teplotě 20 až 22 °C po 20 hodin. Produkt byl vysrážen přidáním 2,5 ml acetonu, odcentrifugován (5 min, 10 000 ot/min) a supernatant slit. Sediment byl rozpuštěn v 3 ml 7 M močoviny v 20 mM Tris-HCl pufru 8,5 a jednotlivé frakce dále děleny technikou FPLC.
Vzorek byl nanesen na kolonu MonoQ HR 5/5 (Pharmacia), která byla v rovnováze s 20 mM Tris-HCl pufrem pH 8,5, který navíc obsahoval 40 % (v/v) isopropanolu. Eluce kolony byla provedena diskontinuálním koncentračním gradientem NaCl 0,0 až 0,1 M (40 min), 0,1 až 0,3 M (6 min), 0,3 až 0,8 M (2 min) při rychlosti eluce 0,9 ml/min ve 20 tris-HCl pufru pH 8,5. Eluát obsahující požadovaný produkt byl dále čištěn na koloně Vydac C-18 (1x25) gradientem acetonitrilu v 0,1 % (v/v) trifluoroctové kyselině. Bylo získáno 1,5 mg čistého L-p-EtPheB24Lys(Pac)B29 lidského inzulínu, který byl shledán homogenním RP-HPLC a kapilární elektroforézou. Složení produktu bylo ověřeno hmotovou spektroskopií (5954,7 Da).
Příklad 2
Příprava L-pEtPheB24 lidského inzulínu (látka II)
L-p-EtPheB24Lys(Pac)B29 lidský inzulín (1 mg) byl rozpuštěn v 0,2 ml 8 močoviny a přidáno 0,7 ml 50 m Na-fosfátového pufru pH 6,5. Roztok byl pomocí peristaltického čerpadla cirkulován rychlostí 0,1/min při 20 až 22 °C přes kolonku rychlostí 0,1 ml/min s 200 mg porézního skla se zakotvenou penicilín amidohydrolazou CS 275449, 280694 a zveřejněné PV 771-92) a kolonu Dowexu 1x8 (4 mg) pro vychytávání kys. fenyloctové. Obě kolony byly ekvilibrovány 50 mM Na-fosfátovým pufrem o pH 6,5. Po 4 hodinách byl chráněný derivát převeden na volný působením zakotvené penicilinamidohydrolazy.
Průběh reakce byl sledován pomocí HPLC a produkt také izolován HPLC na koloně Vydac C 18 (1x25) gradientem acetonitrilu v 0,1% TFA. Produkt byl homogenní při RP-HPLC a kapilární
-2CZ 280693 B6 elektrofořeze. Molekulová hmotnost byla ověřena hmotovou spektroskopií (5836,6 Da).
Příklad 3
Příprava D-p-EtPheB24,Lys(Pac)B29 lidského inzulínu (látka III) 28 mg oktapeptidu o sekvenci
Gly-(D-p-EtPhe)-L-Pha-L-Tyr-L-Thr-L-Pro-L-Lys(Pac)-L-Thr a 20 mg desoktapeptid inzulínu (DOI) bylo rozpuštěno v 82 μΐ dimethylformamidu (DMF) a 40 μΐ H2O. K reakční směsi byl přidán 1 mg TPC trypsinu rozpuštěný v 20 μΐ 0,1 M CaCl2, pH (elektroda skleněná/kalomelová) bylo upraveno přidáním 6 až 8 μΐ 4-methylmorfolinu na hodnotu 7.
Dále bylo pokračováno jako v případě 1. Získáno bylo 0,7 mg D-p-EtPheB24Lys(Pac)B29 lidského inzulínu, který byl shledán homogenním RP-HPLC a kapilární elektroforézou. Hmotovou spektroskopií byla potvrzena hmotnost 5954,7 Da.
Příklad 4
Příprava D-pEtPheB24 lidského inzulínu (látka IV)
0,7 mg D-pEtPheB24, Lys(Pac) lidského inzulínu bylo podrobeno stejnému procesu jakému byl vystaven L-stereoisomer^624) lidského inzulínu. Výsledný produkt, volný D-p-EtPhe24 lidský inzulín byl izolován pomocí HPLC na koloně Vydac C 18 (1x25) gradientem acetonitrilu v 0,1% TFA. Produkt (0,4 mg) byl shledán homogenní při analýze RP-HPLC a kapilární elektroforézou jeho molekul. Váha byla potvrzena hmotovou spektroskopií (5836,6 Da).
Průmyslová využitelnost
Látky podle vynálezu jsou použitelné jako chemikálie pro základní výzkum pro účely substituční léčby diabetes melitus.
Claims (3)
1. Analogy lidského inzulínu, obsahující v pozici B-24 jednu ze stereoisomerních forem p-ethylfenylalaninu, kde e-aminoskupina lysinu v pozici B-29 má vzorec NH-X, kde X je vodík nebo fenylacetyl.
2. Způsob přípravy analogů lidského inzulínu podle nároku 1, vyznačený tím, že se kondenzuje desoktapeptid inzulínu s karboxyterminálním oktapeptidem B-řetězce inzulínu, který má v pozici B-24 L-p-ethylfenylalanin nebo D-p-ethylfenylalanin a e-aminoskupinu lysinu B-29 chráněnou fenylacetylovou skupinou za katalýzy trypsinem v částečně nevodném prostředí obsahujícím maximálně 50 % hmot. vody.
3. Způsob přípravy analogů lidského inzulínu podle nároku 2, vyznačený tím, že chráněný analog inzulínu se oddělí od reakční směsi, zejména chromatografickými metodami, a podrobí se štěpení penicilinamidohydrolasou za vzniku nechráněných analogů lidského inzulínu, které se od ostatních komponent reakční směsi oddělí, zejména chromatografickými metodami.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS921750A CZ280693B6 (cs) | 1992-06-09 | 1992-06-09 | Analogy lidského insulinu a způsob jejich přípravy |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS921750A CZ280693B6 (cs) | 1992-06-09 | 1992-06-09 | Analogy lidského insulinu a způsob jejich přípravy |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CZ175092A3 CZ175092A3 (en) | 1994-01-19 |
| CZ280693B6 true CZ280693B6 (cs) | 1996-04-17 |
Family
ID=5352674
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS921750A CZ280693B6 (cs) | 1992-06-09 | 1992-06-09 | Analogy lidského insulinu a způsob jejich přípravy |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CZ (1) | CZ280693B6 (cs) |
-
1992
- 1992-06-09 CZ CS921750A patent/CZ280693B6/cs not_active IP Right Cessation
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CZ175092A3 (en) | 1994-01-19 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Lorimer | Ribulosebisphosphate carboxylase: amino acid sequence of a peptide bearing the activator carbon dioxide | |
| Honkanan et al. | Characterization of natural toxins with inhibitory activity against serine/threonine protein phosphatases | |
| CS259536B2 (en) | Method of insulin's new derivatives production | |
| O'Harte et al. | Improved stability, insulin-releasing activity and antidiabetic potential of two novel N-terminal analogues of gastric inhibitory polypeptide: N-acetyl-GIP and pGlu-GIP | |
| Nakamura et al. | Isolation and amino acid compositions of geographutoxin I and II from the marine snail Conus geographus Linné | |
| Frey et al. | Affinity purification and characterization of a binding protein for a hepta-β-glucoside. Phytoalexin elicitor in soybean | |
| Kramer et al. | Cocoonase: V. Structural studies on an insect serine protease | |
| FI70721B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av maenskligt fibroblast-interferon som homigent protein | |
| CA1338415C (en) | C-terminal amidating enzyme composition, process for preparing, and use of the same | |
| Miller et al. | Reevaluation of the activation of bovine chymotrypsinogen A | |
| Hasegawa et al. | Chemical structure of angiotensin in the bullfrog Rana catesbeiana | |
| FI79117B (fi) | Foerfarande foer framstaellning av bovine-, svin- eller humaninsulin. | |
| CZ280693B6 (cs) | Analogy lidského insulinu a způsob jejich přípravy | |
| Komori et al. | Complete Primary Structure of the Subunits of Heterodimeric Phospholipase A2fromVipera a. zinnikeriVenom | |
| Katsoyannis et al. | Analogs of insulin. I. Synthesis of destripeptide B28-30 bovine insulin and destripeptide B28-30 procine (human) insulin | |
| Takasaki et al. | Effects of chemical modifications of Pa-11, a phospholipase A2 from the venom of Australian king brown snake (Pseudechis australis), on its biological activities | |
| Puri et al. | In vitro conversion of proinsulin to insulin by cathepsin B and role of C-peptide | |
| Weiss et al. | [15] Complex III from mitochondria of Neurospora crassa: Purification, characterization, and resolution | |
| Saheki et al. | Peptide structures of pyruvate kinase isozymes: 2. Origins of types M1 and M2 isozymes suggested from species-variations in their peptide maps | |
| Salvucci et al. | Photoaffinity labeling of the ATP binding domain of Rubisco activase and a separate domain involved in the activation of ribulose-1, 5-bisphosphate carboxylase/oxygenase | |
| JPH06800B2 (ja) | ヒトインターフェロン―βの精製方法 | |
| Lovell et al. | Determination of l-thyroxine in reference serum preparations as the o-phthalaldehyde-N-acetylcysteine derivative by reversed-phase liquid chromatography with electrochemical detection | |
| CZ280790B6 (cs) | Nové analogy lidského insulinu a způsob jejich přípravy | |
| Sidorova et al. | Peptide fragments and structural analogues of chemokine MCP-1: synthesis and effect on the MCP-1-induced migration of mononuclear cells | |
| EP0327334A2 (en) | Phospholipase A2-inhibiting peptides |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| IF00 | In force as of 2000-06-30 in czech republic | ||
| MM4A | Patent lapsed due to non-payment of fee |
Effective date: 20010609 |