CZ2009190A3

CZ2009190A3 - Zpusob merení lokální toxicity látek a zarízení k jeho provádení

Info

Publication number: CZ2009190A3
Application number: CZ20090190A
Authority: CZ
Inventors: Cejková@Jitka; Cejka@Cestmír; Michálek@Jirí; Širc@Jakub
Original assignee: Ústav experimentální medicíny AV CR, v.v.i; Ústav makromolekulární chemie, AV CR, v. v. i.
Priority date: 2009-03-30
Filing date: 2009-03-30
Publication date: 2010-10-13
Also published as: WO2010111977A3; EP2414814A2; WO2010111977A2

Abstract

Pri zpusobu merení lokální toxicity látek se látce vystaví rohovka oka zvírete a zmerí se zmena tlouštky rohovky a poprípade také absorpcních vlastností rohovky. Zmena tlouštky rohovky se merí pachymetrem, zmena absorpcních vlastností rohovky spektrofotometricky. Vložka do kyvety pro spektrofotometrické merení sestává ze dvou plexisklových krycích desticek (1, 5) s otvorem velikostí odpovídajícím vykrojenému stredu merené rohovky, mezi kterými je umístena desticka (3) z nerezu s kruhovým výkrojem o témže prumeru, pricemž po obou stranách desticky z nerezu, mezi destickou z nerezu a plexisklovými krycími destickami, jsou usporádána kremenná krycí sklícka (2, 4).

Description

Oblast techniky

Vynález se týká nového způsobu měření lokální toxicity látek měřením změny vlastností rohovky.

Stav techniky

Lokální toxicita různých látek se často testuje na tkáňových kulturách. Princip testování spočívá v tom, že kultivované buňky (rohovkové epiteliální buňky, konjunktivalní epiteliální buňky, stromální fibroblasty, retinální pigmentový epitel, nádorové buňky, atd. - buňky mohou být z různých živočišných druhů, anebo lidské - jsou vystaveny různým látkám (noxám), které se mají testovat. Toxicita se posuzuje různými technikami, sledujícími viabilitu buněk (např. Mannerstrom M, Zom-Kruppa M, Diehl H, Engelke M, Toimela T, Maenpaa H, Huhtala A, Uusitalo H, Salminen L, Pappas P, Marselos M, Mántylá E, Táhti H.: Evaluation of the cytotoxicity of selected systemic and intravitreally dosed drugs in the cultures of human retinal pigment epithelial cell line and of pig primary retinal pigment epithelial cells. Toxicol In Vitro, 2002, 16:193-200; Huhtala A, Pohjonen Z, Salminen L, Salminen A, Kaamiranta K, Uusitalo H: In Vitro biocompatibility of degradable biopolymers in cell line cultures from various ocular tissues: extraction studies. J Mater Med 2008, 19:645-9; LaryeaD, Isaksson A, Wright CW, Larsson R, Nygren P: Characterization of the cytotoxic activity of the indoioquinoline alkaloid crryptolepine in human tumor cell lineš and primary cultures of tumor cells from patients. Invest New Drugs, 2008 (Epub ahead of print). Dalším způsobem testování lokální toxicity je oko experimentálního zvířete, nej častěji králíka: Draize test lokální dráždivosti (Dreize JH, Woodard G, Calvery HO: Methods for the study of irritation and toxicity of substances applied topically to the skin and mucous membranes. J Pharmacol and Exp Therapeutics 82, 377-390, 1944) a jeho různé moderní modifikace (chorioallantoidní membrána kuřecích zárodků, např. Saw CL, Heng PW, Liew CV. Chick chorioallantoic membrane as an in šitu biological membrane for pharmaceutical formulation development: A review. Drug Dev Ind Pharm 29,1-10,2008; Budai P, Vámagy L. In vitro ocular irritation toxicity study of some pesticides. Acta vet Hung 48,221-228, 2000).

• ·· · «λ

V Φ « ·

Obě skupiny testů jsou málo vyhovující. Tkáňové kultury jsou vytržené z organismu a mohou sloužit pouze k orientačnímu posouzení vlivu škodliviny. Dreizeho test oční dráždivosti (a jeho modifikace) je sice prováděn na oku živého zvířete, anebo chorioallantoidní membráně kuřecího zárodku (cca. 10 dní starého), ale posuzuje pouze reakcí spojivky, anebo chorioallantoidní membrány (zarudnutí, překrvení, koagulace). Test na chorioallantoidní membráně, (tzv. „Henss egg test on chorioallantoic membrane, HET-CAM) ve svých variacích používá i histologická barvení, např. tiypanovou modř anebo haematoxylin eosín pro zdůraznění stavu chorioallantoidní membrány (např. Djabari Z, Bauza E, Dal Farra C, Domloge N. The HET-CAM test combined with histological studies for better evaluation of active ingredient innocuity. Int J Tissue React. 24,117-21,2002).

Nevýhody dosavadních způsobů stanovování lokální toxicity látek řeší předkládaný vynález.

Podstata vynálezu

Předmětem vynálezu je způsob testování lokální toxicity látek, jehož podstata spočívá v tom, že se látce vystaví rohovka oka zvířete a změří se změna tloušťky rohovky, která odpovídá změně hydratace rohovky, a popřípadě také absorpčních vlastností rohovky.

Jakákoliv škodlivina, která působí na rohovku, vyvolá tzv. histotoxickou hypoxii v buňkách rohovky (třeba pouze v povrchových epiteliálních buňkách). Tato hypoxie, způsobená funkčním nebo morfologickým poškozením rohovkových buněk, vyvolá okamžitě zvýšenou hydrataci rohovky následujícím mechanismem: Poškozené buňky rohovky nemohou normálně utilizovat kyslík (rohovka je závislá především na přísunu atmosférického kyslíku) a nedostatek kyslíku se okamžitě projeví funkčním nebo morfologickým poškozením tzv. endoteliální pumpy, která udržuje rohovku při normální hydrataci. Toto poškození endoteliální pumpy má za následek zvýšenou hydrataci stromatu, t.j. rohovka nasává komorovou vodu přes endotel do stromatu. Zvýšená rohovková hydratace se dá změřit jako zvýšená tloušťka rohovky na oku živého experimentálního zvířete přesně pachymetrem, a tak vyhodnotit vliv škodliviny na rohovku. Pro kvantitativní vyhodnocení vlivu škodliviny je výhodná jednoduchá, ale přesná metoda spektrofotometrická, která se provádí na rohovce enukleovaného oka po zabití experimentálního zvířete. Tato nová metoda kvantitativně vyhodnotí změnu absorpčních vlastností rohovky, t.j. zda škodlivina způsobí pouze změny hydratace, anebo též změny chemických a optických vlastností rohovky.

9 9 9 «9*9

* · ♦ * * * 9

9

Pro spektrofotometrické měřeni absorpčních vlastností rohovky se vykrojí z centra rohovky jejich středy o průměru 4-8 mm, s výhodou cca 6 mm a vloží se do kyvety z křemenného skla vybavené zvláštní vložkou. Vložka sestává z dvou plexisklových krycích destiček s otvorem velikostí odpovídajícím vykrojenému středu rohovky, mezi kterými je umístěna měřená rohovka v kruhovém výkroji o témže průměru, provedeném v destičce z nerezového plechu. Nerezový plech (destička) je po obou stranách překryt křemenným krycím sklíčkem. Tloušťka nerezového plechu odpovídá tloušťce rohovky, která musí být před spektrofotometr] ckou analýzou změřena. Je třeba proto mít k dispozici řadu vložek s rostoucí tloušťkou plechu pro případy zvyšující se hydratace rohovky, která se projevuje její zvyšující se tloušťkou. Celá vložka (sestava) vkládaná do kyvety je zatopená v PBS, s výhodou v 340 mOsm kg'¹ PBS, ve kterém se nejméně mění vodní poměry v rohovce. Zatopení se musí provést pečlivě, aby nikde nedošlo ke vzniku vzduchových bublin negativně ovlivňujících přesnost měření. Měřící paprsek spektrofotometru vstupující do kyvety koncentricky prochází otvorem přední plexisklové destičky, křemenným sklíčkem, dále vstupuje epiteliální stranou do středu rohovky, prochází zadním krycím sklíčkem a otvorem v zadní plexisklové destičce opouští křemennou kyvetu. Nákres sestavy do kyvety pro spektrofotometrické měření je na obr. 1.

Předmětem předloženého vynálezu je dále vložka do kyvety k provádění způsobu podle vynálezu, která sestává z dvou plexisklových krycích destiček s otvorem velikostí odpovídajícím vykrojenému středu rohovky, mezi kterými je umístěna destička z nerezu s kruhovým výkrojem o témže průměru, přičemž po obou stranách destičky z nerezu mezi destičkou z nerezu a plexisklovými krycími destičkami jsou uspořádána křemenná krycí sklíčka, přičemž tloušťka destičky z nerezu odpovídá tloušťce rohovky v jejím středu.

Spektrofotometrem měříme absorpční vlastnosti rohovky v rozsahu vlnových délek 300-650 nm. Měření se vyjádří jako funkce absorbance, resp. transmitance v závislosti na vlnové délce.

Absorbance A = A (λ), resp. transmitance T = T (λ).

Pro absorbanci platí vztahy

A = -logT

A = a . d,

···· ·· 44 4·«« · · · • · · 4 4 · · 4 4 4 « * «4 « 4 44 * *· ·♦ 44 · kde a [mm'¹] je koeficient absorpce a d [mm] je tloušťka rohovky.

Absorbanci a transmitanci lze opatřit indexy N a E odpovídající rohovce normální (standardu) a rohovce experimentální (po aplikaci analyzované látky).

Pro odlišení vlivu analyzované látky na změnu hydratace a na změnu chemických a optických vlastností rohovky, se vynese závislost koeficientu absorpce jako funkce vlnové délky.

a = a (λ) α = Α.ά·’ (vzorecč. 1)

Protože koeficient absorpce není závislý na tloušťce rohovky, vyjadřuje tato závislost vliv chemických a optických vlastností rohovky na absorpci.

Porovnáním výše popsaných závislostí pro normální oko (N) a pro oko po aplikaci analyzované látky (E) lze tyto změny chemických a optických vlastnosti rohovky kvantifikovat.

Zvýše popsaného je tedy patrné, že toxicita určité látky se posoudí kvantitativně (i kvalitativně). O tom, že jsou porušeny normální vlastnosti rohovky svědčí změna její tloušťky, změna rohovkové hydratace, obvykle ve smyslu zvýšené tloušťky, hydratace. Tloušťka rohovky a tedy i hydratace však může být i snížená v případě a to v případě, že noxa z rohovky tekutinu odsaje. Tloušťka rohovky se může vyhodnocovat pachymetrem již během aplikace noxy. Pro spektrofotometríckou metodu je však nezbytné, aby se tloušťka rohovky změřila vždy před spektrofotometrickým vyhodnocením, protože pomocí tloušťky rohovky a průběhu absorbance resp. transmitance (získaných ze spektrofotometrického měření) lze získat průběh absorpčního koeficientu jako funkce vlnové délky (viz vzorec č. 1).

Popis výkresů:

Obr. 1 znázorňuje rozloženou sestavu vložky do kyvety pro spektrofotometrické měření. Obr. 2 znázorňuje průběh absorbance a transmitance při spektrofotometrickém měření podle příkladu provedení vynálezu.

Příklad provedení vynálezu

Jako příklad uvádíme vliv zředěné kyseliny a louhu na rohovku, O,1M HCI a O,1M NaOH.

«φφφ ·Φ • · φφφφ

Popis pokusu: Bylo použito 6 králíků (Novozélandský bílý, 2,5-3,0 kg). U tří králíků na obě rohovky byla kapána slabá kyselina (0,lM HC1) a na rohovky dalších tři králíků byl kapán zředěný louh (O,1M NaOH). Kapalo se vždy 10 kapek po dobu 1 minuty, 1 x denně po dobu dvou dnů. Třetí den byli králíci zabiti, oči enukleovány, rohovky vystřiženy a vyšetřeny spektrofotometricky, jak bylo popsáno. Během celého pokusu byly vyšetřovány hladiny rohovkové hydratace pomocí pachymetru a to tak, že rohovkové hydratace na každém oku byly změřeny před začátkem pokusu a poté vždy 1. den až 3. den pokusu.

Měření pachymetrem: K měření středové rohovkové tloušťky a tedy i její hydratace (normální tloušťka rohovky u králíka Novozélandský bílý je cca 0.4 mm), změny od této hodnoty značí změny hydratace rohovky. K měření hydratace rohovky jsme použili pachymetr SP 100 od fy. Tomey, Technology and Vision, Japan. Tento pachymetr měří tloušťku rohovky tak, že se přiloží jemná sonda přístroje ke středu vnějšího povrchu rohovky. Měření se opakuje 4x a přístroj vyhodnotí jednotlivá měření, jejich průměr a odchylku. Oba roztoky způsobily zvýšenou tloušťku rohovky (méně HCI, více NaOH).

Poté bylo s rohovkami provedeno spektrofotometrické měření. Pro měření byla použita kyveta s vložkou podle vynálezu, která je zobrazena na obr. 1. Na stůl byla položena krycí destička 1 se zářezem směrem nahoru. Bylo přiloženo sklíčko z křemenného skla 2. Na sklíčko byla položena nerezová vložka 3, do kruhového otvoru nerezové vložky byl položen kruhový výřez ze středu rohovky o stejném průměru, přičemž tloušťka nerezové vložky musí odpovídat tloušťce rohovky měřeno v jejím středu, následně bylo přiloženo křemenné sklíčko 4. Vše bylo překryto krycí destičkou z plexiskla 5. Při manipulaci bylo vše zakapáváno 340 mOsm kg'¹ PBS, aby nikde nevznikla bublina. Celá sestava pak byla vložena do kyvety, která byla předem zatopena 340 mOsm kg'¹ PBS. Měřeno bylo tak, aby paprsek pronikal do rohovky z epiteliální strany. Králičí rohovka má následující vstvy: epitel, stroma, endotel.

Spektrofotometrem HELIOS b 84021 v4.55, Spectronic Unicam, Cambridge, UK, s vlnovým rozlišením 1 nm jsme měřili absorpční vlastnosti rohovky v rozsahu vlnových délek 190-650 nm. Křivky průměrných hodnot transmitance a absorbance ukazuje obr. 2. Protože měření na spektrofotometru v rozmezí 190-300 nm je nepřesné, jedná se o tzv. instrumental stray light error, bereme v úvahu - pro přesnost - měření až od 300 nm.

Ze spektrofotometrických křivek je patrné, že oba roztoky byly pro rohovku toxické, méně 0,lMHCI, více 0,lMNaOH.

···· 99 tt ΜΗ Μ 9« • ♦ · *« 9 9 9 9 9

4 4 4 9 9 «4*9 ·· «49 9 *99 * 9·· ···· 94·φ · 9 9 ·· ·· ·· 4» 99 99

Statistické vyhodnocení:

Spektrofotometrie 300 nm (UVB):

Neparametrický t-test (Mann Whitney): pro HC1 vs. normály: nesignifikantní (p=0.5645). Neparametrický t-test (Mann Whitney) : pro NaOH vs. normály: velmi signifikantní (p=0.0012).

Dunnův test mnohonásobného porovnávání: HC1 vs. normály : nesignifikantní (P>0.05) NaOH vs. normály: velmi signifikantní :**P<0.001

Nepárový Welchův test pro HC1 vs. normály: velmi signifikantní (p=0.0087).

Nepárový Welchův test pro NaOH vs. normály: velmi signifikantní (p=0.0066).

Spektrofotometrie 550 nm (VIS):

Dunnův test mnohonásobného porovnávání: HCI vs. normály : nesignifikantní (P>0.05) NaOH vs. normály: velmi signifikantní :***P<0.001

Neparametrický t-test (Mann Whitney) pro HCI vs. normály: signifikantní (p=0.0101). Nepárový Welchův test pro NaOH vs. normály: velmi signifikantní (p=0.0028).

Rohovkové tloušťky

Pro statistiku byly užity následující testy: Párový Wilcoxonův test, Mann-Whitneyův test, nepárový Welchův test a t-test.

HCI, 1. den vs. 3. den: nesignifikantní,

NaOH 1. den vs. 3. den: velmi signifikantní.

Průmyslová využitelnost

Nový způsob testování lokální toxicity využívá oka experimentálního zvířete, např. králíka a testuje vliv škodliviny na rohovku. Z hlediska posuzování lokální toxicity pro oftalmologii rohovka má prvořadý význam pro vidění. Předností tohoto způsobu testování z obecného hlediska lokální toxicity je, že se změny rohovky vyhodnotí i kvantitativně, a to rychle a přesně navrhovanou spektrofotometrickou metodou.

Claims

1. Způsob měření lokální toxicity látek, vyznačený tím, že se látce vystaví rohovka oka zvířete a změří se změna tloušťky rohovky a popřípadě také absorpčních vlastností rohovky.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se změna tloušťky rohovky změří pachy metrem.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačený tím, že se změna absorpčních vlastností rohovky měří spektrofotometricky, s výhodou v rozsahu vlnových délek 300-650 nm.

4. Způsob podle nároku 3, vyznačený tím, že se vykrojí z centra rohovky jejich středy o průměru 4 - 8 mm, s výhodou o průměru 6 mm, a vloží se do vložky sestávající z dvou plexisklových krycích destiček s otvorem velikostí odpovídajícím vykrojenému středu rohovky, dvou křemenných krycích sklíček a destičky z nerezu s kruhovým výkrojem, přičemž se umístí měřená rohovka do kruhového výkroje o témže průměru, provedeného v nerezové destičce, přičemž tloušťka destičky z nerezu odpovídá tloušťce rohovky v jejím středu, načež je destička z nerezu po obou stranách překryta křemenným krycím sklíčkem a vložena mezi dvě plexisklové krycí destičky, načež se celá vložka vloží do kyvety, která se zatopí PBS, a poté se provede spektrofotometrické měření, při němž měřící paprsek spektrofotometru vstupující do kyvety koncentricky prochází otvorem přední plexisklové destičky, křemenným sklíčkem, dále vstupuje epiteliální stranou do středu rohovky, prochází zadním krycím sklíčkem a otvorem v zadní plexisklové destičce opouští křemennou kyvetu.

5. Vložka do kyvety k provádění způsobu podle nároku 4, vyznačená tím, že sestává z dvou plexisklových krycích destiček s otvorem velikostí odpovídajícím vykrojenému středu měřené rohovky, mezi kterými je umístěna destička z nerezu s kruhovým výkrojem o témže průměru, přičemž po obou stranách destičky z nerezu mezi destičkou z nerezu a plexisklovými krycími destičkami jsou uspořádána křemenná krycí sklíčka, přičemž tloušťka destičky z nerezu odpovídá tloušťce měřené rohovky v jejím středu.