CZ2015288A3

CZ2015288A3 - Způsob přípravy magnetického kompozitu pro účely povrchem zesílené Ramanovy spektroskopie, magnetický kompozit a jeho použití

Info

Publication number: CZ2015288A3
Application number: CZ2015-288A
Authority: CZ
Inventors: Robert Prucek; Klára Černá; Aleš Panáček; Libor KvĂtek; Radek Zbořil
Original assignee: Univerzita PalackĂ©ho v Olomouci
Priority date: 2015-04-29
Filing date: 2015-04-29
Publication date: 2016-11-09
Also published as: CZ309424B6

Abstract

Řešení se týká způsobu přípravy magnetického kompozitu pro účely povrchem zesílené Ramanovy spektroskopie, kdy se k vodné disperzi polystyrenových částic s magnetickým jádrem přidá stříbrná a/nebo zlatitá a/nebo zlatná sůl a/nebo částice stříbra a/nebo zlata a nakonec se případně přidá roztok redukčního činidla, přičemž magnetický kompozit případně dále obsahuje streptavidin. Předmětem řešení je rovněž magnetický kompozit pro účely povrchem zesílené Ramanovy spektroskopie připravitelný způsobem podle předkládaného řešení, který obsahuje kompozit polystyrenových mikročástic s magnetickým jádrem a částic zlata a/nebo stříbra. Dále je předmětem řešení použití magnetického kompozitu pro povrchem zesílenou Ramanovu spektroskopii.

Description

Způsob přípravy magnetického kompozitu pro účely povrchem zesílené Ramanovj spektroskopie, magnetický kompozit a jeho použití

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu přípravy magnetického kompozitu za účelem použití v oblast povrchem zesílené Ramanovy spektroskopie, magnetického kompozitu a jeho použití.

Dosavadní stav techniky Vývoj rychlých, citlivých a specifických metod identifikace různorodých látek, pokud možnc vyžadujících minimální množství analyzovaného vzorku, je velmi žádoucí a potřebný. Tentí požadavek se týká zcela jistě řady oblastí lidské činnosti. Například pro efektivní léčbi bakteriálních infekcí je nezbytné použití rychlých a specifických metod identifikace konkrétníh< patogenu. V praxi zavedené a využívané postupy či techniky jsou většinou náročné jal z hlediska ekonomického, časového a také z hlediska nutnosti dostatečného proškolen odborného personálu. Konvenční imuno- či histochemické metody zahrnují časově nároční kultivace patogenů ve vhodném růstovém médiu, tak aby bylo možné specifikovat konkrétn bakteriální kmen.

Spektroskopické metody jako například infračervená, fluorescenční či luminiscenčn spektroskopie představují slibný nástroj pro tyto účely. Ve srovnání s fluorescenčními č luminiscenčními metodami umožňuje infračervená spektroskopie poskytnout detailnější í specifičtější informace o analyzované látce. Problematické je však použití této techniky ve vodných roztocích a to kvůli značné absorpci infračerveného záření molekulami vody, což jí možné překonat za využití Ramanovy spektroskopie, která umožňuje měření ve vodném (tedj fyziologickém) prostředí. Použití klasické Ramanovy spektroskopie je bohužel limitování značně nízkou účinností Ramanova rozptylu, kdy pro analýzu je nutné použití excitačního lasen o značném výkonu, dlouhé doby záznamu spekter a to navíc jen pro analýzu vzorků s poměrní velkou koncentrací sledovaného analytu. Zmíněný nedostatek lze překonat využitím povrchoví zesílené Ramanovy spektroskopie (SERS). Fleischmannův objev povrchem zesílenéht Ramanova rozptylu (SERS) v roce 1974 na stříbrné elektrodě a zejména jeho znovuobjevení m koloidních částicích stříbra v roce 1977 Creightonem znamenal vznik nové velmi citliví analvtické metodv. umožňuiící detekci molekul v oblasti niko až femtomolů /IDnemina W F and Nie S. M., J Phys Chem B, 106, 2002). Vysoké zesílení, dosahujících hodnot až 101' umožnilo dokonce detekci jediné molekuly adsorbované na jediné stříbrné nanočástici (Michaeli M. et al., J Am Chem Soc, 121, 1999; Nie S. and Emory S. R., Science, 275, 1997) Nejpoužívanějšími materiály pro použití v oblasti povrchem zesílené Ramanovy spektroskopií jsou substráty na bázi stříbra a zlata. Částice stříbra pro aplikaci v oblasti SERS jsou nejčastěj připravovány redukcí stříbrné soli tetrahydridoboritanem (Creighton J. A. et al., J Chem So< Faraday Trans 2, 75, 1979), citrátem sodným (Lee P. C. and Meisel D., J Phys Chem 86, 1982 či hydroxylaminem (Leopold N. and Lendl B., J Phys Chem B 107, 2003). Jako redukční činidle pro redukci stříbrných iontů a vznik částic stříbra lze použít redukujících cukrů (Kvítek L. et al. J Mater Chem, 2005). Výše zmíněná redukční činidla jsou často také využívána pro připraví zlatých koloidních částic aplikovatelných v oblasti SERS (Creighton J. A. et al., J Chem So< Faraday Trans 2, 75, 1979; Lee P. C. and Meisel D., J Phys Chem 86, 1982; Yuan H., J Phy; Chem C, 115, 2011). Tyto koloidní částice připravené výše uvedenými postupy však samy ( sobě, zejména v případě nanočástic stříbra, neposkytují výrazné zesílení Ramanova signálu a z< tímto účelem musejí být upraveny, k čemuž se hojně využívá přídavku roztoku anorganickýcl iontů, zejména chloridů (Leopold, N. and Lendl, B. J Phys Chem B 107, 2003; Michaels A. e al., J Am Chem Soc 121, 1999; Leng W. N. et al., J Raman Spectrosc 37, 2006; Zhang P. X. e al., J Raman Spectrosc 21, 1990; Campbell M. et al., J Raman Spectrosc 30, 1999; Doering W E. and Nie S. M., J Phys Chem B 106, 2002). Mechanismus působení těchto iontů na aktivac nanočástic stříbra nebyl zcela vysvětlen, jedno z pravděpodobných vysvětlení tohoto efekti spočívá v částečné agregaci nanočástic stříbra způsobené uvedenými ionty. Nedávno bylí prokázáno, že v oblasti kontaktu dvou či více částic dochází k velmi výraznému povrchovémi zesílení Ramanova signálu (Dadosh T. et al., ACS Nano 3, 2009; Li. W. Y. et al., Nano Lett 9 2009; Brus L., Acc Chem Res 41, 2008). Velmi výrazná hodnota zesílení Ramanova signálu j< také dosahována na nepravidelných částicích obsahujících množství nerovností a zakřivení ní svém povrchu, například částic hvězdicovitého tvaru ěi částic obsahujících na svém povrchi velké množství tmovitých výstupků (Yuan H. et al, Chem Mater 19, 2007; Yuan H. et al., J Phy: Chem C 115, 2011; Li S. et al., ACS Appl Mater Interfaces 5, 2013; Chen K. et al., Analyst 137 2012).

Substráty na bázi stříbra či zlata byly využity pro studium a detekci či stanovení řad; významných či nebezpečných látek, jako například persistentních organických polutantí (Guermni L., et al., Anal Chim Acta 624, 2008), bisfenolu A (Xue J., et al., Anal Chim Act: 777. 20131. nolvchlorovanvch bifenvlů řBantz K. C.. et al. Vib Snectrosc 50. 20091. antibiotil (He L., et al., J Raman Spectrosc 41, 2010), polycyklických aromatických uhlovodíků (Guerrin L, et al., Anal Chem 81, 2009; Jones C. L., et al. Anal Bioanal Chem 394, 2009), trinitrotolueni (Dasary S. S. R., et al, J Am Chem Soc 131, 2009; Mahmoud K. H.and Zourob M., Analyst 138 2013), ricinu (He L., et al., J Food Sci 76, 2011), bakterií či kvasinek (Walter A, et al., Lab Chij 11, 2011; Culha M, et al., Surf Interface Anal 42, 2010; Fan C., et al., Appl Microbio Biotechnol 92, 2011;), markérů bakterií (Cheng H-W., et al, Anal Chem 81, 2009; Cowcher D P., et al., Anal Chem 85, 2013).

Značná řada publikovaných prací však využívá nespecifické a neselektivní interakce s částicem stříbra či zlata, které slouží jakožto zesilovače Ramanova signálu. Zajímavou a slibnou metodi pro selektivní interakci či separaci látek (zejména organických, např. různých markérů) nabíz systém avidin-biotin. Avidin byl objeven již ve 40-tých letech minulého století, jedná se ( protein o molekulové hmotnosti 67 kDa sestávající ze 4 stejných podjednotek. Tentc glykoprotein je značně stabilní a odolává řadě extrémních podmínek (teplota, denaturačn činidla, pH). Význačná je pro avidin velmi silná interakce s biotinem (vitamín B7 či vitamín H) Tato interakce s asociační konstantou 1015 M'1 představuje jednu z nej silnějších nekovalentnícl interakcí. Avidin kromě interakce s biotinem je však schopen i řady nespecifických interakc s jinými látkami. Tento fakt byl překonán prostřednictvím snížení obsahu karbohydrátů vs struktuře proteinu bez ovlivnění jeho interakce s biotinem. Tato látka je na trhu k dispozici o< řady výrobců pod názvy NeutrAvidin (Thermo Scientific Pierce), NeutraLite (Bélovo) č ExtrAvidin (Sigma-Aldrich). Další alternativu představuje protein streptavidin izolovam z bakterie Streptomyces avidinii. Jedná se o homolog avidinu, také se 4 podjednotkami vykazující podobnou afinitu k biotinu, tak jako avidin. Jelikož je na trhu k dispozici velká řadí biotinylovaných protilátek (případně lze provést biotinylaci protilátky za použití známýcl postupů), tak lze tohoto systému biotinylovaná protilátka-streptavidin využít pro řadu aplikac zabývajících se studiem či detekcí rozmanitých látek (Dundas Ch. M. et al., Appl Microbio Biotechnol 97, 2013; Sapsford K. E. et al., Chem Rev 113,2013). Výhodným krokem je nanesení žádané protilátky na magnetický nosič, umožňující selektivn zachycení žádaného antigenu a následně pak i jeho separaci, přečištění a případní zakoncentrování pro následnou analýzu. Tímto přístupem byla např. provedena detekce í separace patogenů (Wang Y. et al., Anal Bioanal Chem 399,2011) či imunoglobulinu IgG (Chei S. et al., Chem Comm 47, 2011). V těchto případech však byla separace provedena n; maenetickvch částicích nokrvtvch vhodnou nrotilátkou a r»oté bvlv tenrve nřidánv modifikován· koloidní částice zlata, jež slouží jako zesilovače Ramanova signálu daného analytu. Tyto postupy jsou však experimentálně náročné a zdlouhavé z hlediska měření povrchem zesílených Ramanových spekter.

Ještě výhodnější oproti předešlým postupům je nanesení částic stříbra přímo na magnetick) nosič modifikovaný protilátkou případně modifikovaný streptavidinem. Předmětem publikace Balzerová A. et al., Anal Chem 86, 2014 je nanesení částic stříbra na částice magnetitu. Tentc kompozit je následně modifikován polyetylenglykolem a karboxymetylcelulosou s následnýir navázáním streptavidinu. Nedostatkem tohoto postupu je, že probíhá v 5 reakčních krocích, coí značně zvyšuje riziko nereprodukovatelnosti přípravy uvedeného substrátu a vyžaduje pečlivé promývání vzorku mezi jednotlivými reakčními kroky. Celý proces navíc vyžaduje několil hodin. Taktéž vlivem magnetických sil dochází k agregaci částic uvedeného kompozitu Podobný vícekrokový postup přípravy byl použit v publikaci Hongrong J. et al., J Biomec Nanotechnol 9, 2013 pro přípravu streptavidinem modifikovaného třívrstvého core-shell kompozitu Fe304@Si02@Au.

Podstata vynálezu Předkládaný vynález řeší nevýhody stavu techniky přípravou magnetického kompozitu pro účel) selektivní a specifické detekce či studia látek pomocí povrchem zesílené Ramanov) spektroskopie (SERS), jejíž podstata spočívá vtom, že se k polystyrénovým částicírr obsahujícím magnetické jádro přidají stříbrné, zlatité či zlatné ionty a provede se jejich redukce nebo se přidají částice stříbra a/nebo zlata, přičemž polystyrénové částice a/nebo částice stříbře a/nebo zlata mohou s výhodou obsahovat streptavidin. Částice zlata či stříbra (přidané ve formě částic nebo vzniklé in šitu redukcí) se naváží na polystyrénové částice s magnetickým jádrem ε fungují jako zesilovač Ramanova signálu daného analytu.

Polystyrénové částice mohou být modifikovány streptavidinem (tj. obsahovat streptavidin). například mohou být pokryty streptavidinem. Polystyrénové částice pokryté streptavidinem jsou výhodné pro selektivní a specifickou separaci a přečištění žádaného biotinylovaného analytu od ostatních balastních látek přítomných v analyzovaném vzorku. Předkládaný vynález připraví magnetický kompozit efektivně zesilující Ramanův signáí v ierlnnm kroku r.ož vvrn7ně snižnip nroblómv ctnvn tť>ohnikv so 7d1nnbnvr»«;lí náročností ř nereprodukovatelností přípravy. Pomocí předkládaného vynálezu lze reprodukovatelně připraví magnetický kompozit efektivně zesilující Ramanův signál biotinylovaného analytu, či připadne daného antigenu po jeho specifické reakci s biotinylovanou protilátkou, kterou je možné naváza skrze biotin na streptavidin, jenž je případně ukotvený na povrchu polystyrénových částic s magnetickým jádrem. Předkládaný vynález tak umožňuje rychlou, selektivní a specifickoi metodu detekce pomocí povrchem zesílené Ramanovy spektroskopie.

Oproti substrátům využívajícím magnetické oxidy železa ze stavu techniky má magneticky kompozit podle předkládaného vynálezu nižší specifickou hustotu (např. přibližně čtyřnásobní nižší v případě komerčně dostupných polystyrénových částic s magnetickým jádrem Sigma Aldrich, katalogové číslo 49532, velikost částic 1 pm ± 0,1 pm; Sigma-Aldrich, katalogové čísle 08014, velikost částic 10 pm ± 0,5 pm), což výrazně snižuje náchylnost polystyrénových částic s magnetickým jádrem k jejich sedimentaci a tedy výrazně zvyšuje reprodukovatelnost a stabiliti měření povrchem zesílených Ramanových spekter. Oproti magnetickým částicím na bázi oxidí železa mají polystyrénové částice s magnetickým jádrem podle vynálezu také výrazně menš náchylnost k vlastní agregaci vlivem magnetických přitažlivých sil. Předmětem předkládaného vynálezu je tedy způsob přípravy magnetického kompozitu pro účely povrchem zesílené Ramanovy spektroskopie, kdy se k vodné disperzi polystyrénových částií s magnetickým jádrem, s výhodou o velikosti 1 pm až 10 pm, výhodněji o velikosti 1 pm, přidí stříbrná a/nebo zlatitá a/nebo zlatná sůl a/nebo částice stříbra a/nebo zlata, s výhodou o velikost v rozmezí od 10 nm do 500 nm, a nakonec se případně přidá roztok redukčního činidla, přičemi polystyrénové částice a/nebo částice stříbra a/nebo zlata s výhodou obsahují streptavidin V jednom provedení mají částice stříbra a/nebo zlata velikost v rozmezí od 100 nm do 500 nm V jiném provedení mají částice stříbra a/nebo zlata velikost v rozmezí od 20 nm do 500 nm V jiném provedení mají částice stříbra a/nebo zlata velikost v rozmezí od 20 nm do 40 nm V jiném provedení mají částice stříbra a/nebo zlata velikost v rozmezí od 200 nm do 400 nm V jiném provedení mají částice stříbra a/nebo zlata velikost v rozmezí od 10 nm do 100 nm V jiném provedení mají částice stříbra a/nebo zlata velikost v rozmezí od 300 nm do 500 nm.

Ve vodě rozpustná stříbrná a/nebo zlatitá a/nebo zlatná sůl je solí anorganické nebo organické kyseliny, s výhodou vybrané ze skupiny zahrnující etylendiamintetraoctovou kyselinu, HC1, HF HI, HBr HCN, H2SO4, HNO3, HCIO4 a soli obsahující zlato vaniontu, například zlatitany alkalických kovů. Nejvýhodněji je stříbrná a/nebo zlatitá a/nebo zlatná sůl solí HC1, HNO3 í HCIO4. V jednom provedení se k vodné disperzi polystyrénových částic s magnetickým jádrem přidt spojovací molekula, stříbrná a/nebo zlatitá a/nebo zlatná sůl a nakonec se popřípadě přidá roztol· redukčního činidla. Některé spojovací molekuly mohou zároveň zastat funkci redukčního činidla, pak není potřebí nakonec přidávat další redukční činidlo. Spojovací molekula je s výhodou vybrána ze skupin) zahrnující látky obsahující C6-C8 aromatické jádro nebo C5-C8 heteroarylové jádro obsahujíc alespoň jeden heteroatom vybraný ze skupiny O, S, N, přičemž aromatické nebo heteroarylové jádro může být substituované, s výhodou alespoň jedním substituentem vybraným ze skupin) zahrnující OH, NH2, F, Cl, Br, CH3, N02 a C1-C20 (s výhodou C1-C6) alkylový řetězec nebe jejich kombinací, nej výhodněji je aromatické nebo heteroarylové jádro substituováno alespor jednou OH skupinou, přičemž aromatické nebo heteroarylové jádro a/nebo C1-C20 (svýhodot C1-C6) alkylový řetězec jsou substituovány alespoň jednou amino či thiolovou skupinou S výhodou je C1-C20 (výhodněji C1-C6) alkylový řetězec substituován terminálně. Cl-C2( (s výhodou C1-C6) alkylový řetězec může být dále substituován, s výhodou karboxylovoi skupinou. Výhodněji je spojovací molekulou benzenthiol, histidin, aminofenol, aminothiofenol fenylbutylamin, fenylethylamin, fenylalanin či dopamin, nejvýhodněji je spojovací molekuloi dopamin. Dopamin, který obsahuje ve své struktuře aromatické jádro schopné interakcí s polystyrénovými částicemi a také obsahuje amino skupinu, která má velmi velkou afinitu vůč iontům, atomům nebo částicím zlata a/nebo stříbra, také ovlivňuje morfologii generovanýcl částic stříbra a/nebo zlata, které následně umožňují velmi výrazné zesílení Ramanova signáli daného analytu. V jiném provedení se k vodné disperzi polystyrénových částic s magnetickým jádrem přídi spojovací molekula, stříbrná a/nebo zlatitá a/nebo zlatná sůl a nakonec se popřípadě přidá roztol redukčního činidla, přičemž polystyrénové částice s magnetickým jádrem jsou pokrytí streptavidinem. V jiném provedení se k vodné disperzi polystyrénových částic s magnetickým jádrem přidí spojovací molekula, a následně částice stříbra a/nebo zlata pokryté streptavidinem. V jiném provedení se k vodné disperzi polystyrénových částic s magnetickým jádrem přidí stříbrná a/nebo zlatitá a/nebo zlatná sůl a nakonec se přidá roztok redukčního činidla Polystyrénové částice s magnetickým jádrem mohou nebo nemusí být pokryté streptavidinem.

Redukční činidlo je s výhodou vybráno ze skupiny zahrnující kyselinu askorbovou, hydrochinon pyrokatechol, pyrogalol, aminofenol, obecné kovy, hydridy, hydridoboritany, hydroxylamin hydrazin, dopamin a redukující cukry (xylosu, maltosu, laktosu, glukosu, galaktosu). V případě iontů zlata jsou výhodnými redukčními činidly dopamin, hydrochinon, pyrokatechol a jejicl deriváty, které ovlivňují morfologii generovaných částic zlata, což následně umožňují intenzivnější zesílení Ramanova signálu. pH reakční směsi je s výhodou v rozmezí od 2,5 do 12. V jiném provedení vynálezu se k reakční směsi před přídavkem redukčního činidla přidí amoniak. Předmětem předkládaného vynálezu je rovněž magnetický kompozit pro účely povrchen zesílené Ramanovy spektroskopie připravitelný způsobem podle předkládaného vynálezu, kterj obsahuje kompozit polystyrénových mikročástic s magnetickým jádrem a koloidních částic zlatí a/nebo stříbra o velikosti v rozmezí od 10 nm do 500 nm, přičemž výsledný magnetick) kompozit případně dále obsahuje streptavidin. V jednom provedení mají částice stříbra a/nebc zlata velikost v rozmezí od 100 nm do 500 nm. V jiném provedení mají částice stříbra a/nebc zlata velikost v rozmezí od 20 nm do 500 nm. V jiném provedení mají částice stříbra a/nebo zlatí velikost v rozmezí od 20 nm do 40 nm. V jiném provedení mají částice stříbra a/nebo zlatí velikost v rozmezí od 200 nm do 400 nm. V jiném provedení mají částice stříbra a/nebo zlatí velikost v rozmezí od 10 nm do 100 nm. V jiném provedení mají částice stříbra a/nebo zlatí velikost v rozmezí od 300 nm do 500 nm.

Ve výhodném provedení obsahuje magnetický kompozit polystyrénové mikročástice s magnetickým jádrem pokryté streptavidinem. V jiném výhodném provedení obsahuje magnetický kompozit částice zlata a/nebo stříbra, ktere jsou pokryty streptavidinem. Předmětem vynálezu je dále použití magnetického kompozitu podle vynálezu pro selektivní í specifické detekce a/nebo studia látek pomocí povrchem zesílené Ramanovy spektroskopie S výhodou je excitační vlnová délka použitého laseru v rozmezí 488 nm až 1064 nm, výhodněj: 514 nm až 830 nm, nejvýhodněji 532 nm nebo 785 nm.

Seznam vyobrazení

Obr, 1 zobrazuje transmisní elektronové snímky kompozitu částic zlata a polystyrenovýcl mikročástic pokrytých streptavidinem připravených dle Příkladu 1.

Obr. 2 zobrazuje transmisní elektronové snímky kompozitu částic zlata a polystyrenovýcl mikročástic pokrytých streptavidinem připravených dle Příkladu 2.

Obr. 3 zobrazuje transmisní elektronové snímky kompozitu částic zlata a polystyrenovýcl mikročástic pokrytých streptavidinem připravených dle Příkladu 3.

Obr. 4 zobrazuje transmisní elektronové snímky kompozitu částic stříbra a polystyrenovýcl mikročástic pokrytých streptavidinem připravených dle Příkladu 4.

Obr. 5 zobrazuje transmisní elektronové snímky kompozitu částic stříbra a polystyrenovýcl mikročástic pokrytých streptavidinem připravených dle Příkladu 5.

Obr. 6 zobrazuje transmisní elektronové snímky kompozitu částic zlata a polystyrenovýcl mikročástic připravených dle Příkladu 6.

Obr. 7 zobrazuje transmisní elektronové snímky kompozitu částic zlata a polystyrenovýcl mikročástic připravených dle Příkladu 7.

Obr. 8 zobrazuje transmisní elektronové snímky kompozitu částic stříbra a polystyrenovýcl mikročástic připravených dle Příkladu 8.

Obr. 9 zobrazuje transmisní elektronové snímky kompozitu částic stříbra a polystyrenovýcl mikročástic připravených dle Příkladu 9.

Obr. 10 zobrazuje transmisní elektronové snímky kompozitu částic stříbra a polystyrenovýcl mikročástic připravených dle Příkladu 10.

Obr. 11 zobrazuje transmisní elektronové snímky kompozitu částic zlata a polystyrénových mikročástic pokrytých streptavidinem připravených dle Příkladu 11.

Obr. 12 zobrazuje transmisní elektronové snímky kompozitu částic zlata pokrytých streptavidinem a polystyrénových mikročástic připravených dle Příkladu 11.

Obr. 13 zobrazuje povrchem zesílená Ramanova spektra za použití kompozitu připraveného dk Příkladu 2 a za použití excitačního laseru s vlnovou délkou 532 nm. (A) Povrchem zesílení Ramanovo spektrum kompozitu částic zlata a polystyrénových částic pokrytých streptavidinen připraveného dle Příkladu 2. (B) Povrchem zesílené Ramanovo spektrum kompozitu částic zlata a polystyrénových částic pokrytých streptavidinem připraveného dle Příkladu 2 a po přídavku biotinylované protilátky vůči proteinu A (markér bakterie Staphylococcus aureus). (C) Povrchem zesílené Ramanovo spektrum kompozitu částic zlata a polystyrénových částic pokrytých streptavidinem připraveného dle Příkladu 2 a po přídavku biotinylované protilátky vůči proteinu A a přídavku bakterie Staphylococcus aureus. (D) Povrchem zesílené Ramanovo spektrum kompozitu částic zlata a polystyrénových částic pokrytých streptavidinem připraveného dle Příkladu 2 a po přídavku biotinylované protilátky vůči proteinu A a přídavku klinickéhc materiálu (kloubní punktát) následně mimotělně infikovaného bakterií Staphylococcus aureus. Obr. 14 zobrazuje povrchem zesílená Ramanova spektra za použití kompozitu připraveného dle Příkladu 1 a za použití excitačního laseru s vlnovou délkou 785 nm. (A) Povrchem zesílené Ramanovo spektrum kompozitu částic zlata a polystyrénových částic pokrytých streptavidinem připraveného dle Příkladu 2. (B) Povrchem zesílené Ramanovo spektrum kompozitu částic zlaté a polystyrénových částic pokrytých streptavidinem připraveného dle Příkladu 1 a po přídavku biotinylované protilátky vůči proteinu Tau (markér pro Alzheimerovu nemoc). (C) Povrchem zesílené Ramanovo spektrum kompozitu částic zlata a polystyrénových částic pokrytých streptavidinem připraveného dle Příkladu 1 a po přídavku biotinylované protilátky vůči proteinu Tau a po přídavku Tau proteinu. Příklady provedení vynálezu

Jako prekurzor pro přípravu kompozitu s magnetickým jádrem pro účely studia a detekce látek za využití povrchem zesílené Ramanovy spektroskopie, byly použity komerčně dostupné polystyrénové mikročástice s magnetickým jádrem a se streptavidinem navázaným na povrchu částic (Sigma-Aldrich, katalogové číslo 49532, velikost částic 1 pm ± 0,1 pm, vazebná aktivita vůči biotinu > 600 pmol/mg, obsah oxidu železa > 20 %, teplota skladování 2 až 8 °C), Sigma-Aldrich, katalogové číslo 08014, velikost částic 10 pm ± 0,5 pm, vazebná aktivita vůči biotinu > 1000 pmol/mg, obsah oxidu železa > 20 %, teplota skladování 2 až 8 °C). Kompozity uvedených polystyrénových částic s nanočásticemi stříbra a/nebo zlata byly připravovány redukcí zlatitých a/nebo zlatných iontů či případně redukcí amoniakálního komplexu stříbrných iontů redukčním činidlem kyselinou askorbovou, dopaminem anebo redukujícími cukry (např. maltosou, glukosou, atd.). Uvedené látky byly získány od firmy Sigma-Aldrich.

Velikost a morfologie částic zlata a stříbra byly pozorovány pomocí metody transmisní elektronové mikroskopie (TEM) na přístroji JEM 2010 (Jeol, Japonsko) za využití urychlovacího napětí 160 kV.

Povrchem zesílená Ramanova spektra byla měřena pomocí DXR Raman Microscope (Thermo Scientifíc, USA) vybaveného termoelektricky chlazeným (-50 °C) CCD detektorem a za využiti laseru s vlnovou délkou 532 nebo 785 nm. Doba záznamu spekter činila 10 s, počet akumulaci byl 10, výkon laseru 10 mW. Měření povrchem zesílených Ramanových spekter bylo prováděno po nanesení 20 μΐ výše zmíněného vzorku kompozitu na podložní materiál na vrstvy oxidi hlinitého případně na sklo či křemen. Příklad 1

Způsob přípravy kompozitu částic zlata a polystyrénových mikročástic s magnetickým jádren, pokrytých streptavidinem provedený za použití dopaminu jako redukčního činidla při hodnotí pH 2,83

Do kádinky o objemu 25 ml bylo vpraveno 0,2 ml ze zásobní disperze polystyrénových mikročástic o velikosti 1 pm s magnetickým jádrem pokrytých streptavidinem (Sigma-Aldrich, hmotnostní koncentrace částic 1 % v disperzi). Poté bylo přidáno 9,1 ml deionizované vody z poté 0,2 ml 1% (w/w) roztoku dopaminu. Reakční směs byla promíchána 5 minut ní elektromagnetické míchačce při otáčkách cca 500 rpm. Poté bylo přidáno 0,5 ml roztoku hydráte chloridu zlatitého o koncentraci zásobního roztoku 5T0'3 mol-dm"3 a reakční směs byla následně promíchávána 5 minuty. TEM snímky připraveného kompozitu jsou uvedeny v Obr. 1. Příklad 2

Způsob přípravy kompozitu částic zlata a polystyrénových mikročástic s magnetickým jádrem pokrytých streptavidinem provedený za použití kyseliny askorbové jako redukčního činidla při hodnotě pH 10,57 a za přítomnosti dopaminu

Do kádinky o objemu 25 ml bylo vpraveno 0,2 ml ze zásobní disperze polystyrénových mikročástic o velikosti 1 pm s magnetickým jádrem pokrytých streptavidinem (Sigma-Aldrich, hmotnostní koncentrace části 1 % v disperzi). Poté bylo přidáno 7,1 ml deionizované vody a pote 0,2 ml 1% (w/w) roztoku dopaminu. Reakční směs byla promíchána 5 minut ní elektromagnetické míchačce při otáčkách cca 500 rpm. Poté bylo přidáno 0,5 ml roztoku hydráte chloridu zlatitého (molámí hmotnost 339,79 g/mol) o koncentraci zásobního roztoku 5· 10"' mol-dm" . Hodnota pH reakční směsi byla upravena pomocí cca 1 ml roztoku NaOH c koncentraci 0,25 mol-dm'3, tak aby pH činilo cca 10,5 a směs byla poté ještě promíchána 3 minuty. Následně byl do reakčního systému vpraven 1 ml roztoku kyseliny askorbové o koncentraci 510' mol-dm' a reakční směs se poté nechala promíchávat 5 minut. TEM snímky připraveného kompozitu jsou uvedeny v Obr. 2. Příklad 3

Způsob přípravy kompozitu částic zlata a polystyrénových mikročástic s magnetickým jádrem pokrytých streptavidinem provedený za použití kyseliny askorbové jako redukčního činidla př\ hodnotě pH 2,53 a bez přítomnosti dopaminu

Do kádinky o objemu 25 ml bylo vpraveno 0,2 ml ze zásobní disperze polystyrénových mikročástic o velikosti 1 pm s magnetickým jádrem pokrytých streptavidinem (Sigma-Aldrich. hmotnostní koncentrace částic 1 % v disperzi). Poté bylo přidáno 8,3 ml deionizované vody, Reakční směs byla promíchána 5 minut na elektromagnetické míchačce při otáčkách cca 50C rpm. Poté bylo přidáno 0,5 ml roztoku chloridu zlatného o koncentraci zásobního roztoku 5-10'' o mol-dm' . Reakční směs byla následně promíchána 3 minuty. Poté byl do reakčního systéme vpraven 1 ml roztoku kyseliny askorbové o koncentraci 5-10'2 mol-dm'3 a reakční směs se poté nechala promíchávat 5 minut. TEM snímky připraveného kompozitu jsou uvedeny v Obr. 3. Příklad 4

Způsob přípravy kompozitu částic stříbra a polystyrénových mikročástic s magnetickým jádrem pokrytých streptavidinem provedený za použití kyseliny askorbové jako redukčního činidla při hodnotě pH 10,54 a za přítomnosti dopaminu

Do kádinky o objemu 25 ml bylo vpraveno 0,2 ml ze zásobní disperze polystyrénových mikročástic o velikosti 1 pm s magnetickým jádrem pokrytých streptavidinem (Sigma-Aldrich, hmotnostní koncentrace částic 1 % v disperzi). Poté bylo přidáno 7,75 ml deionizované vody a poté 0,2 ml 1% (w/w) roztoku dopaminu. Reakční směs byla promíchána 5 minut na elektromagnetické míchačce při otáčkách cca 500 rpm. Poté bylo přidáno 0,5 ml roztoku dusičnanu stříbrného o koncentraci zásobního roztoku 5-10' mol-dm' s následným přídavkem i 0,15 ml roztoku amoniaku o koncentraci 0,1 mol-dm' . Hodnota pH reakční směsi byla upravena Λ pomocí cca 0,2 ml roztoku NaOH o koncentraci 0,25 mol-dm', tak aby pH činilo cca 10,5 a směs byla poté ještě promíchána 3 minuty. Poté byl do reakčního systému vpraven 1 ml roztoku kyseliny askorbové o koncentraci 5-10"2 mol-dm'3. Reakční směs se poté nechala promíchávat 5 minut. TEM snímky připraveného kompozitu jsou uvedeny v Obr. 4. Příklad 5

Způsob přípravy kompozitu Částic stříbra a polystyrénových mikročástic s magnetickým jádrem pokrytých streptavidinem provedený za použití kyseliny askorbové při hodnotě pH 10,46 a bez přítomnosti dopaminu

Do kádinky o objemu 25 ml bylo vpraveno 0,2 ml ze zásobní disperze polystyrénových mikročástic o velikosti 1 pm s magnetickým jádrem pokrytých streptavidinem (Sigma-Aldrich, hmotnostní koncentrace částic 1 % v disperzi). Poté bylo přidáno 7,95 ml deionizované vody. Reakční směs byla promíchána 5 minut na elektromagnetické míchačce při otáčkách cca 500 rpm. Poté bylo přidáno 0,5 ml roztoku dusičnanu stříbrného o koncentraci zásobního roztoku 5*10”3 mol-dm'3. s následným přídavkem 0,15 ml roztoku amoniaku o koncentraci 0,1 mol-dm'3. Hodnota pH reakční směsi byla upravena pomocí cca 0,2 ml roztoku NaOH o koncentraci 0,25 mol-dm', tak aby pH činilo cca 10,5 a směs byla poté ještě promíchána 3 minuty. Poté byl do reakčního systému vpraven 1 ml roztoku kyseliny askorbové o koncentraci 5-10"2 mol-dm'3. Reakční směs se poté nechala promíchávat 5 minut. TEM snímky připraveného kompozitu jsou uvedeny v Obr. 5. Příklad 6

Způsob přípravy kompozitu částic zlata a polystyrénových mikročástic s magnetickým jádrem provedený za použití glukosy jako redukčního činidla při hodnotě pH 11,52 a za přítomnosti dopaminu

Do kádinky o objemu 25 ml bylo vpraveno 0,04 ml ze zásobní disperze polystyrénových mikročástic o velikosti 1 pm s magnetickým jádrem (Sigma-Aldrich, hmotnostní koncentrace částic 5 % v disperzi). Poté bylo přidáno 7,26 ml deionizované vody a poté 0,2 ml 1% (w/w) roztoku dopaminu. Reakční směs byla promíchána 5 minut na elektromagnetické míchačce při otáčkách cca 500 rpm. Poté bylo přidáno 0,5 ml roztoku chloridu zlatitého (molární hmotnost 303,33 g/mol) o koncentraci zásobního roztoku 5-10'3 mol-dm'3. Hodnota pH reakční směsi byla upravena pomocí cca 1 ml roztoku NaOH o koncentraci 0,25 mol-dm'3, tak aby pH činilo cca 11,5 a směs byla poté ještě promíchána 3 minuty. Následně byl do reakčního systému vpraven 1 Λ Λ ml roztoku glukosy o koncentraci 5-10' mol-dm . Reakční směs se poté nechala promíchávat 5 minut. TEM snímky připraveného kompozitu jsou uvedeny v Obr. 6. Příklad 7

Způsob přípravy kompozitu částic zlata a polystyrénových mikročástic s magnetickým jádrem provedený za použití glukosy jako redukčního činidla při hodnotě pH 11,96 a bez přítomnosti dopaminu

Do kádinky o objemu 25 ml bylo vpraveno 0,04 ml ze zásobní disperze polystyrénových mikročástic o velikosti 1 pm s magnetickým jádrem (Sigma-Aldrich, hmotnostní koncentrace části 5 % v disperzi). Poté bylo přidáno 7,46 ml deionizované vody. Reakční směs byla promíchána 5 minut na elektromagnetické míchačce při otáčkách cca 500 rpm. Poté bylo přidáno 0,5 ml roztoku draselné soli kyseliny zlatité o koncentraci zásobního roztoku 5·10'3 mol-dm'3 Hodnota pH reakční směsi byla upravena pomocí cca 1 ml roztoku NaOH o koncentraci 0,25 Λ mol-dm', tak aby pH činilo cca 11,5 a směs byla poté ještě promíchána 3 minuty. Následně byl do reakčního systému vpraven 1 ml roztoku glukosy o koncentraci 5-10'2 mol-dm'3. Reakční směs se poté nechala promíchávat 5 minut. TEM snímky připraveného kompozitu jsou uvedeny v Obr. 7. Příklad 8

Způsob přípravy kompozitu částic stříbra a polystyrénových mikročástic s magnetickým jádrem provedený za použití glukosy jako redukčního činidla při hodnotě pH 11,58 a za přítomnosti dopaminu

Do kádinky o objemu 25 ml bylo vpraveno 0,04 ml ze zásobní disperze polystyrénových mikročástic o velikosti 1 pm s magnetickým jádrem (Sigma-Aldrich, hmotnostní koncentrace částic 5 % v disperzi). Poté bylo přidáno 7,90 ml deionizované vody a poté 0,2 ml 1 % (w/w) roztoku dopaminu. Reakční směs byla promíchána 5 minut na elektromagnetické míchačce při otáčkách cca 500 rpm. Poté bylo přidáno 0,5 ml roztoku chloristanu stříbrného o koncentraci zásobního roztoku 5-10' mol-dm' s následným přídavkem 0,15 ml roztoku amoniaku o koncentraci 0,1 mol-dm'3. Hodnota pH reakční směsi byla upravena pomocí cca 0,2 ml roztoku NaOH o koncentraci 0,25 mol-dm', tak aby pH činilo cca 11,5 a směs byla poté ještě promíchána 3 minuty. Poté byl do reakčního systému vpraven 1 ml roztoku glukosy o koncentraci 5-10' mol-dm' . Reakční směs se poté nechala promíchávat 5 minut. TEM snímky připraveného kompozitu jsou uvedeny v Obr. 8. Příklad 9

Způsob přípravy kompozitu částic stříbra a polystyrénových mikročástic provedený za použití glukosy jako redukčního činidla při hodnotě pH 11,52 a bez přítomnosti dopaminu Do kádinky o objemu 25 ml bylo vpraveno 0,04 ml ze zásobní disperze polystyrénových mikročástic o velikosti 1 pm s magnetickým jádrem (Sigma-Aldrich, hmotnostní koncentrace částic 5 % v disperzi). Poté bylo přidáno 7,95 ml deionizované vody. Reakční směs byla promíchána 5 minut na elektromagnetické míchačce při otáčkách cca 500 rpm. Poté bylo přidáno 0,5 ml roztoku dusičnanu stříbrného o koncentraci zásobního roztoku 5 · 10'3 mol-dm"3 s následným přídavkem 0,15 ml roztoku amoniaku o koncentraci 0,1 mobdrn'3. Hodnota pH reakční směsi byla upravena pomocí cca 0,2 ml roztoku NaOH o koncentraci 0,25 mobdrn'3, tak aby pH činilo cca 11,5 a směs byla poté ještě promíchána 3 minuty. Poté byl do reakčního systému vpraven 1 ml roztoku glukosy o koncentraci 5T0'2 mol-dm'3. Reakční směs se poté nechala promíchávat 5 minut. TEM snímky připraveného kompozitu jsou uvedeny v Obr. 9. Příklad 10

Způsob přípravy kompozitu částic zlata a polystyrénových mikročástic s magnetickým jádrem pokrytých streptavidinem provedený za použití kyseliny askorbové jako redukčního činidla při hodnotě pH 2,92 a za přítomnosti fenylbutylaminu

Do kádinky o objemu 25 ml bylo vpraveno 0,2 ml ze zásobní disperze polystyrénových mikročástic o velikosti 1 pm s magnetickým jádrem pokrytých streptavidinem (Sigma-Aldrich, hmotnostní koncentrace části 1 % v disperzi). Poté bylo přidáno 7,1 ml deionizované vody a poté 0,2 ml 1% (w/w) roztoku fenylbutylaminu. Reakční směs byla promíchána 5 minut na elektromagnetické míchačce při otáčkách cca 500 rpm. Poté bylo přidáno 0,5 ml roztoku hydrátu chloridu zlatitého o koncentraci zásobního roztoku 5-10'3 mol-dm'3. Hodnota pH reakční směsi byla upravena pomocí cca 1 ml roztoku NaOH o koncentraci 0,25 mol-dm'3, tak aby pH činilo cca 10,5 a směs byla poté ještě promíchána 3 minuty. Následně byl do reakčního systému Λ Λ vpraven 1 ml roztoku kyseliny askorbové o koncentraci 5* 10 mol-dm . Reakční směs se poté nechala promíchávat 5 minut. TEM snímky připraveného kompozitu jsou uvedeny v Obr. 10. Příklad 11

Způsob přípravy kompozitu částic zlata a polystyrénových mikročástic s magnetickým jádrem pokrytých streptavidinem provedený za použití dopaminu jako redukčního činidla při hodnotě pH 2,87

Do kádinky o objemu 25 ml bylo vpraveno 200 μΐ ze zásobní disperze polystyrenovýcl mikročástic o velikosti 10 pm s magnetickým jádrem pokrytých streptavidinem (Sigma-Aldrich hmotnostní koncentrace částic 1 % v disperzi). Poté bylo přidáno 9,1 ml deionizované vody í poté 200 μΐ 1% (w/w) roztoku dopaminu. Reakční směs byla promíchána 5 minut ne elektromagnetické míchačce při otáčkách cca 500 rpm. Poté bylo přidáno 0,5 ml roztoku hydráti

J O chloridu zlatitého o koncentraci zásobního roztoku 5-10' mol-dm’ a reakční směs byla následní promíchávána 5 minut. TEM snímky připraveného kompozitu jsou uvedeny v Obr. 11. Příklad 12

Způsob přípravy kompozitu částic zlata pokrytých streptavidinem a polystyrénových mikročástk s magnetickým jádrem provedený za použití dopaminu jako redukčního činidla při hodnotě ph 2,87

Do kádinky o objemu 25 ml bylo vpraveno 200 μΐ ze zásobní disperze polystyrenovýcl mikročástic s magnetickým jádrem o velikosti 1 pm (Sigma-Aldrich, hmotnostní koncentrací částic 1 % v disperzi). Poté bylo přidáno 9,3 ml deionizované vody a poté 200 μΐ 1% (w/w roztoku dopaminu. Reakční směs byla promíchána 5 minut na elektromagnetické míchačce př otáčkách cca 500 rpm. Poté bylo přidáno 0,2 ml roztoku disperze nanočástic zlata o velikosti 2( nm pokrytých streptavidinem a směs byla následně promíchávána 5 minut. TEM snímk) připraveného kompozitu jsou uvedeny v Obr. 12. Příklad 13

Detekce přítomnosti bakterie Staphylococcus aureus v klinickém materiálu Byla provedena detekce přítomnosti bakterie Staphylococcus aureus v klinickém materiáli (kloubním punktátu) za využití povrchem zesílené Ramanovy spektroskopie a magnetickéhc kompozitu umožňujícího selektivní separaci, přečištění a detekci markéru (Protein A) typickéhc pro bakterii Staphylococcus aureus. V experimentech byl používán sterilní punktát z kolene od neznámého pacienta. Sterilití punktátu byla ověřena naočkováním na krevní agar a do Mueller-Hintonova bujónu. Z punktáti byly připraveny čtyři typy vzorků: punktát, do kterého byl přimíchán bakteriální lyzát (ad A) punktát homogenizovaný s živou bakteriální kulturou (ad B), dále punktát s bakteriální suspenzí v Mueller-Hintonově bujónu (ad C) a punktát s bakteriální suspenzí ve fyziologickém roztoku (ad D). A) K přípravě bakteriálního lyzátu byla použita dvacetičtyřhodinová kultura Staphylococcus aureus CCM 3953. Dobře izolované kolonie byly přeneseny do 5 ml Mueller-Hintonova bujónu, aby výsledný zákal odpovídal zákalovému standardu 1 podle McFarlanda. Bakteriální supsenze byla kultivována při 37 °C po dobu 24 hodin. Po inkubaci byl bujón centrifugo ván (2000 otáček/10 minut), supernatant slit a k sedimentu přidán 1 ml destilované vody. Promíchaná suspenze byla střídavě zmražována při teplotě -72 °C po dobu 10 minut a rozmrazována ve vodní lázni při teplotě 37 °C, celkem desetkrát. Takto připravený lyzát byl smíchán s punktátem v poměru 1:1. B) Do 1 ml punktátu byla přidána 1 středně velká kolonie dvacetičtyřhodinové kultury Staphylococcus aureus CCM 3953 a vzorek byl následně homogenizován v minitřepačce. C) Dobře izolované kolonie dvacetičtyřhodinové kultury Staphylococcus aureus CCM 3953 byly přeneseny do 2 ml Mueller-Hintonova bujónu, aby výsledný zákal odpovídal zákalovému standardu 0,5 podle McFarlanda. Bakteriální suspenze byla homogenizována v minitřepačce a následně smíchána s punktátem v poměru 1:1. D) Dobře izolované kolonie dvacetičtyřhodinové kultury Staphylococcus aureus CCM 3953 byly přeneseny do 2 ml fyziologického roztoku, aby výsledný zákal odpovídal zákalovému standardu 0,5 podle McFarlanda. Bakteriální suspenze byla homogenizována v třepačce a následně smíchána s punktátem v poměru 1:1. Výsledná detekce přítomnosti bakterie Staphylococcus aureus v kloubním punktátu byla provedena za použití excitačního laseru s vlnovou délkou 532 nm:

Na obrázku 13 jsou znázorněna povrchem zesílená Ramanova spektra za použití kompozitu připraveného dle Příkladu 2 a za použití excitačního laseru s vlnovou délkou 532 nm. (A) Povrchem zesílené Ramanovo spektrum kompozitu částic zlata a polystyrénových částic pokrytých streptavidinem připraveného dle Příkladu 2. (B) Povrchem zesílené Ramanovo spektrum kompozitu částic zlata a polystyrénových částic pokrytých streptavidinem připraveného dle Příkladu 2 a po přídavku biotinylované protilátky vůči proteinu A (markér bakterie Staphylococcus aureus). (C) Povrchem zesílené Ramanovo spektrum kompozitu částic zlata a polystyrénových částic pokrytých streptavidinem připraveného dle Příkladu 2 a po přídavku biotinylované protilátky vůči proteinu A a přídavku bakterie Staphylococcus aureus. Y j ····*· * ' (D) Povrchem zesílené Ramanovo spektrum kompozitu částic zlata a polystyrénových částic pokrytých streptavidinem připraveného dle Příkladu 2 a po přídavku biotinylované protilátky vůči proteinu A a přídavku klinického materiálu (kloubní punktát) následně mimotělně infikovaného bakterií Staphylococcus aureus.

Rozdílné spektrální pásy ve výše uvedených spektrech je možné využít k detekci infekce bakterií Staphylococcus aureus v biologickém materiálu. Příklad 14

Detekce přítomnosti Tau proteinu

Tau protein (τ-protein) je bílkovinná komponenta, která se vyskytuje v neuronech mozkové tkáně. Za normálních okolností stabilizuje mikrotubulámí struktury axonů. U Alzheimerovy choroby dochází k abnormální fosforylaci tohoto proteinu a ke zvýšenému vylučování do mozkomíšního moku. Fyziologická, normální hodnota, tau proteinu se v případě populace pod 60 let pohybuje v rozsahu 17,3 ± 4,4 pg/l a v případě populace nad 60 let 24,8 ± 15,2 pg/l. Patologická hodnota tau proteinu v mozkomíšním moku, tedy příznak Alzheimerovy choroby, se v případě populace pod 60 let pohybuje v rozsahu 33,3 ± 12,3 pg/l a v případě populace nad 60 let 61,7 ±35,4 pg/l.

Byla provedena detekce Tau proteinu (Sigma-Aldrich, T7951) za využití kompozitu připraveného dle Příkladu 1 a za použití anti Tau protilátky (Sigma-Aldrich, SAB 4501821).

Anti Tau protilátka byla biotinylována za použití Biotin N-hydroxysucciimidu (sigma-Aldrich, H1759). Pro experimenty bylo vždy použito 10 pl od disperze kompozitu, 10 pl od roztoku anti Tau protilátky a 10 pl roztoku Tau proteinu. Ve všech případech byly reakční směsi doplněny fyziologickým roztokem, tak aby výsledné objemy činily 30 pl. Výsledná koncentrace Tau proteinu činila ve vzorku (spektrum C, obr. 14) činila 100 pg/l.

Obr. 14 zobrazuje povrchem zesílená Ramanova spektra za použití kompozitu připraveného dle Příkladu 1 a za použití excitačního laseru s vlnovou délkou 785 nm. (A) Povrchem zesílené Ramanovo spektrum kompozitu částic zlata a polystyrénových částic pokrytých streptavidinem připraveného dle Příkladu 2. (B) Povrchem zesílené Ramanovo spektrum kompozitu částic zlata a polystyrénových částic pokrytých streptavidinem připraveného dle Příkladu 1 a po přídavku biotinylované protilátky vůči proteinu Tau. (C) Povrchem zesílené Ramanovo spektrum kompozitu částic zlata a polystyrénových částic pokrytých streptavidinem připraveného dle Příkladu 1 a po přídavku biotinylované protilátky vůči proteinu Tau a po přídavku Tau proteinu. Rozdílné spektrální pásy ve výše uvedených spektrech je možné využít k detekci Tau proteinu.

Claims

|g ···· »» * ?(/ klT-JW PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob přípravy magnetického kompozitu pro účely povrchem zesílené Ramanovy spektroskopie, vyznačený tím, že se k vodné disperzi polystyrénových částic s magnetickým jádrem přidá stříbrná a/nebo zlatitá a/nebo zlatná sůl a/nebo částice stříbra a/nebo zlata a nakonec se případně přidá roztok redukčního činidla, přičemž polystyrénové částice a/nebo částice stříbra a/nebo zlata s výhodou obsahují streptavidin.
2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se k vodné disperzi polystyrénových částic s magnetickým jádrem přidá spojovací molekula, stříbrná a/nebo zlatitá a/nebo zlatná sůl a nakonec se popřípadě přidá roztok redukčního činidla.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se k vodné disperzi polystyrénových částic s magnetickým jádrem přidá spojovací molekula, stříbrná a/nebo zlatitá a/nebo zlatná sůl a nakonec se popřípadě přidá roztok redukčního činidla, přičemž polystyrénové částice s magnetickým jádrem jsou pokryté streptavidinem.
4. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se k vodné disperzi polystyrénových částic s magnetickým jádrem přidá spojovací molekula, a následně částice stříbra a/nebo zlata pokryté streptavidinem.
5. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se k vodné disperzi polystyrénových částic s magnetickým jádrem přidá stříbrná a/nebo zlatitá a/nebo zlatná sůl a nakonec se přidá roztok redukčního činidla, přičemž polystyrénové částice s magnetickým jádrem mohou nebo nemusí být pokryté streptavidinem.
6. Způsob podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 a 5, vyznačený tím, že redukční činidlo je vybráno ze skupiny zahrnující kyselinu askorbovou, hydrochinon, pyrokatechol, pyrogalol, aminofenol, obecné kovy, hydridy, hydridoboritany, hydroxylamin, hydrazin, dopamin a redukující cukry.
7. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že pH reakční směsi je v rozmezí od 2,5 do 12.
8. Způsob podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, vyznačený tím, že se kreakční směsi před přídavkem redukčního činidla přidá amoniak.
9. Magnetický kompozit pro účely povrchem zesílené Ramanovy spektroskopie připravitelný způsobem podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, který obsahuje kompozit polystyrénových mikročástic s magnetickým jádrem a částic zlata a/nebo stříbra.
10. Magnetický kompozit podle nároku 9, vyznačený tím, že polystyrénové mikročástice s magnetickým jádrem a/nebo částice zlata a/nebo stříbra jsou pokryty streptavidinem.
11. Použití magnetického kompozitu podle nároků 8 až 10 pro povrchem zesílenou Ramanovu spektroskopii.