CZ24089U1 - Aktivní forma alfa-N-acetylgalaktosaminidázy z vláknité houby Aspergillus niger - Google Patents

Description

Aktivní forma α-jV-acetylgalaktosaminidázy z vláknité houby Aspergitíus niger

Oblast techniky

Technické řeSení se týká α-TV-acetylgalaktosaminidázy neboli a-V-acetylgalaktosaminid-V-acetylgalaktosaminohydrolázy, enzymu s α-galaktosidázovou aktivitou, a přípravy aktivní formy tohoto enzymu v kvasinkovém expresním systému Saccharomyces cerevisiae.

Dosavadní stav techniky a-V-acetylgalaktosaminidáza (α-GalNAasa; EC 3.2.1.49) neboli a-7V-acetylgalaktosaminid-7Vacetylgalaktosaminohydroláza je enzym selektivně štěpící tenninálně vázaný GalNAc, který je připojen O-a-D-glykosidovou vazbou na aminokyseliny Ser nebo Thr, či na oligosacharidový io řetězec. Enzymová hydrolýza glykosidické vazby probíhá retenujícím způsobem, kdy je konfigurace anomerie vazby substrátu a produktu nezměněna. Uhlík Cl α-TV-acetylgalaktosaminidu podílející se na glykosidické vazbě, podléhá dvěma následným nukleofilním atakům, při kterých se mění anomerie vazby. Nejprve atom kyslíku Aspl40 atakuje elektrofilní uhlík Cl sacharidového skeletu, což vede k tvorbě kovalentního komplexu enzym-substrát. Následně je kovalentní kom15 plex atakován deprotonovanou molekulou vody, což způsobí regeneraci enzymu a uvolnění produktu.

Podle enzymové nomenklatury ÍUB-MB (International Union of Biochemistry and Molecular Biology) je α-V-acetylgalaktosaminidáza řazena mezi hydrolázy-glykosidázy hydrolyzující O- a 5-glykosidické vazby. Na základě příbuznosti genů a isoenzymů byla sestavena fylogenetická mapa tohoto enzymu. Tato mapa ukázala, že evoluční počátek genu pro a-V-acetylgalaktosaminidázu obratlovců a hub je odlišný. a-A-acetyl-galaktosaminidáza se pravděpodobně vyvinula z α-galaktosidázy u hub, které osídlily pevné substráty, jako adaptace na využití sloučenin obsahující terminálně vázaný N-acetylgalaktosamin.

α-V-acetylgalaktosaminidáza se vyskytuje ve více formách navzájem se lišících svou katalytic25 kou aktivitou. Dimemí a tetramemí forma je enzymově aktivní na rozdíl od monomemí, která nevykazuje enzymovou aktivitu.

Lidská α-GalNAc-áza hraje důležitou roli při metabolismu glykokonjugátů. Nedostatek tohoto enzymu může způsobit Schindlerovu nebo Kanzakiho nemoc, která může vyústit až v nevratné neurodegenerativni postižení.

Bylo prokázáno, že α-GalNAc-áza purifikovaná z kuřecích jater (J. Hata, et al, Purification and characterization of N-acetyl-a-D-galactosaminidase from Gallus domestici, Biochem. Int. 28 (1992) 77-86), grampozitivní tyčinkovité anaerobní sporulující bakterie Clostridium perfringens (G.N. Levý, and D Aminoff, Purification and properties of a-N-acetylgalactosaminidase from Clostridium perfringens, J. Biol. Chem. 255 (1980) 11373-11342) a dalších bakteriálních kmenů (P.Q. Liuet et al, Bacterial glycosidases for the production of universal red blood cells, Nat.

Biotechnol. 25 (2007) 454-464), je schopna účinně štěpit tenninálně a-vázaný GalNAc z epitopů erytrocytů krevní skupiny A. Výsledkem tohoto štěpení jsou epitopické struktury erytrocytů krevní skupiny H(0) univerzální dárce. (C. Y. Yu et al, Human RBCs blood group conversion from A to O using a novel a-N-acetylgalactosaminidase of high specific activity, Chinese Sci. Bull. 53 (2008) 2008-2016). Nevýhodu všech dosud známých α-V-acetylgalaktosaminidáz, ať izolovaných či rekombinantně připravených (viz např. H. Ashida, H. Tamaki, T. Fujimoto, K. Yamamoto, and H. Kumagai, Molecular cloning of cDNA encoding a-N-acetylgalactosaminidase from Acremonium sp. and its expression in yeast, Arch. Biochem. Biophys. 384 (2000) 305-310)) je jejich nulová enzymatická aktivita v oblasti neutrálního pH. Z těchto důvodů nebylo možné pro45 vést experiment přeměny eiytrocytů přímo na živých izolovaných krevních buňkách, které v oblasti nízkého pH podléhají erytrolýze. Všechny výše zmíněné experimenty se sacharidovými strukturami krevních skupin byly prováděny v nízkém pH výhradně se samotnými epitopy, které byly připraveny synteticky.

- 1 CZ 24089 Ul

V Laboratoři architektury proteinů, MBÚ AV ČR, v.v.i a v Laboratoři biotransformací, MBÚ AV ČR, v.v.i bylo provedeno několik experimentů, které vedly k základním biochemickým poznatkům o a-jV-acetylgalaktosamimdázách izolovaných z přírodních zdrojů a byl identifikován nejlepší producent tohoto enzymu - vláknitá houba Aspergillus niger CCIM K2. Extracelulámí enzym z tohoto zdroje byl puntíkován a plně charakterizován (L. Weignerová, T. Filipi, D. Manglová, and V. Křen, Induction, purification and characterization of a-N-acetylgalactosaminidase from Aspergillus niger, Appl. Microbiol Btotechnol 79 (2008) 769-774.).

α-GalNAc-áza je schopná také katalyzovat reverzní hydrolytické reakce, výsledkem těchto reakcí může být a-D-GalpNAc-(l—>6)-D-GaIpNAc, a-D-Gal/?NAc-(l—*3)-D-GalpNAc, a-D-GalpNAcio (1—>6)-D-Gal/NAc a také Tn antigen (GalpNAc-a-O-Ser/Thr) a jeho W-ffórí-butoxykarbonyl) deriváty (L. Weignerová, P. Simerská, and V. Křen, a-Galactosidases and their applications in biotransformations, Biocat. Biotrans. 27 (2009) 79-89), (L. Weignerová et al, Condensation reactions catalyzed by a-N-acetylgalactosaminidase Jřom Aspergillus niger yielding a-N-acetylgalactosaminides. Biocat. Biotrans. 28 (2010) 150-155).

Měření enzymové aktivity a molekulární modelování ukázalo duální enzymatickou aktivitu specifickou jen pro α-GalNAc-ázu izolovanou z Aspergillus niger. Tento enzym je schopný hydrolyzovat jak o-nitrofenyl-2-acetamido-2-deoxy- α-D-galaktopyranosid (a-A-acetylgalaktosaminidázová aktivita), tak p-nitrofenyl- a-D-galaktopyranosid (α-galaktosidázová aktivita), přičemž agalaktosidázová aktivita je ve srovnání s a-TV-acetyl-galaktosaminidázovou přibližně 10% (N.

Kulik et al, The a-galactosidase type A gene aglA from Aspergillus niger encodes a fully functional a-N-acetylgalactosaminidase, Glycobiology, 20 (2010) 1410-1419). Do současné doby byla v literatuře popsána izolace, purifikace a základní charakterizace několika a-A-acetylgalaktosaminidáz z přírodních zdrojů a pouze jedna rekombinantní příprava tohoto enzymu (viz výše). Avšak žádný z těchto enzymů nevykazoval α-A-acetylgalaktosaminidázovou aktivitu v neutrálním pH.

Rekombinantně připravená α-A-acetylgalaktosaminidáza podle předloženého technického řešení překvapivě projevuje významnou a-A-acetylgalaktosaminidázovou aktivitu dokonce i při pH 8 (v 50mM HEPES pufru, pH = 8,0). Tato aktivita je přibližně až 20% vzhledem k maximu, kterého je dosaženo přibližně při pH 2. Aktivita enzymu při pH v rozmezí 6 až 8 je dostatečná pro praktické využití enzymu.

Podstata technického řešení

Technické řešení se týká rekombinantní aktivní formy a-Y-acetylgalaktosaminidázy (a-GalNAcasa; EC 3.2.1.49) neboli a-A-acetylgalaktosammid-A-acetylgalaktosamino-hydrolázy z vláknité houby Aspergillus niger, jejíž aminokyselinová sekvence je následující (SEKV. ID. Č. 1):

MGFNNWARFMCDLNETLFTETADAMAAMGLRDAGYNRINLDDCWMAYQRSDNGSLRWNTT 6 0

EFPHGLPWLAQYVKAKGFHFGIYEDSGNMTCGGYPGSYNHEEQDANTFALWGIDYLKLDG 12 0

CNVYATQGRTLEEEYKQRYGHWHQVLSKMQHPLIFSESAPAYFAGTDNNTDWYTVMNWVP 18 0

XYGELARHSTDILVYSGAGSAWDSIMNNYNYNTLLARYQRPGYFNDPDFLIPDHPGLTAD 240

EKRSHFALWASFSAPLIISAYIPALSKDEIAFLTNEALIAVNQDPLAQQATFASRDNTLD 300

ILTRNLANGDRLLTVLNKGNTTVTRDIPVQWLGLTETDCTYTAEDLWDGKTQKISDHIKI 360

ELASHATAVFRLGLPQGCSSWPTGLVFNTASGNCLTAASNSSVAFGSCNGETSQIWQVT 42 0

LSGVIRPVSQTTQCLAADGNSVKLQACDSTDSDGQNWTYAVTGNLKNAKTDGCLTEGSVQ 48 0

MKSCLYE

Rekombinantně připravená forma tohoto enzymu překvapivě vykazuje v rozmezí pH 6 až 8 a-Nacetylgalaktosaminidázovou aktivitu na úrovni 15 až 30 % (při pH 7 přibližně 20 %) vzhledem k maximu, kterého je dosaženo přibližně pri pH 2. Díky této významné aktivitě při neutrálním pH představuje enzym podle předloženého technického řešení výhodný nástroj pro použití pri přeměně krevních buněk typu A na krevní buňky typu H(0) univerzální dárce. Rekombinantně připravený enzym vykazuje také a-galaktosidázovou aktivitu. Tento enzym může být využit při syntetických reakcích oligo/polysacharidových struktur.

-2CZ 24089 Ul

Dále se předložené technické řešeni týká izolované molekuly nukleové kyseliny, která kóduje aktivní α-V-acetylgalaktosaminidázu s α-galaktosidázovou aktivitou. Tato izolovaná molekula může být DNA nebo RNA (mRNA), výhodně je to cDNA. Také nukleové kyseliny se sekvencí komplementární k výše uvedeným sekvencím spadají do rozsahu předloženého technického řeše5 ní. Nejvýhodněji se jedná o cDNA s následující sekvencí (SEKV. ID. Č. 2):

atgggtttcaacaattgggcccgcttcatgtgcgacctcaacgagaccctgtttaccgag 60 actgecgatgcgatggctgctaacggtctgcgggacgcaggctacaatcgcatcaatctg 120 gatgattgctggatggcttatcagcgatccgacaatggatccctacggtggaacacgact 180 gagttcccacacggcctgccttggctagctcaatatgtcaaagccaaagggtttcatttt 240 ggaatctatgaagattctggcaacatgacttgtggcggataccccggatcctacaaccac 300 gaggagcaggacgccaacacctttgctttatgggggattgactatctcaagctcgacggt 360 tgcaacgtctacgcaacacaaggtaggacactcgaggaggaatacaagcaacgctacgga 420 cattggcaccaagtcctcagcaagatgcagcacccactgatcttctccgagtcagccccg 480 gcatacttcgcgggcacagacaacaacacagactggtacaccgtgatgaactgggtcccg 540 atctacggggagctggcccgccattctaccgatatcctggtgtacagtggagcaggtagc 600 gcatgggacagcattatgaataactacaactacaacactcttcttgcgcgctaccagcga 660 ^cc9399^tatttcaatgatcctgattttctgatcccggatcatcctggcctgacggcggat 720 gaaaagcgatcgcattttgcactgtgggcttctttctcggctccacttattatcagtgct 780 tatatacctgcactttcgaaggatgagattgccttcttgacgaacgaggcattgattgcg 840 gtgaatcaggatcccctggcccagcaggccacgtttgcgagccgcgataacacactggat 900 atattgacgcgtaatctggcaaacggcgacaggctgctgacggtgcttaataagggaaac 960 acaactgtaacgagggacattcccgtacaatggttgggtcttacagagactgactgtaca 1020 tacacggccgaggatctctgggatggcaagacccagaagatcagcgaccatataaagatt 1080 gaactagccagccatgcgacagcagtcttccggctcggtcttccgcagggttgttcctcg 1140 gtagtgccaacgggacttgtcttcaacacagcatcgggcaattgtctgaccgctgcctca 1200 aattcttcagtcgcatttcagtcctgcaatggagagacctctcagatctggcaggtgaca 1260 ctgtcaggagtcattcgtccagtatcgcagaccacacaatgcttggctgctgatggaaac 1320 tcagttaagctgcaagcatgtgacagcacggatagcgacggccagaactggacgtatgca 1380 gtcacgggaaatttaaagaatgcgaagacagatggttgcctgactgagggatcagtgcag 1440 atgaagtcgtgtctttatgaga

Příprava aktivní formy α-V-acetylgalaktosaminidázy zahrnuje čtyři stupně: izolaci celkové RNA z vláknité houby Aspergillus niger, přípravu fragmentů specifické DNA, klonování této DNA do vhodného klonovacího a expresního vektoru, transformaci plazmidové DNA do vhodných hostitelských buněk, expresi aktivního enzymu, izolaci a purifikaci tohoto enzymu.

1. stupeň: Izolace RNA a příprava DNA fragmentů kódujících aktivní formu enzymu α-Ά-acetylgalaktosaminidázy.

Celková mRNA se izoluje z vláknité houby Aspergillus niger a následně se užije jako templát pro syntézu cDNA pomocí reverzní transkriptázy. cDNA se poté použije jako templát pro PCR amplifikaci DNA kódující aktivní formu alfa-V-acetylgalaktosaminidázy. Pro amplifikaci se užijí specifické oligonukleotidové primery následujících sekvencí:

5' - ttat tet aga atg ggt ttc aac aat tgg gcc ege - 3' (SEKV. ID. Č. 3)

5' - att gaa ttc tta gcc atc cct ctc ata aag aca ega ctt - 3' (SEKV. ID. Č. 4)

2. stupeň: Konstrukce expresního plasmidu a jeho transformace do kvasinkového expresního systému Saccharomyces cerevisiae.

Expresní plasmid je konstruován vložením DNA fragmentu vzniklého po PCR amplifikaci v předchozím stupni do vhodného expresního vektoru. Tento vektor se pak metodou transfekce (výhodně elektroporace, nebo jinou metodou odborníkům známou) vnese do kompetentních buněk expresního systému.

-3CZ 24089 Ul

3. stupeň: Exprese aktivní formy a-V-acetylgalaktosaminidázy.

Z transformantů vzniklých ve stupni 2 se vybere nejlepší produkční klon, který se použije pro inokulum, které se následně použije pro velkoobjemovou produkci proteinu ve vhodném produkčním médiu za vhodných kultivačních podmínek. Exprese proteinu je indukována vhodným induktorem (v závislosti na typu promotoru v expresním vektoru a mechanismu regulace proteinové exprese).

4. stupeň: Izolace aktivní a-V-acetyl galaktosaminidázy z hostitelského expresního systému a purifikace tohoto aktivního enzymu.

Po velkoobjemové produkci je buněčná kultura odstředěna centrifugací a aktivní enzym je izoloio ván pomocí lyzačního pufru s přídavkem detergentů. α-V-acetylgalaktosaminidáza se pak purifikuje, např. pomocí tří po sobě jdoucích chromatografií (Phenyl-Sepharosa, S-Sepharosa a Superdex 200), nebo jiným vhodným způsobem odborníkům známým.

Dále se předložené technické řešení týká dvojice oligonukleotidů sestávající ze sekvencí SEKV. ID. Č. 3 a SEKV. ID. Č. 4 pro přípravu nukleové kyseliny, výhodně cDNA, kódující rekombii5 nantní a-7V-acetylgalaktosaminidázu s duální aktivitou vykazující významnou a-JV-acetylgalaktosaminidázovou aktivitu při neutrálním pH. Dvojice uvedených oligonukleotidů je výhodná také pro přípravu rekombinantní α-V-acetylgalaktosaminidázy s duální aktivitou vykazující významnou a-A-acetylgalaktosaminidázovou aktivitu při neutrálním pH.

Stručný popis obrázků

Obrázek 1: A. Elektroforetická analýza produkce α-V-acetylgalaktosaminidázy po jednotlivých časových úsecích. B. α-V-acetylgalaktosaminidázová aktivita měřená v produkčním médiu po jednotlivých časových úsecích.

Obrázek 2: A. Eluční profil rekombinantní a-2V-acetylgalaktosaminidázy z gelové filtrace. B. a-A-acetylgalaktosamímdázová a α-galaktosidázová aktivita měřená v jednotlivých eluovaných frakcích.

Obrázek 3: Stanovení základních enzymatických vlastností rekombinantní a-V-acetylgalaktosaminidázy jako jsou hodnoty K_m a V_inax.

Obrázek 4: Stanovení pH optima a oblasti pH, kde rekombinantní a přirozeně izolované a-N~ acetylgalaktosaminidázy vykazují enzymatickou aktivitu, α-V-acetylgalaktosaminidáza izolovaná z vláknité houby Aspergillus niger (--·--), rekombinantně připravená a-V-acetylgalaktosaminidáza podle předloženého technického řešení (—·—).

Příklady provedení

Příklad 1

Produkce rekombinantní aktivní α-V-acetylgalaktosaminidázy v kvasinkovém expresním systému

Saccharomyces cerevisiae

1.1 Příprava cDNA a expresního vektoru

Celková RNA byla izolována z vláknité houby Aspergillus niger pomocí RNeasy Plant Mini Kit (QIAGEN). Tato celková RNA byla použita jako templát pro syntézu cDNA s využitím reverzní transkritázy SuperScript III (Invitrogen). DNA fragmenty kódující aktivní formu alťa-V-acetyl40 galaktosaminidázy byly amplifikovány pomocí PCR amplifikace s využitím páru specifických oligonukleotidových primerů (SEKV. ID. Č. 3 a SEKV. ID. Č. 4) následujících sekvencí:

5' - ttat tet aga atg ggt ttc aac aat tgg gcc ege - 3'

5' - att gaa ttc tta gcc atc cct ctc ata aag aca ega ctt - 3'

PCR amplifikace probíhala v reakční směsi o objemu 50 μΐ o následujícím složení: 5 μΐ lOx kon-4CZ 24089 Ul centrovaného ThermoPol reaction buffer (New England Biolabs); 1 μΐ lOmM dNTPs; 2 μΐ každého primeru; 1,5 μΐ síranu hořečnatého; 1 μΐ templátové cDNA připravené výše zmíněným postupem; 37,5 μΐ sterilní deionizované vody; 0,5 μΐ Deep Vent Polymerasy (2 U/μΙ). S takto připravenou směsí bylo provedeno 30 cyklů PCR amplifikace, dle standardního protokolu s 30 sekundovým nasedáním (annealing) příměrů na templátovou DNA pri teplotě 50 °C a dvou minutovou polymerací pri teplotě 72 °C.

Vzniklý PCR produkt byl separován pomocí agarosové elektroforézy, po které následovala purifikace amplikonu přímo z gelu pomocí komerčně dostupných souprav (Genomed). Po izolaci byl amplikon štěpen restrikčními endonukleázami Xbal a EcoRI (New England Biolabs) a takto připravený DNA fragment byl opět podroben separaci na agarosové elektroforéze, izolaci a purifikaci z agarozového gelu. Stejným způsobem byl připraven expresní vektor pYES-2CT.

Základní postupy molekulární biologie, které byly použity, jsou odborníkům známy a jsou popsány například v publikaci: Sambrook J, Russel DW. Molecular cloning: A laboratory Manual. Cold Spring Harbor, Laboratory Press, New York, 2001, 3^rd Edition.

Následovala ligační reakce, která probíhala 16 hodin pri laboratorní teplotě. Objem ligační směsi byl 20 μΐ, reakční směs obsahovala cca 50-100 ng linearizovaného expresního vektoru a stejné množství DNA fragmentu; 2 μΐ lOx koncentrovaného ligaČního pufru pro T4 DNA ligázu (Fermentas); 1 μΐ T4 DNA ligázy (5WeissU/gl) (Fermentas). Celý objem ligační směsi byl následně použit pro transformaci kompetentních buněk E. coli BL21-DE3 (Stratagene) a byla provedena velkokapacitní izolace plasmidové DNA pomocí komerčně dostupných souprav (Genomed). Pro ověření kvality plasmidové DNA byla provedena automatická DNA sekvenace. Sekvence cDNA byla následující (SEKV. ID. Č. 2):

atgggtttcaacaattgggcccgcttcatgtgcgacctcaacgagaccctgtttaccgag 60 actgccgatgcgatggctgctaacggtctgcgggacgcaggctacaatcgcatcaatctg 120 gatgattgctggatggcttatcagcgatccgacaatggatccctacggtggaacacgact 180 gagttcccacacggcctgccttggctagctcaatatgtcaaagccaaagggtttcatttt 240 ggaatctatgaagattctggcaacatgacttgtggcggataccccggatcctacaaccac 300 gaggagcaggacgccaacacctttgctttatgggggattgactatctcaagctcgacggt 360 tgcaacgtctacgcaacacaaggtaggacactcgaggaggaatacaagcaacgctacgga 420 cattggcaccaagtcctcagcaagatgcagcacccactgatcttctccgagtcagccccg 480 gcatacttcgcgggcacagacaacaacacagactggtacaccgtgatgaactgggtcccg 540 atctacggggagctggcccgccattctaccgatatcctggtgtacagtggagcaggtagc 600 gcatgggacagcattatgaataactacaactacaacactcttcttgcgcgctaccagcga 660 ccggggtatttcaatgatcctgattttctgatcccggatcatcctggcctgacggcggat 720 gaaaagcgatcgcattttgcactgtgggcttctttctcggctccacttattatcagtgct 780 tatatacctgcactttcgaaggatgagattgccttcttgacgaacgaggcattgattgcg 840 gtgaatcaggatcccctggcccagcaggccacgtttgcgagccgcgataacacactggat 900 atattgacgcgtaatctggcaaacggcgacaggctgctgacggtgcttaataagggaaac 960 acaactgtaacgagggacattcccgtacaatggttgggtcttacagagactgactgtaca 1020 tacacggccgaggatctctgggatggcaagacccagaagatcagcgaccatataaagatt 1080 gaactagccagccatgcgacagcagtcttccggctcggtcttccgcagggttgttcctcg 1140 gtagtgccaacgggacttgtcttcaacacagcatcgggcaattgtctgaccgctgcctca 1200 aattcttcagtcgcatttcagtcctgcaatggagagacctctcagatctggcaggtgaca 1260 ctgtcaggagtcattcgtccagtatcgcagaccacacaatgcttggctgctgatggaaac 1320 tcagttaagctgcaagcatgtgacagcacggatagcgacggccagaactggacgtatgca 1380 gtcacgggaaatttaaagaatgcgaagacagatggttgcctgactgagggatcagtgcag 1440 atgaagtcgtgtctttatgaga

-5CZ 24089 Ul

1.2 Příprava aktivního rekombinantního enzymu

Expresní plasmid byl vnesen do kvasinkových buněk Saccharomyce cerevisiae W303 metodou eiektroporace. Podmínky elektroporace byly 25 pF; 22 ns; 1,2 kV; elektroporace byla provedena na přístroji MicroPulserTM Electroporator (Bio-Rad). Takto připravené transformované buňky byly rozsety na Petriho misky s SC selektivním médiem neobsahujícím uráčil a s přídavkem adeninu a aminokyselin tryptofanu, leucinu a histidinu. Z takto připravených transformantů byl vybrán produkční klon, kterýje použit při inokulací 15 ml SC selektivního média obsahujícím 2% glukosu, tryptofan, leucin, adenin a histidin, neobsahujícím však uráčil který zde slouží jako selekční markér. Buněčná suspenze byla kultivována 12 hodin, při 30 °C při intenzivním třepání 240 ot./min. Buněčné pelety byly odstředěny centrifugací 5OOOg/5min a resuspendovány ve 200 ml SC média obsahujícím 2% galaktózu, tryptofan, leucin, adenin a histidin, neobsahujícím však uráčil. Tato buněčná kultura byla kultivována 72 hodin při 30 °C, 240 ot./min.

1.3 Izolace α-V-acetylgalaktosaminidázy z kvasinkových buněk

Po ukončení inkubace byla biomasa odstředěna centrifugací a resuspendována v 10 ml lyzačního pufru obsahujícím 50mM citrát-fosfát (pH 3,5), 5% glycerol, lmM PMSF a lmM dodecyl maltosid. Dále byla ke směsi přidána skleněné kuličky o průměru r = 0,25-0,5 mm (Pierce), které slouží k mechanickému rozbití buněčných stěn kvasinek. Celá směs byla 1 minutu vortexována a jednu minutu ponechána na ledu. Tento proces byl opakován pětkrát. Po ukončení izolace byla směs odstředěna centrifugací, peleta byla odstraněna a supematant obsahující aktivní a-.V-acetylgalaktosaminidázu byl použit pri purifikaci.

1.4 Purifikace rekombinantní a-V-acetylgalaktosaminidázy

Pro purifikaci byl použit HPLC systém BioSys (Beckman-Coulter) s UV detekcí. Buněčný lyzát vzniklý v kroku 1,3 byl naředěn 60 ml solventu A (1M NaCl in 50mM citrát-fosfát pufr, pH 3,5) a suspense byla centrifugována pri 18000 ot./min., 30 min. pri 4 °C. Buněčný extrakt byl nestříknut na kolonu Phenyl-Sepharose HR (2,6 ^x 10,6 cm, Merck) ekvilibrovanou v solventu A. Enzym byl eluován použitím lineárního gradientu 0-1M NaCl, 90 min pri průtoku 2 ml/min. Frakce obsahující a-V-acetylgalaktosaminidázovou aktivitu byly spojeny a převedeny do pufru C (20mM citrát-fosfát, pH 4,5). Převod byl proveden pomocí ultrafiltračních kolonek Amicon Ultra 10 kDa (Millipore). Pomocí stejných kolonek byl objem frakcí snížen na cca 2 ml. Takto připravený roztok obsahující aktivní enzym byl nanesen na kolonu S-Sepharose FF (1,6 * 12,5 cm, Merck), ekvilibrovanou v pufru C. Enzym byl eluován lineárním gradientem 0-1M NaCl, 60 min při průtoku 1 ml/min. Získané frakce obsahující enzymovou aktivitu byly zakoncentrovány opět pomocí ultrafiltračních kolonek Amicon Ultra 10 kDa (Millipore) na objem cca 100 μΐ. S takto připraveným vzorkem byla provedena gelová filtrace jako poslední krok purifikace a-V-acetylgalaktosaminidázy(obr. l,tab. 1).

Byla použita kolona Superdex 200 10/300 GL (1,0 x 30 cm) (Amersham Bioscience) ekvilibrovaná v 50mM Na-acetátovém pufru pH 3,6. Průtok mobilní fáze byl 0,4 ml/min. V jednotlivých eluovaných frakcích byla měřena α-V-acetylgalaktosaminidázová a α-galaktosidázová aktivita (obr, 2). Frakce vykazující enzymovou aktivitu byly uchovány pri 4 °C.

Koncentrace proteinu byla stanovena metodou dle Bradfordové s použitím standartu BSA. Poté byl protein zakoncentrován na cca 1 mg/ml s pomocí koncentračních kolonek Amicon Ultra 10 kDa (Millipore).

-6CZ 24089 Ul

Tabulka 1. Bilanční tabulka purifikace rekombinantní α-V-acetylgalaktosaminidázy exprimované v kvasinkovém expresním systému Saccharomyces cerevísiae

Stupeň	Protein (mg)	Aktivita (U)	Spec. aktivita (U mg'1)	Přečištění (násobek)	Výtěžno st /ft/ \
Buněčný extrakt	378,0	150,0	0,4	1,0	100
Phenyl-sepharose HR	31,4	102,3	3,3	8,3	68,2
S-Sepharose FF	12,8	81,0	6,3	15,8	54,0
Superdex 200	1,5	41,9	27,9	69,9	27,9

1.5 Stanovení enzymové aktivity α-V-acetylgalaktosaminidázová aktivita byla stanovena použitím 2mM o-nitrofenyl-2-acetamido2-deoxy-a-D-galaktopyranosidu (Sigma). Jednotka enzymové aktivity byla definována jako množství enzymu potřebné k uvolnění 1 pmol o-nitrofenolu za jednu minutu v 50mM citrát-fosfátovém pufru při pH - 3,5 a teplotě 35 °C. ReakČní směs byla inkubována při 35 °C, 10 minut, uvolněný o-nitrofenol byl stanoven spektroskopicky při vlnové délce 420 nm v alkalickém proio středí. Z reakční směsi bylo odebráno 50 μΐ a přidáno do 1 ml 0,1 M Na₂CO3. K sestrojení kalibrační přímky bylo použito 0~2mM o-nitrofenolu.

Bylo stanoveno pH optimum a oblasti pH, kde rekombinantní α-V-acetylgalaktosaminidáza podle předloženého technického řešení a přirozeně izolovaná α-TV-acetylgalaktosaminidáza vykazují enzymatickou aktivitu. α-V-acetylgalaktosaminidáza izolovaná z vláknité houby Aspergillus ni15 ger vykazovala při pH 6 již velmi nízkou aktivitu (přibližně 10 % maxima při pH 2), při neutrálním pH, konkrétně při pH 7 byla aktivita již zcela neměřitelná (nulová).

Naproti tomu rekombinantné připravená a-/Y-acetylgalaktosaminidáza podle předloženého technického řešení vykazovala v rozmezí pH 6 až 8 α-JV-acetylgalaktosaminidázovou aktivitu na úrovni 15 až 30 % (při pH 7 přibližně 20 %) vzhledem k maximu, kterého je dosaženo přibližně při pH 2 (obr. 4).

1.6 Identifikace rekombinantního enzymu

Identifikace α-V-acetylgalaktosaminidázy byla provedena metodou peptidového mapování pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF (Bruker), Vzniklé tryptické fragmenty byly porovnány s databází v programu Mascot (Matrix Science) a byla potvrzena identita enzymu, který má následující sekvenci aminokyselin (SEKV. ID. Č. 1):

MGFNNWARFMCDLNETLFTETADAMAANGLRDAGYNRINLDDCWMAYQRSDNGSLRWNTT 6 0

EFPHGLPWLAQYVKAKGFHFGIYEDSGNMTCGGYPGSYNHEEQDANTFALWGIDYLKLDG 12 0

CNVYATQGRTLEEEYKQRYGHWHQVLSKMQHPLIFSESAPAYFAGTDNNTDWYTVMNWVP 18 0

IYGELARHSTDILVYSGAGSAWDSIMNNYNYNTLLARYQRPGYFNDPDFLIPDHPGLTAD 24 0

EKRSHFALWASFSAPLIISAYIPALSKDEIAFLTNEALIAVNQDPLAQQATFASRDNTLD 300

ILTRNLANGDRLLTVLNKGNTTVTRDIPVQWLGLTETDCTYTAEDLWDGKTQKISDHIKI 3 60

ELASHATAVFRLGLPQGCSSWPTGLVFNTASGNCLTAASNSSVAFQSCNGETSQIWQVT 42 0

LSGVIRPVSQTTQCL₁AADGNSVKLQACDSTDSDGONWTYAVTGNLKNAKTDGCLTEGSVQ 48 0

MKSCLYE

-7CZ 24089 Ul

Výtěžek z 1 litru buněčné suspenze se pohyboval přibližně okolo 1,5 mg aktivního enzymu se specifickou aktivitu 28 U/mg.

Příklad 2

Stanovení enzymové kinetiky reakce rekombinantní a-TV-acetylgalaktosaminidázy

Měření enzymové kinetiky bylo prováděno diskontinuálně. Jako substrát byl použit roztok oNPα-GalNAc o pěti různých koncentracích (0,5mM; 0,7mM; lmM; 2mM; 5mM). K reakční směsi bylo vždy přidáno 5 μΐ roztoku rekombinantní a-7V-acetylgalaktosaminidázy o koncentraci 0,1 mg/ml a 50 μΐ roztoku substrátu. Takto připravená reakční směs byla inkubována při 35 °C za stálého třepání. Probíhající enzymová reakce byla zastavena v šesti odlišných časech (0 min; to 2 min; 4 min; 6 min; 8 min; 10 min) přidáním 150 μΐ 1M Na2CO₃ do reakční směsi. Naměřená data byla vyhodnocena s využitím programu Enzfitter, Byla určena hodnota Michaelisovy konstanty pro οΝΡ-α-GalNAc a hodnota limitní rychlosti enzymové reakce (obr. 3).

Průmyslové využiti

Rekombinantní enzymaticky aktivní α-V-acetylgalaktosaminidáza se uplatní při přeměně krev15 nich skupin typu A na krevní skupinu typu H(0) univerzální dárce, při výrobě krevních derivátů. Dále se tento rekombinantně připravený enzym může použít při syntéze oligosacharidových či polysacharidových řetězců. Takové sacharidové struktury mohou být použity v mnoha průmyslových odvětvích (farmaceutický, potravinářský, chemický průmysl). Vzhledem k duální aktivitě aV-acetylgalaktosaminidázy je možno tento enzym použít jako modelový protein vykazující a20 galaktosidázovou aktivitu v oblasti nízkého pH.

Claims (6)

1. NÁROKY NA OCHRANU

   L Rekombinantní α-jV-acetylgalaktosaminidáza s duální α-galaktosidázovou aktivitou z α-jV-acetylgalaktosaminidázovou aktivitu ph neutrálním pH.

   to i Rekombinantní α-V-acetylgalaktosaminidáza podle nároku 1 projevující při pH 6 až 8 a-Nacetylgalaktosaminidázovou aktivitu v úrovni 30 až 15 % vzhledem k maximální aktivitě při pH
2. 2.
3. 3. Rekombinantní α-A-acetylgalaktosaminidáza podle nároku 1 nebo 2 projevující při pH 7 aA-acetylgalaktosaminidázovou aktivitu v úrovni 20 % vzhledem k maximální aktivitě při pH 2.

   15
4. 4. Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci a-W-acetylgalaktosaminidázy podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3.
5. 5. Izolovaná molekula nukleové kyseliny podle nároku 4, kterou je DNA mající nukleotidovou sekvenci uvedenou jako SEKV. ID. C. 2,
6. 6. Dvojice oligonukleotidů sestávající ze sekvencí SEKV. ID. Č. 3 a SEKV. ID. Č. 4.