CZ244799A3 - Farmaceutický prostředek - Google Patents

Abstract

Farmaceutickýprostředekpro léčení poruch a abnormalit zevních avnitřních tělesných povrchů, reagujících na fotochemotherapeutickou léčbu obsahuje protoporfyrinový prekursor fotochemotherapeutické látky, fotosenzitizační látku, - ukládanou do vaskulámího stromatu apopřípadě látku pro usnadnění průniku a/nebo cbelaíační činidlo. Řešení zahrnuje také balíčky s obsahemjednotlivých složek pro současné, oddělené * nebo následné podání.

Description

Farmaceutický prostředek

Oblast techniky

Vynález se týká farmaceutických prostředků pro použití k léčení poruch nebo abnormalit pokožky a dalších tělesných povrchů při použití fotochemotherapie.

Dosavadní stav techniky

Abnormality nebo poruchy, například nádory nebo projevy lupénky na pokožce nebo na jiném epithelu, například na sliznici se běžně léčí chirurgicky, ozařováním, zmrazením nebo chemickými látkami. Tyto postupy však často mají závažné nevýhody, jako jsou toxicita, teratogenita nebo jiné nepříznivé vedlejší účinky.

Fotochemotherapie nebo fotodynamická terapie PDT je známý postup, který se v poslední době stále častěji užívá pro léčení různých abnormalit nebo poruch pokožky a jiných epitheliálních povrchů. Jde zejména o nádory nebo prekancerozy a o některá onemocnění nezhoubné povahy, jako je lupénka.Fotochemotherapie spočívá v tom, že se na postiženou část těla nebo systemicky aplikuje fotosenzitizační látka a pak se organismus vystaví fotoaktivačnímu světlu k aktivaci uvedené látky a k její přeměně na cytotoxickou formu, čímž dochází ke zničení nežádoucích buněk nebo alespoň k podstatnému snížení jejich schopnosti množení.

Je známa celá řada fotosenzitízačních látek. Jde například o psoraleny, porfyriny, chloriny a ftalocyaniny. Tyto látky se při vystavení světlu stávají toxickými.

Fotosenzitizační látky mohou působit různými mechanismy přímo nebo nepřímo. Například některé z fotosenzitizačních látek se po aktivaci působením světla stávají přímo toxickými, kdežto jiné látky z této skupiny na světelný popud

vytvářejí toxické látky, například oxidační činidla, jako aktivní kyslík nebo jiné volné radikály, odvozené od kyslíku, které jsou nesmírně destruktivní pro buněčný materiál a některé přírodní molekuly, například lipidy, bílkoviny a nukle5 ové kyseliny. Jako příklad přímo působících látek je možno uvést psoraleny, které působením světla tvoří adiční produkty a vytváří zesítění mezi dvěma řetězci molekuly DNA, takže dochází k inhibici syntézy DNA.

Značné riziko tohoto způsobu léčení spočívá v tom, že 10 může dojít k nežádoucím mutagenním a karcinogenním vedlejším účinkům.

Tuto nevýhodu je možno překonat tak, že se užije fotosenzitizační látka s nepřímým působením. Například porfyriny, které působí nepřímo tvorbou toxických sloučenin kyslíku nemají žádné mutagenní vedlejší účinky a jsou proto vhodnějšími látkami pro fotochemotherapii. Porfyriny jsou přírodně se vyskytující prekursory pro syntézu hernu. Hem se vytváří zvláště při zařazení trojmocného železa do protoporfyrinu IX, Pp, působením enzymu ferrochelatázy. Pp je velmi účinná foto20 senzitizační látka, kdežto hem nemá žádný účinek tohoto typu.

Jedna z látek na bázi porfyrinu, Photofrin (Gomer a

Dougherty,Cancer Research, 39, str.146-151, 1979, původní název Photofrin II) se v poslední době užívá jako fotosenzitizační látka při léčení některých typů zhoubných nádorů.

Tato látka je tvořena velkými oligomery porfyrinu a neproniká snadno pokožkou při místním podání, takže je nutno ji podávat systemicky. Hlavní nevýhodou je tedy nutnost parenterálního, obvykle nítrožilního podání. Po tomto podání uvedená látka vyvolává fotosenzitizaci pokožky, která může trvat několik týdnů. Podobné problémy se vyskytují i při použití dalších

• · · · * » · ·

I · · · • · · · · · fotosenzitizačních látek na bázi porfyrínů, například při použití tzv. hematoporfyrinového derivátu Hpd, poprvé uvedeného v publikaci Lipson a další, J.Natl. Cancer Ins., 60,str.l - 10, 1961, tento derivát se užívá při fotochemothe5 rapii nádorů například podle publikací S.Dougherty, J.Natl.

Cancer Ins.,52. str.1333, 1974 a Kelly a Snell, J.Urol., 115, str.150, 1976. Hpd je směs, získaná zpracováním hematoporfyrinu působením kyseliny octové a sírové, získaný acetylovaný produkt se rozpustí v roztoku zásady. Nevýhodou tohoto pro10 středku je nedefinovaná směs látek. Mimo to musí být tento prostředek také podáván injekčním způsobem.

K překonání těchto problémů byly sledovány na svou fotochemotherapeutickou účinnost prekursory Pp. Zvláště kyselina 5-aminolevulová, ALA, byla sledována jako fotochemote15 rapeutická látka pro některé kožní nádory. ALA je možno připravit ze sukcinyl CoA a glycinu v prvního stupni syntézy hernu a je do určité míry schopna pronikat pokožkou a místně vytvářet Pp. Vzhledem k tomu, že přítomnost metalačního enzymu ferrochelatázy je limitujícím faktorem v tomto stupni syn20 tézy hernu, vede přebytek ALA k hromadění fotosenzitizační látky Pp. To znamená, že při místním podání ALA na kožní nádory a po vystavení těchto nádorů působení světla po několika hodinách po aplikaci může být dosaženo příznivého fotochemotherapeutického účinku, jak bylo popsáno například ve

WO91/01727. Protože pokožka nad basaliomy a karcinomy z dlaždicových buněk snáze propouští ALA než zdravá pokožka a mimo to koncentrace ferrochelatázy je v kožních nádorech nižší než ve zdravé tkáni, může místní podání ALA vést k selektivně zvýšené produkci Pp v těchto nádorech.

•·· 99« • 4 · · ·

Avšak i když použití ALA znamená v oboru podstatný pokrok, není fotochemotherapie při použití ALA vždy zcela úspěšná. ALA neproniká dostatečně do všech nádorů, takže nemůže zajistit odstranění široké škály nádorů a dalších cho5 robných stavů, mimo to jde o nedostatečně stálou látku, zejména v některých typech farmaceutických prostředků. Některé z těchto problémů je možno překonat při použití derivátu ALA, například esterů, jako methylesteru, ethylesteru, propylesteru, hexylesteru, heptylesteru nebo oktylesteru ALA nebo solí této látky, jak je popsáno v mezinárodní patentové přihlášce

WO96/28412.

Jak při použití ALA, tak při použití esterových derivátů je účinek vyvolán zvýšenou produkcí Pp. Ve tkáni působí hydrolytícké enzymy, například esterázy, které rozštěpí este15 ry na volnou kyselinu ALA, která se pak účastní syntézy hernu, v jejímž prvním stupni vzniká Pp. Avšak esterové deriváty mají řadu dalších výhod oproto ALA. Především jsou lipoflínější a schopné lépe pronikat pokožkou a dalšími tkáněmi ve srovnání s ALA, takže pronikají rychleji a hlouběji. Tato výhoda je důležitá zvláště při místním podání. Mimo to estery vyvolávají vyšší produkci Pp než volná kyselina ALA. Konečně jsou estery ALA selektivnější pro cílové tkáně, takže účinek zvýšení produkce Pp je lépe lokalizován v nádorové tkáni nebo jiných chorobných projevech a nešíří se do okolní zdravé tká25 ně. To je možno zvláště dobře pozorovat v případě nádorů.

Také při systemickém podání se estery lépe koncentrují po podání v cílové tkáni než volná kyselina. To je rovněž velmi důležité, protože nedochází k nežádoucím fotosenzitizačním účinkům, které jsou jinak v literatuře uváděny pro jiné látky na bázi porfyrinu.

*· ·» • · ♦ • · · ·· · ·· · • · • · · ·

I když estery ALA znamenají značný pokrok ve fotochemotherapii, neodpovídají na tuto látku všechny poruchy pokožky a sliznic a bylo by tedy stále zapotřebí nalézt dokonalejší nebo alternativní fotochemotherapeutické látky, zejména k zábraně nebo prevenci růstu nádorů. Vynález si klade za úkol takové látky navrhnout.

Pokusy prokázaly, že v případě, že má být pomocí PDT dostatečně potlačen nádorový růst, je nutno zničit jak buněčný materiál nádoru, tak jeho cévní zásobení, jak bylo popsáno v publikacích Peng a Moan, Br.J.Cancer, 72, str.565-574,

1995, Peng a další, Cancer Res., 55, str. 2620 až 2626, 1995 a Peng a další, Ultrastructural Pathology, 20, str.109 až 129, 1996. Bylo prokázáno, že podáváním ALA je možno úspěšně léčit nádory, protože syntéza PpIX probíhá z ALA endogenně přímo v nádorových buňkách. Mimo to při místním podání ALA nevyvolává senzitizaci pokožky a nemá žádný mutagenní účinek na DNA buněk. Při systemickém podání ALA nedochází k senzitizaci do 24 hodin po podání. Jak již bylo svrchu uvedeno, není však ALA schopná proniknout do všech nádorů a velmi dobrou účinnost má pouze u povrchových afekcí pokožky s tloušťkou menší než 2 až 3 mm. U silnějších afekcí nebo u afekcí zažívací soustavy, dýchacích cest a dalších dutých orgánů nebylo možno prokázat dobré klinické výsledky při místním ani systemickém podání ALA-PDT. Je známo, že prostředek Photofrin pro25 niká pouze do cévního zásobení nádorů, je však spojen s dlouhodobým rizikem fotosenzitizace pokožky.

Nyní bylo neočekávaně zjištěno, že použití fotosenzitizační látky, která se ukládá do cév, například Photofrinu, tetra(meso-hydroxyfenyl)chloru, m-THPC, chloru e6, aluminium ftalocyanindisulfonátu nebo aluminium ftalocy9 · anintetrasulfonátu v kombinaci s prekursorem protoporfyrinu jako fotochemoterapeutické látky, například ALA nebo jejích methyl-nebo butylesterů dochází ke zvýšení účinnosti PDT ve srovnání s použitím jedné z uvedených látek jako takové. Sy5 nergní účinek byl pozorován mezi fotosenzitizační látkou, ukládanou do cévní soustavy nádoru a protoporfyrinem jako prekursorem fotochemoterapeutické látky, výsledkem bylo zlepšené potlačení nádorového růstu ve srovnání s očekávaným účinkem, vypočítaným jako součet účinků obou společně podaných látek. Tento výhodný účinek byl neočekávaně pozorován i v tom případě, kdy bylo senzítízační činidlo, ukládané do cévní soustavy podáno v nižší než léčebné dávce, takže je možno snížit nebo zcela vyloučit riziko fotosenzitizace pokožky. Bylo například pozorováno potlačení nádorového růstu při pou15 žití ALA v therapeutické dávce a prostředku Photofrin nebo m-THPC v nižší než léčebné dávce. Snížení růstu bylo statisticky významně vyšší ve srovnání se součtem účinků, jichž bylo dosaženo při použití ALA v léčebné dávce nebo prostředku Photofrin nebo m-THPC v léčebné dávce.Jde tedy zřejmě o dosud neznámý synergní účinek mezi těmito dvěma odlišnými typy fotochemotherapeutických látek, a to i v nižších než léčebných dávkách.

Tento synergní účinek je možno klinicky různými způsoby využít. Zlepšení totiž není omezeno na povrchové afekce pokožky. Je možno jej využít také k léčení poškození pokožky s větší tloušťkou a k léčení poškození vnitřních dutých orgánů. Mimo to v případě, že se užije nižší než léčebné dávky fotosenzitizační sloučeniny, je možno se vyvarovat vzniku fototoxicity na pokožku.

Podstata vynálezu

Podstatu vynálezu tvoří farmaceutický prostředek pro léčení poruch nebo abnormalit zevního nebo vnitřního tělesného povrchu, které je možno léčit fotochemotherapií, prostředek obsahuje protoporfyrinový prekursor fotochemotherapeutické látky spolu s fotosenzitizační látkou, ukládanou do cévního stromatu a popřípadě látku, která usnadní průnik povrchem a/nebo jedno nebo větší počet chelatačních činidel. Léčebný účinek fotochemotherapeutické látky je v tomto případě zvýšen vzhledem k použiti této látky jako takové. Ve výhodném provedení farmaceutického prostředku podle vynálezu obsahuje tento prostředek fotosenzitizační látku v nižší než léčebné dávce.

Vynález se tedy týká také použití protoporfyrinového prekursoru fotochemotherapeutické látky spolu s fotosenzitizační látkou, ukládanou do cévního stromatu a popřípadě spolu s látkou pro usnadnění průniku a/nebo nejméně jedním chelatačním činidlem pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení poruch nebo abnormalit zevního nebo vnitřního tělesného povrchu, které je možno léčit pomocí fotochemotherapie.

Je zřejmé, že některé fotosenzitizační látky, ukládané do cévního systému, například Photofrín, není možno podávat místně, takže pokud nejsou obě složky podávány parenterálně, může být každá ze složek podávána odděleně, a to současně nebo následně.

V jednom provedení vynálezu se tedy vynález týká produktu, který obsahuje protoporfyrinový prekursor fotochemotherapeutické látky a fotosenzitizační látku, ukládanou do cévního stromatu, popřípadě spolu s nejméně jednou látkou pro usnadnění průniku a/nebo nejméně jedním chelatačním činidlem, » · · ·· ·· · jako kombinovaného prostředku pro současné, oddělené nebo následné použití pro léčení poruch nebo abnormalit zevního nebo vnitřního tělesného povrchu, které je možno léčit fotochemotherapií.

Podle dalšího provedení vynálezu je možno použít protoporfyrinový prekursor fotochemotherapeutické látky a fotosenzitizační látku, ukládanou do cévního systému, popřípadě s nejméně jedním činidlem pro usnadnění průniku a/nebo nejméně jedním chelatačním činidlem pro výrobu produktu pro současné, oddělené nebo následné podání pří léčení poruch nebo abnormalit zevního nebo vnitřního tělesného povrchu, které je možno léčit fotochemotherapíí.

Pojem protoporfyrinový prekursor fotochemotherapeutické látky znamená strukturní prekursory protoporfyrinu a jeho derivátů, které mají funkci fotochemotherapeutických látek, například ALA, porphobilínogen nebo prekursory a deriváty těchto látek. Obvykle se tyto látky ukládají od porušených buněk, například do nádorových nebo poškozených buněk.

Pod pojmem látky, ukládané do cévního stromatu se rozumí látky, které se po podání ukládají do okolí cév. Z takových látek je možno uvést například následující sloučeniny:

HpD,

Hematoporfyriny jako Photofrin (Quadra Logic Technologies lne., Vancouver, Canada) a Hematoporfyrin IX,

Photosan III (Seehof Laboratorium GmbH, Seehof, Wesselburenerkoog, SRN),

Cloriny jako tetra(m-hydroxyfenyl)chlorin, (m-THPC) a jejich bakteriochloriny (Scotia Pharmaceuticals Ltd, Surrey, Velká Británie), mono-L-aspartyl chlorin e6 (NPe6), Nippon »« «

Petrochemical Co., CA, USA, chlorin e6 (Porphyrin Products lne.), benzoporfyriny (Quadra Logic Technologies Inc.,.Vancouver, Canada), například benzoporfyrinový derivát s kruhem A, BPD-MA a purpurinem (PDT Pharmaceuticals lne., CA, USA), například ethyletiopurpurin cínu, SnET2,

Ftalocyaniny, například odvozené od zinku (Quadra

Logic Technologies lne., Vancouver, Canada), od hliníku nebo křemíku, tyto látky mohou být sulfonovány, jde tedy například o aluminiumftalocyanindisulfonát, AlPcS_2a nebo alumínium fta10 locyanintetrasulfonát AlPcS₄, porphyceny, hypocrelliny, protoporfyriny IX PpIX, diéthery hematoporfyrinu, uroporfyriny, koproporfyriny, deuteroporfyrin a polyhematoporfyrin PHP, a také prekursory a deriváty těchto sloučenin.

Jak již bylo svrchu uvedeno, je prostředek Photofrin tvořen směsí různých složek, přičemž každou z těchto složek nebo jejich kombinaci je možno použít jako látku, ukládanou do cévního systému.

Pod pojmem cévní stroma se v průběhu přihlášky ro25 zumí cévní zásobení pojivové tkáně, matrice a také složky nervové tkáně, makrofágy a fibroblasty, přítomné v cévním systému a další buňky, které mohou do tohoto systému infiltrovat. Je zřejmé, že oblast, do níž se látky ukládají bude závislá na době po podání, v níž se lokalizace látek stanoví.

To znamená, že se některé látky, které se na počátku ukládají • · ··· • · Μ · · • · »·· ·♦· ♦ · « • · · · · · · do buněk, mohou později přemístit mimo buňky a obráceně. Například aluminiumftalocyanindisulfonát se nejprve ukládá do mimobuněčné tkáně, zásobené cévami, avšak 24 až 72 hodin po injekčním podání je možno většinu této látky prokázat v buňkách.

Obecně se však za látky, ukládané do cévního stromatu považují takové látky, které se v této oblasti nacházejí 24 hodin po podání. Tuto dobu je možno různým způsobem upravovat tak, že se PDT podává v různé době po podání senzitizačního činidla, takže v době ozáření se účinná látka nachází podle potřeby na požadovaném místě.

Protoporfyrinovým prekursorem je s výhodou ALA nebo její prekursor nebo derivát, z výhodných fotosenzitizačních látek, ukládaných do cévního stromatu je možno uvést hemato15 porfyriny, zvláště Photofrin, chloriny, zvláště m-THPC nebo chlorin e6 a také sulfonované ftalocyaniny, zvláště aluminiumf talocyanindisulf onát neboaluminiumftalocyanintetrasulfonát.

Pod pojmem prekursory se v průběhu přihlášky rozumí prekursory účinné látky, které jsou metabolicky přeměněny na vlastní účinnou látku a jsou tedy v podstatě ekvivalentní této látce, například ALA. Tento pojem tedy zahrnuje biologické prekursory protoporfyrinu při metabolické biosyntéze hernu. Deriváty mohou být farmaceuticky přijatelné soli i che25 micky modifikované látky, například estery, jako estery ALA, tak jak byly svrchu popsány.

Jako látky, usnadňující průnik je možno užít látky s příznivým vlivem na fotochemotherapeutický účinek. Takové látky je možno použít i v případě, že se fotochematherapeu30 tické látky nepodávají místně. Výhodné jsou » « • · 1 ·· dialkylsulfoxidy, jako dimethylsulfoxid DMSO.Tyto látky jsou podrobně popsány ve WO 95/07077.

Činidla, usnadňující průnik mohou být jakákoliv činidla, popsaná ve farmaceutické literatuře, například HPE-101 (Hisamitsu), DMSO a jiné dialkylsulfoxidy, zvláště n-decylmethylsulfoxid NDMS, dimethylsulfacetamid, dimethylformamid DMF, dimethylacetamid, glykoly, různé pyrrolidonové deriváty podle Woodford a další, J.Toxicol. Cut a Ocular Toxicology,5, str. 167-177,1986 a prostředek Azone podle Stoughton a další, Drug Dpv.Ind. Pharm.,9, str.725-744, 1983 nebo směsi těchto látek.

Velmi výhodnou látkou je DMSO, který má řadu příznivých účinků. Kromě toho, že napomáhá průniku a zvyšuje tedy hloubku účinku účinných látek ve tkáni, má také antihistaminový a protizánětlivý účinek a snižuje bolestivost v průběhu vystavení světlu. Mimo to bylo prokázáno, že DMSO zvyšuje účinnost enzymů ALA-synthetázy a ALA-dehydrogenázy, jde o enzymy, které tvoří a kondenzují ALA na porphobilinogen, čímž zvyšují tvorbu účinné látky, Pp.

V některých případech, například v případě lupénky, dochází k průniku chorobných ložisek poměrně snadno a není tedy tak důležité použít činidlo pro usnadnění průniku. V některých dalších případech, například u kožních karcinomů, kde poškození brání průniku účinné látky je možno použít činidlo pro usnadnění průniku již předběžně a obvykle ve vyšší koncentraci.

Je zřejmé, že různé účinné složky prostředku nemusí být použity současně v tomtéž prostředku, avšak mohou být podle klinické potřeby podávány odděleně nebo následně. V řadě případů bylo pozorováno, že je možno dosáhnout zvláště • *4 * * »· ·· *•4 4 44 44 4 * φ ·

444 4 4 4444 • ··· 44 44 444 444 • 4 4 4 4 4 ··· 44 »44 44« 44 4· příznivého fotochemotherapeutického účinku tak, že se předběžně nanáší činidlo pro usnadnění průniku a pak se podá fotochemotherapeutická látka. Mimo to v některých dalších případech bylo pozorováno, že je výhodné předběžně působit čini5 dlem pro usnadnění průniku a pak podat fotochemotherapeutickou látku ve směsi s tímtéž činidlem. V případě, že se činidlo pro usnadnění průniku užívá předběžně, je možno jej užít ve vysokých koncentracích, například až 100 % hmotnostních. V případě použití tohoto předběžného stupně může být fotoche10 motherapeutická látka podána až několik hodin po tomto předběžném ošetření, například v intervalu 5 až 60 minut po tomto ošetření.

V publikaci Malík a další, Proceedings of Photodynamic Therapy of Cancer, 2078, str.355-362, 1993 se popisuje sledování účinků ALA in vitra při indukci biosyntézy protoporfyrinu a působení na buňky melanomu B16 v buněčné kultuře, předem inkubované s DMSO k diferenciaci a/nebo s allylisopropylacetamidem jako porfyrogenním činidlem ke zvýšení endogenní koncentrace porfyrinu před inkubací s ALA. Došlo k uhynutí nádorových buněk.

V publikaci Doodstar a další, Biochemical Pharmacology, 42 ( 6),str.1307-1303, 1991 se popisuje sledování účinku podmínek pěstování hepatocytů, zvláště vlivu ALA a DMSO, jednotlivě nebo v kombinaci, na zvýšení účinnosti směsi oxidázy a UDP-glukoronosyltransferázy, závislé na cytochromu P450, zvýšením nitrobuněčné koncentrace hernu v jaterních buňkách, pěstovaných v kultuře.

Chelatační činidla jsou případnou složkou farmaceutického prostředku podle vynálezu. Tato činidla mohou být užitečná jednak ke zvýšení stability protoporfyrinového

999

99 9

999 9 ··

9 9 9

9999 9

9 9

999 99 999

999 994

4

99 prekursoru, například ALA a jednak k vyšší akumulaci Pp. Tohoto druhého účinku se dosahuje chelatací železa, čímž se brání inaktivačnímu působení enzymu ferrochelatázy při začlenění kovu do Pp, takže se podporuje tvorba Pp. Tímto mecha5 nismem dochází rovněž ke zvýšení fotosenzitizačního účinku.

V publikaci Hanania a další, Cancer Letters, 65, str.

127-131, 1992 se navrhuje použití ALA v kombinaci s chelatačními činidly při fotochemotherapii, užívané k místnímu léčení nádorů.

Pro toto použití jsou zvláště výhodná chelatační činidla ze skupiny aminopolykarboxylových kyselin včetně chelatačních činidel, popsaných v literatuře pro detoxifikaci kovů a pro chelataci paramagnetických kovových iontů v kontrastních činidlech pro zobrazování magnetickou rezonancí.

Zvláště je možno uvést EDTA, CDTA (kyselina cyklo-hexandiamintetraoctová), DTPA, DOTA a 1,10-fenonthrolin. Výhodná je zejména EDTA, zvláště ke stabilizaci ALA. K dosažení chelatačního účinku na železo je možno užít také desferrioxamin a další siderophory, například spolu s chelatačním činidlem typu polykarboxylové kyseliny, jako je EDTA.

Farmaceutické prostředky podle vynálezu mohou mimo to obsahovat ještě další pomocné látky ke zvýšení účinku. Může jít například o inhibitory angiogeneze, tzn. antiangíogenetické látky, které jsou vhodné při léčení nádorů podle publi25 kácí 0'Reilly a další, Nátuře Medicíně, 2. str.689-692, 1996, Yamamoto a další, Anticancer Research, 14, str.1-4, 1994 a Brooks a další, J.Clin. Invest., 96, str.1815-1822, 1995 a které je možno užít v prostředcích podle vynálezu k dosažení dokonalejšího zničení cévního systému nádoru. Inhibitory an30 giogeneze pro toto použití zahrnují například TNP-470 • ·· · · n ·· ·· · · ·· ·· · ·· · • * · · · · · · · * ··· · · · · ··· ··« • · · · · · ··· ·· ··· ··· 99 99 (AGM-1470, syntetický analog produktu sekrece hub, fumagillinu, Takeda Chemical Industries LTd., Osaka, Japonsko), angiostatin (Surgical Research Lab.,Children' s Hospital Medical Center of Harvard Medical School) a látky, antagonizující integrin alfa_v beta₃, jde například o monoklonální protilátky proti uvedené látce (The Scripps Research Institute, LaJolla, CA) .

Mimo to je možno ke zlepšení účinku použít v prostředku podle vynálezu ještě imunotherapeutické látky, napří10 klad protilátky nebo efektory, jako faktor, aktivující makrofágy. Tato doplňující činidla je možno podávat v koncentraci, obvyklé pro tyto látky běžným způsobem. Také tyto látky mohou být podány před nebo po nebo současně s vlastní účinnou látkou v závislosti na jejich funkci. Například inhibitory angi15 ogeneze je možno podat 5 až 10 dnů po podání účinné látky k zábraně opětného růstu nádoru.

Bylo zjištěno, že také glukóza při místním nebo systemickém podání zvyšuje účinnost PDT. I když není zapotřebí se vázat na jakékoliv teoretické vysvětlení, je pravděpodob20 né, že při podání glukózy dochází ke snížení pH, což zvyšuje hydrofobní vlastnosti protoporfyrinu, takže tato látka může snáze pronikat do buněk. V případě místního podání je například možno použít krém s obsahem 0,01 až 10 % hmotnostních glukózy.

Ve výhodném složení obsahuje prostředek podle vynálezu ALA nebo její prekursor nebo derivát, Photofrin, DMSO,

EDTA a desferrioxamin.

Jak již bylo svrchu uvedeno, byl pozorován synergní účinek mezi protoporfyrinovým prekursorem a fotochemothera30 peutickou látkou, ukládanou do cévního stromatu za zvýšení ·· 99 • 9 9 · » 9 9 9 • · 9 9 9 · • 9 ·· 99 celkového účinku léčení. Tímto způsobem je možno podávat nižší než léčebné dávky fotochemotherapeutické sloučeniny, tzn. dávky, které by při samotném podání uvedené látky nebyly dostatečné pro dosažení požadovaného fotochemotherapeutického účinku.

Bylo zvláště zjištěno, že příznivých výsledků je možno dosáhnout při použití protoporfyrinového prekursoru, s výhodou ALA nebo jejího derivátu v léčebné dávce, obvykle užívané při použití této látky samostatně, mimo to se však ve farmaceutickém prostředku užije nižší než léčebná dávka sloučeniny, ukládané do cévního stromatu, s výhodou se použije Photofrin.

Koncentrace protoporfyrinového prekursoru foťochemotherapeutické látky, například ALA v prostředku podle vynálezu se pohybuje v rozmezí 1 až 40, například 2 až 25, s výhodou 5 až 20 % hmotnostních, koncentrace fotosenzitizační látky, ukládané do cévního stromatu, například Photofrinu se pohybuje v rozmezí 0,1 až 1 % hmotnostních nebo se užije m-THPC v koncentraci 0,01 až 10 % hmotnostních, koncentrace chelatač20 ního činidla je s výhodou 1 až 20, například 2 až 10 a s výhodou 2,5 % hmotnostních, koncentrace činidla, napomáhajícího průniku, například DMSO je s výhodou 2 až 50, například 10 % hmotnostních. Koncentrace kterékoliv z uvedených látek závisí také na specifické použité sloučenině a může být měněna podle požadavků a podle dalšího složení prostředku. Je zřejmé, že použitá koncentrace závisí na způsobu podání a na intervalech, v nichž je prostředek podáván. Avšak v případě, že se látka pro usnadnění průniku podává odděleně v předběžném stupni, může být podána ve vyšší koncentrací až 100 % hmot30 nostních, jak již bylo uvedeno.Prostředky podle vynálezu je

·· «« * » · « • · · · • ·· · · · · • · ·· možno podávat výlučně místně na vnitřní nebo zevní povrchy například ve formě krému, instilací, inhalací a podobně, nebo systemicky, například perorálně nebo nitrožilně nebo také kombinací těchto postupů tak, že se některé složky podávají místně a další systemicky.

Celkové množství podané fotosenzitizační látky, ukládané do cévního stromatu například nitrožilně se s výhodou pohybuje v rozmezí 0,01 až 10 mg/kg hmotnosti, v případě Photofrinu s výhodou 0,01 až 1 mg/kg hmotnosti, což je nižší než léčebná dávka nebo v případě m-THPC s výhodou 0,01 až 0,2 mg/kg hmotnosti, pro protoporfyrinový prekursor fotochemotherapeutické látky je rozmezí dávek 1 až 500 mg/kg, například 1 až 250 mg/kg, v případě ALA v rozmezí 1 až 250 mg/kg, s výhodou 20 až 70 mg/kg.

Je zřejmé, že požadovaná dávka bude záviset na způsobu podání, na podané účinné látce a na léčeném onemocnění. I když je možno použít nižší než léčebné dávky v případě fotochemotherapeutické látky, ukládané do cévního stromatu, může být dávka zvýšena v případě, že běží o velká poškození s vět20 ší tloušťkou nebo o velmi závažné onemocnění, například melanom. Pozorovaný synergní účinek však zásadně dovoluje použít obě základní složky, tzn. látku, ukládanou do vaskulárního stromatu a protoporfyrinový prekursor v nižších než léčebných dávkách.

V dalším provedení vynálezu se vynález týká balíčku pro použití k fotochemotherapii poruch a abnormalit zevního nebo vnitřního tělesného povrchu, balíček obsahuje:

a) první nádobku s obsahem protoporfyrinového prekursoru jako fotochemotherapeutické látky, například ALA nebo její prekursor nebo derivát, ·♦ ·· • · » « • * * » ·· · ··· * ♦ «· ·· • »· · * ·· <· · ♦· • · · · * • «· t> « · · • · · » ··· ·· »·· <·«

b) druhou nádobku s obsahem fotosenzitizační látky, ukládané do cévního stromatu,napřiklad jde o Photofrin nebo o m-THPC, a popřípadě

c) nejméně jedno činidlo pro usnadnění průniku látek, obsažených v první a druhé nádobce,

d) čtvrtou nádobku, obsahující nejméně jedno chelatační činidlo, toto činidlo může být také obsaženo v první, druhé nebo třetí nádobce, přičemž balíček nemusí obsahovat první nebo druhou 10 nádobku a látky, obsažené v těchto nádobkách mohou být uloženy v jiné nádobce balíčku.

Balíček může obsahovat ještě další složky, například inhibitory angiogeneze nebo glukózu, jak již bylo uvedeno svrchu.

Abnormality a poruchy, které je možno léčit při použití farmaceutického prostředku podle vynálezu zahrnují jakékoliv zhoubné abnormality, předběžné stavy těchto zhoubných onemocnění a také onemocnění nezhoubné povahy, pokud reagují na fotochemotherapii. Může jít například o nádory, dysplasie, nezhoubná gynekologická onemocnění jako jsou menorrhagie, endometrioza, a ektopické těhotenství, kožní poruchy jako lupénka, aktinokeratozy a akné, jakož i další choroby nebo infekce, například bakteriální, virové nebo houbové infekce, jako infekce virem oparu. Prostředek podle vynálezu je zvláš25 tě vhodný v těch případech, kdy vytvořená poškození mají ještě malé rozměry, poškozením se v tomto smyslu rozumí i nádory a podobně. Prostředkem podle vynálezu je však možno léčit také poruchy, které se neprojevují místním poškozením, nýbrž tvorbou malých lokalit onemocnění, například abnormalit v krevních buňkách nebo v kostní dřeni nebo jinde v organismu,

9 99 9 9 9 9 9 9	9 99 9	99
9 999 9	9
9 9	9
99 99		99

·· ·· • 9 9 9 • · · « • ··· ·«· • · »· 99 kde důsledkem může být přítomnost abnormálních buněk v krevním oběhu nebo v kostní dřeni.

Vnitřní a zevní povrchy, které mohou být léčeny prostředkem podle vynálezu zahrnují pokožku a všechny další e5 pitheliální a slizniční povrchy a výstelku některých orgánů, například dýchacích cest, zažívací soustavy, pohlavních a močových orgánů včetně žláz, jejichž vývody ústí do těchto povrchů, jako jsou játra, potní žlázky, mléčné žlázy, slinné žlázy a semenné váčky. Kromě pokožky jsou takovými povrchy také výstelka pochvy, endometrium a výstelka močového měchýře. Tyto povrchy mohou zahrnovat také dutiny, které byly v těle vytvořeny chirurgickým zákrokem nebo nádorovou tkání, například mozkové dutiny po odstranění některých nádorů, například gliomů.

Jako příklady takových povrchů je tedy možno uvést:

i) pokožku a spojivky, ii) výstelku ústní dutiny, hrtanu, jícnu, žaludku, střev a přilehlých orgánů, rekta a konečníku, iii) výstelku nosních průchodů, vedlejších nosních dutin, nosohltanu, průdušnice, průdušek a průdušinek, iv) výstelku močovodů, močového měchýře a močové roury,

v) výstelku pochvy, děložního hrdla a dělohy ví)parietální a viscerální pohrudnice vii)výstelka břišní a pánevní dutiny a povrchu orgánů, uložených v těchto dutinách, vili)tvrdá mozková plena a měkké pleny, ix) jakékoliv nádory v pevných tkáních, které mohou být zpřístupněny fotoaktivaci přímo, v době chirurgického zákroku nebo pomocí optického vlákna zavedeného jehlou.

• · • ··· · · · · ··· ··· • · ♦ · · · ·· · ·· ··· · ·· ·· ··

Prostředky podle vynálezu mohou být připraveny obvyklým způsobem při použití nejméně jednoho fyziologicky přijatelného nosiče nebo pomocné látky. Prostředky pro místní podání jsou výhodné až na případy, kdy místní podání není vhod5 né pro některou z hlavních složek, například Photofrin, v tomto případě je nezbytné tuto složku podat systemicky. Z prostředků pro místní podání je možno uvést gely, krémy, mazání, spreje, emulze, tyčinky, mýdla, prášky, pesary, aerosoly, kapky a mimo to jakékoliv jiné formy, které se v oboru běžně užívají.

Mazání a krémy je například možno připravit při použití vodného nebo olejového základu a příslušných činidel pro zahuštění nebo pro tvorbu gelu. Tyto prostředky budou obvykle obsahovat další pomocné látky, například emulgátory, disper15 gační činidla, suspenzní činidla, zahušťovadla nebo barviva.

Prášky je možno připravit při použití vhodného práškového základu. Kapky je možno připravit při použití vodné nebo nevodné baze, která také obsahuje disperzní, solubilizační nebo suspenzní činidla. Aerosolové spreje se obvykle podávají z tlakových balení při použití vhodného hnacího prostředku.

Je také možno postupovat tak, že se látka pro usnadnění průniku podává místně v odděleném stupni a fotosenzitizační látka, ukládaná do cévního stromatu, například Photofrin a protoporfyrinový prekursor fotochemotherapeutické lát25 ky, například ALA se podávají společně nebo odděleně spolu s nejméně jedním chelatačním činidlem jiným způsobem, například perorálně nebo parenterálně, jako intradermálně, podkožně, intraperitoneálně nebo nitrožilní injekcí. Vhodnými farmaceutickými lékovými formami pro toto podání mohou být tablety, povlékané tablety, kapsle, suspenze a roztoky, obsahující • · účinné složky popřípadě spolu s inertními běžnými nosiči a/nebo ředidly, jako jsou kukuřičný škrob, laktoza, sacharoza, mikrokrystalická celulóza, stearan horečnatý, polyvinylpyrrolidon, kyselina citrónová, kyselina vinná, voda, směs vody a ethanolu, vody a glycerolu, vody a sorbitolu, nebo vody a polyethylenglykolu, propylenglykol, stearylalkohol, karboxymethylceluloza nebo tukové látky, například ztužené tuky a jejich směsi.

Po místním nebo systemickém nebo obojím podání se léčená oblast vystaví působení světla k dosažení fotochemotherapeutického účinku. Může jít o působení na několik minut až 96 hodin, s výhodou 15 minut až 3 hodiny. Délka doby před působením světla závisí také na způsobu podání, na dávce a na použitých látkách.

Dávka ozáření bude obvykle v rozmezí 10 až 250 J/cm² při intenzitě 20 až 200 mW/cm² při použití laseru nebo jde o dávku 10 až 540 J/cm² při intenzitě 50 až 300 mW/cm² při použití žárovky. Při použití 100 J/cm² proniká záření poměrně hluboko. Ozáření s výhodou trvá 5 až 30 minut a zvláště 15 minut. Je možno použít jednorázového ozáření nebo dvoufázového ozařování s odstupem několika minut až několika hodin mezi oběma fázemi ozáření.

Vlnovou délku světla, použitého pro ozáření je možno volit tak, aby bylo dosaženo vyššího fotochemotherapeutického účinku. Obvykle v případě použití porfyrinu se ozáření provádí světlem s absorpčním maximem porfyrinu. Například při použití ALA při fotochemotherapii zhoubných kožních nádorů bylo užíváno vlnové délky v oblasti 350 až 640 nm, s výhodou 610 až 635 nm. Avšak fotosenzitízačni účinnost může být ještě zvýšena při použití širšího rozmezí vlnových délek mimo

• · absorpční maximum porfyrinu. I když není zapotřebí se vázat na jakékoliv teoretické vysvětlení, je pravděpodobné, že v případě, že se Pp a další porfyriny vystaví světlu v oblasti svého absorpčního spektra, dochází k degradaci těchto látek na různé produkty, zvláště fotoprotoporfyrin PPp. Jde o chlorin, který má značný fotosenzitizační účinek. Jeho absorpční spektrum zasahuje do delších vlnových délek za vlnovými délkami absorpce Pp, až do téměř 700 nm (Pp již neabsorbuje téměř žádné světlo nad 650 nm). Byly identifikovány i další látky, absorbující světlo při ještě vyšších vlnových délkách. To znamená, že při fotochemotherapii použité vlnové délky neexcitují PPp a nedosahuje se tedy možného přídatného fotosenzitizačního účinku. Bylo proto prokázáno, že ozáření při vlnových délkách v rozmezí 350 až 900 nm je zvláště účinné, i když také závisí na použité látce. Zvláště důležité je zahrnout vlnové délky 600 až 700 nm, zvláště 630 až 690 nm a nejvýhodněji 630 až 670 nm. Podle dalšího provedení vynálezu je tedy možno léčit fotochemotherapeuticky poruchy nebo abnormality zevních a vnitřních povrchů těla tak, že se na tyto povrchy nanese prostředek podle vynálezu a pak se tyto povrchy vystaví působení světla, s výhodou v rozmezí vlnových délek 350 až 900 nm. V případě použití laseru je však také možno použít světla s užším rozmezím vlnových délek, například s vlnovou délkou přibližně 630 nm.

Způsoby ozáření různých částí těla, například žárovkami nebo laserem jsou v oboru známé a byly popsány například v publikaci Van den Bergh, Chemistry in Britain, květen 1986, str.430-439.

Je zřejmé, že léčení s použitím prostředku podle vynálezu zahrnuje také ozařování pomocí fluorescence. I když • ·· ·· • · · · · · intenzita fluorescence může být užita tak, aby došlo k odstranění obnormálních buněk, může být fluorescence užito také ke zviditelnění lokalizace, rozsahu a rozměru abnormality nebo poruchy. To je umožněno schopností složek prostředku podle vynálezu přednostně se ukládat do nenormálních nebo narušených tkání.

V tomto případě se takto identifikovaná nebo potvrzená abnormalita nebo porucha může léčit i jiným způsobem, například chirurgicky nebo chemicky nebo zvýšením intenzity fluorescence nebo dalším použitím sloučenin podle vynálezu v místě prokázané poruchy. Je zřejmé, že při diagnostickém použití je možno použít nižší úrovně fluorescence než při léčebném použití. Koncentrace v rozmezí 1 až 50 %, například 1 až 5 % hmotnostních jsou obvykle vyhovující. Místa, postupy a způsoby podání, uvedené svrchu pro léčebné použití je možno aplikovat také na diagnostickém použití. Složky prostředku podle vynálezu mohou být použity také k diagnostice in vitro a in vivo, například ke sledování buněk, obsažených v tělesných tekutinách. Vyšší fluorescence, spojená s nenormální tkání může prokazovat abnormalitu nebo poruchu. Tyto postupy jsou velmi citlivé a je možno je využít pro časný průkaz abnormalit nebo poruch, například pro zhoubné nádory močového měchýře nebo plic sledováním epitheliálních buněk ve sputu nebo v moči. Tělesnými tekutinami, které je možno kromě sputa a moči užít pro tuto diagnostiku jsou například krev, slzy, stolice, mozkomíšní mok apod. Je také možno vyhodnotit vzorky tkání, získané například biopsií nebo vzorky kostní dřeně. Vynález tedy zahrnuje také použití uvedených látek nebo jejích solí pro diagnostiku svrchu uvedeným způsobem a zahrnuje také zkušební balíčky pro provedení těchto postupů.

Podle dalšího provedení vynálezu se vynález týká in vitro diagnostiky abnormalit nebo poruch zkoumáním vzorku tělesné tekutiny nebo tkáně nemocného, postupuje se tak, že se

i) tělesná tekutina nebo tkáň smísí s svrchu uvedenými sloučeninami, ii) směs se vystaví působení světla, iii) zjistí se úroveň fluorescence a iv) tato úroveň se srovnává s úrovní kontrolního vzorku.

Vynález bude podrobněji osvětlen v souvislosti s přiloženými výkresy.

Přehled obrázků na výkrese

Obr. 1 znázorňuje graf s průměrnými výsledky růstu lidského karcinomu tlustého střeva WiDr, transplantovaného podkožně do bezsrstých myší, jimž byl nitrožilně podán Photofrin a/nebo íntraperitoneálně podána ALA a po 3 hodinách byly myší ozářeny laserem s vlnovou délkou 632 nm a 150 mW/cm² celkem 15 minut. 9 Kontroly (bez léčení a bez ozáření). A Kontroly (pouze ozáření). $ ALA 250 mg/kg, ozáření po 3 hodinách. ψ Photofrin 1 mg/kg, ozáření po 3 h. B ALA 250 mg/kg a Photofrin 1 mg/kg ozáření po 3 hodinách. Na ose úseček jsou dny po ošetření, na ose pořadnic relativní objem nádoru. Úsečky znázorňují standardní odchylku od průměru SEM na bázi nejméně 3 zvířat v každé skupině.

Obr.2 je graf, znázorňující průměrné výsledky růstu lidského karcinomu tlustého střeva WiDr, • · · transplantovaného podkožně bezsrstým myším, jimž byl nitrožilně podán m-THPC a/nebo byla intraperitoneálně podána ALA a po 3 hodinách byly myší ozářeny 15 minut světlem o 632 nm při intenzitě 150 mW/cm² . φ Kontrola (bez léčení a bez ozáření),^ kontrola (pouze ozáření), φ ALA 250 mg/kg, ozáření po 3 hodinách, V m-THPC 75 mikrogramů/kg, ozáření po 3 hodinách, 0 ALA 250 mg/kg a m-THPC 75 mikrogramů/kg, ozáření po 3 hodinách. Na ose úseček jsou dny po ošetření, na ose pořadnic relativní objem nádoru. Úsečky označují standardní odchylku od průměru SEM pro nejméně 3 zvířata z každé skupiny.

Obr.3 je fluorescenční mikrofotografie lidského klkovitého papilárního rektálního adenomu 75-letého muže (A) a 87-leté ženy (B), vzorky byly odebrány 44 hodin po nitrožilní injekci 2 mg/kg Photofrinu (A) a 4,5 hodin po perorálním podání 60 mg/kg ALA (B).

Obr.4 znázorňuje obdobný případ jako obr. 1, nitrožilně byl podán chlorin e6 a/nebo byla intraperitoneálně podána ALA a po 1 hodině bylo provedeno ozáření žárovkou. X znamená kontroly, ALA 250 mg/kg,® chlorin e6 1 mg/kg,$ ALA 250 mg/kg a chlorin e6 1 mg/kg. Na ose úseček jsou dny po ošetření, na ose pořadnic je relativní objem nádoru.

Obr.5 znázorňuje obdobný případ jako obr.l, nitrožilně byl podán AlPcS_2a a/nebo byl « · intraperitoneálně podán 5-methylester ALA a po 1 hodině bylo provedeno ozáření žárovkou.

φ Kontrola, fl AlPcS_2a 1 mg/kg,A 5-methylester ALA 273 mg/kg, X znamená 5-methylester ALA 273 mg/kg a AlPcS_2a 1 mg/kg. Na ose úseček jsou dny po ošetření, na ose pořadnic relativní objem nádoru.

Obr.6 znázorňuje obdobu obr.l, nitrožilně byl podán A1PcS₄ a/nebo byl intraperitoneálně podán

5-butylester ALA a po 1 hodině bylo provedeno ozáření žárovkou.φ Kontrola,0 A1PcS₄ 5 mg/kg,

X A1PcS₄ 1 mg/kg, 5-butylester ALA 338 mg/kg,Δ 5-butylester ALA 338 mg/kg a A1PcS₄ 1 mg/kg. Na ose úseček jsou dny po ošetření, na ose pořadnic je relativní objem nádoru.

Obr.7 znázorňuje obdobu obr.l, nitrožilně byl podán

AlPcS_2a a/nebo byl intraperitoneálně podán 5-butylester ALA a po 1 hodině bylo provedeno ozáření žárovkou. 4 Kontrola, tt AlPcS_2a 1 mg/kg, X 5-butylester ALA 338 mg/kg, φ

5-bytulester ALA 338 mg/kg a ALPcS_2a 1 mg/kg.

Na ose úseček jsou dny po ošetření, na ose pořadnic je relativní objem nádoru.

Obr.8 znázorňuje obdobu obr.l, nitrožilně byl podán

AlPcS₄ a/nebo byl intraperitoneálně podán 5-methylester ALA a po 1 hodině bylo provedeno ozáření žárovkou.® Kontrola,A AlPcS₄ 1 mg/kg,

X 5-methylester ALA 273 mg/kg,φ 5-methylester ALA 273 mg/kg a A1PcS₄ 1 mg/kg. Na ose úseček • · · jsou dny po ošetření, na ose pořadnic je relativní objem nádorů.

Praktické provedení vynálezu bude osvětleno následu5 jícími příklady, které však nemají sloužit k omezení rozsahu vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

1.1 Krém s obsahem ALA pro místní podání θ Krém s obsahem 5 až 30 % ALA se připraví vmíšením ALA do běžně dodávaného základu pro krémy.

Krém s obsahem 20 % ALA byl připraven při použití základu Unguentum Merck (Merck), který obsahuje oxid křemičitý, kapalný parafin, bílou vazelínu, cetostearol, polysor5 bát 40, glycerol monostearát, Miglyol 812 (směs rostlinných mastných kyselin), polypropylenglykol a čištěnou vodu.

1.2 ALA pro systemické podání

Pro perorální podání se ALA rozpouští v kyselých nealkoholických nápojích. Pro nitrožilní podání se ALA rozpoušθ ti v izotonickém roztoku chloridu sodného.

1.3 Photofrin pro systemické podání

Photofrin se rozpustí v 5% roztoku glukózy.

Příklad 2

PDT při použití ALA + Photofrin

Materiály a metody

Chemické látky

Hydrochlorid kyseliny 5-aminolevulové, ALA byl získán ⁰ od Sigma Chemical Company (St. Louis, MO). ALA se čerstvě

444 *

4 4

444 444 rozpustí v izotonickém roztoku chloridu sodného a podá se intraperitoneálně myším. Photofrin je možno získat od Quadra Logic Technologies (Vancouver, Canada). Roztok Photofrinu se připraví v izotonickém roztoku 5% dextrozy a podá se myším nitrožilně do ocasní žíly.

Pokusná zvířata a nádorová linie

Myší samice Balb/c nu/nu se získají od The animal Department, The Norwegian Radium Hospital a umístí se po 10 v jedné kleci a udržují v prostředí, prostém pathogenních organismů. Byly užity myši ve stáří 6 týdnů s hmotností 20 až 22 g při začátku pokusu. Lidský karcinom tlustého střeva WiDr byl namnožen sériovou transplantací bezsrstým myším. Nenekrotický nádorový materiál pro naočkování byl získán sterilním odebráním velkých nádorů od těchto myší. Makroskopicky životaschopná nádorová tkáň byla opatrně rozstříhána nůžkami a několikrát protlačena sterilními jehlami k získání suspenze nádorové tkáně. K tomuto účelu byly užity jehly 19 až 25.

0,02 ml takto získané suspenze pak bylo vstříknuto na dorzál20 ní stranu pravé zadní končetiny každé myši. Transplantace byla úspěšná v téměř 100 %. Nebylo možno pozorovat žádnou ' spontánní nekrozu u nádorů, které rostly a dosáhly v průběhu 14 dnů přibližně průměru 5 až 7 mm při měření posuvným měřítkem každý druhý den. Objem nádoru byl vypočítán podle násle25 dující rovnice.

V = n/6(DiXD₂xD₃) kde D-l, D₂ a D₃ jsou orthogonální průměry nádoru, měřené posuvným měřítkem.

• 9

♦ Μ 999

Vystavení působení světla

Neanestetizované myši byly upevněny do zařízení Lučíte, zvláště upraveného pro ozařování. Oblast, v níž se nacházel nádor byla vystavena působení červeného světla z laseru s dikyanomethylan-2-methyl-6-(p-dimethylaminostyryl)4H-pyranem, DCM při použití 5 W argonového iontového laseru (Spectra Physics, 164). Rozmezí vlnových délek bylo 610-690 nm.Laser s barevným světlem byl nastaven na 632 nm jak pro PpIX, odvozený od ALA, tak pro Photofrin a vlnová délka byla ověřována monochromatickým zařízením. Laserový paprsek byl rozptýlen pomocí mikroskopického okuláru. Světlo bylo dodáváno při intenzitě 150 mW/cm² celkem 15 minut. Tato intenzita byla v oblasti nádoru pravidelně sledována pomocí fotodiody, spojené s digitálním měřícím zařízením (Keithley Instruments,

SRN) a to před vystavení světlu a těsně po něm.

Účinnost PDT při použití ALA nebo Photofrinu jednotlivě a při kombinaci těchto látek.

Myši s nádory příslušných rozměrů byly rozděleny do 5 skupin, přičemž každá skupina obsahovala nejméně 3 myši. Skupina 1 byla kontrolní, myším nebyla podána ALA ani Photofrin a myši také nebyly ozářeny, bylo pouze intraperitoneálně podáno 0,1 ml fyziologického roztoku chloridu sodného. Skupina 2 byla rovněž kontrolní, nádory byly ozářeny stejnou dávkou jako nádory myší, které byly léčeny. Skupina 3 byla léčena podáním ALA, intraperitoneálně bylo podáno 250 mg/kg hmotnosti, načež po 3 hodinách byly myši vystaveny působení světla svrchu uvedeným způsobem. Skupina 4 byla léčena pouze prostředkem Photofrin, bylo nitrožilně podáno množství 1 mg/kg a pak po 3 hodinách byly myši ozářeny svrchu uvedeným * ·· ♦

9 9 ·· · • · · · • ··· · · • « f »♦· ♦· ·*· * způsobem. Skupina A byla léčena kombinací ALA a prostředku Photofrin, intraperitoneálně bylo podáno 250 mg/kg ALA a nitrožilně bylo podáno 1 mg/kg Photofrinu, po 3 hodinách byly nádory ozářeny svrchu uvedeným způsobem. Reakce nádorů byla vyhodnocena jako zmenšení nádoru a popřípadě opětný růst nádoru. Rozměry nádorů byly měřeny každý den a jakmile se nádory zvětšily na pětinásobný objem ve srovnání s objemem 1 den před ozářením, byly myši usmrceny. Údaje o objemu nádorů z každé skupiny byly shrnuty a byla vytvořena křivka průměr10 něho růstu nádorů.

Výsledky

Růst nádorů, vystavených světlu 3 hodiny po intraperitoneálním podání ALA nebo nitrožilním podání Photofrinu jednotlivě nebo po podání kombinace ALA a Photofrinu je znázorněn na obr. 1. Kontrolní nádory neléčené a neozářené rostly exponenciálně při dvojnásobném zvětšení svého objemu po přibližně 5 dnech. Ozáření nádorů u myší po podání ALA mělo vliv na nádorový růst. Naproti tomu při podání samotného Pho20 tofrinu v dávce 1 mg/kg, která nevyvolá žádnou fototoxicitu nedošlo k žádnému účinku. Při podání kombinace ALA 250 mg/kg a Photofrinu 1 mg/kg došlo k inhibici růstu nádorů, která byla účinnější než při podání samotné ALA.

Příklad 3

PDT při použití kombinace ALA a m-THPC.

Postup byl prováděn v podstatě způsobem podle příkladu 2 při použití následujících skupin zvířat, vždy byla užita nejméně 3 zvířata ve skupině.

Skupina 1 byla kontrolní, myši nebyly ani léčeny ani ozářeny, pouze bylo intraperitoneálně podáno 0,1 ml

*9 99 99

9 99 9 99 9 · 9 9 9 9

99 999 999 • 9 9 9 ··· 999 99 99 fyziologického roztoku chloridu sodného. Skupina 2 byla rovněž kontrolní, myši nebyly léčeny, byly však ozářeny stejnou dávkou jako léčené myši. Skupina 3 byla léčena intraperitoneálně podáním ALA 250 mg/kg a po 3 hodinách byla ozářena svě5 tlem s vlnovou délkou 632 nm, jak bylo popsáno svrchu. Skupina 4 byla léčena podáním m-THPC 75 mikrogramů/kg nitrožilně, jde o dávku, která ještě nevyvolá fototoxicitu a po 3 hodinách byla ozářena světlem s vlnovou délkou 652 nm. Skupina 5 byla léčena kombinací ALA a m-THPC, myším bylo podáno intra10 perítoneálně 250 mg/kg ALA a nitrožilně 75 mikrogramů m-THPC, po 3 hodinách byly nádory vystaveny působení světla svrchu uvedeným způsobem. Reakce nádoru na jednotlivé způsoby léčení byly vyhodnoceny svrchu uvedeným způsobem.

Výsledky

Na obr.2 je znázorněno, že kontrolní nádory bez léčení a bez ozáření rostly exponenciálně pří zdvojení svého objemu přibližně po 5 dnech. Ozáření nádorů po podání ALA mělo určitý vliv na nádorový růst, avšak podání m-THPC v uvedené dávce nemělo žádný vliv. Při podání kombinace ALA 250 mg/kg a m-THPC 75 mikrogramů/kg došlo k synergní inhibici nádorového růstu.

Příklad 4

Distribuce ALA a Photofrinu

Metody

Lidský rektální papilární klkovitý adenom dvou nemocných se závažnou dysplasií a s průjmovým onemocněním po dobu několika měsíců před diagnózou byl odebrán 44 hodin po nitrožilní injekci 2 mg/kg Photofrinu nebo 4,5 hodin po perorálním podání 60 mg/kg ALA. Vzorky byly okamžitě ponořeny do

« ··	*
·· ♦ *	« ·	9 9
• · ·	•
• ··· t	9
* ·	9
··· ··	99 9	9 ·

*· *» • * · · • · · · ·· · ··· • · ·· ·· kapalného dusíku a pak upevněny do prostředí pro přípravu mikroskopických preparátů (Tissue Tek II:BDH, Poole, UK). Zmrazené tkáňové řezy byly získány kryostatem v tloušťce 8 mikrometrů a uloženy na čistá podložní skla. Ve fluorescenčním mikroskopu pak byla sledována lokalizace fluorescence v případě PpIX po podání ALA a po podání Photofrinu. Bylo užito mikroskopu Axioplan (Zeíss, SRN). Kombinace filtrů obsahovala 390-440 nm excitační filtr, rozptylový filtr 460 nm a emisní filtr více než 600 nm. Fluorescenční obrazy byly zaznamenávány kamerou CCD (Astromed CCD 3200, Cambridge, UK) a zpracovány jednotkou pro zpracování obrazů (Astromed/Visilog, PC 486DX2 66 MHz VL).

Výsledky

Výsledky jsou znázorněny na obr. 3 pro lokalizaci Photofrinu (A) a ALA (B). Adenom v případě (A) byl odebrán muži ve věku 75 let a v případě (B) ženě ve věku 87 let. Je zřejmé, že fluorescence Photofrinu se nachází převážně ve stromatu nádorové tkáně, kdežto fluorescence porfyrinů po podání ALA se téměř výlučně nachází v nádorových buňkách.

Příklad 5

Materiály a metody Chemické látky

5-ALA, methylester 5-ALA a butylester 5-ALA byly dodány Norsk Hydro Research Center, Porsgrunn, Norsko.

5-ALA (ALA) a methyl ester ALA (ME) byly rozpuštěny v izotonickém roztoku chloridu sodného do koncentrace 0,375 mM.

Butylester ALA (BU) byl rozpuštěn v malém množství ethanolu a dále ředěn izotonickým roztokem chloridu sodného • 99 « ·· ·« • ♦ · • « · ·· · ·· ·· ·· · až do koncentrace 0,375 mM, konečná koncentrace ethanolu byla 2 % objemová.

Aluminiumftalocyanindisulfonát AlPcS_2a (Porphyrin Products lne.) byl rozpuštěn v několika kapkách 1M NaOH a zředěn ve fyziologickém roztoku chloridu sodného s fosfátovým pufrem (PBS, 10 mM fosforečnanu sodného o pH 7,4/150 mM NaCl) do konečné koncentrace 0,25 mg/ml.

Aluminiumftalocyanintetrasulfonát A1PcS₄ (Porphyrin Products lne.) byl rozpuštěn v PBS do konečné koncentrace 0,25 g/ml nebo 1,25 mg/ml v případě pokusu s vyšší dávkou v příkladu 5.3.

Photofrin (PII) (Quadra Logic Technologies) byl rozpuštěn v 5% roztoku glukózy ve vodě do konečné koncentrace 0,25 mg/ml.

Chlorin e6 (e6) (Porphyrin Products lne.) byl rozpuštěn v PBS do konečné koncentrace 0,25 mg/ml.

ALA, methylester ALA nebo butylester ALA byly podány intraperitoneálně (i.p.), kdežto senzitizační látky byly podány nitrožilně (i.v.).

Pokusná zvířata

Pokusná zvířata byla užita stejným způsobem jako v příkladu 2. Všem zvířatům bylo podáno totéž množství 1,5 mmol ALA ve volné formě nebo ve formě esteru. Vzhledem k rozdílům v molekulové hmotnosti ALA a jejích esterů bylo zvířatům podáno 250 mg/kg ALA nebo 278 mg/kg methylesteru ALA nebo 338 mg/kg butylesteru ALA.

Provedení pokusu

Suspenze lidského nádoru (karcinom tlustého střeva WiDr, propagovaný sériovou transplantací) byla připravena z nenekrotických částí nádorů a v množství 20 mikrolitrů byla ·· ♦ vstříknuta do pravé zadní končetiny každé myši. Jakmile nádory dosáhly průměru 5-7 mm, byla každé myši injekčně podána účinná látka nebo pouze fyziologický roztok, tak jak je uvedeno v příkladech 5.1 až 5.5. Injekční objem byl vždy 100 mikrolitrů pro myš s přibližnou hmotností 25 g.

Myši byly ozářeny 1 hodinu po podání účinných látek místo po 3 hodinách jako v předchozích příkladech. Na rozdíl od předchozích příkladů byla užita žárovka se světlem s vlnovou délkou 600-700 nm (Curelight, patent využit PhotoCure AS). Tohoto širšího rozmezí vlnových délek bylo použito z toho důvodu, že světlo by mělo zahrnout kombinace ftalocyaninů s absorpčním maximem 670 nm a protoporfyrinu IX s absorpčním maximem 630 nm, který vzniká po podání ALA nebo esterů ALA.

Žárovka však vydává světlo s nižší intenzitou než laser. To znamená, že kombinace ALA a Photofrinu, které byly účinné v předchozích příkladech již nebudou účinné při použití žárovky. Použitá doba osvětlení je optimální k dosažení účinku většiny senzitizačních látek a je také optimální pro estery ALA, avšak pouze suboptimální pro volnou ALA.

Vyhodnocení bylo prováděno tak, že byl vypočítán průměrný objem nádoru pro každou skupinu a příslušná standardní odchylka v průběhu času. Pokus byl ukončen, jakmile se objem nádoru zvětšil 4x až 5x ve srovnání s počátečním objemem.

Příklad 5.1:kombinace ALA a chlorin e6

Myši s nádory příslušné velikosti byly rozděleny do 3 skupin po 4-5 myších.

Skupina 1: kontrolní, 100 mikrolitrů fyziologického roztoku chloridu sodného i.p.

99 ·

9

9 9

999 9

• ·

9

99 9

Skupina 2: 5-ALA 250 mg/kg (1,5 mmol) i.p. + chlorin e6 (1 mg/kg) i.v.

Skupina 3: 5-ALA 250 mg/kg (1,5 mmol) i.p.

Skupina 4: chlorin e6 (1 mg/kg) i.v.

Jednu hodinu po podání účinných látek byly myši ozářeny žárovkou s širokým spektrem vlnové délky Curelight (161 mW/cm² po dobu 15 minut, 144,9 J/cm²).

Reakce nádorů byla vyhodnocena jako zmenšení nádoru a jeho opětný růst. Rozměry nádorů byly měřeny každý druhý den a byl vypočítán objem nádorů podle vzorce z příkladu 2. Myši byly usmrceny, jakmile dosáhl objem nádoru 5násobku původní hodnoty. Pro každý časový úsek byl vypočítán průměrný objem nádoru a příslušná standardní odchylka (n=4-5). Údaje pak byly podrobeny statistické analýze při použití Q-testu s 90% mezemi spolehlivosti a extrémní hodnoty byly vyloučeny. Standardní odchylky byly ve většině případů nejvýš 1.

Výsledky

Výsledky těchto pokusů jsou znázorněny na obr.4. Pro větší zřejmost byly vynechány úsečky pro standardní odchylky Je zřejmé, že nádory u kontrolních myší dosáhly v průběhu 10 dnů 4násobku původního objemu a rostly tedy logaritmicky. Po podání ALA a chlorinu e6 jednotlivě nebylo možno pozorovat v použitých dávkách žádný účinek. Avšak při použití kombinace

ALA a chlorinu e6 došlo k podstatné inhibici rychlosti růstu nádorů. U léčených myší bylo dosaženo 4násobku počátečního objemu nádoru až po 39 dnech.

Příklad 5.2: methylester ALA a AlPcS_2a

9 4 • · 4 » 4 4 • · · · • 4 4 · 4 « * 4 <

·· 444 >44 ·· • ·

4 • «4

4

4

4« 4 • 4

Myši s nádory příslušných rozměrů byly rozděleny do 3 skupin po 4-5 myších.

Skupina 1: kontroly, 100 mikrolitrů fyziologického roztoku chloridu sodného i.p.

Skupina 2: AlPcS_2a 1 mg/kg i.v.

Skupina 3: methylester ALA 273 mg/kg, 1,5 mmol i.p.

Skupina 4: methylester ALA 273 mg/kg, 1,5 mmol i.p. a AlPcS_2a 1 mg/kg i.v.

Myši byly ozářeny 1 hodinu po injekčním podání účinných látek, reakce nádorů byla vyhodnocena jako zpomalení růstu a opětný růst stejně jako v příkladu 5.1.

Výsledky

Výsledky pokusu jsou znázorněny na obr. 5. Je zřejmé, že nádory kontrolních myší dosáhly 4násobku původního objemu po 10 dnech a rostly tedy logaritmicky. Methylester ALA jednotlivě neměl žádný protinádorový účinek v použité dávce, kdežto u AlPcS_2a bylo možno pozorovat slabý účinek. Při podání kombinace methylesteru ALA a AlPcS_2a bylo však možno pozo20 rovat překvapivě vysoký účinek. V tomto případě vůbec nedošlo k významnějšímu růstu nádorů v průběhu 40 dnů po podání kombinace účinných látek.

Příklad 5.3

Butylester ALA a A1PcS₄

Myši s nádory příslušného rozměru byly rozděleny do 5 skupin po 4-5 myších.

Skupina 1: kontroly, 100 mikrolitrů 2% ethanolu i.p. Skupina 2: butylester 5-ALA 338 mg/kg (1,5 mmol)i.p.

a A1PcS₄ (1 mg/kg) i.v.

• · • 0

000 0 ♦

Skupina 3: A1PcS₄ (5 mg/kg) i.v.

Skupina 4: A1PcS₄ (1 mg/kg) i.v.

Skupina 5: butylester 5-ALA 338 mg/kg (1,5 mmol)i.p. Ethanol byl použit jako kontrolní aplikace vzhledem k tomu, že prostředek s obsahem butylesteru ALA obsahoval přibližně 2 % ethanolu. Myši byly ozářeny 1 hodinu po ošetření a reakce nádorů byla vyhodnocena jako doba zpomalení růstu a opětný růst stejně jako v příkladu 5.1.

Výsledky

Výsledky jsou znázorněny na obr.6. Z výsledků je zřejmé, že kontrolní skupina po podání 2% ethanolu a také nádory ve skupině, jíž byl podán butylester ALA dosáhly 4násobku původního objemu po 9 a 11 dnech. Nádory tedy rostly logaritmicky. A1PcS₄ v dávce 1 mg/kg měl na nádorový růst jen slabý účinek. Avšak při použití této látky v kombinaci s butylesterem ALA došlo k překvapivě velkému účinku, který byl téměř totožný s účinkem po vysokých dávkách 5 mg/kg A1PcS₄. Použití takto vysokých dávek však obvykle vyvolává značné otoky, tzn., že při použití kombinace uvedených látek je možno dosáhnout stejně dobrého účinku a současně se vyvarovat nežádoucích vedlejších účinků.

Příklad 5.4: butylester ALA a AlPcS_2a

Myši s nádory příslušných rozměrů byly rozděleny do 3 skupin po 4-5 myších.

Skupina 1: kontrolní, 100 mikrolitrů fyziologického roztoku chloridu sodného i.p.

Skupina 2: butylester 5-ALA 338 mg/kg (1,5 mmol)i.p. a A1PcS₂ (1 mg/kg) i.v.

• V* · • Β * Β ·Β · • Β · · • ··· · · • · · ··· ·· «Β· Β ·· ·· • · · · • Β · · • ··· ··· • Β • Β ΒΒ

Skupina 3: AlPcS₂ (1 mg/kg) i.v.

Skupina 4: butylester 5-ALA 338 mg/kg (1,5 mmol)i.p. Myši byly ozářeny 1 hodinu po injekčním podání účinné látky a reakce nádorů byla vyhodnocena jako zpomalení růstu a 5 opětný růst stejně jako v příkladu 5.1.

Výsledky

Výsledky jsou znázorněny na obr. 7. Je zřejmé, že kontrolní nádory dosáhly po 10 dnech 4násobku původního objelo mu a rostly logaritmicky. Stejně jako svrchu neměl butylester

ALA téměř žádný účinek na nádory, kdežto AlPcS_2a měl okamžitý účinek, 4násobku původního objemu bylo dosaženo až po 14 dnech. Při použití kombinace obou látek došlo k významnému zpomalení růstu nádoru s jen pomalým obnovením růstu.

4násobku původního objemu bylo v tomto případě dosaženo až po 30 dnech.

Příklad 5.5: methylester ALA a A1PcS₄

Myši s nádory příslušné velikosti byly rozděleny do 3 skupin po 4-5 myších.

Skupina 1: kontrolní myši, 100 mikrolitrů fyziologického roztoku chloridu sodného i.p.

Skupina 2: methylester 5-ALA 273 mg/kg (1,5 mmolji.p. a A1PcS₄ (1 mg/kg) i.v.

Skupina 3: methylester 5-ALA 273 mg/kg (1,5 mmol)i.p.

Skupina 4: AlPcS₄ (1 mg/kg) i.v.

Myši byly ozářeny 1 hodinu po injekčním podání účinných látek a reakce nádorů byla vyhodnocena jako zpomalení růstu a opětný růst jako v příkladu 5.1.

• · » · » · ··· · • ·· · ···

Výsledky

Výsledky jsou znázorněny na obr. 8. Je zřejmé, že kontrolní nádory dosáhly 4násobku původního objemu v průběhu 10 dnů a rostly logaritmicky. Jak již bylo svrchu uvedeno, neměl methylester ALA žádný účinek na nádorový růst, kdežto A1PcS₄ měl středně silný účinek. Kombinace obou látek však nejprve vedla k podstatnému zmenšení objemu nádoru a pak k jeho pomalému opětnému růstu. Pouze při použití této kombinace došlo k počátečnímu zmenšení nádoru. V tomto případě dosáhly nádory 4násobku původního objemu přibližně po 35 dnech.

Zastupuje :

Β ΒΒ Β Β Β Β

Claims (19)

1. Farmaceutický prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje protoporfyrinový prekursor fotochemotherapeutické látky spolu s fotosenzitizační látkou, ukládající se do vaskulárního stromatu, popřípadě spolu s nejméne 1 látkou pro usnadnění průniku a popřípadě spolu s jedním nebo větším počtem chelatačních činidel.

2. Farmaceutický prostředek podle nároku 1, v y z n a č u10 jící se t í m, že je určen pro léčení poruch a abnormalit zevního nebo vnitřního tělesného povrchu, reagujících na fotochemotherapií.

3. Farmaceutický prostředek podle nároku 2, vyznačující se tím, že relativní léčebná účinnost je zvýšena

15 _ve srovnání s použitím fotochemotherapeutické látky nebo fotosenzitizační látky jednotlivě.

4. Farmaceutický prostředek podle nároku 2 nebo 3, vyznačující se tím, že kombinace účinných látek má synergní účinek.

5. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až

4, vyznačující se tím, že obsahuje fotosenzitizační látku, ukládanou do vaskulárního stromatu v nižší než léčebné dávce.

²⁵

6. Farmaceutický prostředek, podle některého z nároků 1 až

5, vyznačující se tím, že jako fotosenzitizační látku, ukládanou do vaskulárního stromatu obsahuje hematoporfyrin, chlorin nebo sulfonovaný ftalocyanin nebo prekursory nebo deriváty těchto látek.

··· · · 4 4 444 • · · φ ·· 444 444 44

7. Farmaceutický prostředek podle nároku 6, vyznačující se tím, že jako látku, ukládanou do vaskulárního stromatu obsahuje Photofrin, m-THPC, chlorin e6, alumíniumftalocyanindisulfonát nebo aluminiumftalocyanin- tetrasul5 fonát nebo prekursory nebo deriváty těchto látek.

8. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 7,vyznačující se tím, že jako protoporfyrinový prekursor obsahuje kyselinu 5-aminolevulovou nebo její prekursor nebo derivát.

9. Farmaceutický prostředek podle nároku 8, vyznačující se tím, že jako derivát kyseliny 5-aminolevulové obsahuje ester kyseliny 5-aminolevulové.

10. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až

-1-5 9, vyznačující se tím, že jako látku, usnadňující průnik obsahuje DMSO.

11. Farmaceutický prostředek podle některého z nároků 1 až 10, vyznačující, se tím, že obsahuje kyselinu 5-aminolevulovou nebo její prekursor nebo derivát, Photofrin, DMSO, EDTA a desferrioxamin.

12. Použití protoporfyrinového prekursoru fotochemotherapeutické látky spolu s fotosenzitizační látkou, ukládanou do vaskulárního stromatu, popřípadě spolu s nejméně 1 látkou pro

25 usnadnění průniku a popřípadě nejméně jedním chelatačním činidlem pro výrobu farmaceutického prostředku pro léčení poruch nebo abnormalit zevního nebo vnitřního tělesného povrchu, reagujících na fotochemotherapii.

13. Produkt, vyznačující se tím, že obsahuje protoporfyrinový prekursor fotochemotherapeutické látky a fotosenzitizační látku, ukládanou do vaskulárního stromatu, popřípadě s nejméně 1 látkou pro usnadnění průniku a popřípadě nejméně 1 chelatačním činidlem jako kombinovaný prostředek pro současné oddělené nebo následné použití při léčení poruch nebo abnormalit zevních nebo vnitřních tělesných povrchů, reagujících na fotochemotherapii.

14. Použití protoporfyrínového prekursoru fotochemotherapeutické látky a fotosenzitizační látky, ukládané do vaskulárního stromatu, popřípadě spolu s nejméně 1 látkou pro usnadnění průniku a popřípadě nejméně 1 chelatačním činidlem pro výrobu produktu podle nároku 13 pro současné, oddělené nebo následné použití při léčení poruch a abnormalit zevních nebo vnitřních tělesných povrchů, reagujících na fotochemotherapii.

15. Použití podle nároku 12 nebo 14, při němž je celková dávka fotosenzitizační látky, ukládané do vaskulárního stromatu v rozmezí 0,01 až 10 mg/kg hmotnosti a dávka protoporfyrinového prekursoru fotochemotherapeutické látky je v rozmezí 1-500 mg/kg hmotnosti.

16. Použití podle některého z nároků 12, 14 nebo 15, při němž se fotochemotherapie provádí ozářením světlem s vlnovou délkou 350-900 nm.

• · ··

17. Balíček pro použití při fotochemotherapii poruch nebo abnormalit zevního nebo vnitřního tělesného povrchu, vyznačující se tím, že obsahuje

a) první nádobku, obsahující protoporfyrinový prekursor fotochemotherapeutické látky podle některého z nároků 2-4, 8 nebo 9,

b) druhou nádobku, obsahující fotosenzitizační látku, ukládanou do vaskulárního stromatu podle některého z nároků 2-7 a popřípadě nejméně jednu sloučeninu pro usnadnění průniku, obsaženou v první nebo druhé nádobce nebo samostatně ve třetí nádobce, podle některého z nároků 2 nebo 10 a/nebo

d) nejméně jedno chelatační činidlo, obsažené v první, druhé nebo třetí nádobce nebo samostatně ve čtvrté nádobce, přičemž první nebo druhá nádobka mohou chybět a sloučeniny, uvedené v bodech a) a b) mohou být uloženy do dalších nádobek, tvořících balíček.

18. Způsob fotochemotherapeutického léčení poruch nebo abnormalit zevních nebo vnitřních tělesných povrchů, v y z - n ačující se tím, že se na tyto povrchy aplikuje farmaceutický prostředek nebo produkt podle některého z nároků 1 až 11, 13 nebo 15 a pak se povrch vystaví působení světla, s výhodou s vlnovou délkou 350-900 nm.

19. Způsob diagnózy abnormalit nebo poruch in vitro analýzou tělesné tekutiny nebo tkáně nemocného, vyznačuj í c í se t í m, že se

i) tělesná tekutina nebo tkáň smísí s farmaceutickým prostředkem podle některého z nároků 1 až 11, ii) směs se vystaví působení světla, iii) zjistí se úroveň fluorescence a • « · · ·· · · · · iv) zjištěná úroveň fluorescence se srovnává fluorescence v kontrolních vzorcích.