CZ2013964A3 - Způsob přípravy nanočástic kovu ukotvených v chitosanu a jejich použití - Google Patents

Abstract

Vynález se týká přípravy nanokompozitního materiálu nanočástic Ag.sup.+.n., Cu.sup.2+.n.a Zn.sup.2+.n.ukotvených v chitosanu a jeho použití pro zlepšení vlastnostní cévních náhrad. Nanokompozit je nanesen na cévní náhradu a po vysušení a vytvrzení je cévní náhrada připravena pro použití. Takto upravená cévní náhrada má výhody lepší biokompatibility a má antimikrobiální vlastnosti.

Description

Způsob přípravy nanočástic kovu ukotvených v chitosanu a jejich použití

Oblast techniky

Předmětem vynálezu je způsob přípravy nanočástic Ag⁺, Cu²⁺ a Zn²⁺ ukotvených v chitosanu a jejich aplikace na cévní náhradu poskytující antibakteriální ochranu při použití v medicínské praxi.

Dosavadní stav techniky

Cévní náhrady jsou nezbytnou součástí současné medicíny. Tyto náhrady musí být upraveny tak, aby měly dobrou biokompatibilitu, zachovanou průchodnost a protisrážlivé vlastnosti. Bakteriální infekce (obzvláště Staphylococcus aureus) patří k nejvážnějším komplikacím operací spojených s použitím cévního implantátu [1-3]. Cévní náhrady mohou být proto upraveny antibiotiky, která jsou navázána prostřednictvím kolagenu nebo želatiny [1, 4], Úskalím použití antibiotik je rychlý postup resistence bakterií vůči těmto léčivům. Další možností antibakteriální úpravy je použití iontů stříbra a ještě účinnějších nanočástic stříbra [5-8]. Kromě samotných nanočástic stříbra lze použít i kombinaci s nanočásticemi paládia a dalšími antibakteriálními činidly [9, 10]. Jsou rovněž známy antimikrobiální účinky biopolymerů, jako jsou kyselina hyaluronová a chitosan. Obě látky jsou dobře odbouratelné a biokompatibilní pro lidský organizmus [11, 12],

Chitosan je lineární polysacharid a je derivátem chitinu [13], Chitosan je dlouhodobě používán v medicíně pro své hojivé, antimikrobiální a protizánětlivé účinky [14-16], Připravují se biokompatibilní materiály s chitosanem obsahující částice stříbra, zinku nebo mědi a další přídavné látky vytvářející formu nanokompozitního gelu, bandáže, či vláknitých membrán s antibakteriálními účinky. V patentu CN101717529-A [17] se uvádí příprava kompozitu chitosanu s nanočásticemi Ag a ZnO, které se připraví přidáním solí stříbrných nebo zinečnatých k roztoku chitosanu a nanočástice se získají rozprášením a vysušením. V patentu CN102552964-A [18] je připraven chitosanový komplex nanostříbra s aditivy octanem zinečnatým, glycerolem nebo močovinou. Chitosanový antibakteriální gel obsahující dusičnan stříbrný a polyvinylpyrolidon je uveden v patentu CN102671239-A [19]. Nanovlákna polysacharidu/chitosanu se stříbrem a ethylen oxidem byla připravena v CN101297976-A [20], Patent W02008075222 uvádí přípravu a použití antimikrobiálního kompozitu složeného z chitosanu nebo derivátu chitosanu, kovových nanočástic, pojivá a • · · · fyzikálního nebo chemického modifikátoru [21]; používá se zde 10% koncentrace chitosanu a obsahy nanočástic kovu v rozmezí 0,01-15 hmotn.%.

Reference:

1. Perl, T.M., et al., Intranasal mupirocin to prevent postoperative staphylococcus aureus infections. New England Joumal of Medicine, 2002. 346(24): p. 1871-1877.

2. Anderson, D.J., et al., Severe surgical site infection in community hospitals: Epidemiology, key procedures, and the changing prevalence of methicillin-resistant staphylococcus aureus. Infection Control and Hospital Epidemiology, 2007. 28(9): p. 1047-1053.

3. Eamshaw, J.J., Methicillin-resistant Staphylococcus aureus: Vascular surgeons should fíght back. European Joumal of Vascular and Endovascular Surgery, 2002. 24(4): p. 283-286.

4. Lew, W. and W. Moore, Antibiotic-Impregnated Grafts for Aortic Reconstruction. Seminars in Vascular Surgery, 2011. 24(4): p. 211-219.

5. Rai, M.K., et al., Silver nanoparticles: the powerful nanoweapon against multidrugresistant bacteria. Joumal of Applied Microbiology, 2012.112(5): p. 841-852.

6. Unger, C. and C. Luck, Inhibitory effects of silver ions on Legionella pneumophila grown on agar, intracellular in Acanthamoeba castellanii and in artificial biofilms. Joumal of Applied Microbiology, 2012. 112(6): p. 1212-1219.

Ί. Li, W.R., et al., Antibacterial effect of silver nanoparticles on Staphylococcus aureus. Biometals, 2011. 24(1): p. 135-141.

8. Choi, O., et al., The inhibitory effects of silver nanoparticles, silver ions, and silver chloride colloids on microbial growth. Water Research, 2008. 42(12): p. 3066-3074.

9. Dowling, D.P., et al., Anti-bacterial silver coatings exhibiting enhanced activity through the addition of platinum. Surface & Coatings Technology, 2003.163: p. 637640.

10. Ruden, S., et al., Synergistic Interaction between Silver Nanoparticles and MembranePermeabilizing Antimicrobial Peptides. Antimicrobial Agents and Chemotherapy,

2009. 53(8): p. 3538-3540.

11. Evanko, S.P. and T.N. Wight, Intracellular localization of hyaluronan in proliferating cells. Joumal of Histochemistry & Cytochemistry, 1999. 47(10): p. 1331-1341.

12. Kogan, G., et al., Hyaluronic acid: a natural biopolymer with a broad range of biomedical and industrial applications. Biotechnology Letters, 2007. 29(1): p. 17-25.

13. Guibal, E., Interactions of metal ions with chitosan-based sorbents: a review. Separation and Purification Technology, 2004. 38(1): p. 43-74.

14. Pires, N.R., et al., Sulfated chitosan as tear substitute with no antimicrobial activity. Carbohydrate Polymers, 2013. 91(1): p. 92-99.

15. Madhumathi, K., et al., Development of novel chitin/nanosilver composite scaffolds for wound dressing applications. Joumal of Materials Science-Materials in Medicine,

2010. 21(2): p. 807-813.

16. Jayakumar, R., et al., Biomedical applications of chitin and chitosan based nanomaterials-A short review. Carbohydrate Polymers, 2010. 82(2): p. 227-232.

17. Deng, H., J. Deng, and M. Luo, Composite materiál comprises silver compound, zinc compound and chitosan in form of nanometer silver compound, nanometer zinc oxide compound and chitosan, respectively, and has good biological compatibility and antibacterial feature, UNIV XIANG TAN (UYXI-Non-standard). p. 8.

······ · · · · · • · · · · · · • · · ······· ··· ··

18. Li, Y., L. Dan, and S. Sun, Nano-silver chitosan composite antibacterial composition, comprises nano-silver, chitosan and additive, where mass of nano-silver is specific percent of chitosan, and mass of additive is specific percent of chitosan, QINGDAO MINGYAOTANG MEDICAL TECHNOLOGY (QING-Non-standard). p. 9.

19. Ji, J., et al., Method for preparing broad spectrum long-acting antibacterial chitosan nanometer composite gel coating layer utilized for medical device, involves coating solution on base substráte surface, and conducting solution with drying processes, Univ Zhejiang (Uyzh). p. 7.

20. Yuan, X. and J. An, Antibacterial argent polysaccharide/chitosan nano fiber preparative method, involves dissolving ethylene oxide into acetic acid aqueous solution, and processing fiber membrane to obtain nano fiber, TIANJIN UNIVERSITY (TIAN-Non-standard). p. 7.

21. Song, X., et al., Antimicrobial composition ušed on medical device, contains přeset amount of metallic nanoparticles with přeset particle size embedded or encapsulated in matrix containing chitosan or its derivative, cross-linking agent and modifier, Kimberly-Clark Worldwide lne (Kimb). p. 13.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu jsou nanočástice kovu ukotvené v chitosanu a způsob přípravy těchto nanočástic smícháním 1% až 5% vodného roztoku chitosanu s vodným roztokem soli obsahující ionty Ag⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ nebo jejich směs, kde výsledná koncentrace každého iontu kovu v roztoku po smíchání je 10 μΜ až 300 μΜ. Poté se roztok soli kovu s chitosanem ponechá reagovat po dobu 1 h, pak se přidá redukční činidlo a směs se míchá až do proběhnutí úplné redukce kovu.

Ve výhodném provedení podle vynálezu je redukčním činidlem výhodně NaBH₄ v množství 5 mg až 20 mg. Redukčním činidlem může být také hydrazin, hydroxylamin nebo redukující cukry.

Předmětem vynálezu je dále použití připravených nanočástic kovu ukotvených v chitosanu k pokrytí cévní náhrady ze syntetického textilního materiálu; cévní náhrada ze syntetického textilního materiálu pokrytá nanočásticemi kovu ukotvenými v chitosanu a její použití pro chirurgické aplikace.

Při přípravě nanokompozitního materiálu dochází nejprve k vytvoření komplexu stříbrných, měďnatých a zinečnatých iontů s chitosanem a následné rychlé redukci iontů na nanočástice. Cévní náhrada s naneseným nanokompozitním materiálem má kromě lepší biokompatibility významné antimikrobiální vlastnosti. Takto upravené cévní náhrady budou mít větší možnost využití v medicínské praxi a sníží možnost pooperačních komplikací nebo nutnost reoperací.

Přehled obrázků na výkresech

Obr. 1: Reakce chitosanu se stříbrnými ionty a následná redukce pomocí tetrahydridoboritanu sodného za tvorby nanočástic stříbra v chitosanové matrici.

Obr. 2: Vlevo: Růstové křivky S. aureus po přídavku různých koncentrací chitosanu s nanočásticemi Ag (1; 1,9; 3,75; 7,5; 15; 30 a 60 μΜ). Měřeno na přístroji Multiskan EX, Thermo Fisher Scientifíc, Germany) při 620 nm, 37 °C po dobu 24 hodin. Vpravo: Inhibiční zóna po aplikaci CAg nanokompozitu (60 μΜ Ag). IC50 = 1,0 μΜ.

Obr. 3: Vlevo: Růstové křivky S. aureus po přídavku různých koncentrací chitosanu s nanočásticemi Cu (1; 1,9; 3,75; 7,5; 15; 30 a 60 μΜ). Vpravo: Inhibiční zóna po aplikaci CCu nanokompozitu (60 μΜ Cu). IC50 =1,1 μΜ.

Obr. 4: Vlevo: Růstové křivky S. aureus po přídavku různých koncentrací chitosanu s nanočásticemi Zn (1; 1,9; 3,75; 7,5; 15; 30 a 60 μΜ). Vpravo: Inhibiční zóna po aplikaci CZn nanokompozitu (60 μΜ Zn). IC₅₀ = 1,1 μΜ.

Vynález je dále blíže popsán pomocí příkladů provedení, které však žádným způsobem neomezují jiná možná provedení v rozsahu patentových nároků.

Příklady uskutečnění vynálezu

Příklad 1

Příprava nanočástic Ag ukotvených v chitosanu (CAg)

K 0,1 g chitosanu (M_r = 140000 - 220000) rozpuštěného v 9 ml vody s přídavkem 0,1 ml kyseliny octové se přidal 1 ml roztoku AgNCh (0,034 g/lOml). Roztok se důkladně promíchal a ponechal k reakci po dobu 1 h. Pak se přidal pevný NaBH₄ (20 mg). Došlo ihned k tvorbě ··· · · · ····· • · 4 4 4 4 4 ·· 4 ff— ···· · · · · | 4444444 ··· · μ ·· ·· · · · ·· · 444 4444 ··· ·· pěny a změně zbarvení do hnědé. Směs se důkladně míchala po dobu 3 h. Takto připravený roztok se použil pro nanesení na cévní náhradu. Inhibiční efekt IC50 =1,0 μΜ.

Příklad 2

Příprava nanočástic Cu ukotvených v chitosanu (CCu)

Nanokompozit se připravil obdobně jako CAg za použití přídavku 1 ml roztoku monohydrátu octanu měďnatého Cu(OAc)₂H₂O (0,199 g/50 ml). Vznikl žluto-hnědý roztok.

IC50 = 1,1 μΜ.

Příklad 3

Příprava nanočástic Zn ukotvených v chitosanu (CZn)

Nanokompozit se připravil obdobně jako CAg za použití přídavku 1 ml roztoku monohydrátu octanu zinečnatého Zn(OAc)2H₂O (0,219 g/50 ml). Vznikl bezbarvý roztok. IC50 = 1,1 μΜ.

Příklad 4

Příprava nanočástic Ag-Cu ukotvených v chitosanu (CAgCu)

K 0,1 g chitosanu (M = 140000 - 220000) rozpuštěného v 9 ml vody s přídavkem 0,1 ml kyseliny octové se přidalo 0,5 ml roztoku AgNC>3 (0,034 g/lOml) a 0,5 ml roztoku

Cu(OAc)2 H₂O (0,199 g/50 ml). Roztok se důkladně promíchal a ponechal k reakci po dobu

h. Pak se přidal pevný NaBIL) (20 mg). Došlo ihned k tvorbě pěny a změně zbarvení do hnědé. Směs se důkladně míchala po dobu 3 h. Takto připravený roztok se použil pro nanesení na cévní náhradu. IC50 = 1,0 μΜ.

• · · • · · ·

• · · · ·

Příklad 5

Příprava nanočástic Ag-Zn ukotvených v chitosanu (CAgZn)

K 0,1 g chitosanu rozpuštěného v 9 ml vody s přídavkem 0,1 ml kyseliny octové se přidalo 0,5 ml roztoku AgNOa (0,034 g/lOml) a 0,5 ml roztoku Zn(OAc)2^-H2O (0,219 g/50 ml). Roztok se důkladně promíchal a ponechal k reakci po dobu 1 h. Pak se přidal pevný NaBH₄ (20 mg). Došlo ihned k tvorbě pěny a změně zbarvení do žluto-hnědé. Směs se důkladně míchala po dobu 3 h. Takto připravený roztok se použil pro nanesení na cévní náhradu.

IC₅₀= 1,0 μΜ.

Příklad 6

Úprava nanocévy pomocí chitosanových nanočástic

Nanokompozitní materiály připravené dle Příkladů 1 - 5 se nanesly v koncentraci 60 μΜ (kov) na cévní náhradu. U takto upravené cévy se sledovala antimikrobiální aktivita vůěi kmenu S. aureus.

Průmyslová využitelnost

Nanokompozitní materiál nanočástic kovu ukotvených v chitosanu je výhodný pro úpravu povrchu cévní náhrady zlepšující její biokompatibilitu i hojivé a antibakteriální vlastnosti cév. Pro výhodné vlastnosti takto upravených náhrad lze očekávat jednodušší aplikaci v medicínské praxi se sníženým rizikem pooperačních komplikací.

Takto upravené cévní náhrady je možné použít v oblasti aortofemorální, ilikofemorální, femoropoplitámí nad kolenní kloub, v oblasti extrakraniálních tepen a pro extraanatomické bypassy.

Claims (7)

1. Způsob přípravy nanočástic kovu ukotvených v chitosanu, vyznačující se tím, že se smíchá 1% až 5% vodný roztok chitosanu s vodným roztokem soli obsahující ionty Ag⁺, Cu²⁺, Zn²⁺ nebo jejich směs, kde výsledná koncentrace každého iontu kovu ve výsledném roztoku po smíchání je 10 μΜ až 300 μΜ, poté se tento roztok soli kovu s chitosanem ponechá reagovat po dobu 1 h, pak se přidá redukční činidlo a směs se míchá až do proběhnutí úplné redukce kovu.

2. Způsob přípravy nanočástic kovu ukotvených v chitosanu podle nároku 1, vyznačující se tím, že redukčním činidlem je NaBEU přidaný v množství 5 mg až 20 mg.

3. Způsob přípravy nanočástic kovu ukotvených v chitosanu podle nároku 1, vyznačující se tím, že redukčním činidlem je hydrazin, hydroxylamin nebo redukující cukry.

4. Nanočástice kovu ukotvené v chitosanu připravené způsobem podle nároků

1 až 3.

5. Použití nanočástic kovu ukotvených v chitosanu podle nároku 4 k pokrytí cévní náhrady ze syntetického textilního materiálu.

6. Cévní náhrada ze syntetického textilního materiálu pokrytá nanočásticemi kovu ukotvenými v chitosanu podle nároku 4.

7. Použití cévní náhrady podle nároku 6 pro chirurgické aplikace.