CZ2016119A3 - Fotoaktivovatelná nanočástice pro fotodynamické aplikace, způsob její přípravy, farmaceutická kompozice ji obsahující a jejich použití - Google Patents

Fotoaktivovatelná nanočástice pro fotodynamické aplikace, způsob její přípravy, farmaceutická kompozice ji obsahující a jejich použití Download PDF

Info

Publication number
CZ2016119A3
CZ2016119A3 CZ2016-119A CZ2016119A CZ2016119A3 CZ 2016119 A3 CZ2016119 A3 CZ 2016119A3 CZ 2016119 A CZ2016119 A CZ 2016119A CZ 2016119 A3 CZ2016119 A3 CZ 2016119A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
nanoparticle
photoactivatable
temoporfin
photosensitizer
fatty alcohol
Prior art date
Application number
CZ2016-119A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ307681B6 (cs
Inventor
Martin Hrubý
Ingrid Brezániová
Vladimír Král
Original Assignee
Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i.
Vysoká škola chemicko-technologická v Praze
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i., Vysoká škola chemicko-technologická v Praze filed Critical Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i.
Priority to CZ2016-119A priority Critical patent/CZ307681B6/cs
Priority to PCT/CZ2017/050008 priority patent/WO2017148454A1/en
Publication of CZ2016119A3 publication Critical patent/CZ2016119A3/cs
Publication of CZ307681B6 publication Critical patent/CZ307681B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0076—PDT with expanded (metallo)porphyrins, i.e. having more than 20 ring atoms, e.g. texaphyrins, sapphyrins, hexaphyrins, pentaphyrins, porphocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5123—Organic compounds, e.g. fats, sugars
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)

Description

Fotoaktivovatelná nanočástice pro fotodynamické aplikace, způsob její přípravy, farmaceutická kompozice ji obsahující a jejich použití
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká fotoaktivovatelných nanočástic pro fotodynamické aplikace, způsobu jejich přípravy, farmaceutické kompozice je obsahující a jejich použití jako léčiva při fotodynamické terapii.
Dosavadní stav techniky
Fotodynamická terapie (photodynamic therapy, PDT) je relativně novou metodou léčby různých onemocnění, zaměřenou zejména na léčbu nádorů, např. spinocelulámího karcinomu hlavy a krku. PDT spočívá v kombinaci fotosenzibilizátoru (photosensitizer, PS), molekuly kyslíku a následného laserového ozáření nádorových lézí. Po laserovém ozáření nádoru absorbují molekuly fotosenzibilizátoru fotony světla a následně excitují kyslík za vzniku singletového kyslíku, který je vysoce destruktivní kvůli poškození buněčných struktur, jako jsou DNA nebo membrány v blízkém okolí. Účinnost PDT z větší části závisí na fotochemických, fotobiologických a fototerapeutických vlastnostech PS. Kritickým faktorem je formulace PS, která zajišťuje, že účinek je selektivně zaměřen na cílovou nádorovou tkáň. PDT je výhodným způsobem léčby nejen v nádorových, i v mnoha nenádorových aplikacích, např. v kosmetice, kde se fotosenzibilizátor kombinuje s biologickým výplňovým materiálem (zahrnujícím kolagen, kyselinu hyaluronovou a další syntetické nebo přírodní produkty) a formulace se následně vstřikuje do ošetřovaného místa (US20110021973 AI). PDT se využívá i jako způsob ošetření nežádoucí celulitidy (US8414880 B2) či při prevenci a léčení vaskulárních nebo zánětlivých chorob (US20090306032 AI), kde autoři popisují pevné lipidické nanočástice získané mikroemulzifikací za tepla, obsahující cholesteryl-propionát a/nebo cholesteryl butyrát.
Nanomedicína je rychle se rozvíjející oblastí lékařského výzkumu, která je zaměřena zejména na vývoj nanočástic (nanoparticles, NPs) pro profylaktické, diagnostické a terapeutické aplikace. V oblasti farmacie je obecně velikost nanočástic obvykle definována v rozsahu 1 nm až 1000 nm. Nanomedicína funguje na stejném principu jako mnoho biologických procesů a buněčných mechanismů. Fotosenzibilizátory inkorporované v nanočásticích poskytují velice slibný přístup v řešení jak problému biodostupnosti, tak cíleného transportu do nádorové tkáně. Metody a postupy pro syntézu, funkcionalizaci a použití NPs jsou dnes široce studovány a představují nové strategie pro molekulární cílení, individuální terapii a minimálně invazivní diagnostické techniky.
Obecně jsou PS podávány pacientovi různými cestami, např., topicky (US20090081281 AI), perorálně (US20100273803 AI) nebo intravenózně, přičemž každá má své výhody a nevýhody. Zejména intravenózní podání je problematické, protože mnoho PS jsou hydrofóbní nebo amfifilní látky obvykle nerozpustné ve vodě. V některých případech jsou PS (zejména temoporfin) podávány v alkoholickém roztoku (ethanol, propylenglykol). Pro PDT byly testovány zejména porfyriny a chloriny. Temoporfin (Biolitec Pharma, Skotsko, Spojené království) byl v EU schválen pro paliativní nádory hlavy a krku, nádory prostaty a pankreatu (US20060040912 AI).
Povrchově stabilizované pevné lipidické nanočástice (solid lipid nanoparticles, SLNP) s nekovalentně vázaným léčivem představují nový typ formulace léčiv. V krevním řečišti tyto SLNP po adhezi na apolipoproteiny napodobují lipoproteiny s nízkou hustotou (low-densitylipoprotein, LDL), přepravující lipidy do tkání. Receptory LDL jsou nadměrně exprimovány na povrchu mnoha nádorových buněk (Kretzer, lara F., Durvanei A. Maria, and Raul C. Maranhao. 2012. Cellular Oncology 35 (6): 451-60; Huntosova, Veronika, Diana Buzova, Dana Petrovajova, Peter Kasak, Zuzana Nadova, Daniel Jancura, Franck Sureau, and Pavol Miskovsky. 2012. International Journal of Pharmaceutics 436 (1-2): 463-71), což vede k cílenému doručení léčiva do nádoru. Pro specifické doručení PS co možná nejblíže k nádorové tkáni je potřebné potlačit mechanizmy omezující účinnost PDT. Z důvodu akumulace PS vedoucí k nežádoucí fotosenzibilizaci celého povrchu těla pacientů je kůže rozhodujícím orgánem (Moore, Caroline M., Mark Emberton, and Stephen G. Bown. 2011. Lasers in Surgery and Medicine. 3:768-75). SLNP jsou tedy účinným systémem podávání léčiv zlepšujících biologickou dostupnost i pro látky špatně rozpustné ve vodě. Formulace na bázi SLNP poskytují obecně vyšší biodostupnost a vyšší terapeutický efekt in vitro a in vivo v porovnání s komerčními formulacemi, zejména pro použití pro intravenózní lékovou aplikační formu.
US5250236 popisuje pevné lipidické sférické částice, které mají průměr menší než jeden mikrometr. Lipidové částice byly získány přidáním zahřátých lipidů (nad bodem tání) do směsi složené z vody, surfaktantu a kosurfatantu.
Patentová přihláška WO 1993005768 AI popisuje systém dopravy léčiv založený na pevných částicích lipidických materiálů nebo jejich směsí, s průměrem od 10 nm do 10 μιη. Poskytují delší dobu řízeného uvolňování účinné látky a umožňují inkorporaci hydrofilních léčiv do pevného jádra částice.
US20080090803 AI popisuje kovalentní konjugáty mastných alkoholů a farmaceutických nosičů pro léčbu nádorových a virových onemocnění a psychiatrických poruch.
US20060127471 AI popisuje přípravu lipozomálních formulací, obsahujících hydrofobní fotosenzibilizátor (temoporfin) a jejich použití v terapii, zejména za použití intravenózní aplikace. Fosfolipidy jsou modifikovány PEGylací (obsahují polyethylenoxid jako nedílnou součást). Vzniklé PEGylované liposomy obsahují hydrofobní fotosenzibilizátor uvnitř membrány. Tento mechanismus dopraví fotosenzibilizátor do buněčné membrány systému přímo do místa působení.
US7354599 B2 popisuje farmaceutické liposomální formulace pro PDT, které obsahují hydrofobní fotosenzibilizátor porfyrinového typu (temoporfin), monosacharid (fruktózu a glukózu) a jeden nebo více syntetických fosfolipidů. Díky lyofilizačnímu procesu jsou vzniklé formulace při skladování stabilní a vhodné pro intravenózní podání.
US8709449 B2 popisuje formulaci zvyšující účinnost PDT a snižující fototoxické reakce pokožky zapříčiněné PDT. Lipidová emulze obsahuje sójový olej, triglyceridy se středně dlouhým řetězcem a fosfolipidy z vajec jako hydrofobní složky. PS je vybrán ze skupiny porfyrinů, ftalocyaninů, metalografitových derivátů, barviv a syntetických fotosenzibilizátorů.
US20080311214 AI popisuje modifikované lipidické nano/ mikročástice, které na svém povrchu obsahují molekulu nebo ligand zaměřující se na specifické vazebné místo a jejich použití pro perorální podání léčiv a antigenů.
Patentová přihláška WO 2006069985 A2 popisuje metody přípravy nanočástic na bázi lipidů pomocí homogenizace za účelem inkorporace sloučeniny do už předem připravených nanočástic pomocí duální asymetrické odstředivky.
Patentová přihláška WO 2010112749A1 popisuje způsob přípravy a složení suspenzí pevných lipidických nanočástic ve vodné fázi, obsahujících minoxidil v lipidové matrici (mono-, di- a triglyceridy neobsahující kyselinu stearovou). SLNP obsahují alespoň jednu amfifilní sloučeninu vybranou z fosfolipidů (sojový lecitin, složený převážně z fosfatidylcholinů). SLNP obsahují zejména fosfatidylcholin, lecitin a jeden nebo více surfaktantů (vybraných z esterů mastných kyselin se sorbitany) a vodnou fázi (obsahující vodu, propylenglykol a popřípadě ethanol). Autoři se zaměřují na kosmetické a farmaceutické využití.
Patentová přihláška WO 2011116963 A2 popisuje systém dopravy léčiv pomocí SLNP, které jako lipidické nosiče obsahují alespoň jednu účinnou látku a jsou potaženy polymery. Účinná látka je vybrána ze skupiny kosmetických, farmaceutických a/ nebo alimentárních účinných látek a/nebo pomocných látek. Polymery (připravené jednoduchou nebo komplexní koacervací) jsou vybrány ze skupiny proteinů, polysacharidů, polyesterů, polyakrylátů, polykyanoakrylátů a/nebo jejich směsí.
US5785976 A popisuje přípravu koloidních suspenzí pevných lipidických částic anizometrických tvarů s lipidovou matricí, která je ve stabilní polymorfní modifikaci. Dále obsahují suspenzi mikro- a submikronových částic bioaktivních látek. Tyto suspenze byly připraveny především pro parenterální podání, které je velmi výhodné pro bioaktivní látky špatně rozpustné ve vodě, zejména léčiva, a jejich použití v kosmetickém, potravinářském a zemědělském průmyslu.
US4880634 A popisuje lipidické nano-pelety obsahující farmakologicky účinné látky, jejichž velikost je v rozmezí od 50 do 1000 nm, a mohou být použity jako pomocné látky v systému dopravy léčiv pro perorální podání.
Pro výběr vhodného typu nanočástic jako transportního média umožňujícího cílenou aplikaci příslušné aktivní farmaceutické ingredience je nutné zvážit i všechny nevýhody a omezení příslušného systému. V případě liposomů použití vysokoenergetického ultrazvuku při přípravě často způsobuje oxidaci a degradaci fosfolipidů (T. P. Chelvi and R. Ralhan, International Journal of Hyperthermia, vol. 11, no. 5, pp. 685-695, 1995; S. Batzri and E. D. Korn, Biochimica et Biophysica Acta-Biomembranes, vol. 298, no. 4, pp. 1015-1019, 1973; J. J. Escobar-Chavez, Skin, vol. 19, p. 22, 2012; M. R. Mozafari, Cellular and Molecular Biology Letters, vol. 10, no. 4, pp. 711-719, 2005). U micel a liposomů je dále např. riziko rozpadu transportního systému ihned po podání kvůli nedostatečné stabilitě (M. Malmsten, Soft Matter, vol. 2, no. 9, pp. 760-769, 2006). Pro systémy využívající enkapsulaci do cyklodextrinů byla prokázána dráždivost a tím obavy o bezpečnost a omezení jejich použití pro parenterální podávání (R. A. Rajewski and V. J. Stella, Journal of Pharmaceutical Sciences, vol. 85, no. 11, pp. 1142-1169, 1996; A. F. Soares, R. D. A. Carvalho, and F. Veiga, Nanomedicine, vol. 2, no. 2, pp. 183-202, 2007). U tekutých krystalů jsou kvůli jejich vysoké viskozitě problémy s přípravou a podáním a dále vykazují toxicitu kvůli vysokému obsahu surfaktantů (M. Malmsten, Soft Matter, vol. 2, no. 9, pp. 760-769, 2006; P. S. Prestes, M. Chorilli, L. A. Chiavacci, Μ. V. Scarpa, and G. R. Leonardi, Journal of Dispersion Science and Technology, vol. 31, no. 1, pp. 117-123, 2009; M. Ruckert and G. Otting, Journal of the American Chemical Society, vol. 122, no. 32, pp. 7793-7797, 2000). Pro různé typy nanočástic mohou být stěžejní i jiné charakteristiky, např. způsob podání léčiva, koloidní stabilita a interakce s krevními bílkovinami, biodegradabilita nosiče, nízká inkorporace a adsorpce léčivé látky, složitý vývoj metodik pro kontrolu kvality transportního systému, problémy se stabilitou po dobu skladování, toxikologické testy některých typů nanočástic nejsou zcela ukončeny a často je potřeba zvýšení efektivity výroby (W. Mehnert and K. Mader, Advanced Drug Delivery Reviews, vol. 47, no. 23, pp. 165-196, 2001; E. B. Souto, P. Severino, Μ. H. A. Santana, and S. C. Pinho, Quimica
Nova, vol. 34, no. 10, pp. 1762-1769, 2011).
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje plně biologicky odbouratelnou formulaci fotoaktivovatelných nanočástic pro fotodynamické aplikace s minimálními vedlejšími účinky. Je založen na pevných lipidických nanočásticích (SLNP) fotosenzibilizátoru a mastných alkoholů, přičemž povrch těchto pevných lipidických nanočástic je stabilizován netoxickým povrchově aktivním polymerem, například kopolymerem polyethylenoxid monomethyléter-ů/oc£-poly(ekaprolaktonem), který zabraňuje zachycování SNLP do retikuloendoteliálního systému. Mastné alkoholy jsou potom při metabolizaci plně odbouratelné β-oxidací, zatímco povrchově aktivní kopolymer je také sám o sobě biologicky odbouratelný na kyselinu 6-hydroxyhexanovou a polyethylenoxid a na základě relativně nízké molekulové hmotnosti jsou oba typy fragmentů odstranitelné ledvinami. SLNP jsou při skladovací teplotě 4 °C pevné, stabilní a nepodléhají agregaci. Teplota tání jádra je 39 °C, což umožňuje uvolňování fotosenzibilizátoru v nádoru kontrolovaným způsobem v důsledku intenzivního hypertermického metabolismu.
Předmětem předkládaného vynálezu je fotoaktivovatelná nanočástice pro fotodynamické aplikace, obsahující jádro a obal, jejíž jádro obsahuje 1 až 50 hmotu. % fotosenzibilizátoru, vztaženo na celkovou sušinu nanočástice, s výhodou 1 až 4 hmotn. % fotosenzibilizátoru, vztaženo na celkovou sušinu nanočástice, a dále 1 až 80 hmotn. % (C8 až C22) mastných alkoholů, vztaženo na celkovou sušinu nanočástice, s výhodou 12 až 72 hmotn. % (C8 až C22) mastných alkoholů, vztaženo na celkovou sušinu nanočástice; a obal obsahuje 1 až 80 hmotn. % polymemího surfaktantu, s výhodou polyethylenoxid monomethyléter-WocA:-poly(ekaprolaktonu), vztaženo na celkovou sušinu nanočástice, s výhodou obal obsahuje 14 až 72 hmotn. % polymemího surfaktantu, vztaženo na celkovou sušinu nanočástice; přičemž velikost nanočástice je v rozmezí od 1 do 1000 nm, s výhodou v rozmezí od 11 do 760 nm, nej výhodněji v rozmezí od 11 do 30 nm, a přičemž jádro nanočástice je při 4 °C pevné a při 39 °C kapalné, stanoveno diferenční skenovací kalorimetrií s proplachováním plynným dusíkem o objemu 50 cm3/min za použití india jako standardu v teplotních cyklech: ohřev - chlazení - ohřev, při 5 °C/min, a odečet teplot tání byl proveden z první křivky ohřevu diferenční skenovací kalorimetrie, kdy výsledkem byl bimodální termogram se dvěma endotermami, jednou pro eutektickou směs fotosenzibilizátoru a mastného alkoholu a druhou pro mastný alkohol.
Začlenění temoporfinu do lipidové matrice má vede k teplotě tání kolem 26 °C, kdy taje eutektická směs fotosenzibilizátoru a (C8 až C22) mastného alkoholu, a mezi 35 a 39 °C, s výhodou mezi 37 a 39 °C, nejvýhodněji kolem 39 °C, kdy taje samotný PS. Znamená to, že v lipidovém jádře existují dvě fáze, obsahující fotosenzibilizátor a (C8 až C22) mastný alkohol. Toto složení umožňuje stabilitu pevných lipidických nanočástic při skladování při teplotě 4 °C a zároveň teplotu tání jádra při 39 °C.
Ve výhodném provedení je fotosenzibilizátor vybraný z derivátů chlorinu a/nebo porfyrinu a/nebo antrachinonu, výhodněji je fotosenzibilizátor vybraný ze skupiny zahrnující temoporfin, verteporfin, lutecium texafyrin, hypericin a porficen.
V jednom provedení vynálezu obsahuje jádro fotoaktivovatelné nanočástice jeden typ (C8 až C22) mastného alkoholu, s výhodou je mastným alkoholem (Cm) mastný alkohol.
V jiném provedení vynálezu obsahuje jádro fotoaktivovatelné nanočástice kombinaci (C8 až C22) mastných alkoholů.
V jednom provedení vynálezu je polymemím surfaktantem polyethylenoxid monomethyléterů/ock-poly(s-kaprolakton), s výhodou o polymerizačním stupni polyethylenoxidového bloku 10 až 100 a o polymerizačním stupni poly(E-kaprolaktonového) bloku 3 až 60, výhodněji je polymerizační stupeň polyethylenoxidového bloku 20 až 50 a poly(E-kaprolaktonového) bloku 3 až 20, nejvýhodněji je polymerizační stupeň polyethylenoxidového bloku 45 a poly(skaprolaktonového) bloku 7.
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž způsob přípravy fotoaktivovatelné nanočástice podle předkládaného vynálezu, kdy:
- fotosenzibilizátor se rozpustí v rozpouštědle, s výhodou v dichlormethanu, a přidá se k (C8 až C22) mastnému alkoholu zahřátému na 45 °C za vzniku první fáze;
- polymerní surfaktant se rozpustí v organickém rozpouštědle, s výhodou v dichlormethanu, přidá se voda a směs se zahřeje na 45 °C za vzniku druhé fáze;
- obě zahřáté fáze se smíchají a homogenizují, s výhodou po dobu 2 min při 8000 otáčkách/min;
- výsledná emulze se podrobí působení ultrazvuku;
- výsledná emulze se ochladí na laboratorní teplotu.
Působení ultrazvuku lze provádět například při laboratorní teplotě a amplitudě ultrazvuku mezi 50 % a 75 %, s výhodou při amplitudě ultrazvuku 50 % po dobu 35 min a potom při amplitudě ultrazvuku 70 % po dobu 5 min.
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž farmaceutická kompozice, která obsahuje fotoaktivovatelnou nanočástici podle předkládaného vynálezu, a dále obsahuje farmaceuticky přijatelné přísady, vybrané ze skupiny zahrnující antiadheziva, pojivá, potahovací látky, barviva, bobtnadla, ochucovadla, maziva, konzervanty, sladidla, sorbenty.
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž fotoaktivovatelná nanočástice podle předkládaného vynálezu a/nebo farmaceutická kompozice podle předkládaného vynálezu pro použití jako léčivo.
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž fotoaktivovatelná nanočástice podle předkládaného vynálezu a/nebo farmaceutická kompozice podle předkládaného vynálezu pro použití jako léčivo pro intravenózní aplikaci. Intravenózní aplikací se rozumí vpravení tekuté formy léčiva přímo do žíly nebo tepny pacienta.
Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž fotoaktivovatelná nanočástice podle předkládaného vynálezu a/nebo farmaceutická kompozice podle předkládaného vynálezu pro použití při fotodynamické terapii a/nebo fotodynamické diagnostice.
Předkládaný vynález systému pevných lipidických nanočástic poskytuje řešení k překonání všech výše zmíněných omezení ze stavu techniky, jako je např. jednoduchá příprava, stabilita po dobu skladování, jádro nanočástice je při skladovací teplotě (4 °C) pevné, stabilní a nepodléhá agregaci při fyziologickém pH (pH ~ 7,4), přičemž teplota tání jádra 39 °C umožňuje uvolňování fotosenzibilizátoru v nádoru kontrolovaným způsobem v důsledku intenzivního hypertermického metabolismu. Nanosystém o jedinečném složení je plně biodegradovatelný a poskytuje zvýšení biodostupnosti a terapeutického efektu in vitro a in vivo (porovnaní s komerční formulací). Použití nanoformulace je jak pro perorální, tak intravenózní lékovou aplikační formu.
Stručný popis obrázků
Obrázek 1: ’H-NMR spektrum kopolymeru polyethylenoxid-6/ock-poly(c-kaprolakton), (PEO-ůPCL). Intenzity protonových signálů označených: a (δ = 3,63 ppm, odpovídá PEO bloku) a c (δ = 1,64 ppm, odpovídá bloku PCL) v *H-NMR spektru.
Obrázek 2: Termogramy DSC analýzy vzorků bez obsahu temoporfinu (označeny jako SLNP s příslušným PEOxPCLy), s inkorporovaným temoporfinem (připraveny dle Příkladů 1, 2 a 3) a čistý temoporfin (10 až 20 mg).
Obrázek 3: Transmisní elektronové mikrografy vzorků pevných lipidických nanočástic s inkorporovaným temoporfinem, připravených dle Příkladů 1, 2 a 3.
Obrázek 4: Časový profil in vitro uvolňování temoporfinu (%) z pevných lipidických nanočástic připravených dle Příkladů 1, 2 a 3, při pH 7,4. Data jsou vyjádřena jako průměr ± SD (n = 3).
Obrázek 5: Vliv „one-shot“ PDT na růst lidského karcinomu prsu linie MDA-MB-231. Skupině Nu/Nu myší (n=5) byly intravenózně aplikovány formulace pevných lipidických nanočástic s inkorporovaným temoporfinem připravených dle Příkladů 1, 2, 3 (dávka temoporfinu 0,8 mg/kg myš, i.v.), které jsou ve srovnání s neléčenou skupinou myší (v grafech jako kontrolní skupina) a v porovnání s komerční formulací (Originátor, 4 mg temoporfinu, 376 mg ethanolu a 560 mg propylenglykolu). Tři hodiny po podání byly nádorové oblasti ozářeny (100 J/cm2) a následně byly v pravidelných intervalech měřeny velikosti nádoru.
Obrázek 6: Křivka inhibice růstu nádoru - TGI % (tumor growth inhibition) jako funkce času po intravenózní aplikaci (i.v.) testovaných formulací pevných lipidických nanočástic s inkorporovaným temoporfinem připravených dle Příkladů 1, 2, 3 (dávka temoporfinu 0,8 mg/kg myš) v porovnání s komerční formulací (Originátor, 4 mg temoporfinu, 376 mg ethanolu a 560 mg propylenglykolu). Graf znázorňuje inhibici růstu lidského karcinomu prsu linie MDAMB-231 ve skupině Nu/Nu myší (n=5).
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Syntéza kopolymeru polyethylenoxid-ů/oc&-poly(a -kaprolaktonu) (PEO-ů-PCL) je založena na polymerizaci s otevíráním kruhu ε-kaprolaktonu bez přítomnosti katalyzátoru, iniciovaná pomocí polyethylenoxid monomethyleteru (MPEO). Do 50 ml odměmé baňky s magnetickým míchadlem byly vloženy 3 g (1,49 mmol) MPEO. Systém byl odplyněn v 5 cyklech vakuum argon. V atmosféře argonu bylo přidáno 3,4 g (30 mmol) ε-kaprolaktonu. Následně byl systém ochlazen suchým ledem/ethanol, evakuován a zahřát na 185 °C. Polymerizace s otevíráním kruhu trvala 33 hodin. Po polymeraci byl systém naplněn argonem a vychlazen na laboratorní teplotu. Pevné látky v baňce byly rozpuštěny v 10 ml dichlormethanu a vysráženy do 350 ml diethyletheru. Po vysušení byl polymer suspendován ve vodě a dialyzován proti vodě v dialyzační membráně MWCO 2 kDa. Příklad 'H-NMR spektra kopolymeru PEO-ů-PCL je zobrazen na Obrázku 1. Poměr monomemích jednotek jednotlivých produktů byl vypočten za použití intenzit protonových signálů označených a (δ = 3,63 ppm, odpovídá PEO bloku) a c (δ = 1,64 ppm, odpovídá bloku PCL) v !H-NMR spektru podle rovnice (1):
DP(PCL) = DP(PEO) (1) kde DP(PCL) je stupeň polymerizace poly(s-kaprolaktonového) bloku, DP(PEO) je stupeň polymerizace polyethylenoxidového bloku a c a a jsou integrální intenzity signálů příslušných protonů (viz Obrázek 1).
Délka bloku PEO makroiniciátoru v kopolymeru se stupněm polymerace byla DP = 45 monomemích jednotek. Délka bloku PCL se stupněm polymerace DP = 7 monomerních jednotek. Výsledný kopolymer (polymerní surfaktant) má průměrný vzorec: PEO45PCL7.
Pevné lipidické nanočástice s inkorporovaným fotosenzibilizátorem temoporfinem byly připraveny pomocí vysokovýkonné homogenizační a ultrazvukové metody. Lipidická fáze složená z 1 -tetradekanolu (10 mg/ml) byla vložena do skleněné lahvičky a zahřáta na 45 °C. Temoporfin (10 mg/ml) byl rozpuštěn v 1 ml dichlormetanu a přidán k lipidové fázi pro získání směsi lipid-léčivo po odpaření dichlormetanu. Vodná fáze byla získána rozpuštěním kopolymeru PEO45PCL7 (50 mg/ml) v 1 ml dichlormetanu, následným přidáním 5 ml H2O a zahřátím na 45 °C. Horká lipidová fáze byla přidána k horké vodné fázi a následně byla směs homogenizovaná po dobu 2 min při 8000 otáčkách/min. Výsledná emulze byla ultrazvukovaná za použití standardního ultrazvukového hrotu (T25 digital Ultra-Turrax, IKA, Schoeller instruments, s.r.o., Czech Republic). Amplituda ultrazvuku byla nastavena na 50 % po dobu 35 min a na 70 % po dobu 5 min. Vzniklá emulze byla okamžitě ochlazená na laboratorní teplotu.
Pro měření velikosti částic (hydrodynamický poloměr, RH), indexu polydisperzity (PDI) a zeta potenciálu (ZP) testovaných pevných lipidických nanoformulací s inkorporovaným temoporfinem byl použit Zetasizer (Zen 3600, Malvem Instruments Ltd.) pomocí dynamického rozptylu světla (DLS). Pro dosažení vhodné koncentrace před samotným měřením byly vzorky zředěny redestilovanou vodou (pH~5 výsledného roztoku). Veškerá měření probíhala při teplotě °C. K reprezentaci dat distribuce velikosti NPs byla použita intenzitně vážená distribuce. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 1.
Pro analýzu pomocí diferenční skenovací kalorimetrie (DSC) byl použit kalorimetr (Q2000, V24.ll Build 124, TA Instruments) s proplachováním plynným dusíkem (50 cm3/min.). Přístroj byl kalibrován pro měření teploty a tepelného toku za použití india jako standardu. Analyzované byly vzorky jednak bez obsahu temoporfmu (označeny jako SLNP s příslušným PEOxPCLy), tak s inkorporovaným temoporfinem (připraveny dle Příkladu 1, 2, 3) a samotný temoporfin (pevná látka, 10 až 20 mg), (viz Obrázek 2). Nanoformulace byly umístěny do T-zero hermetických hliníkových pánviček a analýza probíhala v teplotních cyklech: ohřev - chlazení ohřev, od 10 °C do 50 °C, při 5 °C/min. Teploty tání těchto vzorků byly odečteny z 1. DSCkřivky ohřevu. Začlenění temoporfmu do lipidové matrice má za výsledek bimodální termogram se dvěma endotermami: kolem 26 °C (eutektická směs temoporfmu a 1-tetradekanolu) a kolem 39 °C (1-tetradekanol). To znamená, že v lipidovém jádře existují dvě fáze, obsahující temoporfin a 1-tetradekanol. Toto složení umožňuje stabilitu pevných lipidických nanočástic při skladování při teplotě 4 °C a zároveň teplotu tání jádra při 39 °C.
Testované nanoformulace byly ve skleněných lahvičkách skladovány v chladničce při teplotě 4 8 °C, po dobu 1 měsíce. V den 1, 14 a 30 byla pomocí DLS měřena velikost částic (Rh, nm), PDI a ZP (mV) a to při pH ~ 5 a 7,4. Na základě statistické analýzy rozptylu jednoduchého třídění (one-way ANOVA) nebyl během skladování (den 1, 14, 30) zjištěn žádný významný rozdíl. Hodnota a=0,05 byla použita jako prahová hodnota statistické významnosti.
Obsah temoporfmu v lipidové matrici byl stanoven pomocí UV-VIS spektrometrie (Evolution 220, Thermo Scientific™) následovně: Vzorky nanoformulací (Ιμΐ) byly rozpuštěny v methanolu (0,999 ml) a analyzovány při 652 nm. Koncentrace temoporfmu byla vypočtena použitím Lambert-Beerova zákona, Amax = 652 nm, ε652 = 22 400 M'1cm’1(2). Účinnost enkapsulace temoporfmu (EE %) a obsah temoporfmu v systému nanočástic (DL %) byly vypočteny podle rovnic (3) a (4) a výsledky jsou zobrazeny v Tabulce 2,
A = ελ. c. I (2)
EE (%) — WlétivovSLNP x 100 % (3) wtotal
DL (%) = -------W'ÍÍI ,SL'w------X 100 % (4) wléčivo v SLNP + W lipid + ''*surfai<tarlt (1) A ^absorbance; εχ =molámí absorpční koeficient při vlnové délce λ (652 nm); c =molámí koncentrace absorpční složky v mol/L; 1 =délka absorpční vrstvy. (2) EE (%) =účinnost enkapsulace; wiéčivo v slnp ^hmotnost temoporfinu v pevných lipidických nanočásticích; wtotai = celková hmotnost temoporfinu použitá při přípravě testovaných nanoformulací; (3) DL (%) = obsah temoporfinu v nanočásticovém systému (drug loading); wiiPid =hmotnost 1-tetradekanolu; Wsurfaktant =hmotnOSt PEO45PCL7.
Testované vzorky byly analyzovány a vizualizovány pomocí transmisního elektronového mikroskopu (TEM) (Tecnai G2 Spirit Twin 12, FEI). Vzorek (2 μΐ) byl nakapán na dírkovanou, uhlíkem potaženou mřížku a přebytek roztoku byl odsát dotykem úzkého pruhu filtračního papíru (1 min). Nanočástice byly při laboratorní teplotě ponechány zcela oschnout a následně byly pozorovány pomocí TEM mikroskopu (zobrazení ve světlém poli, urychlovací napětí 120 kV). Částice jsou zobrazeny jako černé skvrny na šedém pozadí (pozitivní kontrast), mají kulovitý tvar a velikost korelující s hydrodynamickým poloměrem, měřeným pomocí DLS, jakje znázorněno na Obrázku 3.
Pro studium in vitro uvolňování temoporfinu z testovaných formulací byla použita metoda dialýzy přes dialyzační membránu (viz Obrázek 4). Dialyzační membrána (3,5 kDa) byla na 20 min ponořena do destilované vody. Alikvotní objem formulace (2 ml) byl nejprve zředěn 2 ml 2 x koncentrovanějšího PBS. Tato směs byla přemístněna do dialyzačních membrán a následně vložena do předehřátého (37 °C) roztoku PBS o pH ~ 7,4 (200 ml) a ponechána míchat na magnetické míchačce (200 otáček za minutu). Alikvotní podíly (0,1 ml) vzorků byly v časových intervalech 0,5; 1; 2; 4; 6; 8; 24 a 72 hodin odebrané z vnitřního prostoru dialyzační membrány a analyzovány pomocí UV-VIS spektrometrie (po vhodném zředění methanolem). Následně byl vypočten procentuální obsah uvolněného temoporfinu a to na základě rozdílu jeho koncentrace použité pro přípravu roztoku SLNP (10 mg/ml) a stanové koncentrace pomocí UV-VIS spektrometrie v odebraném roztoku vzorku z vnitřku dialyzační membrány.
Buňky nádorové linie 4T1 (karcinom mléčné žlázy myší) a MDA-MB-231 (lidský adenokarcinom prsu) byly udržovány v exponenciální fázi růstu za sterilních podmínek v mediu RPMI 1640 obohaceném o 10% bovinního fetálního séra (FCS), penicilinu (100 jednotek/ml), streptomycinu (0,1 mg/ml) a L-glutaminu (2 mmol). Inkubovány byly při 37 °C v atmosféře z 95% vzduchu a 5% CO2. Buněčné linie byly pasážovany každý druhý nebo třetí den.
Pro analýzu in vitro cytotoxicity testovaných formulací byly buňky 4T1 (2 χ 105) nasazeny na Petriho misky (35 mm) a inkubovány přes noc při 37°C. K buňkám pak byly přidány testované formulace tak, aby finální koncentrace temoporfinu byly v rozmezí 0,25 - 2 uM a následně byly dále 16 hodin inkubovány. Koncentrace temoporfinu v SLNP byla zvolena tak, aby sama o sobě nezpůsobila více než 10% mortalitu buněk. Testovací misky s buňkami byly propláchnuty médiem bez fenolové červeně (FČ) a po přidání kultivačního media bez FČ byly 30 min ozařovány pomocí halogenové lampy (75 W) vybavené filtrem pro vlnové délky 620 až 680 nm (Andover, Salem, NH). Maximum excitace temoporfinu odpovídá λ6Χ = 652 nm. Intenzita ozařování buněk byla 3,7 mW/cm s celkovou dávkou ozáření 6,6 J/cm . V Bůrkerově komůrce byl 24 hodin po ozáření stanoven pomocí vstřebávání trypanové modři poměr živých a mrtvých buněk (%, buňky/ml) a tím byly získány křivky dávka - účinek, z kterých byly číselně vyhodnoceny hodnoty IC 50. Hodnota IC 50 představuje koncentraci temoporfinu, která je potřebná k usmrcení 50 % buněk a byla vypočtena pro každou křivku (Tabulka 3). V kontrolních experimentech byl hodnocen jejich toxický efekt bez ozáření (tzv. „dark toxicity”, toxicita bez fotodynamického efektu) a taktéž toxicita formulací SLNP bez obsahu temoporfinu (prázdných, tj. 1-tetradekanol a ΡΕΟχΡΤΧγ) při stejných koncentračních podmínkách. Byla zjištěna velmi nízká toxicita bez ozáření stejně jako u SPLP bez temoporfinu (pod 10 % v celém koncentračním rozsahu).
Subcelulámí lokalizace fotosenzibilizátoru temoporfinu byla zkoumána pomocí fluorescenční mikroskopie v porovnání s formulací originátora (komerční, 4 mg temoporfinu, 376 mg ethanolu a 560 mg propylenglykolu). Nádorové buňky 4T1 nasazené na krycí sklíčka, umístněné v Petriho miskách (průměr 35 mm) byly inkubovány s formulacemi temoporfinu o konečné koncentraci 2 μΜ (1 h nebo 4 h inkubace) nebo 1 μΜ (16 hod inkubace) v kultivačním médiu při 37 °C. Po inkubaci byly misky s buňkami promyty třikrát PBS, zality bezbarvým médiem bez FČ a zkoumány pod mikroskopem (DM IRB, Leica) vybaveným fotoaparátem (DFC 480) při použití objektivu s 63x olejovou imerzí a filtrační kostkou (N2.1, Leica), excitace: BP 515-560 nm, emise: LP 590 nm). Fluorescence formulací fotosenzibilizátoru temoporfinu v nádorových 4T1 buňkách byla měřena 1, 4 a 16 hodin po přidání formulace do kultivačního media. Testovaná nanoformulace, v porovnání s formulací originátora, vykazovala významně rychlejší kinetiku nárůstu fluorescence (po 4 h).
Pro sledování subcelulámí kolokalizace byly buňky inkubovány s testovanou nanoformulací temoporfinu a k buňkám byl postupně přidán na 30 min 100 nM MitoTracker Green (pro značení mitochondrií) nebo 250 nM ER-Tracker Blue pro značení endoplazmatického retikula (ER). Pro označení lysozomů byl do kultivačního média (1 h) přidán 500 nM LysoTracker Green. Filtrační kostka typu A (Leica, excitace: BP 340-380 nm a emise: LP 400 nm) byla použita pro analýzu
ER Tracker Blue; filtrační kostka 13 (Leica, excitace: BP 450-490 a emise: LP 515) byla použita pro MitoTracker Green a LysoTracker Green. Testovaná nanormulace byla lokalizována především v ER.
Terapeutická účinnost pro cílený transport léčiva s PDT aplikací byla testována na nádorovém modelu Nu/Nu myší in vivo a byla srovnaná s originální formulací (komeční, označena jako •7 originátor). Buňky lidského karcinomu prsu linie MDA-MB-231 (1x10 buněk) byly suspendovány v 0,1 ml PBS a 0,1 ml Matrigelu a následně subkutánně (s.c.) injikovány do zadních boků myší. Když hmotnost tumoru dosáhla objemu 200 až 300 mm (7 až 10 dnů po transplantaci), testována formulace byla v objemu 0,1 ml na 20 g myši intravenózně (i.v.) injikována do ocasní žíly v dávce temoporfinu 0,8 mg/kg myši. Po třech hodinách byla plocha nádoru (2 cm ) ozářená pomocí xenonové lampy, (500-700 nm, λ6χ. 652 nm), o celkové maximální dávce světla 100 J/cm a intenzitě ozáření 200 mW/cm . Kontrolní skupina myší byla za stejných podmínek ozářená, ale bez působení léčiva (viz Obrázek 5). Každá experimentální skupina se skládala z 5 myší. Čtyřicet dva dnů po podání testovaných nanoformulací byly myši usmrceny předávkováním ketaminem a nádory byly histologicky vyhodnocené. Všechny aspekty zvířecích experimentů a chovu byly prováděny v souladu s národními a evropskými předpisy a byly schváleny ústavním výborem (Bříza, Tomáš, Jarmila Králová, Petr Cígler, Zdeněk Kejík, Pavla Poučková, Petr Vašek, Irena Moserová, Pavel Martásek, and Vladimír Král. 2012. Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters 22 (1): 82-84; Králová, Jarmila, Tomáš Bríza, Irena Moserová, Bohumil Dolenský, Petr Vašek, Pavla Poučková, Zdenek Kejík, et al. 2008. Journal of Medicinal Chemistry 51 (19): 5964-73). Získaná data pro každou testovanou skupinu jsou vyjádřena jako aritmetický průměr (n=5), chyba měření byla vypočtena jako směrodatná odchylka (± SD) a zobrazena jako funkce času. Zmenšení objemu nádoru bylo ve srovnání s neošetřenou kontrolnou skupinou statisticky významné na hladině významnosti a=0.01 (Tabulka
4)·
Inhibice růstu nádoru (tumor growth inhibition, % TGI) jako měřítko účinnosti terapie byla srovnaná s komerční formulací (4 mg temoporfinu, 376 mg ethanolu a 560 mg propylenglykolu), (viz Obrázek 6). Vypočtena byla podle rovnice (5), kde V je střední objem nádoru konkrétní testované skupiny v daném časovém bodě, Vo je střední objem nádoru konkrétní testované skupiny na začátku experimentu, Vk je střední objem nádoru kontrolní skupiny (s aplikací fyziologického roztoku) v daném časovém bodě a Vk0 je střední objem nádoru kontrolní skupiny na začátku experimentu:
TGI (%) = 100 - x 1001 (5)
Příklad 2
Formulace byla analogická Příkladu 1, obměna spočívala v jiném složení (stupeň polymerace poly(E-kaprolaktonového) bloku) použitého kopolymeru (PEO45PCL17). Výsledky zDLS analýzy (RH, PDI, ZP) uvedeny v Tabulce 1. Výsledky z DSC jsou uvedeny na Obrázku 2. Výsledky pro účinnost enkapsulace temoporfmu (%) a obsah temoporfmu (%) v SLNP jsou uvedeny v Tabulce 2. Transmisní elektronové mikrografy testovaných vzorků jsou zobrazeny na Obrázku 3. Časový profil in vitro uvolňování temoporfmu (%) z nanoformulací je zobrazen na Obrázku 4. Analýza in vitro cytotoxicity probíhala dle Příkladu 1, obměna spočívala v použití finálních koncentrací temoporfmu inkorporovanýho v testovaných SLNP, které byly v rozmezí 1 - 20 uM. Výsledky z mortality buněk (%), IC 50 (μΜ) jsou uvedeny v Tabulce 3. Postup subcelulámí lokalizace fotosenzibilizátoru temoporfmu pomocí fluorescenční mikroskopie proběhl dle Příkladu 1. Postup stanovení subcelulámí kolokalizace nanoformulací pomocí fluorescenční mikroskopie proběhl dle Příkladu 1, obměna spočívala v její lokalizaci - především v lysozomech. Výsledky terapeutické účinnosti pro cílený transport temoporfmu s PDT aplikací in vivo jsou zobrazeny na Obrázku 5 a jejich statistické vyhodnocení je uvedeno v Tabulce 4. Graf znázorňující inhibici růstu nádoru je zobrazen na Obrázku 6.
Příklad 3
Formulace dle Příkladu 1, obměna spočívala v jiném složení (stupeň polymerace poly(skaprolaktonového) bloku) použitého kopolymeru (PEO45PCL34). Výsledky z DLS analýzy (RH, PDI, ZP) uvedeny v Tabulce 1. Výsledky z DSC jsou uvedeny na Obrázku 2. Výsledky pro účinnost enkapsulace temoporfmu (%) a obsah temoporfmu (%) v SLNP jsou uvedeny v Tabulce
2. Transmisní elektronové mikrografy testovaných vzorků jsou zobrazeny na Obrázku 3. Časový profil in vitro uvolňování temoporfmu (%) z nanoformulací je zobrazen na Obrázku 4. Analýza in vitro cytotoxicity dle Příkladu 1, obměna spočívala v použití finálních koncentrací temoporfmu inkorporovanýho v testovaných SLNP, které byly v rozmezí 1-20 uM. Výsledky z mortality buněk (%), IC 50 (μΜ) jsou uvedeny v Tabulce 3. Postup subcelulámí lokalizace fotosenzibilizátoru temoporfmu pomocí fluorescenční mikroskopie dle Příkladu 1. Výsledky terapeutické účinnosti pro cílený transport temoporfmu s PDT aplikací in vivo jsou zobrazeny na
Obrázku 5, obměna spočívala ve statistické analýze dat, kde zmenšení objemu nádoru bylo ve srovnání s neošetřenou kontrolnou skupinou statisticky nevýznamné na hladině významnosti a=0.01, jak je uvedeno v Tabulce 4. Graf znázorňující inhibici růstu nádoru je zobrazen na
Obrázku 6.
Příklad 4
Formulace dle Příkladu 1, obměna spočívala v hmotnostím složení lipidické fáze, kde navážka 1tetradekanolu byla 50 mg/ml a ve hmotnostím složení vodné fáze, kde navážka PEO45PCL7 byla 10 mg/ml. Výsledky z DLS analýzy (Rh, PDI, ZP) uvedeny v Tabulce 1. Výsledky pro účinnost enkapsulace temoporfmu (%) a obsah temoporfinu (%) v SLNP jsou uvedeny v Tabulce 2.
Příklad 5
Formulace dle Příkladu 1, obměna spočívala v hmotnostím složení lipidické fáze, kde navážka 1tetradekanolu byla 50 mg/ml a ve hmotnostím složení vodné fáze, kde navážka PEO45PCLi7byla 10 mg/ml. Obměna dále spočívala dále v jiném složení (stupeň polymerace poly(Ekaprolaktonového) bloku) použitého kopolymeru (PEO45PCL17). Výsledky z DLS analýzy (RH, PDI, ZP) uvedeny v Tabulce 1. Výsledky pro účinnost enkapsulace temoporfmu (%) a obsah temoporfmu (%) v SLNP jsou uvedeny v Tabulce 2.
Příklad 6
Formulace dle Příkladu 1, obměna spočívala v hmotnostím složení lipidické fáze, kde navážka 1tetradekanolu byla 50 mg/ml a ve hmotnostím složení vodné fáze, kde navážka PEO45PCL34 byla 10 mg/ml. Obměna dále spočívala v jiném složení (stupeň polymerace poly(s-kaprolaktonového) bloku) použitého kopolymeru (PEO45PCL34). Výsledky z DLS analýzy (RH, PDI, ZP) uvedeny v Tabulce 1. Výsledky pro účinnost enkapsulace temoporfmu (%) a obsah temoporfinu (%) v SLNP jsou uvedeny v Tabulce 2.
Příklad 7
Formulace dle Příkladu 1, obměna spočívala v navážce temoporfmu použité při přípravě testovaných nanoformulací, která byla 20 mg/ml. Výsledky z DLS analýzy (RH, PDI, ZP) uvedeny v Tabulce 1. Výsledky pro účinnost enkapsulace temoporfmu (%) a obsah temoporfinu (%) v SLNP jsou uvedeny v Tabulce 2.
r* · ·
Příklad 8
Formulace dle Příkladu 1, obměna spočívala v navážce temoporfinu použité při přípravě testovaných nanoformulací, která byla 20 mg/ml. Další obměna spočívala v jiném složení (stupeň polymerace poly(s-kaprolaktonového) bloku) použitého kopolymeru (PEO45PCL17).Výsledky zDLS analýzy (Rh, PDI, ZP) uvedeny v Tabulce 1. Výsledky pro účinnost enkapsulace temoporfinu (%) a obsah temoporfinu (%) v SLNP jsou uvedeny v Tabulce
2.
Příklad 9
Formulace dle Příkladu 1, obměna spočívala v navážce temoporfinu použité při přípravě testovaných nanoformulací, která byla 20 mg/ml. Další obměna spočívala v jiném složení (stupeň polymerace poly(s-kaprolaktonového) bloku) použitého kopolymeru (PEO45PCL34). Výsledky zDLS analýzy (RH, PDI, ZP) uvedeny v Tabulce 1. Výsledky pro účinnost enkapsulace temoporfinu (%) a obsah temoporfinu (%) v SLNP jsou uvedeny v Tabulce
2.
Tabulka 1: Velikost částic (Rh, nm), index polydisperzity (PDI), zeta potenciál (ZP, mV) vzorků pevných lipidických nanoformulací inkorporovaným temoporfinem (průměr ± SD, n = 3), při pH~5.
ZP (mV) ± SD -8,2 ± 1,7 -17,8 ±3,2 -13,1 ±0,5 -9,2 ± 1,6 -7,5 ± 1,3 -6,5 ± 1,3 -9,2 ± 1,3 -4,5 ± 1.6 -14,6 ± 1,2
PDI± SD cn CN (N o' o o ± ± ± ι> o o o' 0,9 ±0,01 0,6 ± 0,01 0,9 ±0,01 0,8 ± 0,02 0,9 ± 0,003 0,5 ± 0,01
Q CZ) -H ΐ X 13,3 ±0,8 7.8 ± 2,3 8.9 ± 1,1 316.2 ±22,5 349.2 ± 15,1 353.2 ±25,3 6,3 ± 0,4 10,4 ± 1,6 20,6 ± 1,4
Hmotnostní procenta (obsah látky v sušině systému) U CU X O w CU 71,4 14,3 62,5
1 -tetradekanol 14,3 12,5
Koncentrace (mg / ml) temoporfm o r-H o 1—^ 20
U Cu X O W CU 50 o 1—-H 50
1 -tetradekanol o ▼—4 50 o r—4
Formulace Příklad 1 Příklad 2 Příklad 3 Příklad 4 Příklad 5 Příklad 6 Příklad 7 Příklad 8 Příklad 9
Tabulka 2: Účinnosti enkapsulace temoporfinu (EE %) a obsah temoporfinu (DL %) v testovaných pevných lipických nanočástic s inkorporovaným temoporfinem (průměr ± SD, n =
3).
Formulace DL (%) ± SD EE (%) ± SD
Příklad 1 3,92 ± 0,06 22,22 ± 0,3
Příklad 2 3,93 ± 0,09 22,65 ± 0,1
Příklad 3 3,96 ± 0,08 23,06 ± 0,4
Příklad 4 2,98 ±0,11 14,83 ± 0,6
Příklad 5 3,08 ± 0,05 17,02 ± 1,1
Příklad 6 3,12 ±0,08 18,13 ±0,8
Příklad 7 1,70 ±0,34 5,26 ± 0,3
Příklad 8 1,82 ±0,12 7,15 ±0,4
Příklad 9 1,90 ±0,02 9,12 ±0,3
Tabulka 3: Mortalita buněk (%) a IC 50 (μΜ) po podání pevných lipidických nanočástic s inkorporovaným temoporfinem připravených dle Příkladů 1, 2 a 3 (průměr ± SD, n = 5).
Formulace Koncentrace (μΜ) (temoporfinu) Mortalita buněk (%) (mean ± SD) IC 50 (μΜ) (temoporfin)
Příklad 1 0,25 0,5 1 2 24 ± 6,8 67 ± 24,7 88 ± 0,9 93 ± 2,4 0,39
Příklad 2 1 2,5 10 20 47 ± 12,9 44 ± 4,2 66 ± 7,7 61 ± 11,5 2,41
Příklad 3 1 2,5 10 20 21 ± 1,6 22 ± 7,6 26 ± 15,7 29 ± 9.7 >20
Tabulka 4: Statistická analýza in vivo dat („one-shot“ PDT) za použití statistické analýzy rozptylu jednoduchého třídění (one-way ANOVA) z programu Origin 9 (OriginLab software), při prahových hodnotách hladiny významnosti a = 0,05 a 0,01.
Kontrola Originátor Příklad 1 Příklad 2 Příklad 3
Kontrola + + + + + + +
Originátor + + 0 0 0
Příklad 1 + + 0 0 + +
Příklad 2 + + 0 0 +
Příklad 3 + 0 + + +
<y významné rozdíly mezi skupinami, a = 0.05.
Žádné statistic
Statisticky významné rozdíly mezi skupinami, a = 0.05. Statisticky významné rozdíly mezi skupinami, a = 0.01.
Příklad 10
Formulace dle Příkladu 1, s tím, že fotosenzibilizátor byl verteporfín.
Příklad 11
Formulace dle Příkladu 1, s tím, že fotosenzibilizátor byl lutecium texafyrin.
Příklad 12
Formulace dle Příkladu 1, s tím, že fotosenzibilizátor byl hypericin.
Příklad 13
Formulace dle Příkladu 1, s tím, že fotosenzibilizátor byl porficen.

Claims (10)

  1. PATENTOVÉ NÁROKY
    1. Fotoaktivovatelná nanočástice pro fotodynamické aplikace, obsahující jádro a obal, vyznačená tím, že jádro obsahuje 1 až 50 hmotn. % fotosenzibilizátorů, vztaženo na celkovou sušinu nanočástice, s výhodou 1 až 4 hmotn. % fotosenzibilizátorů, vztaženo na celkovou sušinu nanočástice, a dále 1 až 80 hmotn. % (Cg až C22) mastných alkoholů, vztaženo na celkovou sušinu nanočástice, s výhodou 12 až 72 hmotn. % (C8 až C22) mastných alkoholů, vztaženo na celkovou sušinu nanočástice; a obal obsahuje 1 až 80 hmotn. % polymerního surfaktantu, s výhodou polyethylenoxid monomethyléter-ů/ncA-poly(s-karoplaktonu), vztaženo na celkovou sušinu nanočástice, s výhodou obal obsahuje 14 až 72 hmotn. % polymerního surfaktantu, vztaženo na celkovou sušinu nanočástice; přičemž velikost nanočástice jev rozmezí od 1 do 1000 nm, s výhodou v rozmezí od 11 do 760 nm, nejvýhodněji v rozmezí od 11 do 30 nm, a přičemž jádro nanočástice je při 4 °C pevné a při 39 °C kapalné, stanoveno diferenční skenovací kalorimetrií s proplachováním plynným dusíkem o objemu 50 cm3/min za použití india jako standardu v teplotních cyklech: ohřev - chlazení - ohřev, při 5 °C/min, a odečet teplot tání byl proveden z první křivky ohřevu diferenční skenovací kalorimetrie, kdy výsledkem byl bimodální termogram se dvěma endotermami, jednou pro eutektickou směs fotosenzibilizátorů a mastného alkoholu a druhou pro mastný alkohol.
  2. 2. Fotoaktivovatelná nanočástice podle nároku 1, vyznačená tím, že fotosenzibilizátor je vybraný z derivátů chlorinu a/nebo porfyrinů a/nebo antrachinonu, s výhodou je fotosenzibilizátor vybraný ze skupiny zahrnující temoporfin, verteporfin, lutecium texafyrin, hypericin a porfícen.
  3. 3. Fotoaktivovatelná nanočástice podle nároku 1 nebo 2, vyznačená tím, že jádro obsahuje jeden typ (Cg až C22) mastného alkoholu, s výhodou je mastným alkoholem (Cu) mastný alkohol.
  4. 4. Fotoaktivovatelná nanočástice podle nároku 1 nebo 2, vyznačená tím, že jádro obsahuje kombinaci (Cg až C22) mastných alkoholů.
  5. 5. Fotoaktivovatelná nanočástice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 4, vyznačená tím, že polymerního surfaktant je polyethylenoxid monomethyléter-ů/oc£-poly(E-karoplakton), s výhodou o polymerizačním stupni polyethylenoxidového bloku 10 až 100 a o polymerizačním stupni poly (ε -karoplaktonového) bloku 3 až 60, výhodněji je polymerizační stupeň polyethylenoxidového bloku 20 až 50 a póly (ε -karoplaktonového) bloku 3 až 20, nejvýhodněji je polymerizační stupeň polyethylenoxidového bloku 45 a póly (ε -karoplaktonového) bloku 7.
  6. 6. Způsob přípravy fotoaktivovatelné nanočástice podle kteréhokoliv z předchozích nároků, vyznačený tím, že:
    - fotosenzibilizátor se rozpustí v rozpouštědle, s výhodou v dichlormethanu, a přidá se k (C8 až C22) mastnému alkoholu zahřátému na 45 °C za vzniku první fáze;
    - polymerní surfaktant se rozpustí v organickém rozpouštědle, s výhodou v dichlormethanu, přidá se voda a směs se zahřeje na 45 °C za vzniku druhé fáze;
    - obě zahřáté fáze se smíchají a homogenizují, s výhodou po dobu 2 min při 8000 otáčkách/min;
    - výsledná emulze se podrobí působení ultrazvuku;
    - výsledná emulze se ochladí na laboratorní teplotu.
  7. 7. Farmaceutická kompozice, vyznačená tím, že obsahuje fotoaktivovatelnou nanočástici podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 a dále obsahuje farmaceuticky přijatelné přísady, vybrané ze skupiny zahrnující antiaheziva, pojivá, potahovací látky, barviva, bobtnadla, ochucovadla, maziva, konzervanty, sladidla, sorbenty.
  8. 8. Fotoaktivovatelné nanočástice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 a/nebo farmaceutická kompozice podle nároku 7 pro použití jako léčivo.
  9. 9. Fotoaktivovatelné nanočástice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 a/nebo farmaceutická kompozice podle nároku 7 pro použití jako léčivo pro intravenózní aplikaci.
  10. 10. Fotoaktivovatelná nanočástice podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5 a/nebo farmaceutická kompozice podle nároku 7 pro použití při fotodynamické terapii a/nebo fotodynamické diagnostice.
CZ2016-119A 2016-02-29 2016-02-29 Fotoaktivovatelná nanočástice pro fotodynamické aplikace, způsob její přípravy, farmaceutická kompozice ji obsahující a jejich použití CZ307681B6 (cs)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2016-119A CZ307681B6 (cs) 2016-02-29 2016-02-29 Fotoaktivovatelná nanočástice pro fotodynamické aplikace, způsob její přípravy, farmaceutická kompozice ji obsahující a jejich použití
PCT/CZ2017/050008 WO2017148454A1 (en) 2016-02-29 2017-02-24 Photoactivatable nanoparticles for photodynamic applications, method of preparation thereof, pharmaceutical compositions containing them, and use thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ2016-119A CZ307681B6 (cs) 2016-02-29 2016-02-29 Fotoaktivovatelná nanočástice pro fotodynamické aplikace, způsob její přípravy, farmaceutická kompozice ji obsahující a jejich použití

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ2016119A3 true CZ2016119A3 (cs) 2017-09-13
CZ307681B6 CZ307681B6 (cs) 2019-02-13

Family

ID=58358331

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ2016-119A CZ307681B6 (cs) 2016-02-29 2016-02-29 Fotoaktivovatelná nanočástice pro fotodynamické aplikace, způsob její přípravy, farmaceutická kompozice ji obsahující a jejich použití

Country Status (2)

Country Link
CZ (1) CZ307681B6 (cs)
WO (1) WO2017148454A1 (cs)

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3421468A1 (de) 1984-06-08 1985-12-19 Dr. Rentschler Arzneimittel Gmbh & Co, 7958 Laupheim Lipidnanopellets als traegersystem fuer arzneimittel zur peroralen anwendung
US5250236A (en) 1991-08-05 1993-10-05 Gasco Maria R Method for producing solid lipid microspheres having a narrow size distribution
DE4131562A1 (de) 1991-09-18 1993-03-25 Medac Klinische Spezialpraep Arzneistofftraeger aus festen lipidteilchen-feste lipidnanosphaeren (sln)
US5785976A (en) 1993-03-05 1998-07-28 Pharmacia & Upjohn Ab Solid lipid particles, particles of bioactive agents and methods for the manufacture and use thereof
GB0005855D0 (en) 2000-03-10 2000-05-03 Scotia Holdings Plc Compounds for pdt
EP1423107B1 (en) 2001-03-23 2012-05-09 Luitpold Pharmaceuticals, Inc. Fatty alcohol drug conjugates
US20050048109A1 (en) 2003-08-26 2005-03-03 Ceramoptec Industries, Inc. Non-polar photosensitizer formulations for photodynamic therapy
US8986731B2 (en) 2003-08-26 2015-03-24 Biolitec Pharma Marketing Ltd Pegylated liposomal formulations of hydrophobic photosensitizers for photodynamic therapy
US8709449B2 (en) 2004-02-12 2014-04-29 Biolitec Pharma Marketing Ltd Methods and compositions for improving photodynamic therapy through administration of lipids
EP1674081A1 (de) 2004-12-23 2006-06-28 KTB Tumorforschungsgesellschaft mbH Herstellung von lipidbasierten Nanopartikeln unter Einsatz einer dualen asymmetrischen Zentrifuge
ITMI20051024A1 (it) 2005-06-01 2006-12-02 Maria Rosa Gasco Nuovo uso di nanoparticelle lipidiche solide
US20070031482A1 (en) 2005-08-02 2007-02-08 Ceramoptec Industries, Ind. PDT treatment method for cellulites and cosmetic use
US20070237826A1 (en) 2006-04-05 2007-10-11 Rao Kollipara K Polymerized solid lipid nanoparticles for oral or mucosal delivery of therapeutic proteins and peptides
US20090081281A1 (en) 2006-05-10 2009-03-26 Gerard Farmer Photosensitizer Formulation for Topical Applications
US20080214460A1 (en) 2007-01-18 2008-09-04 Ceramoptec Industries, Inc. Formulations for cosmetic and wound care treatments with photosensitizers as fluorescent markers
FR2943545B1 (fr) 2009-03-31 2011-06-03 Univ Claude Bernard Lyon Nanoparticules lipidiques solides encapsulant du minoxidil et suspension aqueuse les contenant.
US8815931B2 (en) 2009-04-28 2014-08-26 Biolitec Pharma Marketing Ltd Oral formulations for tetrapyrrole derivatives
ES2384060B1 (es) 2010-03-24 2013-09-23 Lipotec S.A. Cápsulas de nanopartículas lipídicas.
WO2012127037A2 (en) * 2011-03-24 2012-09-27 Leo Pharma A/S A composition comprising lipid nanoparticles and a corticosteroid or vitamin d derivative
KR20150111705A (ko) * 2014-03-26 2015-10-06 한국과학기술연구원 생체영상 및 광역학 치료를 위한 메틸렌 블루 나노 입자 및 이의 용도

Also Published As

Publication number Publication date
CZ307681B6 (cs) 2019-02-13
WO2017148454A1 (en) 2017-09-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Pei et al. Light-activatable red blood cell membrane-camouflaged dimeric prodrug nanoparticles for synergistic photodynamic/chemotherapy
Zhang et al. Carrier-free, chemophotodynamic dual nanodrugs via self-assembly for synergistic antitumor therapy
Hou et al. Fenton reaction-assisted photodynamic therapy for cancer with multifunctional magnetic nanoparticles
Shi et al. Reactive oxygen species-responsive nanoparticles based on PEGlated prodrug for targeted treatment of oral tongue squamous cell carcinoma by combining photodynamic therapy and chemotherapy
Li et al. Multifunctional micelles dually responsive to hypoxia and singlet oxygen: enhanced photodynamic therapy via interactively triggered photosensitizer delivery
Zhu et al. Dually pH/reduction-responsive vesicles for ultrahigh-contrast fluorescence imaging and thermo-chemotherapy-synergized tumor ablation
Jia et al. Plasma membrane activatable polymeric nanotheranostics with self-enhanced light-triggered photosensitizer cellular influx for photodynamic cancer therapy
Kirchherr et al. Stabilization of indocyanine green by encapsulation within micellar systems
Wang et al. Cascade-promoted photo-chemotherapy against resistant cancers by enzyme-responsive polyprodrug nanoplatforms
Kraft et al. Interactions of indocyanine green and lipid in enhancing near-infrared fluorescence properties: the basis for near-infrared imaging in vivo
Zheng et al. Enhanced tumor treatment using biofunctional indocyanine green-containing nanostructure by intratumoral or intravenous injection
He et al. Self-assembled core–shell nanoparticles for combined chemotherapy and photodynamic therapy of resistant head and neck cancers
Zheng et al. Indocyanine green-containing nanostructure as near infrared dual-functional targeting probes for optical imaging and photothermal therapy
Jia et al. Plasma membrane-anchorable photosensitizing nanomicelles for lipid raft-responsive and light-controllable intracellular drug delivery
Yang et al. NIR-activated self-sensitized polymeric micelles for enhanced cancer chemo-photothermal therapy
Thanasekaran et al. Lipid-wrapped upconversion nanoconstruct/photosensitizer complex for near-infrared light-mediated photodynamic therapy
Zagami et al. Folate-decorated amphiphilic cyclodextrins as cell-targeted nanophototherapeutics
Wei et al. Construction of surface-modified polydopamine nanoparticles for sequential drug release and combined chemo-photothermal cancer therapy
Thakur et al. Co-administration of zinc phthalocyanine and quercetin via hybrid nanoparticles for augmented photodynamic therapy
Fathi-Karkan et al. Recent advancements in the targeted delivery of etoposide nanomedicine for cancer therapy: A comprehensive review
Yang et al. Photosensitizer-loaded branched polyethylenimine-PEGylated ceria nanoparticles for imaging-guided synchronous photochemotherapy
Long et al. Azo-inserted responsive hybrid liposomes for hypoxia-specific drug delivery
Chen et al. Oral nanostructured lipid carriers loaded with near-infrared dye for image-guided photothermal therapy
Sheng et al. Lipoprotein-inspired penetrating nanoparticles for deep tumor-targeted shuttling of indocyanine green and enhanced photo-theranostics
Zhang et al. Cisplatin and quantum dots encapsulated in liposomes as multifunctional nanocarriers for theranostic use in brain and skin

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20220228