SU1617377A1 - Способ оценки повреждающего действи веществ, контактирующих с роговицей - Google Patents

Abstract

Изобретение относитс  к области медицины - офтальмологии и может быть использовано при исследовании новых ирригационных и влагозамещающих растворов, а также изучении биологических свойств полимеров, используемых дл  интраокул рной и контактной коррекции. Цель изобретени  - повышение точности способа за счет увеличени  его физиологичности. Способ состоит в инкубации препарата роговицы с исследуемым веществом и регистрации скорости окислени  восстановленных пиридиновых нуклеотидов (НАДН или НАДФ Н), добавленных в среду инкубации. Скорость окислени  регистрируют флюорометрически или спектрофотометрически, и по ее величине оценивают степень повреждающего действи  вещества. Способ позвол ет исследовать биологическое действие на роговицу материалов и препаратов, используемых в фармакологии.

Description

., Изобретение относитс  к офтальмо- ,логии и может быть применено при исследовании новых ирригационных и влагозамещающих растворов, а также изучении . биологических свойств полимеров, используемых дл  интраокул рной и контактной коррекции.

Цель изобретени  - увеличение точности способа за счет повышени  его физиологичрости,

Способ осуществл етс  следующим образом.

Используют роговицу кроликов сам- цов породы шиншилла весом в среднем 2,0 кг. После забо  животных глаза сразу же знуклеируют, а затем из глаз

выдел ют с-помощью трепана центральный диск роговицы диаметром 7,7 мм. Роговичный диск помещают на дно инкубационной кюветы э щотелием вверх в сре,цу, содержащую 2,0-3,0 мл 0,9%-но- го физиологического (NaCl) или исследуемого нлагозамещающего раствора, содержащего тестируемый агент. Процедура вьщелени  роговицы занимает 8- 15 мин с момента забо  животного до получени  готового исследуемого образца . Инкубацию роговицы провод т при комнатной температуре. Поддерживают нейтральньп 7j0-7,3 показатель рН среды. Кинетику окислени  экзогенных пиридиновых нуклеотинов (НАДН

а

со

:i

,йли НАРФН), добавленных в среду с ioмeнтa начала инкубации роговицы в 1|:онцентрации , измер ют флюоресцентным способом (возбуждбние при 360 нм, регистраци  при длине волны максимума испускани  460 нм). Все флюоресцентные измерени  выполн ют на спектрофлюориметре. Дл  снижени  вли ни  возможных оптических артефактов флюоресценцию возбуждают узким пучком совета (1-3 мм), направленным вдоль Передней (обращенной к регистрирую- ,1|1ему монохрома тор у) стенки кварцевой : ювьты. По увеличению скорости оки- .елени  пиридиновых нуклеотидов (ско- $)ости спада интенсивности флюоресценции ) суд т о степени повреждени  роговицы . За скоростью окислени  нуклеотидов можно следить и спектрофотомет- I |5ически при 340 нм.

П р и м е р Т. Проводили исследование поверждающего действи  на рого- Ьицу 0,9%-ного физиологического раствора .

Роговицу кролика вьщелили из глаза . При помещении роговицы кролика в 0,9%-ный физиологический раствор в течение первых 10 мин увеличивалась интенсивность флюоресценции раствора В том случае, если роговица после извлечени  из глаза предварительно инкубировалась в течение 20 мин в физиологическом растворе, не содержащем НАДН, в результате ее значи- тельного повреждени  к этому времени в окружающей среде накапливались вещества , обладающие НАДН-дегидрогеназ ной активностью. Добавка пиридиновог нуклеотида на 20 мин инкубации ткани немедленно приводила к увеличению. НАДН-окислительной активности роговицы и одновременному снижению интенсивности исходного уровн  флюоресценции . Указанна  экспериментальна  кинетика окислени  НАДН полностью соответствует ожидаемой.

П р и м е р 2. Исследование действи  ра роговицу сбалансированного солевого раствора о

При инкубации изолированной роговицы кролика в среде, содержащей сбалансированный солевой раствор, и добавлении пиридиновых нуклеотидов отмечалс  менее выраженный двухфазный характер изменени  интенсивности флюоресценции раствора. Таким образо сбалансированньй солевой раствор

ограничивает осмотическое повреждение ткани роговицы.

П р и м е р 3, Исследование действи  на роговицу влагозамещающего раствора - таурина (тауфона),

Известно, что указанный раствор (0505%, рН 7,2) благопри тно вли ет на процессы регенерации при повреждении задных слоев роговицы с формированием тонкого рубца. Данные, полученные при помещении изолированной роговицы кролика в раствор тауфона, свидетельствовали о предотвращении повреждени  мембран клеток роговицы. Указанный эффект про вл лс  в равной степени и на снижении уровн  выхода флюоресцирующих субстратов из ткани роговицы, и на снижении их НАДН-оКи- слительной активности.

Пример 4. Исследование действи  на роговицу карнозина (/3- аланил-1-гистидина), 10 мМ раствора, рН 7,2-7,3.

Установлено, что репаративные процессы в ткан х, транспорт ионов Са 5 Na, К и реакции окислительного фосфорилировани  после предварительного их нарушени , вызванного повреждающими воздействи , протекали на более благопри тном уровне в присутствии гистидиноБьк депептидо в силу сохранени  дипептидами физиологических свойств мембран и уменьшени  утечки ионов. Целью исследовани  действи  карнозина - природного соединени  гистидиновых дипептидов, на нарушение барьерных свойств.мембранных структур клеток роговицы кролика было определение возможности использовани  карнозина в клинике ка влагозамещающего раствора. В присутс . ВИИ карнозина (10 мМ) сравнительно с физиологическим раствором отмечалс  существенный зашдтный эффект на ранних стади х повреждени  клеточных структур роговицы. Оё этом свидетельствуют незначительные изменени  флюоресценции экзогенного НАДН (т..е. наличие малой скорости его окислени ) , присутствующего в среде инкубации роговицы.Таким образом,карнозин можно реко мендовать дл  дальнейших испытаний ка к вещество, защищающее роговицу от повреждающих воздействий и перспективное дл  апробации в клинике в виде влагозамещающего раствора-.

Пример 5. Изолированную ткань роговицы, инкубировали в растворе HuPi (), содержащем НАДФН (5« ) сбалансированньШ раствор Хэнк са. Кинетику окислени  НАДФН регистри ровали по снижению оптической плотности поглощени  при длине волны 340 нм на спектрофотометре ShimadzXi UV-260. Через Т5-20 мин инкубации отмечали зна1чительный спад поглощени  (от 0.80 и 0,68) отбираемых проб инкубационной среды. Снижение величины оптической плотности при 340 нм раствора, содержащего НАДФН, свидетельствовало об освобождении водорастворимых ферментов (например, глутатион-редукта- зы), обладающих НАДФГ-дегидрогеназной активностью, из ткани роговицы.

Предлагаемьй способ позвол ет по сравнению с прототипом повысить точность способа за счет повышени  его физиологичности,

Применение способа обеспечивает метаболический контроль роговицы на ранних этапах ее повреждени  агентом, что позвол ет повысить точность тестировани  агента. Предлагаемьй способ дает возможность изучать механизм i и последовательность био- Лпчических реакций, привод щих к отеку роговицы и потере ее прозрач16

10

5

7377. .

ности. Способ позвол ет осуществл ть выбор биологических соединений, способных защищать эндотелий роговицы от повреждени , указывать оптимальный состав ирригационных жидкостей и вла- гозамещающих растворов, изучать биологические свойства полимерных материалов , используемых в офтальмологии. Пр мее и продолжительное определение редокс-состо ни  НЛ/Щ в среде инкубации роговицы позвол ет количественно судить об активности процессов, происход щих при токсических воздействи х на роговицу.

15

Claims (1)

1. Формула изобретени  Способ оценки повреждающего действи  веществ , контактирующих с роговицей , включающий добавление исследуемого вещества в среду инкубации препарата изолированной роговицы и регистрацию окислительно-восстановительных реакций в среде инкубации, от.личающийс  тем, что, с целью увеличени  точности способа за счет повышени  его физиологичности, в среду инкубации дополнительно ввод т раствор восстановленного пиридинового нуклеотида и регистрируют скорость его окислени , по которой оценивают степень повреждающего действи ,