CZ238796A3 - Pharmacological preparation containing oligosaccharide and the use of such oligosaccharide - Google Patents

Description

Oblast techniky σ

o

C/X

- o. cc J oc ί σ; : oc co o<

Vynález se týká farmakologických přípravků obsahujících jako účinnou látku oligosacharid a použití těchto oligosacharidů pro přípravu farmaceutických prostředků pro modulaci aktivity efektorových buněk imunitního systému, zejména modulaci komponent imunitního systému.

Vynález je založen na identifikaci ligandů, specielně sacharidových ligandů, pro receptory nalezené na povrchu buněk důležitých v imunitní odpovědi, které zahrnují receptory NKR-P1 a CD69. Mono- a oligosacharidy, jak se ukazuje, jsou schopné inhibovat nebo aktivovat efektorové buňky v závislosti na tom, zdali jsou monomerické (volné) nebo zesíťované (sdružené).

Dosavadní stav techniky

Přirozené zabíječské (NK) buňky jsou cytotoxické lymfocyty, které jsou schopné lyžovat různé cílové buňky, včetně nádorových buněk, viry nebo intracelulárními bakteriemi infikované buňky (12). Úloha NK buněk v imunitním systému se neomezuje pouze na buněčné zabíjení. NK buňky mají receptory pro I. třídu MHC na svém povrchu, a jsou schopny rozpoznávat obojí autologní a allogenní alely I. třídy (63), což ukazuje na jejich úlohu v rozpoznávání změn v konformaci antigenů I. třídy, které mohou být přítomny například během virové infekce. Pomocné T buňky a antigen-prezentující buňky restringované MHC II.třídy nejsou vyžadovány NK buňkami -umožňují pravděpodobnou detekci patologických změn v buňkách většiny tkání, včetně hemopoetických a endotheliálních buněk.

Aktivace buněk NK probíhá nejen při cytotoxicitě, ale rovněž při sekreci cytokinů, zvláště gama-interferonu (IFN-gama), granulocyto-makrofágového kolonie-stimulujícího faktoru (GMCSF) a nádory nekrotizujícího faktoru (12). IFN-gama a GM-CSF lze zahrnovat mezi aktivátory fagocytujících buněk významných v zánětu a aktivaci antigen-prezentujících buněk. NK buňky hrají významnou úlohu v modulaci antigen-specifické odpovědi pomocných a cytototoxických T buněk (65). Skutečně jak shrnul Trinchieri (63), časná odpověď NK buněk během infekce má významný účinek na charakteristiku probíhající antigen-specifické adaptivní imunitní odpovědi, a je vyžadována k optimální odpovědi pomocných (TH1) typu I buněk. Modulace NK buněčné aktivity může tudíž mít výrazný účinek nikoliv jen na přirozenou imunitní odpověď, ale také v antigen-specifických odpovědích.

Porozumnění biologické úloze různých oligosacharidů glykoproteinů, proteoglykanů a glykolipidů sehrává význam v bunčné biologii. Práce s monoklonálními protilátkami ukázaly, že jsou zásadní změny v obraze oligosacharidů na povrchu buněk během embryonálního vývoje a buněčné diferenciace, a že tyto změny jsou předvídány při malignitě^1,2. Vznikly úvahy, že takové oligosacharidy (mezi než patří krevně skupinové antigeny a příbuzné sekvence) mohou mít významné úlohy při buněčné migraci nebo při odpovědi na různé mikropodmínky (1,3,4).

Nyní narůstá znalost o proteinech , které mají domény s předpokládanou sacharidy vázající aktivitou v závislosti na aminokyselinových sekvencích. Prominentní mezi těmito proteiny je lektinová rodina C-typu charakterizovaná přítomností jedné nebo více doménami, které se podobají sacharidy rozpoznávající doméně (CRD) jaterního receptoru pro asialoglykoproteíny (5). Různí členové této proteinové rodiny jsou nyní známy vazbou sacharidů (6). Mezi ně zvláště patří proteiny umožňující adhesi leukocytů k endotheliu, selektiny (7,-9), které hrají stěžejní úlohy v leukocytárním prostupu krevní stěnou a obnově při zánětu a většinou jistě hrají úlohu v rozsevu nádorových buněk krevní cestou.

Proteiny lektinové rodiny C-typu byly popsány u přirozených zabiječských (NK) buněk (10,11). Lektinové proteiny C-typu na NK buňkách jsou dimérního typu, (transmembránové proteiny typu II), obsahující extracelulární motif společný CRD známých lektinů C-typu. Dále mají oblast stopky a cytoplasmatickou část obsahující tyrosinové a serinové zbytky, které jsou potenciálními fosforylačními místy a tetrapeptidový motif, který je u T lymfocytárních glykoproteinů CD4 a CD8. Zprostředkuje asociaci s protein-tyrosin kinásou p56 ^lck (refs 13,14). Do dneška však vazba oligosacharidů k těmto lektinovým proteinům nebyla popsána a protože proteiny byly zařazeny do skupiny V , s chybějícím Ca ²⁺ vázebnýnm motivem , majícím zcela odlišné sekvence. Schopnost vazby oligosacharidů byla zpochybněna (5).

Jako jeden z prvních těchto proteinů,který byl klonován a sekvenován je potkaní NKR-P1 protein (15)- různé isoformy se objevují na potkaních a myších NK buňkách (16,17) . Podobné proteiny se objevují na lidských NK buňkách (10, 11). Protilátky vázající se k NKR-P1 na povrchu NK buněk mohou indukovat na protilátkách závislou cytotoxicitu FcR⁺ cílových buněk (18) ( via Fc částí protilátky - tzv. “ opačně směrované zabíjení”) a překřížení NKR-P1 protilátkami stimuluje přeměnu fosfoinositolů a mobilizaci intracelulárního kalcia (19). Kaskáda dějů vedoucí k zabíjení zahrnuje tvorbu konjugátů s cílovými buňkami, vznik inositolbifosfátu (lnsP₂) a vzrůst volného cytoplasmatického kalcia v zabiječské buňce před uvolněním póry tvořícím proteinem a cytotoxickými faktory uvolňovanými z intracelulárních granulí (12, 19, 20).

CD69 (Schwarting a spol. 1989, Testi a spol. 1994 a Ziegler a spol. 1994a) je buněčná povrchová molekula, homodimér s podjednotkami 26-34 kDa, která je in vivo konstitutivně exprimována na aktivovaných lymfocytech jako CD3^br'^9ht thymocytech, T buňkách, podobně na krevních monocytech, epidermálních Langerhansových buňkách, kostně dřeňových myeloidních buňkách a destičkách. Jinak exprese CD69 může být indukována po stimulaci většiny buněk hematopoetického původu. Protože existuje široká distribuce CD69 a jeho schopnost podněcovat vznik intracelulárních signálů, lze předpokládat, že protein má obecnou úlohu v biologii hematopoetických buněk včetně buněčné aktivace a diferenciace. Může působit jako společný buněčný spouštěč (57). Jak bylo řečeno, definice CD69 ligandu a požadavky na jeho expresi mohou odkrýt molekulární interakce obecné platnosti pro aktivaci a funkci hematopoetických buněk (57).

Molekulární klonace (Hamann a spol. 1993, Lopez-Cabrera a spol. 1993, Ziegler a spol. 1993) prokázala, že CD69 je transmembránový protein typu II s molekulární hmotností 22, 559 Da a karboxy- terminální oblastí, která se podobá sacharidyrozpoznávajícím doménám Ca²⁺ - závislým (C-typu) živočišným lektinům. Dimerické proteiny tohoto typu byly označeny jako lektinová skupina V (5), která zahrnuje vedle přirozených zabiječů (NK) asociované proteiny, NKR-P1, Ly-49 a NKG2 (Chambers a spol. 1993, Yokoyama a Seaman 1993).

CD69 se však odlišuje od těchto proteinů svou krátkostíchybí mu “stopková “ oblast, která intervenuje mezi transmembránovou a “krční “oblastí lektinové domény. Mapování chromosomu ukázalo, že u obou myší a lidí, je gen pro CD69 spojen s oblastí u myší nazvanou jako NK genový komplex a lektiny C-typu jsou exprimované především na buňkách NK (Yokoyama a spol. 1990). A tak u myší CD69 gen patří k distální části chromosomu 6 patřícího k NKR-P1 a Ly-49 genovým rodinám (Yokoyama a spol.1990, Ziegler a spol. 1994b). U lidí je gen řazen k chromosomu 12, který je obdobou distální části myšího chromosomu 6. Analysa CD69 genu poukázala na jedinou kopii v kontrastu s genovou rodinou, která existuje pro NKR-P1 a Ly-49. (Santis a spol. 1994, Ziegler a spol. 1994b).

Ligandy pro CD69 nebyly dříve známy. Antigen CD69 byl zařazen ke skupině V, C-typu lektinů, byly však pochybnosti o jeho schopnosti vázat oligosacharidy (5).

V in vitro experimentech, v kterých lymfocytární CD69 byl překřížen CD69 protilátkou, byly zaznamenány různé účinky (jestliže lymfocyty byly nejprve stimulovány forbol -miristát acetátem, stimulátorem proteinkinásy C): (a) lidské buňky T, buňky B a thymocyty byly indukovány k proliferaci, (b) u thymocytů došlo k stimulaci proliferace a stimulace exprese genů kódujících interleukin-2, interferon-gama (58, 59), faktor nekrotizující nádory alfa (60). Z ostatních pokusů byla získána znalost, že CD69 na aktivovaných buňkách T , po kontaktu s monocyty podporuje stimulaci produkce interleukinu- 1 beta v monocytech .(61,62). Zdá se tedy, že propojení CD69 na T lymfocytech s ligandy může na jedné straně stimulovat proliferaci a produkci cytokinů v téže buňkách a na druhé straně stimulovat buňky nesoucí ligandy patřící k CD69 jako monocyty , k produkci vlastních cytokinů.

U destiček a cirkulujících monocytú, kde dochází ke konstitutivní expresi CD69, propojení CD69 s protilátkami umožňuje aktivaci cytosolické phospholipásy A2. Tato cesta vede ke vzniku oxidovaných metabolitů arachinodonové kyseliny. Tak vzniká propojení s cestou navozující trombostazi destiček (srážecí mechanismus) a také alergické stavy (aktivace monocytů).

Jak bude ještě dále uvedeno, ukázali jsme, že CD69 a NKR-P1 jsou lektiny, které jsou těsně propojeny v přirozených zabiječských procesech. Identifikace ligandů pro CD69 a NKR-P1 má tedy široké uplatnění nejen pro modulaci buněčně-zabíjecí aktivity, ale také pro modulaci produkce cytokinů, a tak v protizánětlivém a imunomodulačním lékovém uspořádání.

Početné lektinové molekuly této rodiny jsou známy na lidských lymfocytech, např. na B lymfocytech, monocytech a přidružených buňkách (5,11). Sacharidové ligandy, případně syntetické napodobující nebo nahrazující tyto, mají tudíž význam jako terapeutické látky pro stimulaci nebo inhibici přirozeného zabíjení, cytotoxicitu zprostředkovanou buňkami T a ostatní vzájemné buněčné interakce. Mezi ně patří B-T buněčná interakce, nebo T buněčná- B buněčná interakce s akcesorními buňkami o nichž je známo, že hrají významnou úlohu v imunitní odpovědi.

Předložený vynález v různých aspektech dokládá, že je založen na získaných výsledcích (jak doloženo dále) včetně následujících signifikantních nálezů:

Na poznatku, že NKR-P1 a CD69 jsou přímo zapojeny v přirozených zabíjecích (NK) procesech.

Ryan a spol. (19) dříve ukázali, že protilátkou způsobená agregace NKR-P1 na buněčném povrchu NK buněk vede k stimulaci fosfoinositolového metabolismu s nárůstem intracelulárního kalcia, ale neurčili úlohu proteinu v přirozeném zabíjení. Protilátka neblokuje přirozené zabíjení YAC-1 cílových buněk a fosfoinositolový metabolismus navozený těmito cílovými buňkami. Autoři uzavřeli nález tvrzením, že zabíjení buněk YAC-1 nezahrnuje NKR-P1. Zde je ukázáno, že se tak děje.

Také je zde ukázáno, že exprese CD69 antigenu je v přirozeném zabíjení časná, rychlejší než následuje nová syntéza proteinu. Zabíjení NKje neinhibovatelné CD69 proteinem.

Nález ligandů pro NKR-P1 a CD69.

Některé z nich jsou velmi vysoké afinity, s hodnotami IC50 od 10'⁹ do10'¹² M.

Přítomnost lektinu-podobné domény na NKR-P1 byla popsána (15). Schopnost vazby monosacharidů N- acetylgalakto saminového, N-acetylglukosaminového typu a fukózy (ICso hodnoty 0.6 χ 10'⁷ , 2x 10 ⁷, 2x 10 '^θ M) je popsána v nedůležité publikaci uvedené zde (21). Nyní identifikované mono- a oligosacharidy mají afinity, které jsou od stokráte do stokrát tisíců větší.

Předpokládaná sekvence proteinu CD69 je pro lektin podobnou molekulu (54-56), ačkoliv sacharidy vazebná místa proteinu ještě nebyla popsána. Jinde je ukázáno, že CD69 je lektin se sacharidovou - vazebnou specificitou, která se překrývá s NKR-P1. Disacharidy heparin a chondroitin sulfát (viz tabulka 2) jsou vysoko-afinitní ligandy pro oba proteiny NKR-P1 a CD69. Disacharid keratan sulfát a ukázané O-glykosidované disacharidy jsou zvláště vyhovující pro CD69.

Je uvedeno zjištění, že oligosacharidová struktura chondroitin sulfátového typu a O- glykosidické typy jsou ligandy pro CD69 na NK- vnímavých cílových buňkách.

Monomérní (“volné”) mono- a oligo-sacharidové ligandy inhibují přirozené zabíjení a inhibují aktivaci buněk NK (zjištěno nárůstem hladiny fosfoinositolů a volného cytoplasmatického kalcia).

Zde jsou uvedeny výsledky inhibice zabíjení cílových buněk přirozenými zabiječskými buňkami. Podobné výsledky byly získány při použití ligandu pro NKR-P1 a ligandů pro CD69.

Určité, zde popsané sacharidy (např. GM2 (27)) ukazující na interakci s NKR-P1, jsou přítomny na NK-vnímavých cílových buňkách, a bylo ukázáno, že inhibují přirozené zabíjení (např. heparin (34), luquoid (53) a mannoso-6-fosfát (36)). Avšak, nebylo známo jak tyto sacharidy jsou do procesu zapojeny. Většina inhibičních látek jsou velké molekuly, s výjimkou mannoso-6-fosfátu a ostatních fosforylovaných a sulfátovaných monosacharidů. Výzkum zaměřený na úlohu mannoso-6fosfátu v přirozeném zabíjení byl v počátku opuštěn z důvodu neznámého mechanismu působení.

Sdružené mono- a oligo- sacharidové ligandy aktivují NK buňky (zjištěno nárůstem fosfoinositolů a volného cytoplasmatického kalcia).

Sdružené ligandy na liposomech aktivují buňky NK. Výsledek aktivace je v závislosti na densitě. Podobné výsledky byly získány užitím ligandů pro NKR-P1 a ligandů pro CD69,

Je zvláště překvapivé, že výhradně negativní nebo positivní signály mohou být vyvolány v závislosti na mono- nebo oligomérním stavu oligosacharidů (tj.jsou-li volné nebo sdružené).

NK-resistentní buňky jsou “udrženy” jako NK-vnímavé opracováním sdruženými sacharidovými ligandy pro NKR-P1 nebo

CD69 (předvedeno užitím liposomů).

Zabíjení jiných resistentních buněk je nejvíce zvýšeno, jsou-li liposomy užity k opracování buněk před exposicí NK buňkám.

Podstata vynálezu

Předmětem předloženého vynálezu je metoda modulace aktivity efektorových buněk imunitního systému, jež spočívá v kontaktování buněk s monosacharidem nebo oligosacharidem , kam patří glykosaminglykanové oligosacharidy, sulfátované gangliosidy jiné než sulfatidy, 6- sialyl hexosy nebo 3-0sulfátovaná uronová kyselina.

Oligosacharid je s výhodou keratan sulfát, chondroitin sulfát nebo heparin sulfát. Preferované oligosacharidy zahrnují K6, Chon OS, 6S, 2,6S a 2,4,6S a Hep IVA, IIA a IS, HNK1,6SN,S2,6SLN,S2,a SN.

Oligosacharidy, které mohou být užity v modulaci aktivity přirozených zabiječů (NK) zahrnují takové látky, jež obsahují glykosaminglykanový oligosacharid, sulfatid, sulfatovaný gangliosid jiný než sulfatid, 6-sialyl hexosu nebo 3-0-sulfátovanou uronovou kyselinu, tetramannosový fosfát, pentamannosový fosfát, sialyl- nebo sulfátovaný- Le^a nebo Le* , HNK-1 ,HNK-3-5-uronovou kyselinu.

Tyto mohou být vybrány z keratan sulfátů, jako je K6, S2, SN, ST, chondroitin sulfáty, jako je ChonSO₃ 0S/6S, 2,6S a 2,4,6S, Heparinové oligosacharidy, jako je HeplVA, IIA, IS a IS2.

Ostatní preferované ligandy, s funkčními znaky a vlastnostmi sdílenými s preferovanými ligandy a tak určujícími užitečné skupiny k zařazení k preferovaným ligandům, jsou snadno identifikovatelné specialisty - patří k zde objeveným. Na příklad, různé znaky (jak je ukázáno), jsou společné více než jednomu ligandu s vysokou afinitou pro NKR-P1 a/nebo CD69. Odborníci snadno určí takové, které jsou obsaženy v informacích zde podaných a použijí je pro označení nebo výběr dalších ligandů, které mohou být užity v souladu s předloženém vynálezem.

Preferované znaky monosacharidů a oligosacharidů zahrnují: alfa2-3 vázanou sialovou kyselinu, 3-0- sulfataci ,3-0sulfátovanou galaktosu, 3-, 4- nebo 6-0- sulfátovaný N- acetyl hexosamin, N-sulfátovaný hexosamin, uronovou kyselinusubstituovanou N-acetylhexosaminem nebo hexosaminem, 2- nebo 3-0- sulfátovanou uronovou kyselinou, alfa1-3 vázanou fukosu, alfa1-4 vázanou fukosou, alfa2-6 vázanou sialovou kyselinu, alfa

2-6 vázanou sialovou kyselinu na galaktose nebo na Nacetylhexose.

Jak je dále zde uvedeno, oligosacharid má krátký řetězec sacharidu, ve srovnání s polysacharidem. Preferované oligosacharidy jsou di-, tetra-, penta-, hexa- a hepta- sacharidy, a oligosacharidy větší délky, s výhodou méně než 25 zbytků. Jak je uvedeno “volné” nebo monomerní, tj. nespojené ligandy mohou být užity k inhibicí efektorové funkce, naproti tomu spojené ligandy mohou být užity k obohacení, posílení nebo nárůstu funkce.

Buňky na něž je efektorové (výkonná) funkce je zaměřena (myšleno na “cílové buňky”) mohou být opracovány monosacharidem nebo oligosacharidem a poté dále opracovány efektorovými buňkami. Opačně -prvně přidané efektorové buňky jsou opracovány monosacharidem nebo oligosacharidem. Opracování (předléčení) monosacharidem nebo oligosacharidem nebo opracování efektorovými buňkami může být nasměrováno k cílovým buňkám, například užitím další komponenty (člena specifického vazebného páru) - jako vazbou specifické protilátky nebo protilátkového fragmentu schopného vazby k antigenu, jako antigenu přítomného na povrchu cílových buněk.

Jak je uvedeno, sdružování může být dosaženo na liposomů, a liposom může zahrnovat první člen specifického vazebného páru (popsaného jako člen) schopného vazby komplementárního druhého člena specifického vazebného páru (tj. protilátky, nebo fragmentu protilátky).

Alternativně, jak je dále uvedeno, sdružování může spočívat na sekvenci aminokyselin, což může být část molekuly jako je protilátka nebo jiný člen specifického vazebného páru.

Aktivita modulovaná anti-proliferační látkou, (jinou aktivitou), cytotoxicitou a/nebo sekrecí cytokinu, nebo jiná výkonnou funkci buněk imunitního systému. Cytotoxicita může zahrnovat apoptický element, jak uvedeno, zvláště váže-li ligand CD69.

Nádorové buňky jsou preferenční cíl, stejně jako virově infikované buňky.

Opracování může být provedeno in vitro nebo in vivo.

Význakem předloženého vynálezu je také použití ligandu podle vynálezu při výrobě látek nebo léků pro opracování ( jak je uvedeno). Látky nebo léky pro užití k takovému opracování .

Dalším význakem předloženého vynálezu je metoda pro získání ligandy pro NKR-P1 a /nebo CD69. Zahrnují vybrané molekuly se schopností vazby k NKR-P1 a/nebo CD69 nebo fragment (např. rozpustný fragment) NKR-P1 a/nebo CD69, s výhodou molekuly, mající patřičnou schopnost. K selekci může být užita jakákoliv metoda přístupná odborníkovi v dané profesi, včetně těch, které jsou zde objasněné a mohou být přímé nebo nepřímé, tj. zahrnovat kompetici mezi testovanými molekulami a známým ligandem pro CD69 a/nebo NKR-P1.

NKR-P1 a/nebo CD69, nebo fragment NKR-P1 a /nebo CD69, může být označen.

Ligand získaný/vybraný v souladu s význakem předloženého vynálezu může být monosacharid nebo oligosacharid, a monosacharid nebo oligosacharid může být částí glykopeptidu, glykoproteinu, glykolipidu nebo proteoglykanu.

Následně po selekci ligandy NKR-P1 a/nebo CD69 za použití metody v souladu s předloženým vynálezem, ligand může být užit k modulaci aktivity efektorových buněk imunitního systému, jako NK buněk metodou zahrnující kontakt buněk s ligandem v souladu s jakoukoliv metodou zde uvedenou nebo jinak dostupnou odborníkovi v oboru.

Aspekty uedené podle předloženého vynálezu zahrnují metody modulace komponent imunitního systému, včetně stimulace a inhibice efektorové buněčné aktivity, jako je buněčnázabíjecí aktivita (cytotoxicita), (nebo jiná aktivita inhibující proliferaci cílových buněk), nebo sekrece cytokinú NK nebo jinými buňkami. Ligandy zde identifikované včetně mono- a oligosacharidů, mohou být užity v metodách léčby savců a v přípravcích pro použití využívající takové metody a mohou být užity při přípravě léků pro použití při takových metodách. Je pravděpodobné, že immunomodulační účinky mono- a oligosacharidů mohou být získány užitím syntetických napodobujících molekul, zvláště malých a negativně nabitých. Takové napodobeniny, (“mimicks or mimetics“) jsou zahrnuty v rámec předloženého vynálezu.

Alternativní návrh předloženého vynálezu se soustřeďuje na cílové buňky a užití ligandů jak je zde popsáno -označovat je jako cíle pro efektorovou funkci efektorových buněk, např. narušení. Opracování cílových buněk ligandem NKR-P1 a/nebo CD69 se může zvýšit nebo snížit (v souladu s význaky předloženého vynálezu) podle vnímavosti nebo resistence k efektorové funkce, například. anti-proliferačnímu účinku, sekreci cytokinů, cytotoxicitě. Takové opracování může nebo nemusí být zacíleno jakýkoliv způsobem uvažovaným v popise vynálezu.

Rozpustné formy NKR-P1 a/nebo mohou být užity v imunomodulaci v souladu s dalšími význaky předloženého vynálezu, včetně metod opracování lidského nebo živočišného těla, látek pro takové opracování a ve výrobě látek nebo léčiv pro takové opracování. Stejně in vitro metody, zvláště jak je doloženo na tomto místě pro různá zapojeni” používající mono- nebo oligosacharidy. Rozpustný NKR-P1 a/nebo CD69 může redukovat nebo inhibovat efektorovou funkci buněk imunitního systému, takových jako NK buněk. Vazba rozpustných proteinů k ligandům, (takovým) volným nebo sdruženým oligosacharidům v mediu nebo na povrchu buněk, může snížit množství ligandu schopného se vázat k NKR-P1 a/ nebo CD69 na povrchu efektorových buněk , a tudíž efektorové funkce může být snížena.

Látky a léky zahrnující rozpustný NKR-P1 a/nebo CD69 fragmenty, vytvořené nebo užité v souladu s různými význaky a provedeními předloženého vynálezu, mohou být vneseny a/nebo použity v principu jakoukoliv cestou a pro jakékoliv účely přiložené na tomto místě: např. v liposomech, směrované užitím členů specifických vazebných párů jako jsou protilátky a fragmenty protilátek, atd.

Imunomodulace podle předloženého vynálezu může být užita k opracování nádorů při rakovině jako solidní tumory a leukemie, například zabití leukemických buněk v autologních kostně dřeňových transplantátech před transplantací. Léčba hematologických (hemopoetických) vad, například leukopenie jako je aplastická anemie, kde NK buňky mohou být více aktivní v kostní dřeni, léčbě alergických stavů, zvláště autoimunitních onemocnění jako je revmatická arthritida, léčbě parasitárních onemocnění, opracování biologického materiálu např. tkání nebo krve, obsahující virově-infikované buňky, které mohou být zacíleny pro NK- zprostředkované zabíjení, a v prevenci nebo vylepšení nemoci štěpu proti hostiteli (GVH), např. opracováním štěpů před transplantací za účelem snížení aktivity NK buněk štěpu. Ostatní opracování směřující k imunomodulaci, zvláště v aktivaci nebo inhibici funkce efektorových buněk, (jako je cytotoxicita NK buněk), může být výhodou pro odborníky v oboru.

Aplikace předloženého vynálezu při onemocnění může zahrnovat: (1)- zavedení inhibice přirozeného zabíjení - nemoc štěpu proti hostiteli, onemocnění pojivové tkáně např. ztráta chrupavky, arthritida, onemocnění kůže, hematopoetická onemocnění, (2) zavedení inhibice apoptického zabíjení ischemické reperfuze při patologických stavech,např. spojených s koronárním srdečním onemocněním, srdečních operacích, periferní vaskulární poškození po traumatu, trombotická onemocnění/ hyperkoagulační stavy například při leukémiích nebo posttraumatech, epiteliální onemocnění například kožní onemocnění spojené s narušením buněk, pemphigus/pemphigoid, ostatní bulozní kožní léze (3) zavedení inhibice vzniku cytokinové kaskády při přirozených buněčných odpovědích zahrnující sepsi, revmatoidní arthritidu, plicní fibrózu, glomerulonefritidu , (4) zavedení inhibice cytokinové kaskády , které jsou spojeny se specifickou odpovědi zahrnující interakce jakýchkoliv monocytú, antigen-prezentujících buněk , B-lymfocytů, T-lymfocytů, buněk NK- včetně alergických stavů jako je astma a ekzém a ostatní zánětlivé choroby, autoimunitu, odhojení štěpu , hyperreaktivní stavy během léčby parasitárních onemocnění a TB, (5) zavedení inhibice cytokinové kaskády zahrnující epiteliální buňky a buňky zánětu, zahrnující zánětlivá onemocnění střeva, Crohnovu chorobu, ulcerativní kolitidu, psoriásu a glomerulonefritidu, (6) zavedení při NK vnímavosti cílových buněk, včetně prekancerózy, nádoru, solidní tumorů a leukémií, virových infekcí/ nosičových stavů, parasitárních infekcí.

Jak je ukázáno na tomto místě, NK buněčná cytotoxicita zahrnuje stimulaci apoptózy cílových buněk. Potenciální vylepšení užitím apoptické (“ programované “) buněčné smrti v terapii, například nádoru bylo již zaznamenáno. Viz, např. Levitzky, Eur.J. Biochem.226 : 1-13 (1994), který rozpoznal, že mnohé buňky v nádorech jsou klidové a nemnožící se. Takové buňky mohou uniknout chemoterapii zaměřené na proliferaci buněk, a poté se mohou začít dělit v intermisi léčby. Apoptózuindukující podněty mohou skutečně vést k zabití nedělících se buňěk a indukovat je k smrti. Schopnost zvýšit NK buněčně zprostředkovanou cytotoxicitu za pomoci ligand vyvolávajících apoptózu jak je zde doloženo, může být zvláště užitečné při terapii nádorů ( ačkoliv klinicky je nejlepší využití v kombinaci s protinádorovou terapii).

Na druhé straně, apoptóza byla indikována jako vedlejší efekt reperfuzního poškození, specielně reperfuzi k limitaci ischemické nekrose například myokardu, dále mrtvice nebo v játrech. Viz Gottlieb a spol., The Journal of Clinical Investigation 94: 1621-1628, (1994). A tak, schopnost inhibovat NK zprostředkovanou cytotoxicitu zahrnující apoptózu může být užitečné v zabránění poškození tkáně během reperfuse a za jiných situací.

Tam, kde NK nebo jiné efektorové buňky jsou nadmíruaktivní, inhibice mono- nebo oligo-sacharidového Iigandu může být užita. Na druhé straně, sdružování ligandů může být užito v ostatních situacích za účelem zvýšit NK nebo jinou funkci efektorové buňky, např. zabití nádorových buněk. Sdružování může být na liposomech, při opakujících se a/nebo větvených sekvencích preferenčně glykosylovaných míst uvnitř buněk, nebo užitím jakékoliv jiné vhodné techniky zřejmé těm, kteří jsou vzděláni v oboru. To je dále diskutováno.

Mono- a oligo-sacharidy, které jsou identifikovány na tomto místě jako ligandy pro NKR-P1 a/nebo CD69, pro některé z nich předtím nebyl ukázán žádný účinek ve smyslu léčebného využití, včetně keratanu a chondroitin sulfátů. Přítomný patent počítá s těmito látkami v procesu využití léčby lidského nebo živočišného těla. Ostatní, jak bylo ukázáno předešle mají nebo pravděpodobně mají některé lékařské indikace. Avšak předložený vynález poskytuje mono- a oligo-sacharidy a navrhuje je k novým účelům, zvláště v přípravě léčiv pro opracování za různých podmínek (vyjmenované výše) modulací funkce efektorových buněk prostřednictvím NKR-P1 a/nebo CD69. Ve výhodných provedeních, výkonná funkce NK buňky je modulována, např. stimulována (zvýšena) nebo inhibována (redukována). Výkonnou funkcí NK buněk může být cytotoxicita a /nebo produkce cytokinu.

Obecně, mono- a oligo-sacharidy využívané podle předloženého vynálezu zahrnují (nebo mají) následující strukturu:

A(v,w)- B(1,x) - C (1- y) - - D kde:

A je vybráno ze skupiny skládající se z vodíku, hexosy, kterou může být galaktosa nebo mannosa a může být substituována jedním nebo více nabitými částicemi, substituovanou sialovou kyselinou, alifatický řetězec s jedním nebo více větvenými částmi, nasycenou nebo nenasycenou uronovou kyselinou, která může být nahrazena jednou nebo více nabitými částmi, N-acetylglukosaminem .který může být nahrazen jedním nebo více nabitými částmi, a N-acetylgalaktosaminem, který může být nahrazen jednou nebo více nabitými částmi,

B může chybět nebo být vybráno ze skupiny skládající se z uronové kyseliny, která může být nahrazena jedním nebo více nabitými částmi, galaktósou, N-acetylglukosaminem, který může být nahrazen jedním nebo více nabitými částmi, alifatickým řetězcem .který může být nahrazen jedním nebo více nabitými částmi a oligosacharidovým řetězcem nebo 3 nebo 4 mannosovými zbytky,

C může chybět nebo být vybráno ze skupiny skládající se z urononové kyseliny, která může být nahrazena jedním nebo více nabitými částmi, galaktósou, glukosou, N- acetylglukosaminem, který může být nahrazen jedním nebo více nabitými částmi, a alifatickým řetězcem .který může být nahrazen jedním nebo více nabitými částmi,

D může chybět nebo být vybráno ze skupiny skládající se z jednoho nebo více opakování se B a/nebo C, zbývající strukturální komponenty N- bi- tri- nebo tetra-antenárních oligosacharidů, 0glykosidických oligosacharidů a glykosamino glykanů, a ostatních sekvencí sloužících k podpoře nebo presentaci ligandy;

v závorkách uvedená malá písmena representují posici vázaných uhlíků vyznačených sacharidů kde v= 1 nebo 2, w = 2,3,4 nebo 6 , x = 2,3 nebo 4, y = 2,3 4 nebo 6.

když A je nahrazená sialová kyselina, substituce mohou být N- acetyl nebo O- acetyl, když B nebo C je nahrazený alifatický řetězec, substituce mohou být vybrány z hydroxylu(ů), acetyl aminu (NH.COCH₃) a nabité části (í); a nabité části mohou být vybrány ze skupiny skládající se ze sulfátu, fosfátu a karboxylu, např. sialové kyseliny ( ostatní nabité skupiny mohou být použity).

Preferované mono- a oligo-sacharidy pro imunomodulaci via vazbu k NKR-P1 jsou ukázány v Tabulce 1, identifikovány a diskutovány na jiném místě. Preferované mono- a oligosacharidy pro imunomodulaci prostřednictvím vazby CD69 jsou ukázány v Tab 2 a identifikovány a diskutovány dále na jiném místě.

Mono- a oligo-sacharidy mohou být isolovány glykosidásovou digescí přirozených glykosaminglykanů, například užitím heparinás nebo chondroitinás, nebo chemickým uvolněním z mucinu typu glykoproteinů jako je hovězí submaxilární mucin, nebo mohou být chemicky syntetizovány jako kompletní sekvence nebo jejich části nebo jednoduché (minimální) analogy mající požadované nabité skupiny nebo minimální rozpoznávací elementy.

Pro inhibici výkonné funkce, mono- nebo oligosacharidy mohou být obecně “monomerické” nebo “volné” formy, například nikoliv část molekuly vykazující nebo nesoucí jiný mono- nebo oligo-sacharid schopný zvýšit nebo obohatit buněčnou aktivitu.

Na druhé straně, pro vzrůst nebo obohacení aktivity, mononebo oligo-sacharidy budou obecně (“ klastrovány” ) sdružovány, tak že se dosáhne vícečetnosti mono- nebo oligo-sacharidových molekul, které jsou presentovány efektorovým buňkám pomocí vehikula.

Sdružování může být dosaženo několika cestami. Např.

mono- nebo oligo-sacharidy mohou být sdružovány na povrchu liposomů. Skladba a tvorba nosičových lipidů se může měnit pro optimální zacílení na cílové buňky, které jsou v použití.

Poučeni v oboru jsou schopni vybrat nejlepší nebo vhodné liposomové složení pro jejich potřeby. Pro in vivo použití, může být žádoucí odebrat biopsii cílové tkáně (např. nádoru) pro in vitro analysu a určení vhodného liposomového složení.

Jako alternativa ke sdružování na liposomech může být užit polypeptid, zahrnující aminokyselinovou sekvenci, která je glykosylována hostitelskými buňkami při rekombinantní expresi polypeptidů. Kterákoliv živočišná buňka může být užita jako hostitelská za předpokladu, že hostitelská buňka poskytne nezbytnou glykosylaci k produkci glykoproteinu. Obecně, jaterní buněčné linie jsou zvláště vhodné, např. CHO buňky.

Například užití sdružených lysinů umožňuje konjugaci reduktivní aminací oligosacharidových ligandů s možností prezentace sdruženého stavu. Aminokyselinová sekvence mucinového typu, například sdružené šeřiny nebo threoniny, může být použita a modifikována in vitro nebo glykosylace provedena uvnitř buněčných linií exprimujících příslušné enzymy: GalNac transferasu a sialyltransferasy nebo sulfotrasferasy. Alternativně, aminokyselinové sekvence jako konsensus sekvencí Ser-Gly nebo Ser-Ala pro dekoraci s glykosaminoglykany může být užita (22, 64, a 67). Z nedostatku, jsou buňkami syntetizovány chondroitin sulfátové řetězce. Vymezující sekvence obsahující hydrofobní domény, které zlepšují biosyntezu heparin/heparan sulfátových řetězců (67).

Polypeptidy mohou na druhé straně být glykosylovány in vitro užitím glykosyltransferas.

Je nutno připomenout, že na tomto místě termíny “monosacharid“ a “oligosacharid” zahrnují příslušné neoglyko lipidy, napříkad vzniklé otevřením sacharidového kruhu, poté jeho připojením k aminolipidu reduktivní aminací, jak je uvedno dále.

Termín “oligosacharid” zahrnuje disacharid (což může být výhodné pro určité účely), tetrasacharid (znovu preferováno pro určitá zabudování), pentasacharid, hexasacharid, heptasacharid, oktasacharid a oligosacharidy nebo delší, ale s výhodou sacharidů nepřesahujících 50 zbytků, výhodnější pod 30 zbytků, a ještě více výhodný pod 20 zbytků a nejvýhodnější pod 15 zbytků. Na tomto místě je nutno zdůraznit, že za určitých okolností aktivita může narůstat s narůstajícícm počtem sacharidů (například narůstat v délce od disacharidu k tetrasacharidu).

V souladu s předloženým vynálezem, ligandy mohou být aplikovány jednotlivcům. Aplikace preferenčně jako “terapeuticky efektivní množství” je dostatečná k ukázce zlepšení stavu pacienta. Skutečně použité množství k aplikaci, rychlost a časové schéma aplikace, bude záležet na původu a odlišnostech léčených případů. Předepsání léčby, tj. rozhodnutí o dávce apod. spadá do odpovědnosti obecného praktika a ostatních lékařů.

Ligandy mohou být aplikovány samotně nebo v kombinaci s ostatními látkami, buď současně nebo postupně v závislosti na daných podmínkách.

Opracování buněk se sdruženou ligandou může posílit zabíjení NK buňkami, v případě normálních i NK-resistentních buněk.

Farmaceutické přípravky nebo léky podle předloženého vynálezu, a pro užití v metodách v souladu s předloženým vynálezem, mohou zahrnovat vedle ligandů, farmaceuticky akceptovatelnou náplň, nosič, ústojný roztok, stabilisér nebo jiný materiál známý dobře odborné veřejnosti. Takové materiály nesmí být toxické a nesmí křížově reagovat s účinkem aktivní složky. Přesná povaha nosiče nebo ostatního materiálu bude záviset na cestě podávání, která může být orální, nebo injekční, např. kožní, podkožní nebo intravenósní.

Farmaceutické přípravky nebo léky pro orální podání mohou být v tabletách, kapslích, prášku nebo tekuté. Tableta může obsahovat pevný nosič jako je želatina. Tekuté farmaceutické přípravky obecně zahrnují tekutý nosič jako je voda, surový petrolej, živočišné nebo rostlinné oleje, minerální nebo syntetické oleje. Dále - fysiologický roztok, zahrnuty mohou být dextrosa nebo jiné sacharidové roztoky nebo glykoly jako je ethylen glykol, propylen glykol nebo polyethylen glykol.

Pro injekce, aktivní ingredience bude ve formě parenterálně přijatelného vodného roztoku, který je apyrogenní a má přijatelné pH, isotonicitu a stabilitu. Ti, kteří jsou odborníky v oboru jsou schopni připravit vhodné roztoky užitím např. isotonických vehikul jako jsou injekce s chloridem sodným, Ringerovým, Ringer laktátem. Ochranné látky, stabilizéry, ústojné roztoky, antioxidativa a/nebo jiná aditíva mohou být včleněny podle požadavků.

Pro směrování efektu např. k nádorovým buňkám jako při leukémii, virově infikovaným buňkám apod., protilátky, fragmenty protilátek nebo jiné vazebné látky mohou být podány před nebo preferenčně simultánně s aplikací ligandu. Podání protilátek je rutinní a může obecně být uplatněno jak je výše uvedeno pro podání ligandu. Intravenósní aplikace je preferována např. v roztoku NaCI.

Jedna z cest směrování zahrnuje užití bispecifické protilátky nebo jiné vazebné substance schopné vazby na cílové buňky a efektorové buňky, například nádorové a NK buňky. A tak, inaktivní buňky NK mohou být “dopraveny” k nádorovému místu před aktivací podáním mono- nebo oligo-sacharidu. CD56 (antigen Leu19) je obecný znak NK buněk (66). Tento antigen chybí u červených krvinek, granulocytů, monocytů a podtřídy T lymfocytů, B buněk, thymocytů a krevních destiček .Může být přítomen na některých nervových a nádorových tkáních. Anti-CD56 specificita může tudíž být použita k zacílení NK buněk. Bi-nebo více- vazebné protilátky mohou být užity k upřednostnění výhod dvojí specificity anti-CD56 pro buňky NK a některé tumory k zacílení buněk NK k těmto tumorům.

Jiná cesta směrování užívá vazebné látky jako je protilátka (potřebuje být monospecifická) ve spojení s liposomem nebo jinou ligandu; nesoucím vehikulem, opakovaně pro sdružování mononebo oligo-sacharidu jak bylo diskutováno. Takový polypeptid může být svázán s protilátkou (např.) jako fúzní protein, vzniklý rekombinantní expresí po fúzi genu. Jestliže specificita protilátky je namířena proti cílovým buňkám, např. nádorovým buňkám, ligand ve spojení s vehikulem spouští nebo zvyšuje aktivitu kolujících buněk NK v okolí nádoru.

Jedna z cest připojení a vazby substance k ligandu (např. mono- nebo oligo-sacharidu); nesoucímu vehikulum, používá pár zprostředkující specifickou vazbu molekul, takových, které vazebná substance užívá v cílení a které jsou spojeny s ligandnesoucím vehikulem nepřímo, když zprostředkující specifické vazebné molekuly se vzájemně váží. Tedy, protilátka, nebo fragment protilátky, může být spojen (např. peptidovou vazbou jako výsledek exprese fúzního polypeptidů z chiméricky zakódované sekvence) s první zprostředkující specifickou vazebnou molekulou. K tomu dochází jakmile ligand nesoucí vehikulum je spojen (opět peptidovou vazbou, jestliže vehikulum je peptid nebo polypeptid), s druhou komplementární specifickou vazebnou molekulou, schopnou vázat se k první.

Zprostředkující specifické vazebné páry mohou být vybrány příkladně z párů známých pro užití u volných polypeptidů, včetně:

proteinová doména, která tvoří komplex s druhou (makro) molekulou jako je glutathion-S-transferása (Srnith a Johnson, (1988), Gene 67, 31-34)), hovězí pankreatický inhibitor trypsinu, BPTI (Borijin a Nathans, (1993) PNAS USA 90,337-341)), protein maltosu vázající, MBP (Bedouelle a Duplay (1988), Eur. J. Biochem. 171, 541-549)), Maina a spol. (1988) Gene 74, 365-373), a polypeptidová sekvence, která může být biotynylována a tak interagovat s avidinem nebo streptavidinem (Schatz (1993) Bio/Technology 11, 1138-1143), nebo kalmodulinem a molekulou schopnou vázat kalmodulin, jako je mastoparan, kalmidazolium nebo melatonin ( myšleno melatonin a kalmodulin mající nízký poločas disociace), nebo Troponin C a molekulou schopnou vazby k němu. Některé z těchto, nebo jiné možnosti, mohou být toxické a /nebo imunogenní in vivo, a tudíž méně výhodné pro podání jednotlivcům, i když mohou být vhodné pro in vitro použití.

Kalmodulin a Troponin C jsou na vápníku závislé vazebné proteiny a PCT/GB94/02420 objasnňuje fúzi těchto molekul k vazebným látkám jako je protilátka nebo fragment protilátky. Tyto fúze mohou vznikat expresí z chiméricky konstruovaného genu užitím standardních technik známých v odborné obci. Obě molekuly použité k fúzi, na vápníku závislý vazebný protein a specifická vazebná látka jako je protilátka, si zachovávají schopnost vázat se s příslušnými komplementárními členy vazebného páru. Podobně, PCT/GB94/02420 objasňuje spojení molekuly schopné vazby s proteinem závislým na vápníku (.např. mastoparan schopný vázat kalmodulin) k jiné molekule, např. polypeptidu, jako je protilátka nebo fragment protilátky.

A tak, protilátka s vazebnou specificitou umožňující směrování k vybraným buňkám (např. protilátka schopná vazby na antigen přítomný na povrchu buněk nádoru), může, v souladu s preferovaným provedením předloženého vynálezu být spojena (příkladně jako fúzní protein) s kalmodulinem (např.). Peptid schopný za patřičných podmínek vazby kalmodulinu, např. mastoparan, může být připojen k sekvenci aminokyselin (opět např. jako fúzní protein), který nese sdružené ligandy (pro použití v uvedeném patentu), např. pro immunomodulaci buněk NK. Protilátka, která váže cílovou buňku (např. nádor) může být vázána k vehikulu nesoucímu ligand (tj. sekvenci aminokyselin nesoucích sdružené mono- a oligo- sacharidy) přes zprostředkující vazbu kalmodulinu a peptidu schopného vazby ke kalmodulinu (například mastoparan). Jak je uvedno, tento způsob může být otočen protilátkou nebo jinou specifickou vazebnou látkou, užívanou pro směrování připojenou k peptidu jako je mastoparan a jinou vázající molekulu (jako je kalmodulin) propojením k ligandu-nesoucímu vehikulum, například polypeptidu.

Ligand-nesoucí vehikulum v situaci, kde jsou zprostředkující vazebné látky použity, může být liposom (jak je diskutováno), s jednou z látek připojených k liposomu v souhlase se známými technikami. Například, liposom nesoucí mono- nebo oligosacharid může inkorporovat kalmodulin vázající ligand, jako je mastoparan, umožňujícímu tak být svázán se specifickou vazebnou látkou jako je protilátka, prostřednictvím kalmodulinu pro směrování.

Výhodou užití systému “dvojího ligandu” zahrnujícího vazebný pár, je výhoda náhrady jedné směrované specifické vazbebné substance za jinou. Vehikulum nesoucí ligand (např. sdružené mono- a oligo-sacharidy) svázané s jedním členem zprostředkujícího vazebného páru, může být užito s kterýmkoliv z extrémně velkého počtu vazebných molekul pro směrování a svázáno navíc se zprostředkujícím vazebným párem. Fágová “display” technologie (viz např. W092/01047) umožňuje výběr protilátky a protilátkových fragmentů schopných vazby kteréhokoliv zájmového antigenu. Vybrané protilátky nebo fragmenty mohou být klonovány jako fúzní proteiny s kalmodulinem (např.) a pak použity ke spojení s hotovými ligandnesoucími vehikuly připojenými ke kalmodulin- vázající molekule jako je mastoparan.

Další možnost v těchto souvislostech zahrnuje užití bispecifické protilátky, schopné vazby k cílovým buňkám a k vehikulu pro sdružené mono- a oligo-sacharidy, například polypeptid buď glykosylovaný, (jak bylo diskutováno), nebo připojený k liposomu nesoucímu mono- nebo oligo-sacharidy. Jedno rameno bispecifické protilátky může být schopno vazby antigenu přítomného na povrchu cílů (tj. nádorových buněk), kdežto druhé může být schopno vazby peptidového přívěsku, který může být propojen k ligandu-nesoucímu vehikulum, jako je sekvence aminokyselin, nebo liposom. Různost přívěsků, které mohou být exprimovány s ostatními polypeptidy jako fúzujícími proteiny byla užita pro rekombinantní proteiny včetně: myc přívěsek, (Munro, S., a Pelham, H.R.B. (1986) Cell, 46, 291-300, Ward,E.S., Gussow, D., Griffiths, A.D., Jones.P.T. a Winter, G. (1989) Nátuře, 341, 544-546), Flag-peptid (Hope, T.P. a spol. (1988) BioTechnology, 6,1204-1210), KT3 epitop (Martin, G.A. a spol. (1990) Cell, 63,843-849, Martin, G.A. , a spol (1992) Science, 255,192-194), alfa-tubulinový epitop (Skinner, R.H. a spol (1991) J. Biol. Chem., 266,14163-14166), T7 gen 10 proteinový peptid (Lutz-Freyermuth,C., Querry, C.C. a Keene, J.D. (1990) Proč. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 87,6393-6397).

Polypeptidy, včetně protilátek mohou být vázány k iiposomům užitím hydrofobní transmembránové sekvence ( například z MHC-I) nebo via (glyko) fosfolipidové kotevní domény z proteinu jako je Decay Accelerating Factor (mDAF- viz W089/01041 například). Shoda aminokyselinové sekvence pro fosfoinositolovou vazbu k lipidu např. v liposomu, je možná. Ti, kteří jsou obeznámeni s oborem znají rovněž tyto techniky.

Je zapotřebí zmínit, že jsou-li vhodné ostatní specifické vazebné páry, mohou být použity namísto protilátky/antigenu. Na příklad, peptidové ligandy (například malé hormony, neuropeptidy) buněčně povrchových receptorů mohou být použity ke značení buněk nesoucí tyto receptory pro destrukci. Za příklad může sloužit peptidový ligand připojený k liposomů nesoucímu mononebo oligo- sacharidy, nebo připojen, například via peptidový můstek po expresi jako fúzní protein ke glykosylované sekvenci aminokyselin (například nesoucích sdružený mono-nebo oligosacharid ).

Protilátky které jsou specifické pro zamyšlený cíl mohou být získány užitím technik, které jsou standardní v oboru. Použity mohou být metody produkce protilátek včetně imunisace savců (tj. myš, potkan, králík, kůň, koza, ovce nebo opice) proteinem nebo jeho fragmentem. Protilátky mohou být z imunisovaných zvířat získány užitím různých technik známých v oboru, a testovány především na vazbu zkoumaného antigenu s protilátkou. Např. Western blotovací techniky nebo imunoprecipitace mohou být užity (Armitage a spol., 1992, Nátuře 357: 80-82).

Produkce monoklonálních protilátek je dobře zavedena v oboru. Monoklonální protilátky mohou být využity s technikami rekombinantní DNA technologie k produkci ostatních protilátek nebo chimérických molekul,které zachovávají specifitu původní protilátky. Taková technika může zahrnovat zavedení DNA kódující imunoglobulinovou variabilní oblast, nebo komplementárně určující oblasti (CRDs), protilátky ke konstatní oblasti, nebo konstatní oblasti plus kosterním oblastem, různého imunoglobulinu. Viz například EP184187A, GB2188638A nebo EP-A0239400. Jedna z příčin proč tak činit , může spočívat “v humanisaci” nehumánní protilátky ke zvýšení poločasu po aplikaci člověku.

Jako alternativní nebo doplňující k imunizaci savců peptidem, protilátka specifická pro protein může být získána z rekombinantně připravené knihovny exprimovaných imunoglobu línových variabilních domén, např. užitím lambda bakteriofágu nebo filamentózního bakteriofágu, který vykazuje funkční imunoglobulinové vazebné domény na jejich površích. Např. viz W092/01047. Knihovna může být původní, např. konstruována ze sekvencí získaných z organizmu, který nebyl imunizován žádným z těchto proteinů (nebo fragmentů), nebo může být konstruována užitím sekvencí získaných z organizmu, který byl exponován k žádanému antigenů.

Žádoucí může být tzv. “humanisace” nehumánních (tj. myších) protilátek za účelem získání protilátek majících antigen vazebné vlastnosti nehumánní protilátky, občas minimalizací imunogenní odpovědí protilátky, např, je-li užita k lidské terapii. A tak, humanisované protilátky mohou zahrnovat rámcové oblasti získané z lidských imunoglobulinů (příjemcovská protilátka) v níž zbytky z jedné nebo více komplementárních určujících oblastí (CRDs) jsou zaměněny zbytky z CDR’s nehumánního druhu (donorová protilátka) jako je myší, potkaní nebo králičí protilátka mající požadované vlastnosti, např. specificitu, afinitu nebo kapacitu. Některé rámcové zbytky lidské protilátky mohou být zaměněny odpovídajícími částmi nehumánního původu, nebo zbytky, které nejsou přítomny buď v dárcovských nebo příjemcovských protilátkách. Tyto modifikace jsou prováděny k dalšímu čištění a optimalizaci vlastností protilátky.

Fágová technologie také umožňuje “humanisaci” nehumánních protilátek, které mohou být zvýhodněny pro použití u lidí. Dvoustupňové “ řetězové promíchání” zamění nehumánní VL a VH domény, které kooperují v tvorbě vazebného místa pro antigen zájmu (PCT/GB/01755). Nukleová kyselina kódující tyto lidské VL a VH domény může být fúzována k sekvencím kódujícím lidské konstatní domény pro expresi kompletních lidských protilátek.

Protilátky mohou být modifikovány několika způsoby. Skutečně termín “protilátka” může být konstruován jako zastřešující pro jakékoliv vazebné substance mající vazebnou doménu s vyžadovanou specificitou. To zahrnuje protilátkové fragmenty, deriváty, funkční ekvivalenty a homologní protilátky, včetně jakéhokoliv polypeptidu zahrnujícího imunoglobulinovou vazebnou doménu, jak přírodní tak syntetickou. Chimérické molekuly zahrnující imunoglobulinovou vazebnou doménu, nebo ekvivalent, fúzovanou k jinému polypeptidu jsou tudíž zahrnuty. Klonování a exprese chimérických protilátek jsou popsány u EP-A0120694 a EP-A-012225023.

Bylo ukázáno, že funkce vazebných antigenů může být zachována u fragmentů celých protilátek. Příkladem vazebných fragmentů jsou: (i) Fab fragment obsahující VL, VH, CL a CH1 domény, (ii) Fd fragmment obsahující VH a CH1 domén,(iii) Fv fragment obsahující VL a VH domén jednotlivé protilátky,(iv) dAb fragment (Ward,E.S. a spol., Nátuře 341,544-546 (1989) který se skládá z VH domény, (v) isolované CRD oblasti ,(vi) F(ab’ )₂ fragmenty a bivalentní fragment zahrnující dva vázané Fab fragmenty (vii) jednotlivý řetězec Fv molekul (scFv), kde VH doména a VL doména jsou spojeny peptidovým “linkerem” který umožňuje dvě domény asociovat k tvorbě antigen vazebného místa, (viii) bispecifický jednoduchý řetězec Fv dimérů (PCT/US92/09965) a (ix) “diabodies “ (imitace fůzní protilátky pozn. překladetele), multivalentní nebo multispecifické fragmenty konstruované fúzí genu (WO94/13804, P. Holliger a spol. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 90 6444-6448, 1993).

“Diabodies” jsou multiméry polypeptidů, každý polypeptid zahrnuje prvou doménu zahrnující vazebnou oblast lehkého řetězce imunoglobulinu a druhou doménu zahrnující vazebnou oblast těžkého řetězce imunoglobulinu, obě domény jsou svázány (například peptidovým linkerem (spojem)), ale neschopné asociovat mezi s sebou k tvorbě antigen vazebného místa: antigen vazebná místa jsou tvořena asociací prvé domény jednoho polypeptidu uvnitř multiméru s druhou doménou jiného polypeptidu uvnitř multiméru (WO94/13804).

Tam, kde bispecifické protilátky jsou užity, tyto mohou být konvenční bispecifické protilátky, připraveny mnoha způsoby (Holliger.P. a Winter G. Current Opinion Biotechnol. 4, 446-449 (1993)), např. připraveny chemicky nebo z hybridních hybridomů, nebo to mohou být jakékoliv fragmenty bispecifických protilátek zmíněných v předcházející části. S výhodou mohou být užity scFv diméry nebo “diabodies” spíše než celé protilátky. “Diabodies” a scFv mohou být konstruovány bez Fc části, použitím pouze variabilních domén, potencionálně redukcí účinků antiidiotypické reakce. Ostatní formy bispecifických protilátek zahrnují jednotlivý řetězec “Janusins” (“Janusiny” pozn. překladatele) popsaný v Traunecker a spol., EMBO Journal, 10, 3655-36659, (1991).

Bispecifické “diabodies”, ve srovnání s bispecifickými celými protilátkami, jsou také zvláště užitečné, protože mohou být lehce konstruovány a exprimovány v E. coli. “Diabodies” (a mnohé ostatní polypeptidy jako fragmenty protilátek) odpovídajících vazebných specificit mohou být snadno selektovány užitím fágové techniky (display) (W094/13804) z knihoven. Jestliže jedno rameno “diabodies” je získáno jako konstatní, např. se specificitou zaměřenou proti povrchovému antigenů NK buněk, pak může být vytvořena knihovna, kde druhé rameno se mění a vybrat protilátku požadované specificity .

A tak, například při zabíjení nádorů, jedno antigenní vazebné místo může být zaměřeno proti nádorovému znaku, kdežto druhé může být zaměřeno proti přítomnému antigenů na efektorové buňce, např. NK buňce. Inaktivní buňky NK a cílové buňky mohou být spojeny před spuštěním NK buněčné aktivity. Bispecifické protilátky s inkorporovanou specificitou pro T buněčný koreceptor CD3 mohou (jak bylo ukázáno) tlumit růst nádoru (Titus, J.A a spol.., J. Immunol. 138, 4018-4022 (1987) a léčit lymfóm (Brisssinck J. a spo., J. Immunol. 174, 4019-4026 (1991)).

Alternativy a variace všech způsobů umožňující různé pohledy uvedeného patentu, budou zřejmé osobám vzdělaným v oboru. Techniky jsou navrženy pomocí příkladů a bez limitace mohou být modifikovány, nebo použity alternativy ve vztahu k vědomostem těch, kteří jsou vzděláni v oboru, bez změny cíle předloženého patentu.

Všechny zmíněné dokumenty v textu jsou zahrnuty v citacích.

Obrázek 1 ukazuje vazbu raioaktivním jódem značeného NKR-P1 proteinu k lipidu-vázaných oligosacharidů ( pro které jsou uvedeny sekvence a zkratky v Tabulce 1).

Obrázek 1a ukazuje výsledky chromatografie na lipid-vázané oligosacharidy, bud chemicky obarvené orcinolem (negativní zobrazení ukázané v liniích 1 až 5) nebo překrytých ¹²⁵lznačeného sNKR-P1 s provedením autoradiogramú (linie 1’ až 5’). Linie 1 a 1’ obsahovaly LNT a H5, linie 2 a 2’ LNNT a LX5, linie 3 a 3’, laktosu (Lac) , DLNN,LNT,LA5 a LB6, linie 4 a 4’,6$L, linie 5 á 5’, 3SL; vzestupná chromatografie.

Obrázek 1b ukazuje vazbu ¹²⁵l- naznačeného sNKR-P1 proteinu (x10'⁴cpm) k lipidu vázaných oligosacharidů imobilisovaných na plastických mikrodestičkách v přítomnosti nosičových lipidů cholesterolu a vaječného lecithinu. Na hlavním panelu ve vzestupujících částech vazebné křivky jsou ukázána sériová ředění na lipid-vázaných oligosacharidů použitých v jamkách, a převrstvených s ¹²⁵l- sNKR-PI, 3x10⁵ cpm na jamku. V okénku je ukázána saturace vazby. ¹²⁵l- značený sNKR-P1 byl smíchán s neznačeným proteinem k získání 10⁶ cpm/pg, byl přidáván ve vzrůstajících množstvích do jamek pokrytých lipidvázanými oligosacharidy GM2 a DLNN (2pmol dávány na jamku).

Obrázek 1c a 1d ukazuje intensitu vazby na lipidicky-vázané oligosacharidy, c při použití 64 pmol na jamku a d 8 pmol na jamku.

Obrázek 2 ukazuje inhibici vazby ¹²⁵l-značeného sNKR-P1 k imobilisovanému DLNN volnými oligosacharidy a polysacharidy.

Obrázek 2a 2c ukazují procento inhibice vazby ¹²⁵lznačeného sNKR-P1 a DLNN v přítomnosti udaných koncentrací sacharidů (M nebo pg/ml).

Obrázek 2b ukazuje korelaci mezi aktivitami různých oligosacharidů zkoumaných ve vazebných a inhibičních testech.

Obrázek 3 ukazuje srovnání schopnosti oligosacharidů jako inhibitorů vazby jódem označeného sNKR-P1 k různým oligosacharidům, a srovnání schopnosti těchto oligosacharidů s nenaznačenými sNKR-P1 a chodroitin sulfátem A (zkratka CA) jako inhibitorů vazby ¹²⁵l- značeného sNKR-P1 k nádorovým cílovým buňkám a cytolýza různých cílových buněk NK buňkami.

Obrázek 3a ukazuje koncentraci volných oligosacharidů dávajících 50 procentní inhibici (IC50) vazby DLNN nebo IS s 1251- značeným sNKR-P1.

Obrázek 3b ukazuje vazbu (cpm/buňku) ¹²⁵l-značeného sNKR-P1 na suspenze buněk, proti přidanému sNKR-P1 (ug/ml). Symboly:·/ YAC-1 buňky; tt_{ B16S buňky; ♦ / 1C21 buňky,·

TRNK-16 buňky; gglutaraldehydem -fixované RNK-16 buňky;

O RNK-16 - buňky glutaraldehydem -fixované v přítomnosti IS / disacharidu; P815 buňky.

Obrázek 3c a d ukazují IC50 hodnoty inhibice vazby ¹²⁵lznačeného sNKR-P1 k různým cílovým buňkám.

Obrázek 3e a f ukazují procento specifické lyže různých buněk čerstvými buňkami NK (e) nebo buňkami RNK-16 (f) při různých poměrech efektorových a cílových buněk (E:T). Symboly jsou stejné jako pro obrázek 3b.

Obrázky 3g -j ukazují inhibici zabíjení a k ukazuje korelaci zabíjení s inhibici vazby: symboly pro inhibitory v panelu g -k jsou: čtverce pro sNKR-P1, kolečka pro chondroitinsulfát A, kosočtverce pro disacharid IS, pravá strana trojúhelníky pro GM2 tetrasacharid, a na straně dole triangly pro DLNN trisacharid, zavřené, otevřené a na pravé straně čarované symboly jsou užity pro YAC-1, B16S a 1C21 buňky: pro výsledky získané s čerstvými NK buňkami, malé plné symboly jsou užity k odlišení výsledků získaných s RNK-16 buňkami.

Obrázek 4 ukazuje vazbu s NKR-P1 proteinu k vysoceafinitnímu sacharidovému ligandu, GM2 glykolipidu, v přítomnosti (obrázek 4a, plná kolečka) a nepřítomnosti (obrázek 4a, prázdná kolečka) vnějšího kalcia a výzkum výskytu NKR-P1 na povrchu čerstvých a aktivovaných NK buněk při kalciu-nezávislé tvorbě konjugátů s cílovými buňkami (Obrázek 4b- konjugáty tvořící NK buňky jako celkové procento ).

Obrázky 4c-h ukazují výsledky průtokové imunocytometrické analýzy, které byly provedeny k zjištění exprese NKR-P1, CD8 a CD5 antigenů, (plné křivky) na čerstvých NK buňkách (panel c, e a g) a na aktivovaných NK buňkách (panel d, f a h). Tečkované křivky ukazují pouze fluorescenčně značený králičí protimyší imunoglobulin .

Obrázek 5 ukazuje hodnoty lnsP3 (panely a, d a g), lnsP2 (panely b, e a h), a volné cytoplasmatické kalcium (Ca ²⁺)l (panely c, f a I) měřené u RNK-16 efektorových buněk po jejich interakci s YAC-1 cílovými buňkami (panely a, b a c) , nebo s liposomy obsahujíícími oligosacharidové ligandy pro NKR-P1 (panely d, e a f), nebo s monoklonální anti-NKR-P1 protilátkou, nebo chondroitin-sulfátem A nebo volnými disacharidy IS (panely g,h a I).

Obrázek 6 ukazuje :

Obrázek 6a: vazbu (cpm/buňku) ¹²⁵ l-značeného sNKR-P1 na 5x10⁵ YAC-1 buněk nebo P815 buněk, které byly opracovány sialidasou (S’ase) nebo heparinásou I (H’ase) nebo chondroitinásou ABC (C’ase) nebo směsí sialidás a chondroitinás ABC (SC’ase) nebo směsí sialidás, chondroitinás ABC a heparinásy I (SCH’ase). Kontrolní buňky byly opracovány směsí teplem inaktivovaných enzymů.

Obrázek 6b: cytolýzy (procento specifické lyže) YAC-1 a P815 buněk čerstvými buňkami NK stanoveno po opracování nádorových buněk , v panelu a, stejnými glykosylhydrolásami nebo inaktivovanými enzymy.

Obrázek 6c: cytolýzy (procento specifické lýze) YAC-1 nebo

P815 buněk čerstvými NK buňkami stanoveno po expozici nádorových buněk k liposomům exprimujícím neoglykolipid laktosy (LAC), nebo GM2 glykolipid (GM2) nebo neoglykolipid IS disacharidu (IS).

Obrázek 6d ukazuje výsledky SDS-polyakrylamidové elektroforesi a elektropřenosu na nitrocelulósu plasmatických membrán buněk YAC-1 a P815, proužky byly obarveny na proteiny (linie 1) a převrstveny ¹²⁵l značeným sNKR-P1 proteinem k ukázce autoradiografie (za 3hod), vázaných látek (linie 2), YAC1 buněčných membrán, přídavné proužky (linie 3,4 a 5) byly testovány na vazbu po opracování silaidásou, chondroitinásou ABC nebo heparinidásou I. Znázorněny jsou pocice Mr.

Obrázek 6e ukazuje linie 1, vazba ¹²⁵ I- značeného sNKR-P1 byla znázorněna k lipidům extrahovaným z YAC-1 a P815 membrán rozpuštěných TLC. Opakované proužky, linie 2 byly barveny primulinem. O ukazuje posici aplikace, GM1, GD1A, GD1B.GD1B laktonu (GD1BL) a GT1B ukazuje posice autentických standardů. GD1 (A)L je minoritní glykolipidová komponenta prozatímně označená jako GD1A lakton. Vazba na relativně nízký obsah glykolipidu GT1B a GD1B byla slabé intensity (šipka) v 3 h autoradiogramu.

Obrázek 7 ukazuje radiovazbu a inhibici vazebných experimentů ukazujících vysokou afinitu sCD69 pro sialylované a sulfátované sacharidy. Hlavní panel ukazuje vazbu ¹²⁵l- značeného sCD69 k lipidu- vázaným oligosacharidům (neoglykolipidům) imobilisovaným na plastických mikrodestičkách” vazba proteinu (x 100-4 cpm/jamku) v neoglykolipid přidán pmol/jamka). Vsuvka ukazuje inhibici vazby sCD69 k IS neoglykolipidu v přítomnosti vybraného sacharidu.

Obrázek 8 ukazuje výsledky radiovazby a cytotoxických experimentů ukazujících, že CD69 je intimně spojen s cytolytickou aktivitou lidských NK buněk.

Obrázek 8a ukazuje vazbu ¹²⁵l- značeného sCD69 k různým leukemickým buněčným liniím: protein vázaný (cpm/buňka) v protein přidaný (ug/ml).

Obrázek 8b ukazuje přirozené zabíjení (procent specifické lýze) leukemických buněčných linií při různém poměru efektorových : cílovým buňkám (E:T).

Obrázek 8c ukazuje korelaci mezi ¹²⁵l- sCD69 vázaným proteinem (cpm/buňka) k leukemickým buňkám a cytotoxicitám při poměru E:T = 128:1.

Obrázek 8d -g ukazují koncentrace v závislosti na aktivitách CD69 (uzavřené trojúhelníky) a SN disacharidem (otevřené trojúhelníky) jako inhibitory přirozeného zabíjení 4 NK sensitivních buněčných linií? D -M0LT-4, Ε- K-562, F- U937, GDAUDI.

Obrázek 9 ukazuje povrchovou expresi CD69 na lidských NK buňkách fenotypu CD56 k níž prudce dochází po jejich inkubaci s NK-sensitivními cílovými buňkami nebo liposomy obsahujícícími vysoko afinitní ligandy pro CD69 protein, a je inhibována v přítomnosti volných oligosacharidových ligand a je opožděna u buněčnýxch populací , které byly nejdříve zbaveny buněk exprimujících CD69: A- procento CD56+/CD69+ po celou dobu (h); B- procento CD3+/CD69+ buněk po celou dobu (h); C- procento CD56+/CD69+ po celou dobu (h); buňky které byly nejdříve zbaveny CD69+ buněk inkubací s protilátkou za přítomnosti komplementu (lyží).

Obrázek 10 ukazuje udržení NK-resistentních- leukemických buněčných linií vnímavými k přirozenému zabíjení předinkubací jich s liposomy nesoucími oligosacharidové ligandy pro CD69.

Procento specifické lyže je ukázáno proti koncentraci přidaného neoglykolipidu (nmol/ 100ul liposomů); A- MOLT -4 buňky; B-RAJI buňky; C- IM-9 buňky; D- KG-1 buňky.

Obrázek 11 ukazuje kinetiku zavzetí (inkorporaci pozn. překladatele) neoglykolipidu kultivovanými buněčnými liniemi. Zavzetí neoglykolipidu do buněk (procento přidaných cpm) je ukázáno proti inkubačnímu času (h) pro MOLT-4, RÁJI,THP-1 a IM-9 buňky.

Obrázek 12 ukazuje apoptické zabíjení NK vnímavých cílových buněk v závislosti na CD69 sacharidových interakcích.

(a)až(c}:procento lyže (a) MOLT-4 buněk, (b) U937 buněk a c K-562 buněk je ukázáno v poměru E.T 2, 8, 32.

(d) až (f) : Tři typy stanovení byly provedeny v Mg 2+/EGTA mediu : v (d) výsledky 4h ⁵¹Cr uvolnění jsou ukázány při E:T poměru 8:1 užitím PBMC (procento specifické lyže); in (e), výsledky apoptózy zkoumané cytofluorometricky (procento apoptických buněk); a (f) výsledky apoptické DNA testů. Výsledky jsou platné pro NK sensitivní buněčné linie MOLT-4,U937,a K-562 a NK resistentní buněčné linie Ráji označené R, THP-1 označené T, a IM-9 označené I. S MOLT-4 a U937 buňkami jsou ukázány další výsledky s reakční směsí obsahující 10-5 M laktosu (označeno L) nebo disacharidem SN (S) nebo 10-8 MsCD69, (c). Linie označené (O) v panelech (D) k (E) ukazuje výsledky v nepřítomnosti inhibitoru.

MODULACE AKTIVITY PROSTŘEDNICTVÍM NKR-P1.

V Escherichia coli jsme exprimovali rekombinantní formu

NKR-P1 (označeno zde jako s NKR-P1) korespondující s dimerickou extracelulární částí NKR-P1 a ukázali, že jde o kalcium dependentní sacharidy vázající protein s vazebnou kapacitou monosacharidů odlišných od těch ,které byly popsány pro ostatní C-typy lektinů a neobvykle silnou asociací s kalciem.

Předcházející vazebné a inhibiční studie s imobilizovanými a volnými monosacharidy ukázaly, že protein má vyšší afinitu vazby k beta-N- acetyl-D- galaktosaminu než k beta-N- acetyl-Dglukosaminu a s nižší afinitou k alfa- fukóse s IC so hodnotami (koncentrace udané jako jako 50% inhibice vazby) tj. 0.6 χ 10'⁷ Μ, 2x 10'⁷ M a 2x 10‘⁶ M. Nyní jsme identifikovali některé extrémně potentní sacharidové ligandy pro NKR-P1, některé s IC₅o v hodnotách 10 '⁹ - 10 ’¹² M. Tyto zahrnují oligosacharidové sekvence krevních skupin, rodiny gangliosidů a glykosaminglykany.

Vedle toho jsme získali doklady, že existuje interakce NKRP1 proteinu s oligosacharidy na povrchu cílových buněk nebo podobných proteinů na NK buněčném povrchu , které jsou intimně zastoupeny v mechanismu NK buněčného spouštění vedoucí ho k cytolýze cílových buněk.

PŘÍKLAD 1

Exprese NKR-P1 proteinu a rozpustných fragmentů v COS buňkách.

COS-7 buňky byly transfekovány s NKR-P1 cDNA v plasmidů pCDm8 použitím DEAE-dextran procedury. 3 dny po přidání plasmidů, buněčně povrchové proteiny netransfekovaných a transfekovaných buněk byly označeny radioaktivním jódem glukoso oxidásou/ podle laktoperoxidásového protokolu, lyžovány ústojným roztokem Tris- (TBS) obsahujícím 1% Triton -X 100 a 1 mM fenyl-methyl- sulfonyl-fluorid (PMSF) a lysáty byly vyčištěny centrifugací při 100.000 xg 60min.

Supernatanty (5x 10⁵ cpm) byly podrobeny imunoprecipitaci monoklonálními protilátkami nebo afinitní chromatografií na 1 ml kolonách s monosacharid- Sepharosou. Kolony byly ustáleny TBS obsahující 10mM CaCI₂ a 0.1% Tritonu X-100 (TBS + C +T) a radioaktivně značené lyzáty aplikované v 1ml TBS+C+T. Kolony byly promyty stejným pufrovacím roztokem a 1 ml frakce byly sebrány. Vázaný protein ke GIcNAc-Sepharose byl vymyt s 0.5 M GIcNAc v TBS-C +T. Frakce byly proměřeny v gama počítači a stejné díly (10⁴ cpm) precipitovány 10% trochlorovou kyselinou k analýze na SDS polyakrilamidové gelové elektroforéze za redukujících a neredukujících podmínek.

K přípravě solubilních fragmentů NKR-071, NKR-081 a NKR091, NKR-P1 protein byl isolován z Tritonových lysátů 10⁹ transfekovaných buněk afinitní chromatografijíia GIcNAcSepharose jako výše, dialysován proti TBS +c+T, a podroben případně následujícím opracováním: (a) limitovanou proteolýzu (0.1 ug/ml trypsinu nebo thrombinu, 10min. při pokojové teplotě); (b) limitované proteolýze následované deglykosylací N-glykanásou (podle protokolu založeného na enzymatické přípravě); nebo © digesci subtilisinu (25 ug/ml subtilisin, 37° C, 1h). Proteinové produkty získané těmito zpracováními byly podrobeny afinitní chromatografií na GIcNAc-Sepharose a dialyzovány proti TBS+C.

PŘÍKLAD 2

Exprese solubilního NKR-P1 fragmentu v prokaryotických buňkách

Celá proteinová kódovací sekvence NKR-P1 proteinu byla subklonována z původního cDNA klonu jako 0.8 kb Hindlll-Bglll fragment (HindlII místo bylo zaplněno a konvertováno v EcoRI místo užitím EcoRI linkeru) a přeneseno do pGEM-3Z vektoru, štěpeno Eco Rl a BamHl k získání pNKR-124.

pNKR-141 obsahující sekvence kódující pro celou extracelulární část NKR-P1 začínající valinem 65 přeneseným z pNKR-124 jako 145 bp Hinfl-Pf1 Ml fragment. pNKR-141W měl aminokyselinovou substituci, v které tryptofan 115 byl zaměněn za threonin během ligace Pf1M1 místa. pNKR-161 zahrnoval lektinovou doménu NKR-P1 z tryptofánu 115 a byl konstruován ligací EcoRI linkeru (10mer) k Pf1M1 místu v pNKR-124, zarovnán T4 DNA polymerásou. PNKR-171 a -191 jsou varianty výše uvedených konstrukcí, z kterých segment kódující 8 nejvíce Cterminálních aminokyselin byl odňat.

Toho bylo dosaženo otevřením daných plasmidů na jediném místě Bsm1 , odnětím jednořetězcových prodloužení, a ligací “ vystřihovacího” linkeru (1144 , New England BioLabs ). Plasmidy byly znovu uzavřeny, amplifikovány in vivo , natráveny BspM1 a opracovány nukleásou z fazolí ( Phaseolus aureus) k odnětí jednořetězcových prodloužení. Malý EcoR1-BspM1 fragment byl svázán proti zaplněnému C1a1 místu v polylinkeru EcoRI natráveného plasmidu pGEM-7Zf(-) za účelem znovuobnovy stop kodónu (konečný kodón pozn. překladatele). EcoR1/Hindlll inserty byly přeneseny do vektorů plNiiiompA2 nebo pMAL-2 (New

England BioLabs) k získání expresních plasmidů pNKR- 241-261,271 a-291, nebo pNKR-341 ,-341W nebo-391.

Proteiny NKR-241 k -291 byly produkovány v Escherichia coli kmeni JA221 před tím popsanými metodami a čištěny afinitní chromatografií na GIcNAc-Sepharosové koloně. Proteiny NKR341, -341W, nebo -391 byly exprimovány v Escherichia coli kmeni NM522 užitím protokolu přípravy Fúzovaných proteinů a Čistícího systému.

Krátce, 600ml LB media s 100 ug/ml ampicilinu bylo inokulováno s 6 ml přes noc. Získané kultury obsahující expresní plasmidy a inkubovány v orbitální třepačce při 300 rpm po 2 hod. Při 37°C., případně 30 min. při pokojové teplotě. Buňky byly indukovány isopropyl-beta-D- thiogalaktosidem (0.1 mM) a inkubovány po další 3-4 hodiny při pokojové teplotě. Buňky byly sklizeny centrifugací v Beckmanově J-6 centrifuze, resuspendovány v přibližně 20 ml extrakčního pufru (0.02 M Tris. Hel pH 8.0, O.5 M Naci, 10mM EDTA, 10mM 2-mercaptoetanolu (2ME), 1 mM NaN3 a 1mM PMSF), sonikovány na ledě 4x 30 s, a centrifugovány při 15000xg po 10 min. Fúzované proteiny byly izolovány z pročištěných bakteriálních extraktů na amylóseagarósové afinitní koloně podle standardního protokolu (New England BioLabs).

Spojené fúzovací proteiny (100mg) byly štěpeny Faktorem Xa při 23° C a NKR proteiny separovány na maltose- vázajícím proteinu, chromatografovány na DEAE-Sepharósové koloně (2 x 15 cm), ustáleny v 10mM Tris pH 8.0, 25 mM NaCl, 10mM 2-ME a vymyty v lineárním gradientu NaCl 500mM ve 4 kolonových objemech. Konečná purifikace byla provedena gelovou filtrací na Sephakrylu S-200 SF (0.5 x 120 cm) ustáleném TBS +C, obsahujícím 8 M močoviny a 10 mM -ME. NKR fragmenty byly vymyty v druhém vrcholu a určeny SDS polyakrylamidovou gelovou elektroforézou.

Proteiny byly renaturovány sérii dialysačních kroků, prvně odstraněním močoviny a poté zbaveny 2-ME a snížením koncentrace denaturačních látek na polovinu v několika dialysačních krocích. Vzorky pro antigenní analysu byly sbírány po každé dialýse. Konečně proteiny byly dialyzovány proti TBS + C obsahujícím 1 mM NaN₃ a uchovávány v tomto pufru.

PŘÍKLAD 3

Vysoce afinitní sacharidové ligandy pro NKR-P1

Jako referenční látku jsme užili na lipid vázaný trisacharid, DLNN (zkratka označující v textu látku uvedenou mezi sacharidy tabulky 1), s terminálním N- acetylglukosaminem vázajícím se sNKR-PI. Zvláště jsme užili DLNN k výzkumu vlivu NKR-P1 na rozpoznávání dalšího prodloužení oligosacharidové páteře a periferní substituce krevně skupinových monosacharidů, sialovou kyselinou a sulfátem.

V počátečních chromatogram- vazebných experimentech sNKR-PI bylo nalezeno, že se váže k LNT sekvenci, galaktósa je beta 1-3 vázána k N-acetylglukosaminu DLNN sekvenci, ale nikoliv k LNNT sekvenci, kde galaktósa je beta 1-4 vázána (obrázek 1a, linie Γ, 2’ a 3’). Avšak v přítomnosti alfa 1-3 vázané fukósy na N-acetylglukosaminu LNNT jako v Le^x j antigenní sekvenci LX5, vazba byla nalezena (linie 2’). Pro LNT páteř bylo zvýšení vazby v přítomnosti alfa 1-4 vázané fukósy jako v Le^a antigenní sekvence LA5 (linie 3’)·

Krevně skupinové H a Le b sekvence obsahující fukósu alfa

1-2 vázanou ke galaktóse na LNT a LA5 sekvence jako v H5 (linie 1’) a LB6 (linie 3’) byly také vázány. Ale, v přítomnosti krevně skupinového A monosacharidu , alfa-N-acetyl-Dgalaktosamin na H a Le sekvencích jako v A6 a A7, vazba nebyla nalezena (výsledky nejsou ukázány). A tak, krevně skupinový A monosacharid “maskuje” vazebná místa na Le a a Le b sekvencích.

V dalších pokusech (nejsou ukázány) glykolipid globosid s oligosacharidovou sekvencí GalNAc betal-3Galalfa1-4 Galbetal4Glc byl vázán NKR-P1, kdežto Forsmanův glykolipid ,který obsahuje GalNac spojeném alfa 1-3 vazbou ke globosidové sekvenci nebyl vázán. A tak afinita NKR-P1 pro Nacetylgalaktosamin se zdá je restringován k beta anoméru (viz také ganglio serie sacharidů uvedená níže). Afinita pro Nacetylneuraminidovou kyselinu , vázanou alfa 2-3 (ale nikoliv alfa

2- 6) byla objevena pro sNKR-P1, jak ukázáno u 3SL (Iinie5’) ale nikoliv 6SL (linie 4’) , ani nesubstituované laktosyl páteři (linie 3’).

Kvantitativní vazebné experimenty ukázaly, že vazba rozpustného NKR-P1 (sNKR-P1) k lipidu-vázaným oligosacharidům imobilizovaným na plastických mikrodestičkách byla nasycena (panel b, vsuvka). Vazebná data na obr. 1b a c , ne pouze souhlasila s chromatogram- vazebnými daty, ale navíc ukázala , že (I) alfa 1-3 vázaná fukósa propůjčuje vazebnou aktivitu k laktosylové kostře jako u LX3, (ii) alfa 2-3 vázaná Nacetylneuraminová kyselina potencuje vazbu k LNT a K Le a a Le x sekvencím jako u 3SLT,3SA5, a 3SX5 , a (iii) alfa-2-3 vázaná sialová kyselina na 6SLT není vázáná, nicméně vazba je vyloučena k Le x sekvenci přítomností alfa-2-6 vázanou sialovou kyselinou jako v 6SX5.

Síran na galaktóse (3-0 substituovaný) měl větší potenciační účinek na vazbu NKR-P1 vazbu k Le x a Le a sekvencím, než měla

3- vázaná sialová kyselina: srovnej 3SX3 s SUX3 a 3Sař s

SUA5 (obr. 1c). Bylo také zřejmé, že délka oligosacharidového řetězce má vliv na intensitu sNKR-P1 vazbu: vazba k SUX4 byla větší než k SUX3, jako byla vazba SUA5 vyšší než SUA4. Přítomnost 3-0 sulfátované glukuronové kyseliny připojené vazbou

3- k vnější galaktóse LNNT tvořící HNK-1 antigen také propůjčuje srovnatelnou vazebnou aktivitu.

sNKR-PI vazebná specificita je nejen vztažena k sérii krevně skupinových oligosacharidů, ale také zahrnuje ganglio sérii. (Obr. 1c) Jak lze předpokládat z vazebných studií monosacharidů (21), glykolipid GA2 s terminálním beta-N- acetyl-D- galaktosaminem se silně vázal. Taktéž k této sekvenci byla zjištěna vazba , i když slabší beta 1-3 vázané galaktósy jako u GA1. Bylo zjištěno obohacení vazebné intensity když tyto dvě kostry byly nahrazeny alfa 2-3 vázanou sialovou kyselinou: srovnej GM1 s GA1 a GM2 s GA2. V přítomnosti druhé sialové kyseliny 2-8 vázané dojde k vymizení vazby: srovnej GD3 s GM3, GD2 a GM2, GD1B s GM1 a GT1B s GD 1A. Jako u serie krevních skupin síran (3-0substituovaný) na ganglio sériové kostře má vyšší potenciační efekt na s NKR-P1 než měl k 3- vázané sialové kyselině: srovnej SM3 s GM3,SM2 s GM2, SM1A s GM1 a SB1A s GD1A. Sulfatid (SULF) byl rovněž vázán. Sulfátovaný glykolipd SB2 s 3-0síranem oběma na N- acetylgalaktosaminu a galaktóse byl nejvíce vázán mezi sérii ganglio glykolipidů.

Silnější vazba NKR-P1 byla zjištěna mezi oligosacharidy odvozenými z heparinu a chondroitin sulfátu (Obr. 1d). Nesulfátované disacharidy OS a IVA per se podporují vazbu, ale analogy obsahující různě sulfátované hexosaminy (2-Nsulfátovaný glukosamin, 4-0- sulfátovaný N- acetylgalaktosamin, -O sulfátovaný acetylgalaktosamin nebo N- acetylglukosamin nebo 2-0-sulfátovaná uronová kyselina (viz tab. 1) vyvolaly zvýšenou vazbu. Z celého testovaného spektra , se zdá, že 4-0- a 6-0 sulfátované N- acetylhexosaminy jsou specielně reaktivní. Mezi disacharidy, tri-sulfátovaný IS z heparinu byl nejvíce vázán. Nejvyšší vazba mezi všemi testovanými oligosacharidy byla k hexasulfátovanému heparin tetrasacharidu IS2. Vazebná aktivita sNKR-PI zahrnuje fosforylované oligosacharidy , jako 6fosforylované tetra- a pentasacharidy, M4P a M5P podporující vazbu.

Obrázek 1 ukazuje vazbu jódem značeného NKR-P1 proteinu k lipidům vztaženým oligosacharidům. Oligosacharidové sekvence a jejich zkratky jsou uvedeny v tabulce 1.

V a, k lipidu vztažené oligosacharidy (neoglykolipidy) (38,44), přibližně 500 pmol každého byly chromatografovány (38) na destičkách silikagelu v rozpouštěcím systému chloroform/ metanol/ voda, objemy 55/45/10 (linie 3 a 3’) nebo objemy 65/35/8 (ostatní linie), buď byly barveny chemicky orcinolem, (negativní vzorky ukázány v liniích 1 k 5), nebo převrstveny ¹²⁵l- značeným sNKR-P1 (rekombinantní rozpustný, dimerická forma NKR-P1 exprimovaná v E. coli (specifická radioaktivita 107 cpm/jjg) (21) po opracování destiček 0.2% (w/v) polymetakrylátem, a vazba byla detekována (38) autoradiograficky (linie 1’ k 5’) . Linie 1 a 1’ obsahovaly LNT a H5, linie 2a 2’ LNNT a LX5, linie 3 a 3’, laktosu (LAC) DLNN,LNT, LA5 a LB6, linie 4 a’, SL, linie 5 a 3SL , vzestupná chromatografie.

V b, na lipidu vázané oligosacharidy (glykolipidy nebo neoglykolipidy) byly imobilizovány na plastických destičkách v přítomnosti nosičových lipidů cholesterolu a vaječného lecitinu (40,41), a jejich interakce s 125 I- značeným sNKR-P1 proteinem byla určena (21). Ve vsuvce je ukázka saturace vazby, 125 jódem značeného s NKR-P1 s neznačeným proteinem k dosažení 1(^ia 6 cpm^ug, a nanesen ve vzrůstajícím množství do jamek pokrytých lipidy navázanými oligosacharidy GM2 a DLNN (2pmol naneseno na jamku). V hlavním panelu vzestupné části vazebné křivky jsou ukázány pro sérii ředění selektovaných na lipidu- vázaných oligosacharidů použitých pro destičky, a převrstveny ¹²⁵ I- značeného s NKR-P1, 3x10 ⁵ cpm pro jamku. Symboly: Q, LNNT;», LNT;O, DLNN;t, GA2;·, GM2;4, SUA5; 4 ,

IS.

V c a d , intensita vazby sNKR-PI k lipidu vázaných oligosacharidů byla porovnávána s odečtením vazebné křivky uvedené v panelu b, a ostatních neuvedených, dále uvedeny hodnoty vazby s hodnotami povlečení od 64 pmol na jamku (panel

c) a 8 pmol/jamku (panel d) , výsledky jsou uvedeny jako duplikáty s odchylkami označenými čarami.

Oligosacharidy ,které byly navázány k sNKR-P1 v pevné-fázi vazebných experimentů inhibovaly vazbu proteinu (Obr. 2a). Jestliže DLNN byl užit jako referenční imobilizovaný ligand, Nacetylglukosaminem -zakončené a fukosou- zakončené oligosacharidy, DLNN a LA5 byly přibližně 10x více potentními inhibitory vazby (IC ₅₀ 3x 10'⁸ M a 2 χ 10⁷ M) než monosacharidy , N-acetylglukosamin a fukosa zkoumaná dříve (21). Navíc , sialylovaný oligosacharid 3SA5 a sulfátovaný oligosacharid SUA5 byly přibližně 10x 100 x více potentní než LA5 s IC50 hodnotami

1.3 x 10 ^sM (neukázáno) a 3x 10'⁹ M,. Rovněž mannoso- 6 fosfát (IC50 6x 10'⁸ M) byl téměř 20 tisíckrát více aktivní než nesubstituovaná mannosa (IC5o1O'³ M(ref 21) a a pak byl další 10x vzrůst aktivity (IC 50 5 x 10'⁹) v přítomnosti zvýšení “mannosylové kostry” jako v M5P. Nejvyšší inhibiční aktivity byly zjištěny se sulfátovanými oligosacharidy z heparinu a chondroitin sulfátu (Obr. 2a a b), hodnota IC50 pro nejvíce potentní mezi těmito jsou IS a IS2, kde jsou hodnoty 10'¹¹ M a 1.3 χ 10'¹² M.

ICsohodnoty pro daný oligosacharid se liší vzhledem k užitému imobilizovanému oligosacharidovému Iigandu (Obr. 3a): vyšší koncentrace volných oligosacharidů byla vyžadována jestliže kyselé komponenty , GM2 glykolipid nebo IS neoglykolipid byly užity k povlékaní než DLNN neoglykolipid. Ačkoliv hierarchie inhibičních aktivit porovnávaných čtyř oligosacharidů byla stejná.

Jakmile inhibiční studie byly rozšířeny o polysacharidy (Obr. 2c) bylo zjištěno, že celý heparin glykosaminglykan (navzdory k jeho multivalenci pro NKR-P1 determinanty), byl pouze marginálně více aktivní na váhovou jednotku než cele sulfátovaný tetrasacharid IS2 (IC₅o 30pg/ml a 40pg/ml) To může být reflexe na přítomnost méně sulfátovaných sekvencí (22) v glykosaminglykanové populaci. Příprava síran keratanu měla srovnatelnou aktivitu s heparinem , ukazujíc, že 6-0- sulfátovaná gaiaktosa (22,23) je rovněž rozpoznávaná NKR-P1. Chondroitinsulfátované preparace byly výbornými inhibitory s hodnotami IC₅o 2,5 a 10pg/ml chondroitinsulfátů C,A a B. Vysoko a nízko molekulární formy dextran sulfátů a hyalurunové kyseliny byly nejméně aktivní testované polysacharidy s IC50 0-2 ng/ml,1 ng/ml a 1.8 ng/ml.

V a- a c-, DLNN neoglykolipid byl potažen na mikrodestičkové jamky (64 pmol aplikováno na jamku) a vazba ¹²⁵l- s NKR-P1 (5x10⁴ cpm na jamku) byla měřena v přítomnosti požadovaných koncentrací sacharidů. Regresní křivky byly vyneseny z experimentálních bodů podle vzorce y=IC₅o-F(x+ IC₅o), kde y=1(% inhibice 4-100), x= koncentrace inhibitoru, a IC₅o je koncentrace inhibitoru dávající 50% inhibici vazby.

Zkratky pro mono- nebo -oligosacharidy jsou uvedeny v tabulce 1_f pro polysacharidy platí: CA a CB pro sírany chondroitinu A a B (hovězí); CC síran chondroitinu C (žraloci); H pro heparin ( prasečí střevní mukosa); DH a DL jsou pro vysoko a nízko molekulární sírany dextranu (průměrná molekulová hmotnost 500kDa a 5kDa,' HY hyalurunová kyselina, všechny Sigma Chemical Company? síran keratan (z hovězí rohovky) (23) ·, tečkovaná křivka v panelu c je pro heparin tetrasacharid IS2 vyjádřená pro srovnání v ug/ml.

V b- je uvedena korelace aktivit různých oligosacharidů zkoumaných ve vazebných a inhibičních studiích. Vazebné aktivity byly kalkulovány jako poměry hodnot vázby k specificky imobilisovaným ologosacharidům -k těm, které jsou imobilisovány k DLNN ( vzato z obr. 1 při 64 nebo 8 pmol/jamku). Inhibiční aktivity volných oligosacharidů relativních k DLNN byly kalkulovány jako poměry IC ₅o pro DLNN k hodnotám určených oligosacharidů- hodnoty IC₅o byly odečteny z inhibičních křivek uvedených v panelu a, ostatní nejsou uvedeny.

Obrázek 3 ukazuje srovnání schopnosti oligosacharidů jako inhibitorů vazby jódem značeného sNKR-P1 k různým oligosacharidům, a srovnání schopnosti těchto oligosacharidů se stejnými- s neznačeným s NKR-P1 a chondroitin sulfátem A (zkratka CA) jako inhibitorů vazby ¹²⁵l-sNKR-P1 k nádorovým buňkám a k cytolýze různých cílových buněk buňkami NK.

V a-, mikrojamky byly povlečeny DLNN neoglykolipidem nebo GM2 glykolipidem 64pmpl/jamku, nebo IS neoglykolipidem při 8 pmol/jamku (společně s nosičem lipidů (40,41) a byla určena inhibice vazby ¹²⁵l- s NKR-P1 v přítomnosti různých koncentrací volných oligosacharidů IS, GM2, IVA a DLNN. Výsledky byly vyjádřeny jako koncentrace dávající 50% inhibici vazby (IC₅o). V oddělených pokusech (není ukázáno) při užití stupnice- různé hladiny (pro povlékání jamek) na lipidu vázaných oligosacharidů ( vzato 4-32 pmol/jamku DLNN, 0.5-32 pmol/jamku GM2 nebo 0.5-8 pmol/jamku IS), Bylo zjištěno že ICsohodnoty jsou ovlivněny zanedbatelně.

In b-, byla měřena vazba ¹²⁵ I- s NKR-P1 k suspenzím 5x10⁵ buněk. Symboly : YAC-1 buňky, B16S buňky, 1C21 buňky, RNK-16 buňky, glutaraldehydem -fixované RNK-16 buňky, RNK-16 buňky glutaraldehydem- fixované RNK-16 buňky v přítomnosti IS disacharidu, P815 buňky. V oddělených experimentech (neukázáno) sNKR-P1 vazba k čerstvým NK buňkám byla podobná jako pro RNK-16 buňky.

V c- a d-, neznačený sNKR-P1, chondroitin sulfát A (průměrná molekulární hmotnost 15 kDA), a oligosacharidy IS.GM2, IVA a DLNN byly testovány (v koncetračním rozsahu) jako inhibitory vazby ¹²⁵ l-sNKR-P1 k cílovým buňkám YAC-1 , B16S nebo 1C21. výsledky byly vyjádřeny jako IC50·

V e-, cytotoxicity NK-sensitivních YAC-1 a NK-resistentních P815 buněk čerstvými NK buňkami, a v f- cytotoxicity YAC-1, P815 a také NK-sensitivních B16S a 1C21 buňky RNK-16 buňkami byly studovány v rozdílných poměrech efektorových k cílovým buňkám (E:T). Symboly pro cílové buňky byly stejné jako v panelu b-.

V g- , aktivity látek ukázaných v panelu c- byly uvedeny jako inhibitory zabíjení YAC-1 cílových buněk čerstvými buňkami NK, a v h- do j tyto samé látky byly vyjadřovány jako inhibitory zabíjení YAC-1 , B16S a 1C21 buněk buňkami RNK-16 v poměru E:T udaných v metodách.

V panelu k-, schopnosti s NKR-P1, chondroitin sulfátu A a oligosacharidů IS a GM2 jsou porovnávány jako inhibitory sNKRP1 vazby k YAC-1, B16S a 1C21 buňkám (IC₅o hodnoty užity z panelu c) a zabíjení YAC-1 buněk čerstvými NK buňkami a YAC1,B16S ,1C21 buněk RNK-16 buňkami v poměru E:T udaných v metodách (IC₅o hodnoty z pokusů zde neukázaných).

Symboly pro inhibitory v panelech g - až k- jsou: čtverce pro sNKR-P1, kroužky pro chondroitin sulfát A, diamanty pro disacharid IS, pravá strana nahoře trojúhelníčky pro GM2 tetrasacharid, vpravo dole trojúhelníčky pro DLNN trisacharid: zavřené otevřené a vpravo čárkované symboly jsou užity pro YAC1, B16S a 1C21 buňky, pro výsledky užity čerstvé NK buňky, malé uzavřené symboly jsou užity k odlišení výsledků získaných RNK16 buňkami.

METODY.

Čerstvé NK buňky byly izolovány z potkaních slezin samců Fisher F344 adherencí na plastik (45), následovně inkubací ve 200 U/ml rlL-2 (Cetus Inc.) 2 hod. RNK-16, NKR-P1+ buněčné linie odvozené z velkých granulárních leukemických lymfocytů potkana rostly in vitro v kompletním RPMI (medium obsahující 10% fetálního telecího séra, L-glutamin a antibiotika) s 25uM 2merkaptoetanolu (RPMI/ME). NK-sensitivní cílové buněčné linie YAC-1 (T-buněčný lymfom), B16S (melanoma), 1C21 (makrofágy) a NK resistentní buněčná linie P815 (mastocytom) byly získány z americké sbírky tkáňových kultur a kultivovány v kompletním RPMI mediu.

Pro vazebné radiostudie , buňky byly promyty 3x RPMI s 10mM Hepes pH 7.4 (RPMI/Hepes) a suspendovány v koncentraci 5x10⁶ buněk /ml .100ul buněčné suspenze (v tripletech v 1.5 ml zkumavkách Eppendorf) byly smíchány s ¹²⁵f-s NKR-P1 ředěným v 10ul RPMI/Hepes, inkubovány při při 23° C po dobu 1 hod: buněčný pelet byl získán při 1000g po dobu 5 min, buňky 5x promyty v 1 ml RPMI/Hepes, a radioaktivita meřena na gama počítači.

V paralelním experimentu RNK-16 buňky byly předinkubovány s IS disacharidem (10'⁷ M) v 10mM fosfátovém ústojném roztoku (PBS) nebo PBS samotném, fixovány přidáním glutaraldehydu na finální koncentraci 0.01% (v/v) a inkubovány 10 min. Buňky byly peletovány a 5 x promyty v PBS, veškerý glutaraldehyd byl odmyt při 37° 30 min. kompletním RPMI mediem, buňky byly 3x promyty RPMI/Hepes a použity k měření vazby ¹²⁵ Is NKR-P1 jak bylo dříve popsáno.

Pro inhibici buněčné vazby , 0.5 x 10⁶ buněk bylo smícháno s ¹²⁵ I- sNKR-PI při koncentracích dávajících poloviční saturaci vazby. Sériová ředění inhibitorů byla zahrnuta ( celkový reakční objem 100 ul ) a vazebné kalkulace na buňku byly vyjádřeny jak je dříve uvedeno. Spontánní lyže nádorových buněk čerstvými buňkami NK a RNK-16 buněčnou linií byla změřena v tripletech při E:T poměrech : od 0.5 do 64:1 standardní⁵¹ Cr technikou uvolnění chrómu (47) při 37° C za 4 hodiny v celkovém kultivačním objemu 250 ul, spontánní uvolnění ⁵¹Cr bylo změřeno v nepřítomnosti efektorových buněk a nepřesahovalo 5%.

Inhibiční testy cytotoxicity při užití buněk YAC-1, B16S a 1C21 cílových buněk byly provedeny při E:T poměrech'= 2:1,4:1, a 16:1 v přítomnosti sériově ředěných inhibitorů v celkovém objemu kultivačního media 250 ul.

PŘÍKLAD 4

Sacharidy inhibovatelná vazba sNR-P1 na buňky.

Vazba ¹²⁵l- značeného s NKR-P1 byla prováděna s nádorovými buněčnými liniemi YAC-1, B16S a 1C21, které jsou známými cílovými buňkami pro NK buňky ²⁴ Zanedbatelná byla vazba k NK -resistentní buněčné linii P815 buněk (Obr. 3b). Vazba k cílovým buněčným liniím byla inhibovatelná s nenaznačeným s NKR-P1 (Obr. 3c). Vazba byla pravděpodobně zprostředkována sacharidy .protože byla sacharidy inhibovatelná a hierarchie inhibičních aktivit 4 oligosacharidů byla podobná. Sledované inhibiční experimenty byly provedeny s imobilisovanými oligosacharidy (cf Obr. 3a a 3c).

Při použití YAC-1 buněk, tCso hodnoty pro oligosacharidy byly srovnatelné s těmi kde bylo použito glykosaminglykanového disacharidu IS k pokrytí jamek (Obr. 3c),Když byly použity B16C buňky, IC₅o hodnoty dosahovaly IS a GM2 oligosacharidů, nikoliv však IVA a DLNN při nejvyšších koncentracích (10'⁴ M), jestliže byly užity buňky 1C21 byla nalezena inhibice s IS nikoliv s ostatními oligosacharidy. Analogické byly zjištěny rozdíly mezi IC50 hodnotami při použití imobilizovaných GM2 a tS (Obr. 3a), výsledky naznačují, že mohou existovat rozdíly v repertoáru ligandů kyselých oligosacharidů pro každou ze tří cílových buněčných linií.

Nepatrná vazba sNKR-P1 byla zjištěna k buňkám NK linie RNK-16 (Obr. 3b), také k čerstvým buňkám NK (výsledky neukázány) a dodatečná vazebná místa byla objevena jestliže tyto buňky byly opracovány NKR-P1 inhibičním disacharidem IS, během fixace glutaraldehydem , během vazebných experimentů (fixace glutaraldehydem per se neměla vliv na vazebnou aktivitu jak je ukázáno na Obr. 3b) a nebyla změna v hladině sNKR-P1 vazbě k P815 buňkám, jestliže byly podobně opracovány IS a fixovány glutaraldehydem (neukázáno). Jestliže IS byl vymyt z RNK-16 buněk před fixací neproběhlo zvýšení vazby sNKR-P1 (neukázáno).

Tato zjištění napovídají existenci reversibilní cis- interakce mezi membránově asociovanými sacharidovými ligandy a endogenním NKR-P1 (nebo jinými sacharidy-vázajícími proteiny) na povrchu zabiječů, které maskují některá vazebná místa pro exogenní NKR-P1. S čerstvými buňkami NK a buňkami RNK-16, vyžadovaná koncentrace oligosacharidů pro inhibici s

NKR-P1 vazbu byla nižší než vyžadovaná pro vazbu na nádorové buňky, spíše však byly srovnatelné s těmi pro pokrytí DLNN (srovnej Obr. 3a- a d-).

PŘÍKLAD 5

Sacharidy - inhibovatelné zabíjení cílových buněk.

Protein sNKR-P1 nevyvolává detekovatelnou lysi je-li přidán k cílovým buňkám YAC-1,B16S nebo C21 v koncentracích od 0.1 do 100ug/ml (přibližně 2x 10'⁹ do 2x 10'⁶ M) za normálních podmínek NK lytického testu (neukázáno). Avšak je-li lyže YAC-1 buněk zkoumána oběma -čerstvými NK buňkami a RNK-16 buněčnou linií , stejně jako lyže B16S a 1C21 testována RNK-16 (obr. 3e- a f-) , byla inhibovatelná nikoliv pouze sNKR-P1, ale také sacharidovými ligandy pro tento protein (Obr. od 3g-až j-).

Inhibiční data pro čerstvé buňky NK a RNK-16 byla velmi podobná (ukázáno pro YAC-1 cílové buňky v obr. 3g- a h-). IC ₅₀hodnoty pro inhibici zabíjení podobně jako relativní aktivity individuálních inhibitorů se lišily pro 3 cílové buňky testované s RNK-16 buňkami (Obr. 3h- , I- a j-). Hierarchie inhibičních aktivit byla srovnatelná s daty, které byly získány pro inhibici sNKR-P1 k těmto buňkám.

A tak, jak je ukázáno na obr. 3k -byla nalezena silná korelace mezi koncentracemi oligosacharidů nutných pro inhibici vazby sNKR-PI k cílovým buňkám (Obr. 3c-) a pro inhibici předmětných cílových buněk oběma zabiječi- čerstvými buňkami a buňkami RNK-16 (obr. 3g- až j-). Společně tyto výsledky naznačují, že protein NKR-P1 (ostatní proteiny .které mohou být brány v úvahu vazebných specificit a jsou podobné NKR-P1) umožňuje zabíjení nádorových buněk.

K určení zda-li membránově -asociované NKR-P1 na zabiječích je zapojeno v konjugaci s cíly, jsme počítali konjugáty tvořené v mediu postrádajícím kalcium a obsahující EGTA k zabránění lytického procesu. Ačkoliv NKR-P1 je na kalciu- závislý sacharidy vázající protein, asociuje s kalciem velmi pevně, zjistili jsme, že je pouze 20% oslabení v jeho vazbě k DLNN v přítomnosti EGTA (ref. 21).

S ligandy o vyšší afinitě , jako je GM2, nebylo zjištěno oslabení až do doby než byl protein kompletně dekalcifikován za nefysiologických podmínek (obr. 4a). Tak, při studiu konjugátů (v mediu EGTA) bylo zjištěno, že NKR-P1 -zprostředkovaná interakce se sacharidovými ligandy nemůže být závažně ovlivněna.

Jestliže byly užity čerstvé NK buňky za těchto podmínek, vytvořily 11% konjugátů s YAC-1 buňkami (obr. 4b). Počet konjugátů byl nezměněn v přítomnosti sNKR-P1 nebo disacharidu IS v 10‘⁸ a 10'⁷ M koncentraci, ( která umožnila kompletní inhibici vazby ¹²⁵ I- naznačeného sNKR-P1 k nádorovým buňkám ) a kompletní inhibici cytotoxicity (obr. 3c- a f-). Vedle toho, když byly zkoumány aktivované NK buňky .procento konjugáty-tvořících buněk bylo vyšší (23%).Přítomnost sNKR-P1 nebo disacharidu IS v reakční směsi, negativně ovlivnilo množství konjugáty -tvořících buněk jako v případě použití čerstvých buněk (obr. 4b-). Jak jsme již poznamenali dříve (18), množství NKR-P1 na buněčném povrchu srovnatelně vzrostlo po NK buněčné aktivaci (obr. 4c- a d-), kdežto množství CD8 antigenu nebylo změněno a CD5 antigen zůstal nedetekovatelným (obr. 4e až h). A tak, mezi aktivovanými buňkami mohou být odlišeny dvě populace konjugáty-tvořících buněk; první se podobá čerstvým NK buňkám, přičemž tvorba konjugátů může zahrnovat I jiné buněčně adhesivní molekuly (51), a druhá zprostředkovaná NKR-P1 (nebo podobnými proteiny) uskutečňujícími tvorbu konjugátů. Tyto mohou přispět k zvýšení tvorby konjugátů (52).

Popsané experimenty nevylučují objevení se disociovatelných konjugátů zprostředkovaných NKR-P1 (analogy k disociovatelným elementům DLNN-vazby (21) jak je diskutováno výše) .které nemusí být detekovány v nepřítomnosti kalcia v kultivačním mediu.

Obr.4 poukazuje na vazbu sNKR-P1 proteinu k vysoce afinitním sacharidovým ligandům, GM2 glykolipidu v nepřítomnosti externího kalcia, zapojení NKR-P1 na povrchu čerstvých a aktivovaných buněk NK, a na účast kalcia nezávislých konjugátů s cílovými buňkami.

V a- plastických mikrojamkách potažených GM2 glykolipidem (64 pmol na jamku) vazba ¹²⁵-l značeného sNKR-P1 byla měřena jako je uvedeno v popise k obr. 1, po následném opracování radioaktivně značeného proteinu : dialýza (4dny) proti 10 mM Tris ústojnému roztoku (TBS) s 10mM Ca Cl₂, pH 8 (TBS+ C) (uzavřená kolečka), nebo dialýza (4 dny) proti TBS obsahujícímu 10m M EGTA, pH 8 (TBS+E) (otevřená kolečka), nebo “kompletní dekalcifikační (21) dialýza” proti 0.1 M Tris-HCl, pH 10 po dva dny následovaná dialýzou proti TBS+E po dva dny (otevřené čtverečky), alikvótní duplikáty vzorků byly dialyzovány zpět do TBS +C po dva dny ( uzavřené čtverečky).

V b - vliv sNKR-PI a IS disacharidu byl zkoumán na tvorbu konjugátů čerstvými a aktivovanými NK buňkami s YAC-1 cílovými buňkami, v kontrolním experimentu v nepřítomnosti inhibitorů, nebo v přítomnosti sNKR-P1 a IS testovaných jako inhibitory. Výsledky jsou uvedeny jako % NK buněk tvořících konjugáty (průměr se stand. odchylkou ze tří určení).

V c- až h- ukázka zvýšené exprese NKR-P1 na aktivovaných buňkách (s chyběním exprese CD5 a nezměněné účasti antigenu CD8) .Provedena průtoková cytofluorometrie za účelem exprese antigenů NKR-P1, CD8 a CD5 (plné čáry) na čerstvých buňkách NK (panely c-, e- a g-) a na aktivovaných buňkách NK (panely d-, f- a h-) . Tečkované linky označují fluorescenci v kontrolních experimentech užitím fluoresceinem- značených buněk pouze při použití králičího anti-myšího imunoglobulinu.

METODY

Čerstvé buňky NK byly připraveny jak je uvedeno v popisu k obr. 3, k dosažení maxima exprese buněčného NKR-P1 (ref. 18) , čerstvé buňky NK byly aktivovány kultivací po dobu 120 h v přítomnosti rlL-2, (množství 1000 U/ml).

Pro měření tvroby konjugátů (50) , YAC-1 buňky byly značeny hydroethidinem a efektorové buňky kalceinem-AM (obě látky z Molecular Probes), buňky dále promyty, suspendovány v mediu PBS bez kalcia - obsahujícím 10mM MgCI₂. 10⁵ použitých buněk bylo smícháno v tripletech v nepřítomnosti aditiv nebo v přítomnosti s NKR-P1 (10-8 M) nebo IS disacharidu (10'⁷ M),.Buňky byly stočeny při 4 stupních Celsia, ohřátý na 37 stupňů C po dobu 10 minut a % konjugáty-tvořících buněk bylo odečteno za podmínek dvou-barevné průtokové cytometrie (FACSort, Becton Dickinson).

Pro provedení cytofluorometrické analýzy a měřeni exprese povrchových antigenů NKR-P1,CD 5 ,CD8, čerstvé nebo aktivované NK buňky byly inkubovány v PBS obsahujícím 3% hovězího sérového albuminu a 0.1% NaN₃ . Následně byly přidány saturující koncentrace monoklonálních protilátek 3.2.3 (proti NKR-P1, ref. 18) , nebo OX8, nebo OX 19 (obě z Serotec) a inkubovány při 23° C, poté buňky promyty a inkubovány při 23° C po dobu 1 hodiny v PBS s 0.1% Na N₃ obsahujícím fluoresceinem značený králičí anti-myší imunoglobulin (Cappel Inc. 1 ug/ml). Buňky byly promyty v PBS mediu bez Ca²⁺/Mg²⁺’ s 0.02% EDTA a analyzovány v průtokové cytometrii.

PŘÍKLAD 6

Oligosacharidy-zprostředkovaná aktivace zabiječských buněk.

V souladu s dřívějšími zjištěními (19), lnsP3 a lnsP2 hladiny se zvyšují po exposici RNK16 buněk s YAC -1 buňkami (obr. 5a, b) nebo propojením membránově- asociovaných molekul NKR-P1 s protilátkami (panely g- a h- ). Odpovídavost k YAC-1 buňkám byla potlačena v přítomnosti sNKR-P1 a heparindisulfidu IS (panely aa b-) při koncentracích které inhibovaly ¹²⁵-l -sNKR-P1 vazbu k cílovým buňkám (1Ο'^β Μ, 10'⁷ M). Obsah cytoplasmatického kalcia po exposici k buňkám YAC-1 (panel 5c) byl také utlumen v přítomnosti sNKR-P1- dokazujíc, že interakce membránově asociovaného NKR-P1 (nebo proteinů majících podobné vazebné specificity) s ligandy na povrchu nádorových buněk jsou intimně zapojeny ve spuštění aktivačních procesů.

Liposomy obsahující na lipidy vázané oligosacharidové ligandy pro NKR-P1, neoglykolipid disacharidu IS a glykolipidu GM2 jsou-li přidány k buňkám RNK16 vyvolají zvýšenou hladinu lnsP3 a lnsP2, která je srovnatelná s hodnotami zjištěnými po propojení membránově asociovaného NKR-P1 s protilátkami (srovnej panely d- a e- s panely g- a h-). Odpovědi vzniklé shluklými oligosacharidy byly inhibovatelné jakmile byly dodány do reakční směsi volné oligosacharidy (panely d- a e-).

Navíc, na dávce zvýšené uvolnění cytoplasmatického kalcia bylo zjištěno v RNK-16 buňkách po jejich exposici liposomům s GM2 (panel f-). Účinek je odvislý na densitě glykolipidů zabudovaných do liposomů- byly pozorovány tři hladiny zabudování GM2 : při 0.2 nmol/ 100ul liposomů byla pozorována malá změna volného cytoplasmatického kalcia. Při 2 nmol / (equivalent k hladině fosfoinositidového experimentu v panelu d -a e-), bylo zvýšení více patrné než u 20nmol. Na densitě-závislé spouštění uvolňování kalcia bylo také inhibovatelné u GM2 jestliže GM2 oligosacharid nebo sNKR-P1 byly včleněny v reakční směsi (panel f-).

V experimentu, v kterém RNK-16 buňky byly exponovány přítomnosti chondroitinsulfátu A (10‘⁷ M), indukované hladiny lnsP3 a lnsP2 (panely g-a h-) byly téhož řádu jako byly zjištěny při exposici YAC-1 buněk popsaných v panelech a- a b -(vezmi na vědomí odlišné stupnice v panelech a-, b-, a g- a, h-), nelze pochybovat o zvýšení cytoplasmatického kalcia (panel i-).

Na rozdíl od význačných účinků zjištěných u sdružených oligosacharidových ligandů presentovaných liposomy, kde RNK16 buňky byly exponovány s volným disacharidem IS, žádné změny nebyly nalezeny v hladině inositolfosfátů (panely g- a h-), ačkoliv malé (ale reprodukovatelné) zvýšení bylo nalezeno v cytoplasmatickém kalciu (panel i-) .

Obrázek 5 ukazuje zapojení protein-sacharidové interakce v aktivaci buněk NK. Hladiny lnsP3 (panely a-,d- a g-), lnsP2 (panely b-,e- a h-), a cytoplasmatického kalcia (Ca²⁺)i (panely c-,f, a i) byly změřeny u efektorových buněk RNK-16 po jejich interakci s YAC-1 cílovými buňkami (panely a-, b-, a c-), nebo s liposomy obsahujícími oligosacharidové ligandy pro NKR-P1 (panely d-,e- a f-) nebo s monoklonálními NKR-P1 protilátkami, nebo chondroitin sulfátem A nebo volným disacharidem IS (panely g-,h- a i-).

V a- a b- bylo zjišťováno množství vzniklých inositolfosfátů (19) jestliže myo- (³H) inositol-značené buňky RNK-16 (5x 10⁶ v

0.25 ml RPMI media /ME) byly smíchány se stejným množstvím

YAC-1 buněk (0.25 ml) v nepřítomnosti inhibitorů (uzavřené kroužky) a v přítomnosti IS disacharidu (10'⁷ ) nebo sNKR57

P1 proteinu (10'⁸) (otevřené kroužky a otevřené čtverečky).

V d- a e- byly zkoumány inositolfosfáty jestliže NKR-16 buňky (5x 10 ⁶ v 0.45 ml RPMI/ME) byly inkubovány s 50 ul liposomů ⁴⁸ skládajících se z 25 nmol (obě hodnoty) cholesterolu a vaječného lecithinu se zabudovaným neoglykolipidem IS (2.5 nmol, uzavřené, vpravo nahoře trojúhelníčky) nebo GM2 glykolipidy (1nmol uzavřené, vedle dole trojúhelníčky). V paralelních pokusech (odpovídající symboly otevřené) inkubační směs obsahovala rovněž volné oligosacharidy IS a GM2, (10 '⁷ a 1Ο'^θ M ).

V g- a h- inositolfosfáty byly zkoumány za následujících podmínek : myo (³ H) inositolem značené RNK-16 buňky ( 5 x 10 ⁶ v 0.5 ml RPMI/ME) byly inkubovány s 0.5 ug fragmentů F(ab ‘) 2 ¹⁹ purifikované monoklonální protilátky 3.2.3 a potom propojeny (18) přidáním 1 ug/ml F(ab’) 2 kozího anti-myšího imunoglobulinu (Capell lne.) (uzavřené čtverečky), nebo chondroitinsulfátu A , 10'⁷ M (plné čtverečky) , nebo chondroitin sulfátu A, 10‘⁷ M (uzavřené diamanty) nebo disacharidu IS (10‘⁷, uzavřené trojúhelníčky).

V c, - f-, a i- byly zkoumány základní hladiny volného cytoplasmatického kalcia (49) 5 minut než RNK-16 buňky jsou opracovány lndo-1 AM a bez aditiv. Reaktanty v c- se skládají z 10na 6 RNK-16 buněk a ze stejného počtu YAC-1 buněk v 1 ml RPMI/ME v nepřítomnosti inhibitoru (uzavřené kroužky) nebo v přítomnosti 1O'⁸ M sNKR-P1 buněk přidaných přidaných před cílovými buňkami (otevřená kolečka).

V f-, reakční směs se skládala z 1O⁶ RNK-16 buněk v 0.9 ml RPMI/ME a 100 ul liposomů (50 nmol cholesterolu a 50 ul vaječného lecithinu) GM2 glykolipidů, 0.2 nmol (otevřené ,vpravo nahoře trojúhelníčky), nebo 2 nmol (uzavřené vpravo nahoře trojúhelníčky) , nebo 20 nmol (uzavřené vpravo dole trojúhelníčky) , nebo 2nmol tetrasacharidu (10-6 M) nebo sNKRP1 proteinu (10'⁸ M) . Výsledky s GM2 tetrasacharidem jsou ukázány,s sNKR-P1 byly podobné.

V i- , reakční směs obsahovala 10^e buněk v 1 ml RPMI/ME a 10'⁷ M chondroitinsulfátu A (uzavřené diamanty) nebo disacharidu IS (uzavřené trojúhelníčky). Po 15 minutách inkubační směs byla podrobena účinku 1uM ionomycinu za účelem maximální stimulace uvolnění kalcia z intracelulárních reserv.

PŘÍKLAD 7

NKR-P1 vazba a cytolýza ligandy sialylovaného a glykosaminglykanového typu na cílových buňkách

Nádorové linie byly opracovány sialidásou, heparinásou I, chondroitinásou ABC jednotlivě nebo ve směsi. Výsledky získané NK sensitivními buňkami YAC-1,B16S a 1C21 byly podobné. Výsledky pro YAC-1 a NK-resistentní P815 buňky jsou ukázány na obr. 6.

Vazba sNKR-P1 a cytolýza NK- vnímavých nádorových buněk byla odstraněna opracováním sialidásou a chondroitinásou, směs obou enzymů měla nejvyšší účinek se snížením s NKR-P1 vazby přibližně na 60% a snížením specifické cytolýze přibližně na 50% kontrolních hodnot, kdežto heparinasa měla malý účinek (panely a- a b-). V příbuzných pokusech (výsledky neukázány) užití heparinasy III, nemělo vliv na vazbu sNKR-PI nebo cytolýzu 4 nádorových buněčných linií.

Předběžná pozorování, která zahrnovala vazebné experimenty sNKR-P1 k membránovým preparacím nádorových buněk a elektroforézu na polyakrylamidovém gelu s elektropřenosy na nitrocelulósu a chromatogram vazebné experimenty užitím glykolipidových extraktů nádorových buněk ukázaly, že sialylované ligandy na NK-vnímavých buňkách jsou převážně gangliosidy, na YAC-1 buňkách tyto mají chromatografické vlastnosti a fragmentační profily při použití techniky “liquid secondary ion mass spectrometry” shodné s těmi -pro GD1A, GN1,GM2,GT1A (se snižující se převahou). Chondroitinásavnímavé ligandy jsou polydispersní proteoglykany větší 200kDa 60kDa (jejich popsání bude uvedeno jinde).

Úlohy pro ligandy gangliosidového a glykosaminového typu na cílových buňkách lze spatřovat v úloze mediátorů přirozeného zabíjení. To může být jasně ukázázno provedením cytolytického testu (E:T poměry 16:1) po exposici NK-resistentních buněk P815 k liposomům obsahujícím GM2 glykolipid nebo heparin disacharid IS nebo neoglykolipid laktósy (Obr. 6, panele-). Jestliže v nepřítomnosti liposomů, nebo v přítomnosti liposomů obsahujících neoglykolipid laktósy je specifická lýze těchto buněk pouze 10% , preinkubací P815 buněk s GM2 nebo IS liposomy dosáhneme vzrůstu na 60% a 80% specifické lýze. Tak, předložení NKR-P1 ligandů na liposomech tyto NK resistentní buňky se stávají vždy sensitivní k cytolýze jako cílové buňky YAC-1 v E:T poměru 16:1 ( cf obr. 3d-). Preinkubace YAC-1 buněk s GM2 nebo IS liposomy vede k zvýšené cytolýze těchto buněk rovněž v poměru E:T= 4:1 (Obr. 6, panel c-). Jestliže po preinkubačním kroku slabě asociované liposomy byly odmyty z nádorových buněk , cytolýza nádorových buněk vzrostla, ale v menším rozsahu (panel c-) . Jestliže předinkubace s liposomy byla vynechána , byla pozorováno pouze slabé zvýšení lyže P815 buněk (přibližně 25% hodnoty s GM2 liposomy a 30% hodnoty s IS liposomy).

Obrázek 6 ukazuje úlohy membránově-asociovaných komponent sialylového a glykosaminglykanového typu jako ligandy

NKR-P1 na nádorových buňkách. Podobné úlohu těchto komponent pro vnímavost k cytolýze a indukci NK vnímavosti k resistentním nádorovým buňkám za pomoci inkubace s liposomy exprimujícími oligosacharidové ligandy.

V a-, vazba ¹²⁵ l-sNKR-P1 byla měřena na 5x 10⁵ YAC-1 nebo P815 buňkách. Buňky byly opracovány sialidásou (S’ ase) nebo heprinásou I (H ‘ase) nebo chondroitiásou ABC (SC ‘ase) nebo směsí silaidásy, chondroitinásy ABC a heprinásy I (SCH ‘ase) , a výsledky byly porovnány s výsledky vazby buněk opracovaných směsí teplem opracovaných enzymů (Kontrola).

V b-, cytolýza buněk YAC-1 a P815 čerstvými NK buňkami byla sledována po opracování nádorových buněk, jako v panelu a-, glykosylhydrolásami nebo inaktivovanými enzymy.

V c-, cytolýza YAC-1 nebo P815 buněk čerstvými NK buňkami byla sledována po exposici nádorových buněk k liposomům exprimujícím neoglykolipid laktósy (LAC), glykolipid GM2 (GM2) nebo neoglykolipid disacharidu IS (IS). Podmínky pro liposomovou exposici byly následující preinkubace s liposomy byla následována promytím nádorových buněk (P+W+), nebo preinkubace s liposomy nebyla následována promytím nádorových buněk (P+W-), nebo nebyla provedena preinkubace a promytí nádorových buněk (P-W-). Výsledky jsou srovnávány s cytolýzou nádorových buněk v nepřítomnosti liposomů (kontrola).

V d-, plasmatické membrány buněk YAC-1 a P815 byly podrobeny SDS-elektroforése na polyakrylamidovém gelu, a přeneseny na nitrocelulózu. Proužky byly barveny na obsah proteinů (linie 1)nebo převrstveny s ¹²⁵l- sNKR-P1 k autoradiografii (za 3h), vazbě komponentů (Iinie2), s YAC-1 buněčnými membránami, další proužky (linie 3, 4 a 5) byly testovány na vazbu po opracování silaidásou, chondroitiásou ABC nebo heparinásou I. Jsou vyznačeny posice molekulových hmotností (kDa).

V e-, linie 1 ukazuje vazbu ¹²⁵l- sNKR-P1 sledovanou k lipidům extrahovaným z YAC-1 a P815 buněčných membrán rozpuštěných TLC. Opakované proužky, linie 2, byly barveny primulinem. O označuje posici aplikace, GM1 ,GD1 A,GD1 B,GD1 B laktonu (GD1BL) a GT1B ukazuje posice autentických standardů. GD1(A)L je minoritní glykolipidová komponenta označena jako GD1A lakton. Vazba k relativně nízkobohatému glykolipidu GTB1 aGD1B byla slabé intensity (šipka) v 3h autoradiogramech.

METODY.

Pro glykosylhydrolásové opracování kultivovaných nádorových buněk promytí bylo provedeno 3x PBS: 10⁷ buněk bylo resuspendováno v 0.9 ml 0.01 M fosfátového pufru pH 6.5 obsahujícícho 0.14 M NaCl . Enzymy (0.1 U Arthrobacter sialidase, nebo 2 U chondroitinásy ABC z ískané od Boehringer Mannheim , nebo 100 U heparinásy I nebo 100U heparinásy III získané od Sigma nebo směs enzymů) byly přidány k buněčným suspenzím v 0.1 ml téhož pufru a inkubovány 30 min při 37° C. Jako kontroly byly použity buňky inkubované v přítomnosti individuálních enzymů nebo směsi enzymů , které byly inaktivovány inkubací při 100° C po dobu 5 minut. Po těchto opracováních , nádorové buňky byly 3x promyty v RPMI a užity pro vazebné studie s ¹²⁵lsNKR-P1, nebo pro cytotoxické studie s čerstvými NK buňkami jak bylo posáno v popise k obr. 3.

¹²⁵l-sNKR-P1 vazba k buňkám nebo cytolýza buněk opracovaných heparinásou III nebo se čtyřmi tepleminaktivovanými enzymy - stejný postup jako s buňkami pouze v pufru. Výsledky jsou ukázány jako kontroly v panelech a- a b- a jsou vyjádřeny jako průměry hodnot získaných po opracování směsí inaktivovaných enzymů- sialidasy, heparinasy I a chondroitinasy ABC.

V experimentech s exposicí liposomům , YAC-1 nebo P815 buňky ( 10⁵ buněk v 0.9 ml kompletního RPMI) byly smíchány s 0.1 ml liposomů připravených jak bylo popsáno v popise k obr. 4, a obsahujících 2 nmol GM2 glykolipidu nebo neoglykolipidu IS nebo laktosy. Směs byla inkubována 1h při 37° C, a liposomy opracované nádorové buňky byly užity v cytolytických testech po 3x promytí kompletním RPMI nebo bez promytí. Alternativně nádorové buňky byly inkubovány 1 hodinu v nepřítomnosti liposomů a liposomy byly přidány k buněčné suspensi bezprostředně před přidáním efektorových buněk. Jako kontroly sloužily nádorové buňky inkubované pouze v mediu,

Čerstvé NK buňky byly použity k sledování specifické lyse nádorových buněk jak bylo uvedeno v poise k obr. 3 v poměru E:T =4:1 s YAC-1 buňkami a 16:1 s buňkami P815. Tyto poměry byly vybrány ve vztahu k cytolytické křivky u obr. 3d- za účelem maximalisace zviditelní zvýšeného zabíjení obojích NKsensitivních YAC-1 a resistentních P815 buněk.

Výsledky v a- jsou průměry duplikátů s odchylakami vyjádřenými úsečkami a ty v b- a c- průměry triplikát§ se standardními deviacemi. V a- a b- spontánní uvolnění ⁵¹ Cr nádorovými buňkami exponovaných glykosylhydrolásám a v c-, exponovaným liposomům - bylo nižší než 5% v nepřítomnosti efektorových buněk.

Pro identifikaci komponent nádorových buněk které se váží k ¹²⁵l-sNKR-P1, alokvóty membránových preparací (85) povařeny ve vzorkovém pufru (84), rozpuštěny v opakujících se liniích 3-7% gradientu SDS- polyakrylamidového gelu (30g membránových proteinů na lini) a elektropřeneseny z gelů na nitrocelulósové membrány (0.45m, BioRad Laboratories, Hercules, CA), nastřihány na proužky . Jeden proužek byl obarven na proteiny (AuroDye, Amersham, UK). Ostatní proužky byly blokovány v 10mM CaCb, 5%BSA a 0.1% Tween 20 a inkubovány při 20° C 1 h pouze s blokovacím reagentem , nebo sialidasou 10U/ml nebo heparinásou I 100U/ml nebo chondroitinásou ABC 1U/ml v 0.01 M fosfátovém pufru pH 6.5, promyty a vazba ¹²⁵l sNKR-PI byla určena za podmínek uvedených u obr. 2a.

Po lipidové extrakci (88) plasmatických membrán , extrakty byly odsoleny na Sep-Pak Vac C18 patronách. (Millipore, Bedford.MA) a rozpuštěny v tenké vrstvě chromatografcky v chloroform/metanol/0.5% kalcium chlorid, 55/10 (v/v) užitím 4g extraktu pro linii. Lipidy byly visualisovány barvením primulinem (38) a vazba ¹²⁵ l-sNKR-P1 určena autoradiograficky podle popisu obr. 1a. Vázané komponenty byly analyzovány přímo na chromatogramech pomocí kapalinové sekundární iontové hmotové spektrometrie (44). GD1B lakton byl chemicky syntetizován (nepublikováno)- syntetický GD1A lakton nebyl vhodný.

DISKUSE K PRÁCI S NKR-P1

Výsledky poukazují za prvé, že mebránově-asociovaný NKRP1 na buňkách NK je klíčový efektor jehož interakce se sacharidovými ligandy na nádorových buňkách vede k aktivaci zabíječské buňky, což vede k zabytí cílové buňky a za druhé , že sialylové a glykosaminoglykanové typy sekvencí tvoří přirozené ligandy NK- vnímavých nádorových buněk.

Úloha NKR-P1 v zabíjecí kaskádě nemusí být prokázána ostatními jsou-li podniknuty pokusy (25) blokovat zabíjení užitím monoklonální protilátky 3.2.3 specifické pro NKR-P1.

Z našich výsledků lze vyvodit, závislosti na typu cílové buňky, odlišných tříd oligosacharidů : rodiny krevně skupinových, rodiny ganglio a glykosaminglykanů .které na cílových buňkách mohou představovat ligandy pro NKR-P1.

Mnohotvárná specificita oligosacharidů, znak sdílený ostatními endogenními lektiny (6) (často se překrývající ve vazebných specificitách) je mimořádně vyjádřen v případě NKRP1. Extensivní křížové rekace zjištěné u NKR-P1 mohou být reflexí vysoce afinitních CRD tohoto proteinu pro kalcium a sacharidy jak bylo již dříve ukázáno (21). Výsledky ukazují že nejvyšší afinity jsou namířeny proti kyselým oligosacharidům chrondroitin sulfátu, heparinů a keratansulfátů (mezi sacharidy doposud sledovanými).

Mnohé z látek zde identifikované jako NKR-P1 ligandy, na příklad GM2 a heparin inhibují přirozené zabíjení jak bylo již dříve ukázáno (27-29). Vnímavost lidské leukemie, buněk lymfomů k NK lysi může být korelována s expresí GM2 (30). V souladu ze zjištěními zde v potkaním NK systému při použití strukturálně definovaných oligosacharidů, jiné výsledky (29) poukazují v myším systému na inhibiční aktivity heparinů v korelaci s jeho negativním nábojem (tj. stupněm sulfatace). Žádného inhibičního účinku nebylo dosaženo (touto skupinou) s chondroitinsulfáty A, B, a C (glykosaminoglykanový zdroj a cílové buňky nespecifikovány) .

Výsledky nabízejí vysvětlení pro zjištění (31,32) že přirozené zabíjení je inhibovatelné v přítomnosti mannoso-6-fosfátu (a hexoso-6-fosfátů)-fenomén pro který v pozdějším výzkumu (33,34) bylo prokázáno, že se netýká mannoso-6-fosfátového receptoru. S pohledu, že byla nalezena afinita NKR-P1 pro mannoso-6 fosforylované oligosacharidy, bylo by zajímavé zkoumat zda-li tento protein má úlohu ve spouštění mannoso-6-fosforylovaných lysosomálních enzymů přítomných uvnitř granulí NK buněk.(34), a odeslání hydrolytických enzymů k cílovým buňkám v zabíjecích procesech.

Mnohé NKR-P1 ligandy identifikované v přítomné studii byly detekovány imunochemicky na povrchu NK buněk. Ty zahrnují asialo GM1 (GA1) u myší (35), a HNK-1 (36) a sialyl-Le^x (37) u lidí. Tyto antigeny nepatří mezi s nejvyšší aktivitou ligandu pro NKR-P1. (Obr. 1c). Vedle toho existuje průkaz, že část ligandu na povrchu NK buněk zůstává v kryptickém stavu během sacharidy inhibovatelných interakcí s endogenně membránově-asociovanými komponentami. Tyto skutečnosti mohou sloužit k ochraně NK buněk před auto-lýzou.

Různé účinky exogenně použitých monomerických (volných) a sdružených oligosacharidových ligandu na aktivaci NK buněk mohou mít specielní význam v řídících mechanismech cytolytické kaskády a naznačit nové imunomodulační léky. Monomerické oligosacharidové ligandy nejen že kompetují pro vazbu s NKR-P1, ale také inhibují NK buněčnou aktivaci, která je vyvolávána cílovými buňkami a sdruženými oligosacharidovými ligandy. Na rozdíl, sdružené na lipid- vázané oligosacharidové ligandy na liposomech mohou sloužit jako “decoys” ,které napodobuje cílové buňky a má schopnost densitně-závislé aktivace NK buněk: zvyšující se hladina cytoplasmatického Ca²⁺ je zjištěna se vzrůstající densitou až ke kritické densitní hladině, na které Ca²⁺ hladina je nižší.

Z pohledu výzkumu léčiv je patrné, že silný negativní nebo positivní dopad na cytolytický proces může být jednoduše uskutečněn volnými nebo na lipid- vázanými formami heparindisacharidu který postrádá (22) antikoagulační aktivity. Ukázka, že NK-resistentní nádorové buňky mohou být udržovány vnímavé po předléčení sdruženými NKR-P1 ligandy na liposomech, nabízí velmi silnou terapeutickou možnost k napadení vybraných buněk.

MODULACE BUNĚČNĚ AKTIVITY VIA CD69

K zahájení ligand identifikační studie , byla připravena rozpustná dimerická forma CD69 proteinu, (zde označena jako sCD69). Byla získána expresí jeho extracelulární části v Escherichia coli. Počáteční studie ukazují, že protein je neobyčejně svázán s kalciem, znakem společným pro NKR-P1 a že sacharidová vazebná afinita proteinu je spojena s N- acetyl-Dglukosaminem a N- acetyl-D-galaktosaminem jako silnými monosacharidovými inhibitory.

příklad 8

Produkce rozpustné formy CDG9 v E. coli.

Byly připraveny tři proteiny obsahující extracelulární části CD69 antigenu : CDA-401 zahrnující extracelulární část minus dvě aminokyseliny začínající glycinem 64, CD-411 je zkrácen a cystein 68 je nahrazen argininem, CD-421 skládající se z lektinové domény.

Korespondující DNA fragmenty byly přeneseny do pMALc2 expresního vektoru “dowmstream from a unique EcoRI site”. EcoRI linker byl použit z důvodů korekce čtecího rámečku, a expresní plasmidy byly sekvenovány z double-stranded templátů užitím pMAL primeru a TaqTrack sekvenační protokol (Promega, Madison, USA).

Rozpustné CD69 proteiny byly exprimovány jako fúsní proteiny s bakteriální maltosu-vázajícím proteinem v E. coli kmene

NM a štěpeny faktorem Xa. Po štěpení a purifikaci za denaturačních podmínek, rozpustné CD69 proteiny byly renaturovány podle CD69 epitopů rozpoznávaných dvěma monoklonálními protilátkami. 10 cyklů Edmanovy degradace bylo připraveno s naštěpenými proteiny k určení přítomnosti aminokyselin (4-5 aminokyselin z expresního vektoru bylo přítomno).

Rekombinantní rozpustný CD69 byl užit v pokusech zde popsaných jako CDA-401 a byl purifikován gelovou filtrací na Sephacryl S-200 SF koloně, koncentrován na 10mg/ml a skladován při 4° C v Tris-ústojném roztoku (TBS) obsahujícím 10mM CaCI₂ a 1mM NaN₃.

příklad 9

Ligandy CD69

Pilotní vazebné pokusy byly prováděny s rozpustnou molekulou sCD69 značenou radioiodinací, a několika na lipid vázanými oligosacharidy (neoglykolipidy), které též obsahovaly monosacharidy N-acetylglukosamin a N-acetylgalaktosamin, o nichž bylo ukázáno, že tvoří strukturu rozpoznávanou tímto proteinem.

Trisacharid DLNN obsahující terminální N-acetylglukosamin (sekvence oligosacharidů jsou uvedeny v Tabulce 2) byl vázán s hodnotou signálu jasné nad úrovní pozadí v množství 300 pmolů na jamku (Obr. 7). Vazba na tuto sekvenci byla porušena v přítomnosti terminálně navázané beta 1-3 galaktosy, jak je patrné u LNT. Ani disacharid laktosa nebyl vázán (výsledek není ukázán), avšak vysoká vazba byla pozorována u 6'-sialyl analogu 6SL, nikoliv však u 3' sialyl analogu, 3SL, což ukazuje na specifickou vazbu kyseliny N-acetylneuraminové s vazbou alfa 2-6.

Tento závěr byl až překvapivě potvrzen vazebnými pokusy s disacharidem SN, který obsahuje N-acetylneuraminovou kyselinu vázanou právě vazbou alfa 2-6 na N-acetylgalaktosamin. Vazebný signál pro SN v množství 1 pmolu na jamku byl ekvivalentní signálu 300 pmolů DLNN, která obsahuje nesubstituovaný terminální N-acetylgalaktosamin. Přídavná vazba 6-O-substituovaného sulfátu molekulou CD69 byla prokázána ve vazebných studiích s použitím disacharidu z chondroitin sulfátu 6S, který obsahuje 6-0 sulfatovaný glukosamin, a dva další sulfáty 2 O substitující uronovou kyselinu a N-substitující glukosamin.

Pro získání představy o relativních aktivitách oligosacharidů s rozličným způsobem sialylace a sulfatace, serie volných oligosacharidů byla zkoumána jako inhibitory vazby sCD69.

Počáteční pokusy ukázaly, že inhibiční aktivita (vyjádřená například jako koncentrace inhibitoru nezbytná pro dosažení 50 5 inhibice, IC₅o) závisí na síle vazby immobilizovaným ligandem: přibližně desetkrát vyšší koncentrace seacharidových inhibitorů jsoyu nezbytné jestliže se jako immobilizovaný ligand použije neoglykolipid odvozený od disacharidu heparinu IS ve srovnání s neutrálním neoglykoproteinem GlcNAc₂3-BSA, který sloužil jako imobilizovaný ligand v počátcích našich studií. V případě, že se buďto tento neoglykoprotein nebo IS neoglykolipid (Tabulka 2) poožijí jako immobilizované ligandy, hodnoty IC₅o pro Nacetylgalaktosamin jsou 8 x 10'⁵ M resp. 2 x 10‘⁴ M a pro Nacetylglukosamin 4 x 10'⁵ M resp. 1 x 10‘⁴ M.

V předkládané studii byly inhibiční pokusy prováděny s disacharidem IS odvozeným od glykosaminoglykanů jako s immobilizovaným ligandem. Výsledky získané s rozsáhlým panelem strukturně definovaných oligosacharidů budou popsány na jiném místě. Výsledky s vybranými sloučeninami jak jsou uvedeny v malém panelu obrázku 7 a v tabulce 2 ukazují jasně na existenci určitých ligandů s extremně vysokou afinitou ve formě sekvencí O-glykosidového, N-glykosidového a glykosaminoglykanového typu.

Inhibiční data se souborem oligosacharidů 1 (tabulka 2) opět ukazují maskující vliv galaktosy vázané vazbou beta 1-3 po jejím přidání k sekvenci DLNN, jako je tomu u LNT, což vyústí v desetinásobné snížení inhibiční aktivity, z IC50 2 χ 10'⁵ M na 3 x 10‘⁴ M. 6-0 substituce terminálního N-acetylglukosaminu sulfátem, jak je tomu u disacharidu odvozeného z keratan sulfátu K6 ovšem vyústila až ve stotisícinásobný vzrůst inhibiční aktivity (IC50 8 x 10¹¹ M) ve srovnání s DLNN.

Výsledky dosažené se souborem oligosacharidů 2 zdůrazňují přednostní rozpoznání kyseliny N-acetylneuraminové vázané vazbou alfa 2-6 na galaktosu oproti 2-3 analogu.

V tomto případě je 6SL více jak desetisícekrát účinnější inhibitor vazby sCD69 oproti 3SL (IC50 7 χ 10'⁹ M, resp. 3 χ 10'⁴ M).

Soubor oligosacharidů 3 ilustruje možnosti N-glykosidicky vázaných oligosacharidů odvozených od glykoproteinů jako ligandů pro CD69 protein. Biantenární oligosacharid N2 obsahující dva terminální N-acetylglukosaminové zbytky (IC50 10'⁹ M) je téměř desetisícekrát účinnějším inhibitorem než monomerní DLNN. Také zde vyústí přítomnost terminálních galaktos na vnějších ramenech oligosacharidů (látka G2, IC50 5 χ 10'⁴ M) v dramatickou, více než tisícenásobnou, ztrátu inhibiční aktivity, zatímco přítomnost kyseliny N-acetylneuraminové vázané vazbou alfa2-6, jako je tomu u látku SN (IC₅₀ 2 χ 10¹¹ M) zvyšuje inhibiční aktivitu téměř desetimilionkrát oproti sloučenině G2.

Soubor oligosacharidů 4 ilustruje rozpoznání oligosacharidů

O-glykosidického typu proteinem CD69. V tomto případě, na rozdíl od souborů 1 a 2, je zřejmé, že substituce N-acetylgalaktosaminu jádra pomocí beta 1-3 vázané galaktosy jako v disacharidu T zvyšuje inhibiční aktivitu asi stonásobně ve srovnání s nesubstituovaným N-acetylgalaktosaminem, IC50 3 x 10'⁶ M, resp. 2 x 10‘⁴ M. Potenciující vliv kyseliny sialové vázané vazbou alfa 26 na monosacharid jádra je zřetelnější v nepřítomnosti galaktosy, jelikož disacharid SN (IC50 6 x 10'¹² M) je téměř stonásobně aktivnější inhibitor než trisacharid ST (IC50 3 x 10’¹° M). Jestliže tedy srovnáme inhibiční účinnost disacharidu SN s nesubstituovaným monosacharidem, dospíváme k neobyčejnému, asi stomilionnásobnému zvýšení biologické aktivity.

Soubor 5, který se skládá ze sacharidů chondroitinsulfátového a hepartnového typu ukazuje, že substituce N-acetylhexosaminů kyselinou uronovou v nepřítomnosti sulfatace, jako u látek OS a IVA, má za následek téměř tisícinásobné zvýšení inhibiční aktivity ve srovnání s nesubstituovanými monosacharidy (IC₅₀ 2 x 10’⁷M, resp. 5 x 10'⁷ M). Je také yřejmé, že 6-0 sulfatovaná forma monosacharidu N-acetylglukosaminu NS (IC50 4 x 10® M), ačkliv je téměř tisíckrát aktivnější než nesubstituovná forma, je stále ještě téměř desettisíckrát méně účinný než 6'-sialyl analog SN (viz. Soubor 4). Výsledky ukázané v tabulce 2 a další výsledky, které budou popsány na jiném místě, ukazují, že 2 sulfatace kyselin uronových, 4-0 sulfatace Nacetylgalaktosaminu nebo N sulfatace glukosaminu má za následek relativně malé zvýšení inhibičních aktivit vůči sCD69.

Bovinní submaxilární mucin, který je bohatý na shluky 0glykosidicky vázaných disacharidu NeuAcalfa2-6GalNAc (SN), je účinným inhibitorem vazby sCD69, IC₅o 10 pg/ml. Komerčně dostupné glykosaminoglykany, heparin, chondroitin sulfáty A, B a C, které se skládají z lineárních oligosacharidových řetězců s průměrnou molekulovou hmotností v rozsahu 1-2 kDa jsou méně aktivní při vztažení ja jednotku hmotnosti, IC50 1, 7, 2 a 20 ng/ml, zatímco preparát peptidogiykanu keratan sulfátu byl ještě méně aktivní, při koncentraci 100 ng/ml bylo dosaženo pouze 20 % inhibice. Z těchto výsledků a dalších pozorování, které budou uvedeny na jiném místě, vyvozujeme, že rozpoznávací elementy které jsou shluklé nebo lokalizované v terminálních polohách, spíše než takové, které jsou lokalizovány interně uvnitř lineárních oligosacharidových řetězců, jsou vázány proteinem CD69.

Obrázek 7 ukazuje radiovazebné a inhibiční experimenty ukazující vysokou afinitu sCD69 proteinu pro sialované a sulfatované oligosacharidy.

Hlavní panel ukazuje vazbu ¹²⁵l-sCD69 na lipidově vázané oligosacharidy (neoglykolipidy) imobilizované v plastikových jamkách. Neoglykolipidy byly sériově ředěny v methanolu obsahujícím nosičové lipidy cholesterol a vaječný lecithin (4 ug obou látek na 1 ml), aplikovány do jamek, a vysušené při 37°C. Jamky byly promyty, blokovány v přítomnosti 5 % bovinního sérového albuminu, a inkubovány 2 hodiny při 20°C s ¹²⁵l-sCD69. Poté byly jamky promyty a proměřeny. Ukázané výsledky jsou průměrem duplikátních specifických impulsů (po odečtění pozadí v jamkách bez obsahu neoglykolipidů).

Vedlejší panel (inset) ukazuje inhibici vazby sCD69 na neoglykolipid IS (aplikováno 60 pmolů na jamku) v přítomnosti vybraných sacharidů. Výsledky jsou průměry duplikátních stanovení s vyznačenou směrodatnou odchylkou.

PŘÍKLAD 10

Přirozené zabíjení zahrnuje interakci CD69 se sacharidem

Z důvodu strukturní příbuznosti molekuly CD69 s několika dalšími proteiny asociovanými s buňkami NK, a též pro blízkou genovou příbuznost genu pro CD69 s geny pro několik jiných proteinů buněk NK (Testi et al. 1994, Ziegler et al. 1994a), jsme zkoumali, zda může být CD69 důležitý pro přirozené zabíjení.

Byla pozorována vazba ¹²⁵l-sCD69 na buněčné linie MOLT4, K562, U937 a Daudi o nichž je známo, že jsou citlivé na zabíjení buňkami NK, velice malá vazba proteinu byla pozorována na NKrezistentní buněčné linie KG1, IM9, Ráji a THP-1 (Obr.8a). Byla pozorována pozoruhodná korelace mezi pořadím vazebných aktivit, a stupněm citlivosti těchto buněčných linii vůči NK zabíjení (Obr. 8b, c).

Kromě toho bylo zabíjení inhibovatelné nejen neznačeným sCD69 (IC₅₀ činily 1.5 x 10’⁹, 2.5 x 10'¹⁰, 1.3 χ 10'⁹ and 1 χ 1O'¹⁰ M u buněk MOLT-4, K562, U937 a Daudi), ale též disacharidovým ligandem, SN (IC₅o bylo pro výše uvedené linie 1.5 x 10 ®, 1.2 x 10' ⁷, 1.2 χ 10⁸ a 1 χ 10'⁶ M). Zabíjení buněk K562 bylo zcela inhibováno, zatímco u buněk MOLT-4, U937 a Daudi byla maximální dosažitelná inhibice kolem 80 %.

Tyto výsledky jasně ukazují na důležitost proteinu CD69 pro přirozené zabíjení, a navrhují, že interakce receptoru CD69 s cílovými buňkami může být sacharidově závislá.

Obrázek 8 ukazuje radiovazebné a cytotoxické pokusy poukazující na intimní zapojení proteinu CD69 do cytolytické aktivity lidských buněk NK.

Vazba ¹²⁵l-sCD69 je ukázána na suspenze kultivovaných leukemických buněčných linií jak je popsáno v “Experimentální části”. Ukázané výsledky představují průměry duplikátních stanovení s ukázanou směrodatnou odchylkou.

Přirozené zabíjení kultivovaných buněčných linií. Cytotoxicity leukemických buněčných linií po působení PMBC byly stanoveny měřením uvolněného radioaktivního chrómu ⁵¹Cr s použitím různého poměru efektorových a cílových (Ε : T) buněk jak je popsáno v “Experimentální části”. Výsledky jsou vyjádřené jako průměry % specifické cytotoxicity vypočteného z triplikátních stanovení s ukázanou směrodatnou odchylkou.

Je ukázána korelace mezi vazbou ¹²⁵l=sCD69 na kultivované leukemické linie (údaje z panelu A) a cytotoxicitami těchto buněk dosaženými při Ε : T 128 : 1 (údaje z panelu B).

(D) až (G) Koncentrační závislost aktivit sCD69 (plné trojúhelníky) a SN (prázdné trojúhelníky) jako inhibitorů přirozeného zabíjení čtyř buněčných linií citlivých na NK zabíjení podle metody posané v “Experimentální části”. Ukázané výsledky jsou průměry triplikátních stanovení s vyznačenou standardní odchylkou.

PŘÍKLAD 11

Indukce exprese CD69 antígenu na CD56+ buňkách závislá na cílových buňkách a sacharidech.

CD69 je exprimován na buněčném povrchu pouze u minoritní frakce nestimulovaných buněk NK (Lanier et al. 1988), proto byla monitorována exprese CD69 na těchto buňkách (s použitím

CD56 antigenů jako markéru buněk NK) v průběhu čtyř hodin. Toto je časové období během něhož jsou efektorové buňky inkubovány s cílovými buňkami v průběhu standardního krátkodobého testu NK zabíjení.

V nulovém čase méně než 20 % CD56+ buněk vykazovalo měřitelnou povrchovou expresi CD69 (obr. 9A). Avšak během 30 minut inkubace s NK-citlivými buňkami K562 byla povrchová exprese CD69 zvýšena na 40 %, a během jedné až dvou hodin inkubace přes 50 % buněk s NK fenotypem (CD56+ buňky) vykazovalo pozitivní expresi CD69 antigenů. Poté následoval jistý pokles povrchové exprese na asi 40 % po 4 hodinách, ačkoliv ještě nová vlna povrchové exprese následovala při dlouhodobé stimulaci.

Rychlá indukce povrchové exprese antigenů CD69 závisela prokazatelně na cílových buňkách stejně jako na povrchových sacharidech jelikož nebyla pozorována při použití NK-resistentní buněčné linie RÁJI, a indukce byla zcela inhibována při přidání ligandu molekuly CD69, oligosacharidu SN, do inkubační směsi (Obr. 9A). Kromě toho liposomy obsahující na lipidy navázaný oligosacharid SN, se chovaly jako mimikry NK-citlivých cílových buněk v tom, že také vyvolávaly povrchovou expresi CD69 se shodnou kinetikou (Obr.9A). Také zde byla povrchová exprese odstraněna v přítomností volného sacharidového ligandu, a žádná indukce nebyla pozorována s liposomy obsahujícími irrelevantní oligosacharid, laktosu. U CD3+ buněk nebyla zaznamenána žádná indukce povrchové exprese za podmínek NK stanovení (obr. 9B).

V dalším pokuse (Obr. 9C) v němž byly CD691 buňky odstraněny na yačátku pokusu, se projevil pouze nepatrný vzrůst povrchové exprese antigenů CD69 nad kontrolní hodnoty během prvých čtyř hodin inkubace. Teprve po 16 hodinách bylo více než 80 % CD56+ buněk pozitivních na CD69. Ani tato zpožděná indukce CD69 neprobíhala v přítomnosti volného oligosacharidů SN. Tyto výsledky ukazují,že k počáteční rychlé indukci povrchové exprese antigenu CD69 docháyí přednostně u těch buněk, které už exprimují alespoň minimální množství tohoto antigenu, ale po prodloužené inkubaci pravděpodobně nastává exprese nové syntetizovaného CD69 antigenu.

Obrázek 9 ukazuje, že povrchová exprese CD69 na lidských buňkách s fenotypem NK (CD56+ buňky) je rychle indukována při jejich inkubaci s NK-citlivými cílovými buňkami nebo liposomy obsahujícími vysokoafinitní ligandy pro CD69 protein, a tyto procesy jsou inhibovány v přítomnosti volných oligosacharidových ligandu.

Lidské PBMC byly obohaceny o buňky NK na Percollovém gradientu a inkubovány s NK-citlivými buňkami K562 v přítomnosti nebo nepřítomnosti 10‘⁵ M volného disacharidu SN, nebo spolu s SN liposomy v nepřítomnosti nebo v přítomnosti 10'⁵ M volného oligosacharidů, nebo s NK resistentními buňkami RÁJI. Jako negativní kontrola byly buňky K562 inkubovány v samotném mediu. Povrchová exprese antigenu CD69 na CD56+ buňkách byla monitorována dvoubarevnou průtokovou cytometrií jak je popsáno v experimentální části. Výsledky ukazují % ze všech PBMC , které byly dvakraát pozitivní(CD56⁺/CD69⁺).

Experiment podobný jako v bodu (A) byl uskutečněn s cílem sledovat % PBMC, které by byly CD3+/CD69+. V těchto pokusech byly použity buňky K562 v přítomnosti nebo nepřítomnosti 10'⁵ M disacharidu SN, nebo buňky RÁJI. Nebyla pozorována žádná indukce exprese CD69 (jsou ukázány pouze výsledky s buňkami K562). Tyto výsledky jsou vyjádřeny jako % dvojitě pozitivních CD3+/CD69+ buněk. Jsou ukázány průměrné hodnoty triplikátních stanovení spolu se standardní odchylkou.

Byl proveden experiment podobný jako v případě (A), ale v tomto pokuse byly PBMC isolované na Ficoll-lsohypaque dále zbavovány CD69+ buněk pomocí protilátek a komplementu před inkubací s buňkami K562 v přítomnosti nebo nepřítomnosti 10'⁵ M disacharidu SN, nebo s buňkami Ráji, a byla analyzována exprese CD69 antigenu na CD56+ buňkách. Byla pozorována pouze velmi malá indukce CD69. Jsou ukázány výsledky s buňkami K562 v přítomnosti a nepřítomnosti disacharidu SN, výsledky s buňkami Ráji (nejsou ukázány) byly podobné jako s buňkami K562 v přítomnosti inhibujícícho sacharidu. .Výsledky jsou vyjádřeny jako % CD56+/CD69+ dvojitě pozitivních buněk z celkových PBMC (nepřerušovaná linie). Ukázány jsou průměrné hodnoty triplikátních analýz s vyznačenou standardní odchylkou.

PŘÍKLAD 12

Udělení citlivosti na přirozené zabíjení pomocí na lipidy vázaných ligandů antigenu CD69

NK-resistentní buněčné linie RÁJI, IM9 a KG1 byly vystaveny po dobu jedné hodiny působení liposomů obsahujících různé koncentrace na lipidy navázaných ligandů proteinu CD69 SN a 6S, neoglykolipid laktosy byl použit jako negativní kontrola (Obr. 10 B - D). Účinnost inkorporace neoglykolipidů asociovaných s liposomy byla asi 40 - 70 % u těchto různých buněčných linií (Obr. 10D, inset).

V cytotoxických stanoveních byla úroveň specifické lyže dosažené při Ε : T 16 : 1 zhruba 40 - 65 % při hustotě ligandu 20 nmolů na 100 ul liposomů, což snese srovnání s hodnotami dosaženými (při Ε : T 16 : 1) pro NK citlivé buněčné linie U937, K562 a MOLT-4, 45 - 75 % (srovnej obr. 8B). V přítomnosti liposomů obsahujících kontrolní neoglykolipid s laktosou nebyla cytolysa NK-resistentních buněk ovlivněna. Liposomy s ligandy SN a 6S, ne však laktosové liposomy, též způsobily značné zvýšení cytotoxicity u NK-sensitivní buněčné linie MOLT-4: u těchto buněk byla při Ε : T 1 : 1 zvýšena specifická cytotoxicita ze zhruba 30 na více než 70 %. U všech pěti zkoumaných buněčných linií byly liposomy obsahující disacharid SN vždy účinější než 6S liposomy, což odpovídá potenci těchto látek jako ligandu CD69 (tabulka 2).

Obrázek 10 ukazuje možnost, jak učinit NK-resistentní buněčné linie vnímavými vůči přirozenému zabíjení preinkubací s liposomy nesoucími oligosacharidové ligandy pro CD69.

NK citlivá buněčná linie MOLT 4 a (v panelech B až D) NK resistentní buněčné linie RÁJI, IM-9 a KG-1 byly značeny chromém ⁵¹Cr, a 10⁴ buněk v 90 ul media RPMI bylo smícháno s 10 ul preparátu liposomů (obsahujících na lipidy vázané oligosacharidy v koncentraci 0.2 nebo 2 nebo 20 nmolů na 100 ul liposomů. Po 1 h inkubace při 37°C byly přidány PBMC ve 150 ul media RPMI při Ε : T 1 : 1 (buňky MOLT-4) nebo 16 : 1 (jiné typy buněk), a cytotoxicita stanovena po 4 hodinách jak je uvedeno v experimentílní části. Výsledky jsou uvedeny jako průměrné hodnoty triplikátních stanovení s uvedením standardní odchylky.

Obrázek 11 ukazuje kinetiku příjmu neoglykolipidú kultivovanými buněčnými liniemi.

Suspenze (5 χ 10⁴ buněk v 90 ul media RPMI) NK citlivé buněčné linie MOLT-4 nebo NK-resistentních linií RÁJI, THP-1 a IM9 byly inkubovány s 10 ul preparátu liposomů typu I (plné symboly) nebo typu II (prázdné symboly) obsahujícími ³H-značený neoglykolipid laktosy (2 χ 10⁴ cpm) po uvedenou dobu, a pohlcení na lipid vázaných oligosacharidů buňkami (vyjádřené jako % přidaných cpm) bylo stanoveno jak je uvedeno v experimentální sekci. Uvedené výsledky jsou průměrem duplikátních stanovení s uvedením rozptylu.

Ve zvláštním pokuse (který není ukázán) jsme pozorovali, že NK citlivost linie MOLT-4 a NK-resistentních buněčných linií je ovlivněna pouze málo při použití liposomů typu II. Na rozdíl od těchto linií inkorporují erytrocyty a normální lymfocyty cca. 40 %, resp. 25 % značeného, na lipid vázaného oligosacharidů při použití tohoto preparátu liposomů, avšak inkorporace je nepatrná u preparátu liposomů I. Ve stanoveních přirozeného zabíjení s použitím ⁵¹Cr značených červených krvinek a lymfocytů vykazovaly tyto specifickou lyzu při opracování liposomy typu II (ne však liposomy typu I), která dosahovala 40 % a 50 % při E : T=16 : 1.

Z těchto pokusů lze uzavřít, že pro různé cílové buňky může být nezbytné vyzkoušet liposomy s rozličným složením lipidů, aby bylo dosaženo optimalizace přenosu na lipid vázaného oligosacharidů. Podle výše uvedených výsledků by liposomy typu II neměly činit normální červené krvinky nebo lymfocyty více zranitelné pro přirozené zabíjení, a mohou tedy být užitečné za podmínek in vivo, kdy je žádoucí eliminovat abnormální buňky, například nádorové, leukemické nebo virově infikované.

PŘÍKLAD 13

Stimulace apoptosy s použitím iigandů pro CD69

Abychom zjistili, zda vazba CD69 antigenu na zabíječských buňkách na sacharidy cílových buněk způsobuje jejich apoptotické azbíjení, testy přirozeného zabíjení byly prováděny v nepřítomnosti Ca²⁺ a v přítomnosti Mg²⁺/EGTA, čímž byla inhibována neapoptotická dráha přirozeného zabíjení závislá na vápníku za podmínek, o nichž je známo, že u lymfocytů umožňují apoptotické zabíjení (Rouvier et al. 1993).

Při poměru E:T=32:1 byla přibližné polovina specifické cytotoxicity buněk MOLT-4 a U937 závislá na vápníku (Obr. 12A, B). Tato cytotoxicita byla pouze nepatrně ovlivněna opracováním těchto cílových buněk O-glykoproteinasou (výsledek není ukázán) nebo sialidasou NDV, ale byla snížena asi na polovinu po opracování sialidasou AU nebo N-glykanasou. Na vápníku nezávislá cytotoxicita není vůbec pozorována u NK citlivých buněk K562.

Pro další zkoumání apoptosy byly provedeny další pokusy s cytotoxicitou v Mg²⁺/EGTA (Obr.12D) a další dva typy stanovení apoptosy s použití průtokové cytometrie a elektroforesou DNA (panely E a F) v přítomnosti sCD69 nebo disacharidového ligandu pro CD69 (SN), nebo irelevantního oligosacharidů (laktosy).

Bylo pozorováno, že specifická cytotoxicita v Mg²⁺/EGTA u PBMC nebyla ovlivněna vpřítomnosti laktosy, byla však snížena zhruba na polovinu v přítomnosti oligosacharidového ligandu SN nebo rozpustné molekuly CD69 (panel D).

Výsledky cytofluorometrických stanovení apoptotických buněk včetně inhibičního obrazy s oligosacharidovými ligandy, sCD69 a fragmentem protilátky souhlasily velice dobře s výsledky cytotoxických stanovení (panel E).

Tyto analýzy, a analýzy fragmentace DNA (tvorba “žebříčků) ustanovili existenci apoptotického zabíjení u NK=sensitivních buněčných linií, MILT-4 a U937.

Obrázek 12 ukazuje, že apoptotické zabíjení NK sensitivních cílových linií závisí na interakcích CD69 se sacharidy.

(A) až (C) Přirozené zabíjení PBMC bylo stanoveno ve standardním mediu obsahujícím vápník (tečkované linie) nebo v bezvápníkovém mediu s obsahem Mg²⁺/EGTA umožňujícím apoptosu (nepřerušovaná linie) s použitím NK sensitivních linií MOLT-4, U937 a K562. U buněk MOLT-4 a U937, byla provedena dodatečná stanovení v bezvápníkovém mediu po opracování těchto buněk po dobu šé minut při 37°C sialidasou NDV nebo AU, N-glykanasou, popřípadě O-glykoproteinasou. Ve srovnávacím pokuse byly buňky inkubovány 30 minut při 37°C v přítomnosti pufrů bez enzymu. Výsledky s buňkami opracovanými 0glykoproteinasou byly shodné s výsledky u neopracovaných buněk. Výsledky jsou vyjádřeny jako průměrné hodnoty triplikátních stanovení s vyznačenou směrodatnou odchylkou.

(D) až (F) Tři typy stanovení byly prováděny v mediu s Mg²⁺/EGTA: v (D) jsou ukázány výsledky čtyřhodinového stanovení uvolnění ⁵¹Cr při E:T=8:1 s použitím PBMC. V (E) jsou uvedeny výsledky apoptotických stanovení cytofluorometrií, a v (F) apoptotické fragmentace DNA při nichž byly PBMC, které byly předtím obohaceny o buňky s NK fenotypem mnohastupňovou metodou, sledovány při E:T=1:1, jak je popsáno v experimentální části. Výsledky jsou ukázány pro NK sensitivní buněčné linie MOLT-4, U937 a K562, a pro NK resistentní buněčné linie RÁJI (označená R), THP-1 (označená T) a IM-9 (označená I). Pro buňky MOLT-4 a U937 jsou ukázány další výsledky pokusů, v nichž reakční směs obsahovala 10'⁵ M laktosu (označeno L) nebo disacharid SN (S) nebo 10'⁸ M sCD69 (C). Linie označené (O) v panelech (D) a (E) ukazují výsledky v nepřítomnosti inhibitorů.

V separátních pokusech, jejichž výsledky nejsou zde ukázány, v nichž nebyly přidány efektorové buňky, bylo procento nalezených apoptotických buněk menší než 5 % a tvorba “žebříčků” u DNA nebyla pozorována, výsledky s použitím směsi oligosacharidů SN a sCD69 byly podobné jako v pokusech, v nichž byly tyto látky vyšetřovány separátně. Výsledky v (D) až (E) jsou vyjádřené jako průměry triplikátních stanovení s vyznačenou směrodatnou odchylkou.

DISKUSE VÝSLEDKU S CD69

V této práci bylo zjištěno, že molekula CD69 na povrchu buněk NK je těsně zahrnuta v procesech spuštění cytotoxických mechanismů, které závisejí na vazbě oligosacharidových ligandů na povrchu cílových buněk touto molekulou. U dvou NK citlivých buněčných linií je ynačná část přirozeného zabíjení apoptotická. Dalším novým principem zjištěným v našich pokusech je na sacharidech závislá indukce exprese CD69 u buněk NK; jde o rychlou indukci s kinetikou charakteristickou pro translokaci molekuly na buněčný povrch s intracelulárních yásob, následovaná druhou fází indukce s kinetikou odpovídající nové proteinové syntéze.

Pozoruhodné zesílení vazby CD69 bylo pozorováno v případě, kdy byly monosacharidy N-acetylgalaktosamin nebo Nacetylglukosamin substituovány alfa2-6 vázanou kyselinou Nacetylneuraminovou nebo 6-0 sulfátem, k dalšímu zesílení vazby docházelo vpřípadě, kdy byly 6'-sialylové nebo 6'-sulfo monosacharidy součástí oligosacharidů. Hodnota IC₅o dosahovala až 6 χ 10'¹² M u disacharidu SN, který je O-glykosidicky vázán na protein, 2 x 10'¹¹M pro disacharid odvozený od chondroitin sulfátu, a 8 χ 10'¹¹ M pro disacharid K6 nacházející se v keratan sulfátovém proteoglykanu.

Stojí za povšimnutí, že 6-0 sulfatovaný analog Nacetylgalaktosaminu se sekvencí K6 (o němž předpokládáme, že by mohl být vysokoafinitním ligandem pro CD69) byl pozorován v terminální sekvenci vnějších řetězců N-glykosidicky vázaných oligosacharidů pituitárních hormonů a dalších glykoproteinů.

Z výsledků uvedených v tabulce 2 (soubor oligosacharidů 2 a 3) a dalších výsledků, které budou popsány na jiném místě, je zřejmé, že CD69rozpoznává 6'-sialyl motif sám o sobě, aniž musí tento být nezbytně připojený na N-acetylhexosamin. Tento motif se vyskytuje ve vnějších řetěycích N-glykosidicky vázaných oligosacharidů připojený na galaktosu, u biantenárního řetězce S2 byla zaznamenána hodnota ICso 2 x 10'¹¹M.Přednostní rozpoznání 6'-sialyl oproti 3 -síalyl motivu je v případě CD69 v příkrém kontrastu s pozorováními u NKR-P1 proteinu potkana, který rozpoznává pouze 3'-sialyl motif.

Způsob prezentace rozpoznávaných elementů na makromolekulárním nosiči může mít zásadní vliv na jeho rozpoznání CD69. BSM u něhož jsou krátké O-glykosidické sekvence SN uspořádány ve formě shluků je velmi silným inhibitorem vazby sCD69, IC₅o 0.01 ng/ml. Na druhé straně jsou glykosaminoglykany heparan sulfát a chondroitin sulfát A, B a C o dva až tři řády horšími inhibitory I přesto, že disacharidické jednotky, z nichž jsou složeny, je ve formě volného oligosacharidu dobrým inhibitorem, a silná vazba se pozoruje vpřípadě, kdy jsou tyto disacharidy shlukované. Extrémním příkladem je peptidoglykan keratan sulfát, který je bohatý na lineárně se opakující disacharidovou sekvenci K6. Hodnota IC₅o pro volný disacharid je 8 χ 10'¹¹ M, a přesto je tato sekvence špatně rozpoznávána sCD69 v případě, kdy je součástí dlouhého oligosacharidu tohoto peptidoglykanu.

EXPERIMENTÁLNÍ PŘÍSTUPY POUŽÍVANÉ PŘI VÝZKUMU CD69

Sacharidy, neoglykolipidy a jiné glykokonjugáty

Struktura a označení zkoumaných sacharidů je uvedena v tabulce 2.

Monosacharidy N-acetylglukosamin, N-acetylgalaktosamin a jejich 6-0 sulfatované formy byly od firmy Sigma, stejně jako disacharid laktosa (LAC), 3'-sialyllaktosa (3SL), 6'-sialyllaktosa (6SL), a disacharidy odvozené od chondroitin sulfátu OS, 6S a disacharidy odvozené od heparinu IVA, HA a IS. Lakto-N-tetraosa (LNT) byla od firmy Dextra. Trisacharid DLNN byl připraven štěpením lakto-N-tetraosy beta-galaktosidasou (Bezouška et al. 1994a). Disacharid K6 byl isolovánz bovinního keratan sulfátu po působení endo-beta-galaktosidasou (Scudder et al. 1986), a 0glykosidové disacharidy SN a T byly připraveny z bovinního submaxilárního mucinu (Chai, Feizi a Lawson, nepublikované výsledky) popřípadě z glykoproteinu ovariálních cyst po nereduktivní beta-etiminaci (citace 41). O-glykosidicky vázaný trisacharid 6ST je dar od Prof. André Lubineau. Biantenární Nglykosidické oligosacharidy N2 a G2 byly získány darem, S2 byl zakoupen u firmy Biocarb.Bovinní submaxilární mucin, heparin z prasečí intestinální mukosy, a chondroitin sulfát A a B (bovinní( a chondroitin sulfát C (žraloka) byly od firmy Sigma.Peptidoglykan keratan sulfát byl isolován z bovinní rohovky (Scudder et al. 1986).

Neoglykolipidy (oligosacharidy konjugované na aminofosfolipid L1-2-dihexadecyl-s/7-glycero-3-fosfoethanolamin) byly připraveny z laktosy, DLNN, LNT, 3SL, 6SL, 6S a IS, a přečištěny jak bylo předešle popsáno, s použitím bezvodých podmínek pro derivatizaci laktosy, DLNN a LNT, a 5 % v/v vody pro další oligosacharidy.

Neoglykolipidy označené ³H byly připraveny substitucí ³H označeného kyanoborohydridu sodného (specifická aktivita 2.9 x 10¹³ Bq/mol) za neaktivní ekvivalent. Po standardní době ohřevu byla víčka reakčních zkumavek ( s výjimkou neutrálních oligosacharidů) odstraněna, aby bylo umožněno odpaření na ohřívací plotně po dobu několika hodin pro zvýšení výtěžku neoglykolipidu. ³H-značené neoglykolipidy laktosy a SN byly isolovány s použitím sloupce s fenylboronovou kyselinou, neoglykolipidy obsahující 6S a IS s použitím C18 kolony.

V některých pokusech byly neoglykolipidy inkorporovány do liposomů připravených z (a) cholesterolu a vaječného lecitinu, řé nmolů obou látek (Feizi et a/.1978, Bezouska et al. 1994b), dále zde uváděné jako liposomy typu I, nebo (b) fosfatidylserin a fosfatidylethanolamin, 50 nmolů obou (Correa-Freire et a/.1984), liposomy typu II, ve 100 ul RPMI media. Oba typy liposomů byly připraveny sonikací v ultrazvukové vodní lázni (Feizi 1978).

Glykosidasy

Sialidasa z Arthrobacter ureofaciens (AU), sialidasa z Newcastle virus disease (NVD), a endo-beta-galaktosidasa z Bacteroides fragilis byly od firmy Boehringer Mannheim. Heparinasa I a chondroitinasa ABC pocházely od firmy Sigma. 0glykoproteinasa (Abdullah et a/.1992) byla yískána darem.

Protilátky

Protilátka proti alfa fetoproteinu (AFP-02) byla poskytnuta Dr.

I. Hilgertem, ÚMG AV ČR Praha, a použita jako ascites po ředění 1 : 1000.

Protilátka proti CD69 označená FITC (Leu-23), protilátka proti CD56 označená PE (Leu-19), a protilátka proti CD3 (Leu-4) byly od firmy Becton-Dickinson, použity v ředění doporučovaném výrobcem.

Buňky

Lidské mononukleární buňky periferní krve (PBMC) byly isolovány na gradientu Ficoll-lsopaque centrifugací heparinizované krve, červené krvinky byly odebrány ze sedimentu. V uvedených případech byly připraveny frakce obohacené o NK buňky a lymfocytární frakce centrifugací na diskontinuálním Percollovém gradientu (Timonen eř al. 1981) nebo po mnohastupňové proceduře v níž jsou nejprve monocyty odstraněny adherencí na plastikové povrchy, poté jsou odstraněny B lymfocyty po průchodu suspenze nylonovou vatou, a CD3⁺ buňky jsou odstraněny imunomagnetickými částicemi (Borrego eř al. 1993). Lidské leukemické linie MOLT-4, K562, U937, Daudi, RÁJI, THP-1, IM9 a KG-1, byly získány z European Tissue Culture Collection (UK) a kultivovány za standardních podmínek v kompletním mediu RPMI s výjimkou buněk KG-1, které byly kultivovány v lscove's DMEM s 20% (v/v) fetálním sérem.

Před opracováním glykosidasami bylo 10^e kultivovaných buněk promyto a resuspendováno v 50 ul 10 mM fosfátového pufru pH 6.5 s 0.15 M NaCI, asmícháno s 50 ul tohoto pufru obsahujícího 50 mU AU sialidasy, nebo 100 U N-glykanasy, nebo množství O-glykoproteinasy schopné rozštěpit 80 ug glycoforinu A za 1 h (Abdullah eř al. 1992), nebo 50 mU chondroitinasy ABC. V kontrolních vzorcích byl přidán enzym po povaření 5 min při 100°C. Po 30 min inkubace při 37°C, buňky byly promyty třikrát kompletním mediem RPMI.

Pro opracování liposomy (Bezouska eř al. 1994b) kultivované buňky byly značeny ⁵¹Cr, a 10⁴ buněk v 90 ul kompletního

RPMI bylo smícháno s 10 ul preparátu liposomů s uvedenou koncentrací neoglykolipidu, a inkubovány 1 hodinu při 37°C.

Pro stanovení kinetiky inkorporace neoglykolipidu buňkami, 5 x 10⁴ buněk v 90 ul kompletního RPMI bylo smícháno s 10 ul preparátu liposomů obsahujícího ³H-značené neoglykolipidy, 0.2 nmol (2 x 10⁴ cpm)a inkubováno po ukázáný časový úsek při 37°C. Reakce byla ukončena ochlazením buněčné suspenze na ledu, buňky byly promyty ledovým mediem RPMI, a aktivita buněčného sedimentu získaného centrifugací při 500 g měřena kapalinovou scintilací. Radioaktivita v kontrolních zkumavkách (neobsahujících buňky) byla vždy méně než 0.1 % přidané radioaktivity.

Radiovazebná stanovení

Vazba sCD69 na neoglykolipidy: neoglykolipidy byly imobilizovány v 96 jamkových destičkách s plochým dnem (Immulon 1, Dynatech Inc.) v přítomnosti nosičových lipidů cholesterolu a vaječného lecithinu (citace 40,41), a vazba ¹²⁵lsCD69 (10 x 10® cpm/ug, 10⁵ cpm/jamku) byla stanovena jak bzlo předešle popsáno (Bezouska et al. 1994a). Pro inhibiční experimenty, jamky byly pokryty aplikací 32 pmolů/jamku neoglykolipidu IS, a vazba ¹²⁵l-sCD69 (10⁵ cpm/jamku) byla měřena v přítomnosti uvedené koncentrace oligosacharidu.

Vazba sCD69 na buňky: kultivované buňky byly promyty v mediu RPMI s 10 mM Hepes pH 7.4, resuspendovány v koncentraci 5 x 10® buněk/ml, a vazba ¹²⁵l-sCD69 na 100 ul buněčné aliquoty byla měřena v 1.5 ml mikrozkumavkách jak bylo popsáno (Bezouska et al. 1994b). Nespecifická vazba, stanovená v přítomnosti tisícinásobného nadbytku neznačeného proteinu, která vždy činila méně než jedno procento experimentální vazby, byla odečtena.

Stanovení cytotoxicity

Standardní čtyřhodinové stanovení cytotoxicity (Brunner et al. 1968) bylo prováděno v destičkách s 96 jamkami se dnem ve tvaru V (Falcon) v kompletním mediu RPMI s použitím PBMC jako efektorových buněk, a ⁵¹Cr-znacených leukemických buněčných linií jako cílových buněk, celkový reakční objem byl 250 ul.

Čtyřhodinové stanovení cytotoxicity v nepřítomnosti extracelulárního kalcia (Kojima et al. 1994) bylo prováděno vbezvápníkovém mediu připraveném smícháním Ca²⁺-deficientního Hanksova pufračního roztoku, který obsahoval 1 mM Mg²⁺ s dialyzovaným fetálním telecín sérem (10 %) a 0.1 mM EGTA (Mg²⁺/EGTA medium).

Analýza změn v expresi CD69

PBMC obohacené o NK buňky centrifugací na percollovém gradientu, 10⁵ buněk v 0.5 ml kompletního RPMI media, bylo smícháno s 10⁵ cílových buněk nebo 100 ul suspense liposomův 0.5 ml media, s obsahem nebo bez obsahu oligosacharidových inhibitorů, a inkubovány při 37°C.

Na konci zvolené inkubační periody byly buňky centrifugovány, a dále udržovány na ledové lázni v 10 mM PBS pH

7.4 s 5 % (w/v) BSA a 0.1 % NaN₃ (barvicí pufr). Buňky byly inkubovány s 1 mg/ml irrelevantní monoklonální protilátky (proti alfa-fetoproteinu) v barvicím pufru 30 minut, následovala 30 minutová inkubace s FITC-anti-CD69 a PE=anti-CD56 protilátkami, nebo s FITC-anti CD69 a PE-anti-CD3 protilátkami, poté byly buňky promyty třikrát v barvicím pufru, a exprese povrchových antigenů byla určena průtokovou cytometrií (FACScan, BectonDickinson) vybaveném s tříbarevnou fluorescencí. Bylo proměřeno nejméně deset tisíc pozitivních buněk, a mrtvé buňky byly vyloučeny s použitím propidium jodidového barvení.

Výsledky byly vyjádřeny jako % buněk pozitivních na CD56 a CD3, nebo jako relativní fluorescence anti CD69 protilátky, nebo jako % dvojitě pozitivních buněk.

V některých pokusech byly z efektorové buněčné populace nejprve odstraněny buňky s povrchovou expresí CD69 inkubací se saturující koncentrací monoklonální protilátky BL-FB/B1 a komplementem po dobu 1 hodiny (Correa-Freire et al. 1984), mrtvé buňky byly odstraněny po centrifugací na FicollIsopaqueovém gradientu, a zbývající buňky promyty třikrát v kompletním RPMI.

Stanovení apoptosy průtokovou cytometrií

Neznačené cílové buňky v přítomnosti nebo v nepřítomnosti různých inhibitorů byly smíchány za podmínek identických s podmínkami na kalciu nezávislého cytotoxického stanovení, PBMC byly obohaceny mnohastupňovou metodou, celkový reakční objem byl 250 ul. Na konci čtyřhodinové inkubačbí periody byly buňky centrifugovány, a fragmentace DNA byla visualizována (Sgonc et a/. 1994) pomocí terminální deoxynukleotidyl transferasy značící místa fragmentace DNA v jádře, a FACS analýzou.

Pět tisíc pozitivních buněk bylo proměřeno v jednom pokuse, všechny buňky s relativní fluorescencí FITC-dUTP větší než 10² byly vyhodnoceny jako apoptotické, a výsledek vyjadřován jako procento apoptotických buněk.

Analýza fragmentace DNA

Pro detekci apoptotické fragmentace DNA (tvorba “žebříčků”), χ 10⁵ cílových buněk v 0.4 ml Mg²⁺/EGTA media bylo smícháno se stejným objemem PBMC, které byly isolovány mnohastupňovou metodou pro obohacení o buňky NK (0.4 ml), a 200 ul média obsahujícího různé inhibitory, nebo media bez inhibitorů, a inkubováno při 37°C po dobu 4 hodin. Na konci tohoto inkubačbího období byly buňky centrifugovány, resuspendovány v lyzačním pufru obsahujícím 10 mM Tris-HCl pH 7.0 s 10 mM EDTA, 0.2 % Tritonem X-100 a 0.1 ug/ml proteinasy K. Byly připraveny vzorky buněčné DNA (Eischen eř al. 1994), aanaiyzovány elektroforesou v 1.2 % agarosovém gelu (Sambrook eř al. 1989).

TABULKA 1

Monosacharidy a oligosacharidy zkoumané při sledování interakcí NKR-P1.

Ukázané sacharidy byly zkoumány jako neoglykolipidy, tj. oligosacharidy konjugované (cit. 38) na aminolipid L-1,2dihexadecyl-sn-glycero-3-fosfoetanolamin, s výjimkou těch uvedených pod hlavičkou gangliosidy a sulfatované gangliosidy, které byly přirozenými glykolipidy, a látek 3SX5 a 6SX5 uvedených pod hlavičkou sialované oligosacharidy 2. Typu, které byly chemicky syntetizovanými glykosfingolipidy. Část těchto sacharidů (uvedená v obrázcích 2a a 2b) a mannosa-6-fosfát byly též zkoumány jako volné sacharidy. Přesný popis sacharidů uvedených pod hlavičkami Neutrální, Sialylované, a Sulfatované (typu 1 a 2, z rodiny sacharidů krevních skupin) jsou uvedeny v citacích 21, 39-41, s výjimkou látek 3SL a 6SL, které byly zakoupeny u firmy Sigma. Sacharidy uvedené pod hlavičkou Gangliosidy, Sulfatované gangliosidy, a Fosforylované sacharidy jsou uvedeny v citaci 42, s výjimkou volných oligosacharidů GM1 a GM2 (viz. citace 43). Tetrasacharid IS2 byl isolován z heparinu prasečího střeva (Sigma) po štěpení heparinasou I (EC 4.2.2.7., Sigma) po isolaci pomocí HPLC používající silný ionex (nepublikované výsledky). Disacharidy chondroitin sulfátu a heparinu byly zakoupeny od Dextra Laboratories.

Zkratky pro monosacharidy: Fuc, fukosa, Gal, galaktosa, GalNAc, N-acetylgalaktosamin, Glc, glukosa, GlcN, glukosamin, GIcNAc, N-acetylglukosamin, GIcA, kyselina glukuronová, Man, mannosa, NeuAc, kyselina N-cetylneuraminová, UA, uronová kyselina (glukuronová nebo iduronová bez bližší specifikace), delta UA, 4,5-nesaturovaná kyselina uronová.

TABULKA 2

Monosacharidy a oligosacharidy zkoumané jako inhibitory vazby CD69 proteinu na IS neoglykolipid.

Detailní popis mnoha těchto oligosacharidů lze nalézt v tabulce 1 (DLNN.LAC, 3SL, 6SL, disacharidy chondroitinsulfátu Chon O-S, 6-S (dva posledně jmenované vystupují pod zkratkou OS a 6S) disacharidy heparinu HEP IV-A, ll-A a l-S (jsou zde zkráceny jako IVA, IIA a IS), monosacharidy N-acetylglukosamin ©, a N-acetylgalaktosamin (N) a jejich 6-0 sulfatované formy (SC a NS) byly zakoupeny od firmy Sigma, stejně jako Chon 2,6S a 2,4,6S. Lacto-N-tetraosa (LNT) byla od firmy Dextra. Trisacharid DLNN byl připraven z lacto-N-tetraosy štěpením betagalaktosidasou (Bezouska et al. 1994a). Disacharid K6 byl isolován z bovinního keratan sulfátu po působení endo-batagalaktosidasou (Scudder et a/.1986), a O-glykosidické disacharidy SN a T byly isolovány z bovinního submaxilárního mucinu (Chai, Feizi a Lawson, nepublikováno) a z glykoproteinu ovariálních cyst nereduktivní beta-eliminací (41). O-glykosidický trisacharid 6ST byl získán jako dar od Prof. André Lubineau. Biantenární oligosacharid N2 a G2 byly získány darem, S2 byl zakoupen u firmy Biocarb.Bovinní submaxilární mucin, heparin z prasečí intestinální mukosy, a chondroitin sulfáty A a B (bovinní) a C (ze žraloka) byly zakoupeny u firmy Sigma. Peptidoglykan keratan sulfátu byl isolován z hověyí rohovky (Scudder et al. 1986).

U/i - % ) 00 o<

~0	>	“O 73 O
r~'	to		c-
•	—I	-<	Xk
		to
	O	o	σ
	—i	< ΓΠ»
		ΣΕ
		O

M-

Claims (50)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Farmakologický přípravek obsahující jako účinnou látku oligosacharíd vybraný ze skupiny zahrnující oligosacharidy glykosaminoglykanů, sulfatované gangliosidy jiné než sulfatidy, 6-sialylované hexosy a 3-0-sulfatované kyseliny uronové.
2. 2. Farmakologický přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že oligosacharidem je keratan sulfát, chondroitin sulfát nebo heparin sulfát.
3. 3. Farmakologický přípravek podle nároků 1, vyznačující se tím, že oligosacharíd je disacharidem nebo tetrasacharidem.
4. 4. Farmakologický přípravek podle nároku 1, vyznačující se tím, že oligosacharíd je vybrán ze skupiny zahrnující K6, Chon OS, 6S, 2,6S a 2,4,6,S a Hep IVA, IIA a IS, HNK-1, 6SN, 6S2, 6SLN, S2 a SN.
5. 5. Farmakologický přípravek obsahující jako účinnou látku oligosacharíd jenž je tvořen glykosylaminoglykanovými oligosacharidy, sulfatidem, sulfatovaným gangliosidem jiným než sulfatidem, 6-sialyl hexosou nebo 3-0-sulfatovanou kyselinou uronovou, fosfátem tetramannosy, fosfátem pentamannosy, sialyl- nebo sulfatyl- Le^a nebo Le^x , HNK-1, HNK-3-5-kyselinou uronovou.
6. 6. Farmakologický přípravek nároku 5, vyznačující se tím, že oligosacharíd je vybrán z keratan sulfátů jako K6, S2, SN, 6ST, Chondroitin sulfátů, jako je ChonSO3 0S/6S, 2,6S , heparinových oligosacharidů jako je Hep IVA, IIA, IS a 12S.
7. 7. Farmakologický přípravek podle nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že oligosacharid je volný.
8. 8. Farmakologický přípravek podle nároků 1 až 6, vyznačující se tím, že monosacharid nebo oligosacharid je shluknutý.
9. 9. Farmakologický přípravek podle nároku 8, vyznačující se tím, že monosacharid nebo oligosacharid je ligandem pro protein NKR-P1.
10. 10. Farmakologický přípravek podle nároků 8 a 9, vyznačující se tím, že monosacharid nebo oligosacharid je ligandem proteinu CD69.
11. 11. Farmakologický přípravek podle nároků 9 nebo 10, vyznačující se tím, že monosacharid nebo oligosacharid má následující strukturu:

    A(v,w)-B(1,x)-C(1-y)-D kde:

    A je vybráno ze skupiny sestávající z vodíku, hexosy, kterou může být galaktosa nebo mannosa a může být substituována jedním nebo více nabitými skupinami, substituované kyseliny sialové, alifatického řetězce s jedním nebo více rozvětvenými skupinami, nasycené nebo nenasycené kyseliny uronové, která může být substituována jednou nebo více nabitými skupinami, N-acetylglukosaminu, který může být substituován jednou nebo více nabitými skupinami, a Nacetylgalaktosaminu, který může být substituován jednou nebo více nabitými skupinami,

    B může zcela chybět, nebo být vybráno ze skupiny sestávající z kyseliny uronové, která může být substituována jednou nebo více nabitými skupinami, galaktosy, Nacetylglukosaminu, který může být substituován jednou nebo více nabitými skupinami, galaktosou nebo fukosou, Nacetylgalaktosaminu, který může být substituován jednou nebo více nabitými skupinami, alifatického řetězce, který může být substituován jednou nebo více nabitými skupinami, a oligosacharidového řetězce se 3 nebo 4 mannosovými zbytky,

    C může chybět nebo být vybráno ze skupiny sestávající z kyseliny uronové, která může být substituována jednou nebo více nabitými skupinami, galaktosy, glukosy, Nacetylgalaktosaminu, který může být substituován jednou nebo více nabitými skupinami, N-acetylgalaktosaminu, který může být substituován jednou nebo více nabitými skupinami a alifatického řetězce, který může být substituován jedním nebo více nabitými skupinami,

    D může chybět nebo být vybráno mezi jedním nebo několika opakováními B a/nebo C, může však také představovat zbývající strukturní komponenty N-glykosidicky vázaných bi-, tri- nebo tetraantenárních oligosacharidů, Oglykosidických oligosacharidů nebo glykosaminoglykanů, a dalšími sekvencemi, které mohou sloužit k dodatečné vazbě nebo prezentaci ligandu a dolní závorkovaný index představuje pozici uhlíkové vazby u uvedených sacharidů, kde v = 1 nebo 2, w = 2,3,4 nebo 6, x = 2,3 nebo 4, y = 2,3,4 nebo 6, přičemž, když A je substituovaná kyselina sialová, substituce mohou být N-acetyl nebo O-acetyl, když B nebo C jsou substituované alifatické řetězce, substituce mohou být vybrány z hydroxylu(ů), acetyl aminu (NH.COCH3) a nabitých skupin, a nabité skupiny mohou být zvoleny ze skupiny zahrnující sulfáty, fosfáty, a skupiny kyselin karboxylových, jako je tomu u kyselin sialových.
12. 12. Farmakologický přípravek podle nároku 11, vyznačující se tím, že monosacharidy nebo oligosacharidy jsou tvořeny a2-3 vázanou kyselinou sialovou, 3-O-sulfátem, 3-O-sulfátovanou galaktosou, 3-, 4-, nebo 6-O-sulfátovaným N-acetylhexosaminem, N-sulfátovaným hexosaminem, kyselinou uronovou substituovanou N-acetylhexosaminem nebo hexosaminem, 2nebo 3-O-sulfatovanou kyselinou uronovou, a1-3 vázanou fukosou, a1-4 vázanou fukosou, a2-6 vázanou kyselinou sialovou, a 2-6 vázanou kyselinou sialovou na galaktose nebo N-acetylhexose.
13. 13. Farmakologický přípravek podle nároků 9 nebo 10, vyznačující se tím, že oligosacharid je vybrán ze skupiny zahrnující oligosacharidy glykosaminoglykanů, sulfatid, sulfatované gangliosidy jiné než sulfatid, 6-sialylovanou hexosu nebo 3-O-sulfatovanou kyselinu uronovou, fosfát tetramannosy, fosfát pentamannosy, sialylované nebo sulfatované Le^a nebo Le^x, HNK-1, HNK-3-5-uronovou kyselinu, keratan sulfáty jako K6, S2, SN, 6ST, chondroitin sulfáty jako ChonSO₃ OS/6S, 2,6 S a 2,4,6 S, a oligosacharidy heparinu jako jsou HeplVA, IIA, IS a IS2.
14. 14. Farmakologický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 7 až 10, vyznačující se tím, že monosacharid nebo oligosacharid je shlukován na liposomech.
15. 15. Farmakologický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 8 až 13, vyznačující se tím, že monosacharid nebo oligosacharid je shlukován na sekvenci aminokyselin.
16. 16. Farmakologický přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 15, vyznačující se tím, že dále farmaceuticky přijatelný excipient nebo nosič.
17. 17. Použití oligosacharidů, který je představován oligosacharidem glykosaminoglykanu, sulfátovaným gangliosidem jiným než sulfatidem, 6-sialylovanou hexosou nebo 3-O-sulfatovanou kyselinou uronovou, pro výrobu farmaceutického prostředku pro modulaci aktivity efektorové funkce imunitního systému.
18. 18. Použití podle nároku 17, při němž je oligosacharidem keratan sulfát, chondroitin sulfát nebo heparin sulfát.
19. 19. Použití podle nároků 17 a 18, při němž je oligosacharid disacharidem nebo tetrasacharidem.
20. 20. Použití podle nároku 17, při němž je oligosacharid vybrán ze skupiny zahrnující K6, Chon OS, 6S, 2,6S a 2,4,6,S, a Hep IVA, IIA a IS, HNK-1, 6SN, 6S2, 6SLN, S2 a SN.
21. 21. Použití oligosacharidů, který je představován glykosaminoglykanovými oligosacharidy, sulfatidem, sulfatovaným gangliosidem jiným než sulfatidem, 6-sialyl hexosou nebo 3-Osulfatovanou kyselinou uronovou, tetramannose fosfátem, pentamannose fosfátem, sialyl- nebo sulfatyl- Le^a nebo Le^x, HNK-1, HNK-3-5-kyselinou uronovou při výrobě kompozice určené pro modulaci aktivity efektorové buňky, kterou je přirozená zabíječská buňka.
22. 22. Použití podle nároku 21, při němž je oligosacharid vybrán z keratan sulfátů, jako je K6, S2, SN, 6ST, chondroitin sulfátů jako je ChonSO₃ OS/6S, 2,6S, 2,4,6 S, oligosacharidů heparinu jako je HeplVA, IIA, IS, IS2.
23. 23. Použití podle nároku 22, při němž je oligosacharid volný.
24. 24. Použití podle nároku 23, při němž je oligosacharid shluknutý.
25. 25. Použití shluknutých monosacharidů nebo oligosacharidů při výrobě farmaceutického přípravku pro zvýšení aktivity efektorových buněk imunitního systému.
26. 26. Použití podle nároku 25, při němž je efektorovou buňkou přirozená zabíječská (NK) buňka.
27. 27. Použití podle nároku 26, při němž je monosacharid nebo oligosacharid ligandem NKR-P1 proteinu.
28. 28. Použití podle nároku 26 a nároku 27, při němž je monosacharid nebo oligosacharid ligandem CD69.
29. 29. Použití podle nároku 27 nebo nároku 28, při němž má monosacharid nebo oligosacharid strukturu:

    A(v,w)-B(1,x)-C(1-y)—D kde:

    A je vybráno ze skupiny sestávající z vodíku, hexosy, která může být galaktosa nebo mannosa a může být substituovaná jedním nebo více nabitými skupinami, substituované kyseliny sialové, alifatického řetězce s jedním nebo více rozvětvenými skupinami, nasycené nebo nenasycené kyseliny uronové, která může být substituována jednou nebo více nabitými skupinami, N-acetylglukosaminu, který může být substituován jednou nebo více nabitými skupinami, a N-acetylgalaktosaminu, který může být substituován jednou nebo více nabitými skupinami,

    B může zcela chybět, nebo být vybráno ze skupiny sestávající z kyseliny uronové, která může být substituována jednou nebo více nabitými skupinami, galaktosy, Nacetylglukosaminu, který může být substituován jednou nebo více nabitými skupinami, galaktosy nebo fukosy, Nacetylgalaktosaminu, který může být substituován jednou nebo více nabitými skupinami, alifatického řetězce, který může být substituován jednou nebo více nabitými skupinami, a oligosacharidového řetězce se 3 nebo 4 manosovými zbytky,

    C může chybět nebo být vybráno ze skupiny zahrnující kyselinou uronovou, která může být substituována jednou nebo více nabitými skupinami, galaktosu, glukosu, N-acetylgalaktosamin, který může být substituován jednou nebo více nabitými skupinami, N-acetylgalaktosamin, který může být substituován jednou nebo více nabitými skupinami a alifatickým řetězcem, který může být substituován jedním nebo více nabitými skupinami,

    D může chybět nebo být vybráno mezi jedním nebo několika opakováními B a/nebo C, může však také představovat zbývající strukturní komponenty N-glykosidicky vázaných bi-, tri- nebo tetraantenárních oligosacharidů, Oglykosidických oligosacharidů nebo glykosaminoglykanů, a dalšími sekvencemi, které mohou sloužit k dodatečné vazbě nebo prezentaci Iigandu, dolní závorkovaný index představuje pozici uhlíkové vazby u uvedených sacharidů, kde v = 1 nebo 2, w = 2,3,4 nebo 6, x = 2,3 nebo 4, y = 2,3,4 nebo 6, kde A jsou substituované kyseliny sialové můžou být substituenty N-acetyl nebo O-acetyl, kde B nebo C jsou substituované alifatické řetězce, může být substituce volena mezi hydroxyly, acetyly, amino (NH.COCH3) a nabitými skupinami, a nabité skupiny mohou být představovány sulfáty, fosfáty, a skupinami kyselin karboxyiových, jako je tomu u kyselin sialových, mohou být též použity jiné nabité skupiny.
30. 30. Použití podle nároku 29 při němž je monosacharid nebo oligosacharid je tvořen a2-3 vázanou kyselinou sialovou, 3-0sulfátem, 3-O-sulfatovanou galaktosou, 3-, 4-, nebo 6-0sulfatovaným N-acetylhexosaminem, N-sulfatovaným hexosaminem, kyselinou uronovou substituovanou N-acetylhexosaminem nebo hexosaminem, 2- nebo 3-O-sulfatovanou kyselinou uronovou, a1-3 vázanou fukosou, cc1-4 vázanou fukosou, alfa2-6 vázanou kyselinou sialovou, a 2-6 vázanou kyselinou sialovou na galaktose nebo N-acetylhexose.
31. 31. Použití podle nároku 29 nebo nároku 30, při němž je oligosacharid vybrán ze skupiny zahrnující oligosacharidy glykosaminoglykanů, sulfatid, sulfatované gangliosidy jiné než sulfatid, 6-sialylovaná hexosa nebo 3-0-sulfatovaná kyselina uronová, fosfát tetramannosy, fosfát pentamannosy, sialylovaný nebo sulfatovaný Le^a nebo Le^x, HNK-1, HNK-3-5uronovou kyselinou, keratan sulfáty jako K6, S2, SN, 6ST, chondroitin sulfáty jako ChonSO₃ 0S/6S, 2,6 S a 2,4,6 S, a oligosacharidy heparinu jako jsou HeplVA, IIA, IS a IS2.
32. 32. Použití podle kteréhokoliv z nároků 17 až 31, při němž je farmaceutický prostředek určen pro opracování buněk jejichž efektorové funkce je směrována na cílové buňky před opracováním cílových buněk efektorovými.

    100
33. 33. Použití podle nároku 32, při němž je uvedené působení farmaceutického prostředku namířeno na cílové buňky.
34. 34. Použití podle nároku 32, v němž je uvedené opracování efektorovými buňkami namířeno na buňky cílové.
35. 35. Použití podle nároku 33 nebo nároku 34, v němž využívá cílové směrování protilátky nebo jejího fragmentu schopného vázat antigen.
36. 36. Použití podle kteréhokoliv z nároků 17 až 35, při němž je farmaceutický prostředek určen pro opracování buněk na něž je směrována efektorová funkce (“cílové buňky”) po opracování cílových buněk s uvedenými efektorovými buňkami.
37. 37. Použití podle nároku 36, při němž je uvedené opracování farmaceutickým prostředkem směrováno na cílové buňky.
38. 38. Použití podle nároku 36, při němž je uvedené opracování buňkami imunitního systému směrováno na cílové buňky.
39. 39. Použití podle nároku 37 nebo nároku 38, při němž směrování používá protilátky nebo jejího fragmentu schopného vázat antigen.
40. 40. Použití podle kteréhokoliv nároku 24 až 31, při němž jsou monosacharidy nebo oligosacharidy shlukovány na liposomech.
41. 41. Použití podle nároku 40, při němž liposomy tvoří prvý člen specifického vazebného páru (sbp) schopného vazby na komplementární druhý článek specifického vazebného páru.
42. 42. Použití podle nároku 41, při němž je druhý člen sbp na povrchu buňky vůči níž je směrována efektorová funkce (“cílová buňka”).

    101
43. 43. Použití podle nároku 41 a nároku 42, při němž je prvým členem sbp protilátka nebo její fragment schopný komplementární vazby druhého člena.
44. 44. Použití podle kteréhokoliv z nároků 24 až 31, při němž je monosacharid nebo oligosacharid shlukován na sekvenci aminokyselin.
45. 45. Použití podle nároku 44, při němž je sekvence aminokyselin součástí molekuly tvořící prvý člen specifického vazebného páru (sbp) schopný komplementární vazby na druhý člen tohoto vazebného páru.
46. 46. Použití podle nároku 45, při němž je druhý člen sbp na povrchu buněk vůči nimž je směřována efektorové funkce (“cílová buňka”).
47. 47. Použití podle nároku 45 nebo nároku 46, v němž je prvý člen sbp protilátkou nebo jejím fragmentem schopným komplementární vazby druhého člena sbp.
48. 48. Použití podle kteréhokoliv z nároků 17 až 47, při němž je modulovanou aktivitou anti-proliferační aktivita, cytotoxicita a/nebo sekrece cytokinů.
49. 49. Použití podle nároku 48, při němž je cytotoxicita tvořena stimulací apoptosy u cílových buněk.
50. 50. Použití podle kteréhokoliv z nároků 17 až 49, při němž je efektorové funkce namířená vůči cílovým buňkám, které jsou buňkami nádorovými.