CZ2010132A3 - Rozpustná forma myších receptoru prirozených zabíjecských bunek NKR-P1A a zpusob její rekombinantní prípravy - Google Patents

Abstract

Rozpustná forma myšího aktivacního receptoru prirozených zabíjecských bunek rodiny NKR-P1, konkrétne NKR-P1A, a zpusob její rekombinantní prípravy, který je založený na identifikaci presné aminokyselinové sekvence v extracelulární cásti tohoto receptoru, získání odpovídajícího DNA fragmentu kódujícího tuto cást extracelulární domény uvedeného receptoru metodou RT-PCR, klonování do expresního vektoru, expresi proteinu v bakteriálních expresních systémech, renaturaci in vitro a purifikaci metodami ionexové a gelové vylucovací chromatografie.

Description

Oblast techniky

Vynález se týká rozpustné formy myších aktivačních receptorů přirozených zabíječských buněk rodiny NKR-Pl, konkrétně NKR-PIA, a způsobu rekombinantní přípravy této rozpustné formy.

Dosavadní stav techniky

NK („naturai killer“) buňky jsou významnou součástí imunitního systému se schopností eliminovat některé nádorové a viry infikované buňky. Důležitou úlohu mají i v regulaci imunitních reakcí, kde vytváří spojku mezi přirozenou a adaptivní imunitou. V současnosti se velký význam připisuje aloreaktivnim NK buňkám, ať už v boji proti nádorům nebo v prevenci jak rejekce tak GVHD („graft-versus-host disease“) po transplantaci hematopoetických kmenových buněk. Zdá se, že NK buňky mají významné postavení i v reprodukci, dále v patogenezi autoimunit, astmatu a infekce HIV.

Myší receptory NKR-PIA jsou homodimemí transmembránové proteiny II. typu patřící do rodiny C-lektinů. Jejich exprese byla pozorovaná především na NK buňkách, ale i na NKT lymfocytech a některých subpopulacích T lymfocytů. Celá NKR-Pl rodina těchto receptorů kódovaná jednotlivými geny tzv. NK genového komplexu, který je lokalizován na myším chromosomu c. 6, zahrnuje dle současných znalostí nejméně 6 proteinových produktů, totiž mNKR-P 1 A, B, C, D, E a F. S výjimkou sekvenční homologie na úrovni primární aminokyselinové sekvence, která je dobře patrná zejména v oblasti kódující globulámí ligand vázající doménu, existuje mezi těmito molekulami jen velmi malá podobnost pokud jde o jejich signalizační schopnosti, biologické funkce, a ligandy s nimiž tyto receptory interagují. mNKR-P 1 A, C a F jsou obecně řečeno receptory aktivační, na základě vazby ligandu na tyto receptory a jejich zesitění dochází k aktivaci efektorových (zejména zabíječských) funkcí NK buněk. mNKR-PlB a D, které se mezi sebou liší v primární aminokyselinové sekvenci minimálně, ale mají různý výskyt u různých výzkumných myších kmenů používaných v imunologii, jsou považovány za receptory inhibiční, přičemž inhibice ejektorových funkcí NK buněk těmito receptory je zajišťována prostřednictvím ITIM motivů v jejich intracelulámích sekvencích podobně jako je tomu u jiných receptorů imunitního systému. Naopak přítomnost aktivačních ITAM motivů v intracelulámích úsecích aktivačních receptorů mNKR-ΡΙΑ, C a F pozorována nebyla, což naznačuje nezbytnost jiných mechanismů pro zajištění jejich aktivačních funkcí (viz.^dále).

Receptor NKR-Pl C byl původně označen jako NK1.1 antigen, je historicky prvým studovaným zástupcem NKR-Pl rodiny, a byl dlouho považován za diferenciační znak NK buněk u myší kmene C57BL/6. Pro detekci NK buněk se používala monoklonální protilátka anti-NKl.l známá také jako PK.136. Později se zjistilo, že se váže i na jiné polymorfní receptory rodiny NKR-Pl u různých myších kmenů, a není tedy příliš spolehlivým ukazatelem identity příslušného receptoru. Jiné monoklonální protilátky proti antigenům rodiny NKR-Pl byly získány pouze v omezené míře, a jejích použití pro detekci jednotlivých antigenů této rodiny se příliš nerozšířilo.

Nepřítomnost ΠΊΜ nebo ITAM motivu v cytoplasmatické doméně mNKR-ΡΙΑ a mNKR-PIC poukazovala na alternativní molekulární mechanismus vysvětlující jejich aktivační charakteristiky. Ten byl opravdu nalezen, a spočívá v přítomnosti kladně nabitého zbytku argininu v transmebránové doméně těchto receptorů, který jim umožňuje přímo v membráně interagovat s některými adaptorovými proteiny, které již obsahují imunoaktivační ITAM motivy a mohou tak snadno sloužit k další propagaci aktivačního signálu. Myší NKR-PlC asociuje s adaptorovou molekulou FceRIy, zesíťování těchto receptorů monoklonální protilátkou anti-NKl.l vede k vysoké produkci interferonu-y. Podobná reakce byla pozorována i v případě antigenů mNKR-Pl A. Kromě toho byla pozorována interakce mNKR-PIC s proteinovou tyrosinovou kinasou rodiny Src, a to p56^kk. Tato interakce je pravděpodobné zprostředkována interakcí s tetrapeptidovým motivem CXCP v cytoplasmatické doméně tohoto receptoru, jedná se o tentýž motiv, který odpovídá za interakci výše zmíněné kinasy s ůitracelulámími doménami důležitých imunitních koreceptorů CD4 a CD8.

Ortology myších NKR-Pl genů byly identifikovány u potkanů a u člověka. U potkanů byly doposud identifikovány 4 isoformy tohoto receptoru, rNKR-ΡΙΑ, B, C a D. Jejich funkční vlastnosti jsou podobné odpovídajícím myším formám, reccptory rNKR-ΡΙΑ a C jsou aktivačními receptory NK buněk potkana, rNKR-ΡΙΒ a D jsou inhibující. U lidí byla doposud nalezena jen jediná forma hNKR-Pl, což není překvapivé vzhledem k významným odlišnostem v systému receptorů NK buněk mezi člověkem a hlodavci. Lidský NKR-Pl antigen není navíc příliš specifický pro NK buňky, a je exprimován i na povrchu dalších subpopulací leukocytů. Tento antigen je rozpoznáván monoklonální protilátkou DX-1.

Do současné doby byla v patentové literatuře popsána pouze purifikace lidského NKR-Pl a příprava činidel reagujících s tímto antigenem (U_xŠ^Patent 5,965,401). Ve vědecké literatuře je pak popsána pouze transientní exprese transmembránových forem myších receptorů NKR-PlA a NKR-PlC v imortalizovaných buněčných liniích při studiu reaktivity protilátky anti-NKl.l (Carlyle, J. R., Martin, A., Mehra, A., Attisano, L., Tsui, F. W., Zuniga-Pflucker, J. C.: J. Immunol. 162, 5917*5923 (1999)), dále při studiu signalizace receptorů {Ljutic, B., Carlyle, J. R., Filipp, D., Nakagawa, R., Julius, M., Zuniga-Pflucker, J. C.: J. Immunol. 174, 4789*4796 (2005)) a při studiu kmenově-dependentní aloreaktivity NK1.1 na myších NK buňkách (Carlyle, J. R., Mesci, A., Ljutic, B„ Belanger, S., Tai, L. H„ Rousselle, E„ Troke, A.

u.*'

D., Proteau, M. F, Makrigiannis, A, P.: J. Immunol. 176, 7511*7524 (2006)). Doposud však nebyla připravena rozpustná forma žádného receptoru rodiny myších NKR-Pl, což představuje překážku v dalším studiu receptorů, jejich struktury, vazebné specifícity, a zejména přípravě specifických protilátek, které by mohly najít uplatnění i jako markéry NK buněk při studiu jejich tkáňové distribuce a imunologických funkcí, případně při racionálním návrhu imunostimulátorů v protinádorové terapii. Původci již dříve popsali imunomodulace s použitím proteinů NKR-Pl, CD69 a jejich ligandú (IVO 95/21612, český patent é. 296202). Kromě sacharidových ligandů zmiňovaných v těchto patentových dokumentech ovšem mohou receptory rodiny NKR-Pl interagovat též s proteinovými ligandy, jak bylo ukázáno po nedávných objevech skupiny Wayne Yokoyamy (Carlyle, J. R., Jamieson, A. M„ Gasser, S., Clingan, C. S.. Arase, H., Raulet, D. H.: Proč. Nati. Acad. Sci. td

USA 101, 3527*3532 (2004)).

Podstata vynálezu

První předmět vynálezu se týká rozpustné formy části extracelulární domény myšího receptoru přirozených zabíječských buněk NKR-P1A, která sestává z následující aminokyselinové sekvence (SEKV. ID. Č. 1):

Ser-Ala-Lys-Leu-Glu-Cys-Pro-Gln-Asp-Trp-Leu-Ser-His-Arg-Asp-Lys-16

Cys-Phe-His-Val-Ser-Gln-Val-Ser-Asn-Thr-Trp-Glu-Glu-Gly-Leu-Val-32

Asp-Cys-Asp-Gly-Lys-Gly-Ala-Thr-Leu-Met-Leu-Ile-Gln-Asp-Gln-Glu-48

Glu-Leu-Arg-Phe-Leu-Leu-Asp-Ser-Ile-Lys-Glu-Lyg-Tyr-Asn-Ser-Phe-64

Trp-Ile-Gly-Leu-Arg-Tyr-Thr-Leu-Pro-Asp-Met-Asn-Trp-Lys-Trp-Ile-30

Asn-Gly-Ser-Thr-Leu-Asn-Ser-Asp-Val-Leu-Lys-Ile-Thr-Gly-Asp-Thr-96

Glu-Asn-Asp-Ser-Cys-Ala-Ala-Ile-Ser-Gly-Asp-Lys-Val-Thr-Phe-Glu-112

Ser-Cys-Asn-Ser-Asp-Asn-Arg-Trp-Ile-Cys-Gln-LyB-Glu-Leu-Tvr-Hig-128

Glu-Thr-Leu-Ser-Asn-Tyr-Val-Gly-Tyr-Gly-His

Rozpustná forma částí extracelulární domény myšího receptoru přirozených zabíječských buněk NKR-P1A podle předloženého vynálezu vykazuje mimořádnou stabilitu a představuje proto výhodný nástroj pro studium receptorů, zejména může být využita při přípravě specifických protilátek.

Celkový počet cysteinů ve výše popsané molekule je výhodně 6 cysteinových zbytků, které tvoří tri dísulfídové můstky, které jsou nezbytné pro stabilizaci struktury proteinu.

Další předmět vynálezu se týká izolované molekuly nukleové kyseliny, která kóduje výše uvedenou rozpustnou formu části extracelulární domény myšího receptoru přirozených zabíječských buněk třídy NKR-P1, konkrétně NKR-P1A. Tato izolovaná molekula nukleové kyseliny může být DNA nebo RNA, výhodně je to cDNA. Také molekuly nukleové kyseliny se sekvencí komplementární k výše uvedené sekvenci spadají do rozsahu vynálezu.

Další předmět vynálezu se týká způsobu přípravy rozpustné formy části extracelulární domény myšího receptoru přirozených zabíječských buněk NKR-P1A, jak byla definována výše. Způsob přípravy rozpustných forem myších receptoru podle vynálezu zahrnuje předstupeň, ve kterém je stanoven rozsah (velikost) exprimovaného proteinu, a dále 5 stupňů, které zahrnují izolaci celkové RNA, přípravu fragmentů specifické DNA, klonování této DNA do vhodného vektoru, transformaci vhodných hostitelských buněk, které umožní expresi požadovaných proteinů, izolaci inkluzních tělísek obsahujících požadované proteiny a nakonec solubilizaci inkluzních tělísek a případně i purifikaci požadovaných proteinů.

Předstupeň: Definice rozsahu exprimováného proteinu.

Po letech velmi intenzivního výzkumu v této oblasti bylo původci zjištěno, že definice rozsahu exprimováného proteinu je absolutně kritická pro stabilitu připravovaného proteinu. Pokud je exprese proteinu omezena na samotnou lígand vázající doménu o velikosti přibližně 100 aminokyselin, je produkovaný protein zpravidla nestabilní. Stabilita se většinou zvyšuje přidáním segmentu dalších así 30 aminokyselin tvořících třetí disulfidový můstek, ale zahrnutí dalších aminokyselin těsně za transmembránovou doménou může stabilitu naopak dále snižovat, a je třeba použít velmi složité protokoly pro správné poskládání proteinu. Stanovení velikosti požadovaného proteinu, tj. přesného rozsahu exprimovaných aminokyselin, vyžadovalo proto kromě vědecké erudice a intuice obsáhlé experimentování.

Rozpustná forma myšího receptoru NKR-P1A podle předloženého vynálezu může být připravena následujícím postupem:

1. stupeň: Izolace RNA a příprava DNA fragmentů kódujících rozpustné formy myších receptoru N KR-P1A

Celková RNA je izolována ze sleziny C57BL/6 myší a následně je použita jako templát pro syntézu cDNA s využitím reverzní transkriptasy. cDNA je poté použita na PCR amplifikaci DNA fragmentů kódujících rozpustné formy extracelulární části myších receptorů NKR-PI A. Pro amplifikaci jsou použity vhodné páry oligonukleotidových primerů vybrané ve výše uvedeném předstupni. Výhodné primery, které byly použity v příkladu 1 pro mNKR-PlA, mají sekvence SEKV. ID. Č, 3 a 4.

Tyto oligonukleotidy mohou být navíc využity jako molekulární sondy pro detekci (hybridizace) přítomnosti rtukleové kyseliny kódující NKR-P1A nebo jako primery v PCR (RT-PCR), kdy produkt PCR je indikátorem přítomnosti nukleové kyseliny kódující NKR •PIA.

2. stupeň: Konstrukce expresního plazmidu a transformace kompetentních buněk

Expresní plazmid je zkonstruován vložením fragmentu DNA kódujícího rozpustnou formu myšího receptoru NKR-PIA připraveného vstupní l do expresního vektoru a takto připravený expresní plazmid je následně vnesen metodou transformace do kompetentních buněk.

3. stupeň: Exprese rozpustných forem myších receptorů NKR.-P1A a izolace inkluzních tělísek

Z transformantů připravených v stupni 2 je vybrán produkční klon, který je použit jako inokulum pro velkoobjemovou produkci proteinu ve vhodném kultivačním médiu. Exprese proteinů je indukována induktorem v závislosti na typu promotoru v expresním vektoru a mechanizmu regulace proteinové exprese. Odborník je schopen zvolit vhodný promotor a odpovídající induktor. Po velkoobjemové produkci je bakteriální kultura odstředěna centrifugací a inkluzní tělíska jsou izolována podle standardního postupu.

4. stupeň: Solubilizace inkluzních tělísek získaných v kroku 3, renaturace in vitro a diaiýza

Inkluzní tělíska jsou solubilizována v guanidinovém pufru a proteiny jsou následně renaturovány in vitro metodou rychlého naředění. Po renaturaci je renaturačni směs dialyzována proti dialyzačnimu pufru.

5. stupeň: Purifikace proteinových preparátů ionexovou a gelovou vylučovací chromatografíí

Po dialýze se proteinové preparáty puntíkují ionexovou chromatografíí např. na koloně Q-Sepharosy FF, po které následuje finální gelová vylučovací chromatografie např. na koloně Superdexu 75. V proteinových frakcích je nakonec stanovena koncentrace proteinů. Finální proteinový preparát je /koncentrován (5 mg/ml) a uchováván v Tris pufru s lynM NaNí. Za těchto podmínek je proteinový preparát velmi stabilní po dobu několika měsíců.

Základní postupy molekulární biologie, které byly použity, jsou popsány např. v publikacích: Sambrook J, Russell DW. Molecular Cloning: A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 2001, 3rd Edition (ISBN: 0-87969-576-5) a Ausubel et al. (eds.), Short Protocols in Molecular Biology, 4th ed, Wiley, 1999 (ISBN 0-471-32938-X).

Předmětem vynálezu je tedy konkrétně rozpustná forma části extracelulární domény myšího receptoru přirozených zabíječských buněk NKR-P1A, která sestává z aminokyselinové sekvence SEKV. ID. Č. 1.

Dále je předmětem vynálezu také izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci výše popsané rozpustné formy části extracelulární domény myšího receptoru přirozených zabíječských buněk NKR-P1 A.

Dále je předmětem vynálezu způsob přípravy rozpustné formy části extracelulární domény myšífhf receptoru přirozených zabíječských buněk NKR-P1A, /kterýžW způsob zahrnuje kroky, kdy je z RNA připraven DNA fragment kódující část extracelulární domény receptoru pomoci reverzní transkripce a PCR (RT-PCR) s dvojicí oligonukleotidových primerů sestávající ze sekvencí SEKV. ED. Č. 3 a SEKV. ID. Č. 4, a tento DNA fragment je pak vnesen do hostitelských buněk.

Způsob podle vynálezu výhodně dále zahrnuje kroky, kdy jsou z transformovaných hostitelských buněk izolována inkluzní tělíska, inkluzní tělíska jsou solubilizována a proteiny jsou renaturovány, případně ještě dále puntíkovány.

Dalším předmětem vynálezu je dvojice oligonukleotidů sestávající ze sekvencí SEKV. ID. Č. 3 a SEKV. ID. Č. 4 pro použití při přípravě nukleové kyseliny kódující rozpustnou formu části extracelulární domény NKR-P1 A.

,'StFuěnv popWobrázků na .< t,-h

Obr. 1: MALDI-TOF hmotnostní spektrum tryptických štěpů mNKR-PlA (horní panet) amNKR-PIC (dolní panel). V pravém horním rohu každého panelu jsou znázorněny sekvence odpovídající některým tryptickým štěpům.

Obr. 2: Analýza preparátů mNKR-ΡΙΑ (A) amNKR-PIC (B) SDS elektroforézou v 15% polyakrylamidovém gelu za redukujících a neredukujícich podmínek.

Obr. 3: Spektrum mNKR-Pl A měřené ESI FT-ICR hmotnostní spektrometrií. Po dekonvoluci spekter byla stanovena celková hmotnost mNKR-Pl A [M+H]⁺ na 15 976,50 Da.

Obr. 4: Spektrum mNKR-PlC meřené ESI FT-ICR hmotnostní spektrometrií. Po dekonvoluci spekter byla stanovena celková hmotnost mNKR-PlC [M+H]⁺ na 15 394,38 Da.

Obr. 5: Vazebný experiment radioaktivně značených mNKR-Pl A a mNKR-PlC s neoglykoproteiny a přirozenými glykoproteiny. Testované látky (B) byly přeneseny na PVDF membránu (A), inkubovány s radioaktivně značenými proteiny a vizualizovány autoradiograficky. Autoradiogram ^!25I-mNKR-PlA je znázorněn na panelu C a autoradiogram ¹²⁵I-mNKR-PIC na panelu D.

Příklady provedení vynálezu

Experimenty popsané v příkladech byly prováděny současně pro NKR-P1A a NKR-P1C, avšak vynález, pro který je požadována patentová ochrana touto-přihláškou, se týká pouze NKR-P1A.

Příklad 1

Příprava rekombinantního proteinu mNKR-PlA na LB médiu a identifikace tohoto proteinu

1.1. Příprava cDNA a expresního vektoru

Celková RNA izolovaná ze slezin C57BL/6 myší pomocí RNA Blue (Top-Bio) byla použita jako templát pro syntézu cDNA s využitím reverzní transkriptasy Superscript III (Invitrogen).

DNA fragmenty kódující rozpustnou formu myšího receptoru mNKR-PlA, respektive mNKR-PIC, byly amplifikovány metodou PCR s využitím párů oligonukleotidových přiměni Pt 1 a P12 (pro mNKR-ΡΙΑ) a P21 a P22 (pro mNKR-PIC):

PÍ 1: 5'- gcc ata tgt cag cta age tag agt gcc ca -3' (SEKV. ID. Č. 3)

PÍ2: 5'- gca agc tta tca gtg tcc ata acc cac ata gtt gct -3' (SEKV. ID. Č. 4)

P21: 5'- gcc ata tgt cag tta att tag agt gcc ca -3' (SEKV. ID. Č. 5)

P22: 5'- gca agc tta tca gga gtc att act cgg ggt -3’ (SEKV. ID. Č. 6).

PCR amplifikace probíhala v reakční směsi o celkovém objemu 50 μΐ a následujícím složení:

30,5 μΙ sterilní deionizované vody; 1,5 μΐ !00|mM síranu horečnatého;

μΐ 10 ^x koncentrovaného pufru ThermoPol Reactíon Buffer (New England Biolabs); dále aždého z dvojice primerů ; 1,5 μΐ 10jnM dNTP, 1 μΐ cDNA (připravené výše uvedeným postupem) a 0,5 μΐ Deep Vent DNA polymerasy (2 U/μΙ) (New England Biolabs), přičemž bylo provedeno 30 cyklu PCR amplifikace dle standardního protokolu s půlminutovým nasedáním primerů při 55 °C a jednominutovou polymerací při 72 °C.

Dalším krokem byla elektroforetická separace DNA fragmentů v agarózovém gelu, po které následovala izolace a purifikace amplikonu přímo z gelu s použitím komerčně dostupných souprav, např. od firmy Genomed, nebo Qiagen. Amplikon byl poté štěpen restrikčnimi endonukleázami Ndel a HindllI (New England Biolabs) a připravený DNA fragment s přečnívajícími konci byl separován elektroforeticky v agarózovém gelu, z kterého byl následně izolován a purifikován uvedeným postupem. Analogicky byl připraven linearizovaný expresní vektor pET-30a(+)(Novagen). Poté následovala ligace připravených fragmentu s komplementárními konci, která probíhala 4 hodiny při laboratorní teplotě η τ * v reakční směsi o objemu 20 μ! a složení: 50»200 ng linearizováného expresního vektoru, ekvimolámí množství insertu, 2 μΐ 10 * koncentrovaného ligačního pufru pro T4 DNA ligázu (MBI Fermentas) a 1 μΐ T4 DNA ligázy (5 WeissU/μΙ) (MBI Fermentas). Ligační směs byla poté použita pro transformaci kompetentních buněk určených pro amplifíkaci plazmidu. Po izolaci plazmidové DNA byla kvalita konstruktu verifikována sekvenováním DNA.

1.2. Příprava rekombinantního proteinu

Pro produkci proteinu byl připravený expresní plazmid vložen do kompetentních buněk Escherichia coli BL-21 (DE3) Gold (Stratagene) metodou transformace tepelným šokem a stacionární kultura selektovaného produkčního klonu byla následně použita pro inokulaci 1 litru LB média s obsahem tetracyklíhu a kanamycíhu.

Dalším krokem byla submerzní kultivace za intenzivního třepání při 220 rpm a teplotě 37 °C, Pro zajištění dostatečné aerace byl objem použité Erlenmeyerovy baňky minimálně čtyřikrát větší než objem média. Při ODs5o=0,7 byla provedena indukce proteinové exprese pomocí roztoku O.limM isopropyl-P-D-thiogalaktopyranosidu, po které následovala kultivace při 220 rpm a teplotě 37 °C po dobu 2 hodin. Po kultivaci byla bakteriální kultura odstředěna centrifugací a inkluzní tělíska izolována podle standardního postupu (ťalez-Gomez, M„ ii*

Reybum, Η. T„ Mandelboim, M„ andStrominger, J. L. (1998) ímmunity 9, 337»344).

Poté byla inkluzní tělíska solubilizována v 4 ml 6 M guanidin-hydrochloridu (pH 8,0) s lO mM DTT a proteiny byly následně renaturovány in vitro metodou rychlého naředění v 400 ml renaturačního pufru obsahujícího 50mM Tris-HCl, iOOmM CaCh, 0,4 M L-Arg, 9 mM cysteamin, 3 mM cystamin, 1 mM NaNx, 1 mM fenylmethylsulfonyl fluorid a pH 8,5. Po renaturaci byla renaturační směs dialyzována dvakrát při 4 °C proti 8 litrům 15 mM Tris-HCl (pH 8,5), 9 mM NaCl a 1 mM NaNj po dobu 6 hodin. Po dialýze byl roztok proteinu zahuštěn ultrafiltrací na objem 30 ml s využitím ultrafiltrační membrány z PLGC celulosy (Millipore) o průměru 76 mm a s limitem 10 kDa.

Poté byl roztok proteinu přefiltrován přes filtr Whatman o průměru 25 mm a následně nanesen při průtokové rychlosti 1,0 ml/min na kolonu Q-Sepharosy FF (GE Healthcare) o rozměrech 1,0 * 6,0 cm ekvilibrovanou díalyzačním pufrem. Po nanesení proteinu byla kolona promyta dialyzačním pufrem a navázané proteiny byly eluovány lineárním gradientem NaCl od 9niM do l M, který trval 60 minut.

Proteinové frakce z kolony Q-Sepharosy FF byly zahuštěny centrifugačním koncentrátorem Amicon Ultra (Millipore) s limitem 10 kDa na objem 400 μΐ a byly naneseny na kolonu Superdex 75 HR 10/30 (GE Healthcare) ekvilibrovanou pufrem s obsahem 15 mM Tris-HCl (pH 8,0), 150 mM NaCl a 1 mM NaNj. Proteiny byly eluovány izokraticky při průtokové rychlosti 0,4 ml/min. Koncentrace proteinů v proteinové frakci z kolony Superdex 75 HR 10/30 byla stanovena dle Bradforové s použitím standardu BSA, poté byl protein zkoncentrován (5 mg/ml) s použitím membránových koncentrátorů.

Výtěžky 2 1 litru buněčné kultury na LB médiu se pohybovaly okolo 21 mg pro mNKR-PlA li* a 17 mg pro mNKR.-PlC. Uvedené množství je možné vyrobit za 4«6 dní po transformaci kompetentních buněk.

1.3 Identifikace rekombinantniho proteinu

Identifikace rekombinantniho proteinu byla realizována metodou peptidového mapováni pomocí hmotnostní spektrometrie MALDI-TOF (Bruker). Přítomnost rekombinantních proteinů mNKR-Pl A a tnNKR-PlC byla potvrzena komparací naměřených hodnot s databází v programu Mascot (Matrix Science). Hmotnostní spektra MALDI-TOF tryptíckých fragmentů jsou znázorněna na obr. 1. Čistotu a homogenitu proteinových preparátů dokumentuje elektroforetická analýza proteinových preparátů za redukujících a neredukujících podmínek. Elektroforeogramy jsou znázorněny na obr. 2, kde je jasně viditelný posun elektroforetické mobility za neredukujících podmínek způsobený větší kompaktností molekuly, která byla daná zesíťováním disulfidových vazeb. Intaktnost a vysokou čistotu obou proteinů mNKR-ΡΙΑ a mNKR-PIC dále dokumentují hmotnostní spektra {obr. 3, 4} měřená na ESI FT MS analyzátoru (Bruker) s iontově cyklotronovou rezonancí (ICR). Po dekonvoluci spekter byla stanovena celková hmotnost mNKR-Pl A [M+Hf na 15 976,50 Da, resp. mNKRP-lC [M+Hf na 15 394,38 Da, což odpovídá monoizotopické molekulové hmotnosti proteinu mNKR-ΡΙΑ resp. mNKR-PIC s absenci iniciačního methioninu a po spárovaní všech 6 cysteinů. Vazebné experimenty znázorněné na obr. 5 prokázaly, že radioaktivně značené proteiny mNKR-Pl A a mNKR-PIC mají podobnou vazebnou specificitu jako potkaní NKR-P1A.

Příklad 2

Příprava rekombinantniho proteinu mNKR-Pl A na minimálním médiu M9

Postup byl shodný jako v příkladu 1, pouze s tím rozdílem, že proteiny byly produkovány na M9 minimálním médiu. Výtěžky z l litru buněčné kultury na M9 médiu se pohybovaly okolo 10 mg pro mNKR-Pl A a 7 mg pro mNKR-PIC. Výtěžky na minimálním médiu M9 byly pro oba proteiny nižší než na médiu LB (viz příklad 1), nicméně dostatečné pro efektivní přípravu proteinů.

Příklad 3

Příprava rekombinantního proteinu mNKR-Pl A na modifikovaném minimálním médiu M9

Postup byl shodný jako v příkladu 1, pouze s tím rozdílem, že proteiny byly produkovány na M9 minimálním médiu, kde jediným zdrojem dusíku byl ¹⁵NH4C1. Výtěžky z 1 litru buněčné kultury na uvedeném modifikovaném M9 médiu se pohybovaly okolo 1,9 mg pro myší ^l5NNKR-P1A a 1,2 mg pro myší ¹⁵N-NKR-P1C. Výtěžky v tomto příkladu byly pro oba proteiny pochopitelně výrazně nižší než v příkladech 1 a 2, avšak uvedená kultivace poskytuje izotopově značené myší proteiny ¹⁵N-NKR-P1A a ^I5N-NKR-P1C v množství dostatečném pro experimenty se značenými proteiny.

Průmyslová využitelnost

Rozpustná forma části extracelulámí domény myších receptorů přirozených zabíječských buněkNKR-PlA se uplatní v biotechnologickém a farmaceutickém průmyslu při konstrukci monoklonálních protilátek, které zatím nejsou k dispozici, dále jako modelový protein ke studiu interakce protein - sacharid a pro návrh a přípravu imunostimulátorů s protinádorovým účinkem.

SEZNAM SEKVENCÍ <110> Univerzita Karlova v Praze, Přírodovědecká fakulta <120> Rozpustná forma myších receptorů přirozených žabíječských buněk NKR-P1A a způsob její rekombinantní přípravy

<130>

P-0042-CZ

<150>

<151>

<160>	6
<210> <211> <212> <213>	1 139 PRT Mus musculus
<400>	1

Ser-Ala-Lys-Leu-Glu-Cys-Pro-Gln-Asp-Trp-Leu-Ser-Hla-Arg-Asp-Lya-16

Cys-Pha-Hi a-Val-Ser-Gin-Val-Ser-Asn-Thr-Trp-Glu-Glu-Gly-Leu-Val-32

Aap-Cya-Asp-Gly-Lya-Gly-Ala-Thr-Leu-Met-Leu-Ile-Gln-Aap-Gln-Glu-48 α1α-Ι,βη-ΑΓ3-Ρ1ι.β-Ι,βη-Ιιβιι-Α8ρ-3βΓ-Ι1β-Ιιγ8-01π-Ι^β-ΤγΓ-Α3ΐ1-3βΓ-Ρ1ιβ-64

Trp-Ile-Gly-Leu-Arg-Tyr-Thr-Leu-Pro-Aap-Met-Aan-Trp-Lya-Trp-Ila-80

Asn-Gly-Ser-Thr-Leu-Asn-Ser-Aep-Val-Leu-Lys-Ile-Thr-Gly-Asp-Thr-96

Glu-ABn-Asp-Ser-Cys-Ala-Ala-Tle-Ser-Gly-Asp-Lya-Val-Thr-Pha-Glu-112

Ser-Cys-Aan-Ser-Aap-Aen-Arg-Trp-Ile-Cya-Gln-Lya-Glu-Leu-Tyr-Hia-128

Glu-Thr-Leu-Ser-Aan-Tyr-Val-Gly-Tyr-Gly-Hia <210> 2 <211?135 <212> PRT <213> Mus musculus <400>2

Ser-Val-Asn-Lau-Glu-Cys-Pro-Gln-Aap-Trp-Leu-Leu-His-Arg-Asp-Lya-16

Cys-Phe-Hia-Val-Ser-Gln-Val-Ser-Asn-Thr-Trp-Glu-Glu-Gly-Gln-Ala-32

Asp-Cya -Gly-Arg-Lya-Gly-Ala-Thr-Leu-Leu-Leu-Ile-Gln-Asp-Gin-Glu-4 8

Glu-Leu-Arg-Phe-Leu-Leu-Asp-Ser-Ile-Lya-Glu-Lys-Tyr-Aen-Ser-Phe-64

Trp-Ile-Gly-Leu-Arg-Phe-Thr-Leu-Pro-Aap-Met-Aan-Trp-Lys-Trp-Ile-80

Asn-Gly-Thr-Thr-Pha-Asn-Ser-Aap-Val-Leu-Lya-Ile-Thr-Gly-Val-Thr-9 6

Glu-Agn-Gly-Ser-Cys-Ala-Ser-Ila-Leu-Gly-Aap-Lya-Val-Thr-Pro-Glu-112

Ser-Cys-Ala-Ser-Asp-Asn-Arg-Trp-Ile-Cys-Gln-Lys-Glu-Leu-Asn-Hia-128

Glu-Thr-Pro-Ser-Asn-Asp-Ser <210? 3 <211? 29 <212? DNA <213?

<22 0? Znaky <223? Umělá sekvence <400? 3 gccatatgtc agctaagcta gagtgccca 29

<210?	4
<211?	36
<212?	DNA
<213?
<220?	Znaky
<223?	Umělá sekvence
<400?	4
gcaagcttat cagtgtccat aacccacata gttgct	36

<210?	5
<211?	29
<212?	DNA
<213?
<220?	Znaky
<223?	Umělá sekvence
<400?	5

gccatatgtc agttaattta gagtgccca

<210?	6
<211?	30
<212?	DNA
<213?
<220?	Znaky
<223?	Umělá sekvence
<400?	6

gcaagcttat caggagtcat tactcggggt

PV 1OX - 331 ζ0 37θ

PV 2010-132 (22.113010)

PATENTOVÉ NÁROKY

Claims (5)

1. Rozpustná forma části extracelulámí domény myšího receptorů přirozených zabíječských buněk NKR-P1 A, která sestává z aminokyselinové sekvence SEKV. ID. Č. 1.

2. Izolovaná molekula nukleové kyseliny kódující aminokyselinovou sekvenci rozpustné formy části extracelulámí domény myšího NKR-P1A podle nároku 1.

3. Způsob přípravy rozpustné formy části extracelulámí domény NKR-P1A podle nároku i vyznačující se tím, že zahrnuje kroky, kdy se z celkové myší RNA připraví DNA fragment kódující část extracelulámí domény NKR-P1A pomocí reverzní transkripce a PCR (RT-PCR) s dvojicí oligonukleotidových primerů sestávající ze sekvencí SEKV. ID. Č. 3 a SEKV. ID. Č. 4 a tento DNA fragment se vnese do hostitelských buněk.

4. Způsob podle nároku 3 vyznačující se tím, že dále zahrnuje kroky, kdy se z transformovaných hostitelských buněk izolují ínkluzní tělíska, inkluzní tělíska se solubilizují a proteiny se renaturují a případně se dále puntíkují.

5. Dvojice oligonukleotidů sestávající ze sekvencí SEKV. ID. Č. 3 a SEKV. ID. Č. 4 pro použití při přípravě molekuly nukleové kyseliny podle nároku 2.