CZ200441A3

CZ200441A3 - Způsob navrhování struktury léčiv pro identifikaci inhibitorů D@Ala@D@Ala ligasy jakožto antibakteriálních léčiv

Info

Publication number: CZ200441A3
Application number: CZ200441A
Authority: CZ
Inventors: Naviaámanuel; Alaápauláj; Griffithájamesáp; Aliájanidáa; Faermanácarlosáh; Moeáscottát; Mageeáandrewás; Connellyápatrickár; Perolaáemanuele
Original assignee: Plivaád@Ád
Priority date: 2001-06-28
Filing date: 2002-06-28
Publication date: 2004-08-18
Also published as: HUP0600158A2; US20070207512A1; YU102403A; CN1268765C; EP1412516A2; CA2451837A1; EE200400044A; IL159539A0; CN1539020A; EA007612B1; US20030119061A1; EP1412516A4; BG108549A; WO2003002063A3; SK282004A3; EA200400093A1; PL367484A1; MXPA04000157A; WO2003002063A2; BR0211312A

Description

Předmětný vynález se týká způsobů identifikace nových léčiv, konkrétně pak způsobů identifikace nových sloučenin, které inhibují D-Ala-D-Ala ligasu, což je enzym, který hraje zásadní roli při vytváření bakteriálních buněčných stěn.

Dosavadní stav techniky

Je prokázáno, že sloučeniny, které inhibují biosyntézu bakteriální buněčné stěny jsou účinnými antibiotickými činidly. Tak například inhibitor racemasy fluor-D-alanin, který brání tvorbě D-alaninu, a β-laktamová antibiotika, která inhibují transpeptidaci, inhibují syntézu buněčné stěny a bakteriální růst (viz. publikace Parsons a spolupracovníci,

J. Med. Chem., 1988, 31, 1772-1778). Nicméně výskyt bakteriálních kmenů rezistentních k léčivům, který lze pozorovat v posledních letech, je příčinou toho, že stále existuje poptávka po nových širokospektrálních antibiotikách.

Mezi enzymy zodpovědnými za biosyntézu buněčné stěny hraje důležitou roli D-alanyl-D-alaninligasa (dále jen „D-Ala-D-Ala ligasa; E.C. 6.3.2.4), protože tento enzym syntetizuje unikátní dipeptid D-alanyl-D-alanin (dále jen „D-Ala-D-Ala). Tento dipeptid je nakonec inkorporován do jednotlivých peptidoglykanových řetězců, ve kterých poskytuje vazebná místa pro transacylaci během síťování peptidoglykanu, což je poslední stupeň syntézy buněčné stěny (viz. publikace • · • 9 9 ·

9 9 9 9 99

9999 9 9 9 9

99 9 9 9 9 9 9 9 ·

Ellsworth a spolupracovníci, Chemistry & Biology, 1996, 3, 3744) .

Byla vyslovena hypotéza, že inhibitory, které brání syntéze a inkorporaci D-Ala-D-Ala do buněčné stěny, jsou účinnými antibiotiky, protože mohou způsobovat bakteriální lýzu. Inhibitory D-Ala-D-Ala ligasy mohou být vysoce selektivními širokospektrálními antibiotiky s poměrně malými nežádoucími vedlejšími účinky, protože D-Ala-D-Ala ligasa je vysoce zakonzervována mezi prokaryoty a není přítomná v lidském organismu.

D-Ala-D-Ala ligasa je vícedoménový protein, který obsahuje dvě vazná místa, z nichž jedno slouží pro vázání ATP a druhé pro vázání D-Ala-D-Ala. Až dosud však nebyly identifikovány inhibitory, které by se vázaly k D-Ala-D-Ala ligase v místě, ve kterém dochází k vázání ATP.

Podstata vynálezu

Vynález je částečně založen na zjištění, že některé malé sloučeniny se mohou vázat k místu D-Ala-D-Ala ligasy, ve kterém dochází k vázaní ATP, a to dokonce i v nepřítomnosti uvedeného enzymového substrátu, a mohou tak způsobit konformační změnu ve struktuře enzymu, která je podobná konformační změně, k níž dochází po navázání ATP a substrátu k enzymu. Bez vazby na jakoukoli teorii se předpokládá, že uvedená konformační změna je vyžadována buď pro aktivaci nebo inhibici uvedeného enzymu. Informace získaná z tohoto poznatku umožnila identifikaci klíčových interakcí v aktivním místě • · · ··· ··· • · φ φ · · · · φ φφφ

3· ······ · · φφφ Φ···· φ φ φφφφ Φ·· φφφ · φφ φφ φφ φ uvedeného enzymu a navrhování a optimalizaci struktury inhibitorů.

V jednom provedení se předmětný vynález týká způsobu odhadu potenciálu chemické entity asociovat se s molekulou nebo molekulárním komplexem zahrnujícím vazebnou doménu definovanou strukturními koordinátami aminokyselin Lysl44, Glul80, Lysl81, Leul83, Glul87, Asp257 a Glu270 D-Ala-D-Ala ligasy bakterie E. coli podle obrázku 8; nebo s homologem uvedené molekuly nebo molekulárního komplexu, přičemž uvedený homolog zahrnuje vazebnou doménu, jejíž směrodatná odchylka od atomů tvořících základní řetězec uvedených aminokyselin není větší než 10 Á. Uvedený způsob zahrnuje jeden nebo více z následujících stupňů, výhodně pak všechny tyto stupně:

(1) použití prediktivní metody (například počítačového programu nebo jiného výpočetního prostředku) pro provedení operace vložení uvedené chemické entity do vazebné domény definované jako strukturní koordináty aminokyselin Lysl44, Glul80, Lysl81, Leul83, Glul87, Asp257 a Glu270 D-Ala-D-Ala ligasy bakterie E. coli ± standardní odchylka od atomů tvořících základní řetězec uvedených aminokyselin nepřevyšující 10 Á; a (2) analýzu výsledků uvedené operace za účelem kvantifikace asociace mezi uvedenou chemickou entitou a uvedenou vazebnou doménou.

V dalším provedení se předmětný vynález týká způsobu identifikace potenciálního inhibitoru D-Ala-D-Ala ligasy. Uvedený způsob zahrnuje následující stupně: použití polohy nebo struktury Lysl44, Glul80, Lysl81, Leul83, Glul87, Asp257 a Glu270 D-Ala-D-Ala ligasy bakterie E. coli podle obrázku 8 • · » · • · (např. použití atomových koordinát těchto aminokyselin) ± standardní odchylky od atomů tvořících základní řetězec uvedených aminokyselin nepřevyšující 10 Á pro vytvoření trojrozměrné struktury vazebné domény D-Ala-D-Ala ligasy;

(2) použití uvedené trojrozměrné struktury pro návrh nebo výběr potenciálního inhibitoru (např. pro návrh nebo výběr inhibitoru, jenž uspokojuje požadavky dané charakterem fyzikálních interakcí definovaných shora uvedenými aminokyselinami a/nebo jinými aminokyselinami nacházejícími se v enzymu na místě, kde dochází k vázání kosubstrátu, přičemž uvedené interakce mohou být podobné předem vybranému nebo referenčnímu charakteru interakcí, jako jsou interakce, ke kterým dochází po navázání D-alaninu nebo jinému substrátu nebo po navázání kosubstrátu k enzymu). Ve výhodném provedení uvedený způsob dále zahrnuje jeden nebo oba z těchto stupňů: (3) syntézu nebo získání daného inhibitoru; a (4) kontaktování uvedeného inhibitoru s D-Ala-D-Ala ligasou za účelem stanovení schopnosti uvedeného potenciálního inhibitoru inhibovat D-Ala-D-Ala. Uvedený stupeň použití může případně zahrnovat navržení takové sloučeniny, která při vložení do uvedené trojrozměrné struktury bude obsahovat donor pro vytvoření vodíkové vazby ve vzdálenosti od 2,4 Á do 3,5 Á od jednoho nebo obou atomů kyslíku karboxylátové skupiny Glul80, jež je součástí postranního řetězce, donor pro vytvoření vodíkové vazby ve vzdálenosti od 2,4 Á do 3,5 Á od amidového atomu kyslíku Lysl81, jenž je součástí základního řetězce, akceptor pro vytvoření vodíkové vazby ve vzdálenosti od 2,4 Á do 3,5 Á od amidového atomu dusíku Leul83, jenž je součástí základního řetězce, donor pro vytvoření vodíkové vazby ve vzdálenosti od 2,74 Á do 3,5 Á od amidového atomu kyslíku Leul83, jenž je součástí základního řetězce, a akceptor pro vytvoření vodíkové .2 • · • · « • · » · · · · · vazby ve vzdálenosti od 2,4 Á do 3,5 Á od atomu dusíku Lysl44, jenž je součástí postranního řetěz;ce. Daná sloučenina může dále zahrnovat hydrofobní interakce ve vzdálenosti 3,5 až 4,5 A od atomu uhlíku CDI a atomu síry SD postranního řetězce Leu269, respektive Metl54. Potenciální inhibitor podle tohoto vynálezu může rovněž být bisubstrátovým analogem (například analogem, jenž se může vázat k uvedenému enzymu jak v místě, kde dochází k vázání ATP, tak v místě, kde dochází k vázání D-Ala).

V dalším provedení se předmětný vynález týká způsobu identifikace potenciálního inhibitoru D-Ala-D-Ala ligasy nebo homologu D-Ala-D-Ala ligasy. Uvedený způsob zahrnuje následující stupně: (1) návrh nebo výběr sloučeniny, která způsobí přiblížení Ilel42 D-Ala-D-Ala ligasy nebo jeho protějšku v homologu na vzdálenost 12 A od Met259 D-Ala-D-Ala ligasy nebo jeho protějšku v homologu a přiblížení Metl54 D-Ala-D-Ala ligasy nebo jeho protějšku v homologu na vzdálenost 12 Á od Leu269; (2) syntézu nebo získání uvedeného inhibitoru; (3) kontaktování uvedeného inhibitoru s D-Ala-D-Ala ligasou za účelem stanovení schopnosti uvedeného potenciálního inhibitoru inhibovat D-Ala-D-Ala.

Pokud není uvedeno jinak, mají všechny technické a vědecké výrazy použité v tomto textu význam běžný pro odborníka v dané oblasti techniky. Ačkoli je při praktickém užití předmětu tohoto vynálezu nebo provádění testů podle předmětného vynálezu možné použít metody a materiály podobné nebo ekvivalentní k metodám a materiálům popsaným v tomto textu, jsou dále v textu popsány vhodné metody a materiály pro uvedený účel.

Obsah všech publikací, patentových přihlášek, patentů a • · · · · · · • · · * · 4 • 4··· 4 44*

44 444 44444 dalších citovaných materiálů je zahrnut v tomto textu jakožto odkazový materiál. V případě jakéhokoli rozporu je rozhodující znění tohoto popisu, včetně definic v něm uvedených. Kromě toho, materiály, metody a příklady popsané v tomto textu je třeba považovat jen za ilustrativní a ne omezující z hlediska rozsahu tohoto vynálezu.

Další aspekty předmětného vynálezu a výhody spojené s tímto vynálezem budou zřejmé z následujícího podrobného popisu a ze znění patentových nároků.

Popis obrázků na výkresech

Na obrázku 1 je zobrazena hypotetická struktura D-Ala-D-Ala ligasy při absenci substrátů a/nebo kofaktorů, která byla vytvořena na základě krystalografických údajů a která ukazuje vzájemnou polohu vazebných míst ATP a D-Ala-D-Ala a čtyř proteinových domén.

Na obrázku 2 je zobrazena superpozice krystalické struktury D-Ala-D-Ala ligasy, která je komplexována buď samotným ATP, nebo ADP, fosfátem a D-Ala-D-Ala, jak je vyznačeno červeným, respektive žlutým vyobrazením. Šipky na obrázku označují směr otáčení rigidní části domény B při přechodu z prvně zmíněné struktury na druhou.

Na obrázku 3 je schématicky zobrazena konformační změna, ke které by podle předpokladů mělo docházet během reakce enzymu po navázání ATP nebo inhibitoru k D-Ala-D-Ala ligase v místě, kde dochází k vázání ATP. Na uvedeném schématu odpovídá struktura (E) nevázanému enzymu, struktura (El) odpovídá • · • · · 4 4 4 · « 4

4<4 4 · 4 4 4 4 444

44444« 44 «4« «4444

4 4 4 4 4 «44 «44 4 4 4 44 4« 4 modelu počátečního komplexu enzymu a inhibitoru a struktura (El*) odpovídá krystalické struktuře enzymu po inhibitorem vyvolané konformační změně.

Na obrázku 4 jsou znázorněny alespoň některé z klíčových elektrostatických (a) a hydrofobních (b) interakcí mezi zbytky aktivního místa enzymu a inhibitoru, které vyvolávají konformační změnu ligasy. Přerušované čáry odpovídají vodíkovým vazbám, které se tvoří mezi zakonzervovanými aminokyselinovými zbytky proteinu a daným inhibitorem. Aminokyselinové zbytky znázorněné na obrázku (b) participují na van der Waalsových interakcích s inhibitorem.

Na obrázku 5 je znázorněn graf závislosti rychlosti vázání ligasy na koncentraci ATP, která byla měřena metodou stoppedf low.

Na obrázku 6 je graf závislosti zhášení fluorescence D-Ala-D-Ala ligasy na koncentraci ATP.

Obrázek 7 znázorňuje mapu interakcí, která byla vytvořena na základě krystalické struktury nového inhibitoru vázaného k D-Ala-D-Ala ligase.

Obrázek 8 uvádí seznam atomových strukturních koordinát D-Ala-D-Ala ligasy kmene E. coli v komplexu s ADP, fosfátovým iontem a D-Ala-D-Ala, jak byly odvozeny na základě měření rentgenové difrakce krystalu tohoto komplexu.

Obrázek 9 uvádí seznam atomových strukturních koordinát D-Ala-D-Ala ligasy kmene E. coli v komplexu s AMPPNP, jak byly • · odvozeny na základě měření rentgenové difrakce krystalu tohoto komplexu.

Na obrázku 10 jsou uvedeny do tabulky zpracované sekvence 51 různých D-Ala-D-Ala ligas získaných z různých bakteriálních kmenů.

Charakterizace konformační změny

D-Ala-D-Ala ligasa je vícedoménový protein sestávající ze čtyř domén, jejichž rozhraní vytváří vazebná místa pro D-AlaD-Ala a ATP (viz. obrázek 1). Konformační změna byla pozorována tak, že byla stanovena struktura krystalu enzymu v komplexu s ligandy, které jsou kompetitivními inhibitory ATP; při biochemických testech pak bylo pomocí dvou kinetických studií potvrzeno, že k uvedené konformační změně skutečně dochází.

Strukturní metody pro identifikaci konformační změny

Konformační flexibilita enzymu byla nejprve identifikována porovnáním dvou struktur krystalů: (1) struktury krystalu enzymu v komplexu s ATP (El*) a (2) struktury krystalu enzymu v komplexu s ADP, fosfátem a D-Ala-D-Ala (EP). Superpozice těchto dvou struktur odhalila mírnou rotaci rigidní části domény B směrem k aktivnímu místu, ke které dochází při tvorbě komplexu enzymu s ADP, fosfátem a D-Ala-D-Ala (viz. obrázek 2). Z těchto výsledků lze usuzovat, že bod spojující doménu B se zbývající částí enzymu je velmi flexibilní a že doména B při navázání ligandů mezi rozhraní domén B a C pravděpodobně podléhá výraznému pohybu rigidní části. Znázornění sekvence

• · · · událostí, ke kterým dochází když se ligandy poprvé navážou k enzymu, a potenciální velikosti vyvolané konformační změny je uvedeno na obrázku 3, kde El znázorňuje předpokládanou strukturu počátečního komplexu.

Studie stopped-flow prováděné s ligasou

Bylo zjištěno, že po navázání ATP a ADP dochází k výraznému zhášení fluorescence a tento jev byl využit pro zkoumání mechanistických charakteristických rysů ligasy. Byly provedeny studie stopped-flow, které sloužily pro sledování vázání ATP a ADP k ligase. Tyto studie byly prováděny při teplotě 4 °C. Byl pozorován exponenciální průběh zhášení fluorescence, které bylo skončeno během méně než 20 milisekund. Pozorované rychlostní konstanty byly vyneseny do grafu v závislosti na koncentraci nukleotidu, čímž byl získán hyperbolický graf, ze kterého je patrné, že po počátečním vázání nukleotidu dochází ke konformační změně (viz. obrázek 5). Toto zjištění potvrzuje předešlé hypotézy týkající se ligasy, zejména pak tu hypotézu, že uvedený enzym podléhá konformačním změnám, které jsou důležitou a nedílnou součástí enzymatického mechanismu.

Uvedený enzym patrně spadá do kategorie „indikovaného přizpůsobení („induced fit).

Jak je znázorněno na obrázku 5, je počáteční kolizní komplex poměrně slabý na to, aby vytvořil komplex EA (otevřený komplex). Uvedený enzym podléhá konformační změně za vzniku částečně uzavřeného komplexu EA*. V případě ATP uvedená konformační změna zvyšuje afinitu 3,2-násobně na výslednou hodnotu Kd = 157 μΜ (celková afinita je výsledkem dvou disociačních konstant Kai a Kd2) s hodnotou disociační rychlostní • 0 0 • · • · · · **·· • ····♦· · 0

konstanty 126 s¹. ADP vykazuje podobnou hyperbolickou závislost, což je opět známkou mechanismu indukovaného přizpůsobení (tj. přítomnosti konformační změny, ke které dochází po navázání). V případě ADP uvedená konformační změna zvyšuje afinitu uvedeného nukleotidu k částečně uzavřenému komplexu na 7-násobek oproti afinitě k počátečnímu koliznímu komplexu, což vede k dosažení celkové hodnoty K_d ve výši 50 μΜ. Na základě těchto pozorování byla vyslovena hypotéza, že vytvoření více interakcí může zvýšit afinitu a tím stabilizovat uvedenou částečně uzavřenou formu. Za účelem disociace ligandu musí enzym relaxovat zpět do otevřené formy. Proto tedy afinita těchto inhibitorů pravděpodobně koreluje s poklesem hodnoty disociační rychlostní konstanty (tj. s poklesem hodnoty k₂) . Tak například ADP má k D-Ala-D-Ala ligase třikrát vyšší afinitu než ATP a má nižší hodnotu k₂, t j. k₂ = 72 s¹. V některých případech může být výhodné, pokud inhibitor vyvolá další konformační změnu, kterou je patrně uzavření omega smyčky domény D za vzniku zcela uzavřené formy enzymu.

Stopped-flow studie objasnily mechanismus, kterým ligasa váže ligand a potvrdily předchozí předpoklady, že k tomuto vázání dochází mechanismem „indukovaného přizpůsobení. Stanovení afinity vysoce afinitních inhibitorů (s nízkou nM) metodami rovnovážného vázání nebo metodami měření kinetiky enzymu ve statickém stavu by bylo obtížné. Proto mohou být studie stopped-flow jediným způsobem, jak je možné s určitou mírou spolehlivosti stanovit afinitu vysoce afinitních inhibitorů. Uvedené studie je možné provádět například pomocí metod popsaných J. F.Ecclestonem ve stati „Stopped-flow Spectrophotometric techniques, jež je součástí publikace Spectrophotometry and Spéctrofluorometry a Practical Approach, φ φ Φ· φ· φφφ φφφ φ φφφ φ φφφφ φ • φφφφφφ φφ φφφ φ φ φφφφ φ φφφ φ φφ φφ editoři D. A. Harris a C. L. Bashford, IRL Press, 1987, str. 137-164.

Fluorescenční titrace

Kromě stopped-flow experimentů je pro stanovení afinity nových sloučenin podle tohoto vynálezu k D-Ala-D-Ala ligase možné použít fluorescenční titrační studie ve statickém stavu. Tyto experimenty rovněž využívají inherentní zhášení fluorescence tryptofanu, které se projevují po navázání nukleotidu. Byla stanovena afinita ATP k ligase při teplotě 25°C (viz. obrázek 6) . Je pozoruhodné, že hodnota K_D vázání ATP je nižší než hodnota K_m, což zcela neočekávaně poukazuje na skutečnost, že rychlost omezující stupeň v mechanismu uvedené ligasy nastává až po vytvoření uvedených produktů. Tuto metodologii je možné použít pro charakterizaci potenciálních inhibitorů ligasy. Uvedené titrační experimenty je možné provádět například s použitím metod popsaných v publikaci Lohman, T. M. a Mascotti, D. P. „Nonspecific Ligand-DNA Equilibrium Binding Parameters Determined by Fluorescence Methods, Methods in Enzymology, 1992, 212, 425-458.

Proteolýzové experimenty

Byl vyvinut in vitro test pro sledování uzavření omega smyčky (tj. domény D). Uzavření omega smyčky je testováno proteolýzou. Při absenci ligandů je uvedený enzym štěpen trypsinem na dva menší fragmenty. Přítomnost ATP a fosfinátu vede k ochraně uvedeného enzymu před proteolýzou. Je známo, že uvedená směs stabilizuje uzavření omega smyčky, jak bylo demonstrováno krystalografickými studiemi. Samotný ATP nebo • · · · ♦ · · • · · ♦ « · • · · ·· · · · · • · · · · · · · ·«· • · « · 9 9 9 sloučeniny vázající ATP nejsou schopny uzavřít omega smyčku. Avšak v přítomnosti sloučeniny vázající se k enzymu v místě, kde dochází k vázání D-Ala, jako je fosfinát, dipeptid D-Ala-D-Ala nebo cykloserin, spolu s ATP, ADP nebo ATPgS dochází ke stabilizaci uzavření omega smyčky. Zcela neočekávatelně nepodporuje nehydrolyzovatelný analog ATP, kterým je AMPPNP, uzavření omega smyčky, což může být známkou slabé interakce v oblasti vázání fosfátu z hlediska uzavření omega smyčky. Byl syntetizován analog adenosinu, ve kterém byla fosfátová skupina nahrazena krátkým řetězcem, na jehož konci byla aminoskupina. Tato sloučenina je zajímavá ze dvou důvodů: podporuje uzavření omega smyčky v přítomnosti fosfinátu nebo cykloserinu a zároveň přivádí do oblasti vázání fosfátu skupinu, která zvyšuje afinitu uvedené sloučeniny. Tato sloučenina má 20-násobě větší afinitu než ATP (K_d = 300 μΜ).

Připravení sloučeniny, která je schopná podporovat uzavření omega smyčky, může vést až k získání inhibitoru s podstatně vyšší afinitou, tyto studie jsou rovněž důležité pro stanovení podmínek krystalizace při pH 7. Zdá se totiž, že při pH 7 může krystalovat pouze forma enzymu s uzavřenou omega smyčkou.

Charakterizace konformační změny

Struktury krystalů enzymu komplexovaného s použitými inhibitory zcela jasně odhalily dobře definovanou vazebnou doménu. Některé klíčové interakce mezi uvedeným proteinem a inhibitorem, které vyvolávají konformační změnu, jsou vyobrazeny na obrázku 4. Aminokyselinové zbytky zobrazené na

• · · β ·

0 0 ·

00000 •00 uvedeném obrázku jsou klíčovými aminokyselinovými zbytky aktivního místa enzymu, se kterými musí inhibitory interagovat aby byla vyvolána velká rotace rigidní části domény B směrem k uvedenému aktivnímu místu, jak je znázorněno na obrázku 3.

Tuto změnu lze rovněž popsat pomocí změn poloh jednotlivých aminokyselinových zbytků, jak je uvedeno v tabulce 1.

Tabulka 1 Změna intermolekulární vzdálenosti během konformačních změn - vzdálenost mezi zbytky ILE142 a MET259 a MET154 a LEU269 v hypotetickém modelu El a v krystalických strukturách El* a EP (uzavřená)

	Vzdálenost ILE142 a MET259	Vzdálenost MET154 a LEU269
El	17,4	13,5
El*	7,9	8,9
EP	7,0	8,5

Další aminokyselinové zbytky uvedeného aktivního místa, které byly cílem během procesu optimalizace struktury daného inhibitoru, jsou uvedeny níže. Tyto zbytky mohou potenciálně interagovat přímo s inhibitory prostřednictvím van der Waalsových interakcí a/nebo prostřednictvím vodíkových vazeb.

Byly studovány potenciální hydrofobní interakce s postranními řetězci těchto aminokyselinových zbytků:

ILE142

TRP182

LEU183

MET259

MET154

Dále byly zkoumány potenciální elektrostatické interakce s postranními řetězci (nebo atomy, jež jsou součástí základního řetězce, v případech, kdy je toto uvedeno) těchto aminokyselinových zbytků:

LEU269

PHE209.

GLU180

LYS181

LEU183

GLU185

LYS144

GLU187

LYS215

TYR212

SER150

GLU270

ASP257

LYS97

GLU148

ARG255

ASN272

SER94

GLU68 (skupina CO v (skupina NH v (skupina NH v základním základním základním řetězci) řetězci) řetězci)

Zbytek Interagující partneři postranního řetězce

Asp

Glu donory pro vytvoření vodíkové vazby donory pro vytvoření vodíkové vazby •··· ft ft • · • ftft • ftftftft

Arg

Lys

His

Pro

Val

Ala

Leu

Ile

Trp

Gin

Asn

Ser

Thr

Tyr

Phe

Gly

Cys akceptory pro vytvoření vodíkové vazby, aromatické kruhy akceptory pro vytvoření vodíkové vazby, aromatické kruhy donory pro vytvoření vodíkové vazby, akceptory pro vytvoření vodíkové vazby, aromatické kruhy, kladně nabité skupiny hydrofobní skupiny (alifatické, aromatické) hydrofobní skupiny (alifatické, aromatické) hydrofobní skupiny (alifatické, aromatické) hydrofobní skupiny (alifatické, aromatické) hydrofobní skupiny (alifatické, aromatické) hydrofobní skupiny (alifatické, aromatické), kladně nabité skupiny donory pro vytvoření vodíkové vazby, akceptory pro vytvoření vodíkové vazby donory pro vytvoření vodíkové vazby, akceptory pro vytvoření vodíkové vazby donory pro vytvoření vodíkové vazby, akceptory pro vytvoření vodíkové vazby donory pro vytvoření vodíkové vazby, akceptory pro vytvoření vodíkové vazby donory pro vytvoření vodíkové vazby, akceptory pro vytvoření vodíkové vazby, hydrofobní skupiny (alifatické, aromatické), kladně nabité skupiny hydrofobní skupiny (alifatické, aromatické), pozitivně nabité skupiny (nemá postranní řetězec) donory pro vytvoření vodíkové vazby, akceptory pro vytvoření vodíkové vazby

4 • 44 » donory pro vytvoření vodíkové vazby, hydrofobní skupiny (alifatické, aromatické)

Met

Postup optimalizace účinnosti inhibitoru

Byl vyvinut iterační postup pro zlepšení účinnosti sloučenin, které vyvolávají shora popsanou konformační změnu. Uvedený postup postupně využívá údaje získané na základě krystalografie proteinu, molekulárního modelování, chemických postupů a biochemických vlastností.

Krystalografie proteinu

Prvním stupněm uvedeného postupu je krystalizace a zjištění struktury krystalického enzymu v komplexu s ligandem, jenž vyvolává požadovanou konformační změnu. Vazebná doména nacházející se v blízkosti daného inhibitoru, se analyzuje a takto získané informace o její struktuře je možné následně použít pro návrh derivátů, jejichž struktura je přizpůsobena za účelem dosažení specifických interakcí s cílovými aminokyselinovými zbytky v uvedené katalytické doméně. Tento přístup je nejlépe ilustrován pomocí dvourozměrného znázornění krystalické struktury orientace nově vyvinutého inhibitoru, vázaného v aktivním místě D-Ala-D-Ala ligasy, jak je zobrazeno na obrázku 7.

Tato struktura identifikuje polohu 6 purinového kruhu jakožto nej lepší místo pro účinnou derivatizaci, zatímco polohy 2, 3 a 9 se zúčastňují rozhodujících interakcí s aminokyselinovými zbytky proteinu. Proto může derivát modifikovaný v poloze 6 interagovat s aminokyselinovými zbytky Glu270 a 187, « ·

9

9999 ·» ·· ·· 9

9 9 9 9 9 • · ··· · 9 9 9

9 9 999 9 9999

9 9 9 9 9 9

99 99 »

Aspl57, Lysl44 a 97 a dalšími, jak je popsáno v dalším odstavci.

Molekulární modelováni

Uvedenou strukturní informaci týkající se vazebné domény je možné použít také pro návrh optimalizovaných analogů prostřednictvím vytvoření a vkládání virtuálních knihoven sloučenin, které obsahují požadované jádro, do uvedené vazebné domény. Tak například na základě krystalografické informace znázorněné na obrázku 1 se vytvoří virtuální knihovny 6-substituovaných-2-aminopurinů, a to tak, že purinové jádro se kombinuje s komerčně dostupnými stavebními bloky. Výsledné struktury se následně vkládají do aktivního místa D-Ala-D-Ala ligasy a na základě vkládacího skóre se vybere soubor sloučenin, pro které se zjistí nadějné výsledky.

Jak již bylo zmíněno výše, uvedená krystalová struktura rovněž identifikuje sérii aminokyselinových zbytků v uvedené vazebné doméně, které by mohly být potenciálnímu cíly specifických interakcí, a to: Glu270 a 187, Aspl57, Lysl44 a 97 a další. Nové ligandy se navrhují tak, že se purinové jádro derivatizuje fragmenty o vhodné velikosti a vhodných chemických vlastnostech,a to tak aby docházelo ke specifické interakci s některým z uvedených aminokyselinových zbytků. Dané návrhy se následně vyhodnocují vložením výsledných derivátů do katalytické domény DDL. Stupně zahrnuté v postupu vygenerování a vkládání virtuální knihovny β-substituovaných purinů jsou popsány v příkladu 7. Tyto modelovací metody stanovují priority syntetického úsilí tím, že na jejich základě jsou vybráni nejnadějnější kandidáti pro syntézu, čímž je zvýšena • ··· • 9 · ···« · · účinnost celého procesu optimalizace struktury uvedených sloučenin.

Chemické postupy

Třetím stupněm uvedeného postupu je syntéza vytipovaných sloučenin. Shora popsané analogy, které byly vloženy do aktivního místa enzymu a byly na základě skóringu vytipovány pro syntézu, se připravují buď speciálními metodami nebo známými chemickými reakcemi, které jsou popsány v odborné literatuře. Virtuální knihovnu sloučenin, která byla popsána v oddíle Molekulární modelování, je možné vytvořit s použitím komerčně dostupných výchozích sloučenin nebo s použitím výchozích sloučenin popsaných v odborné literatuře. V případě, že jsou výchozí sloučeniny komerčně dostupné, tyto sloučeniny se zakoupí a použijí pro syntézu sloučenin, které byly na základě shora popsaného vkládání do aktivního místa enzymu vytipovány jako účinné inhibitory enzymu. V případě, že výchozí sloučeniny nejsou komerčně dostupné, ale je možné je syntetizovat podle postupů popsaných v odborné literatuře, se nejprve syntetizují tyto výchozí sloučeniny, a to pomocí metod popsaných v odborné literatuře nebo pomocí speciálních metod, a tyto sloučeniny se následně použijí pro syntézu chemických struktur vytipovaných na základě vkládání virtuálních knihoven sloučenin do aktivního místa enzymu.

Biochemické vlastnosti

Posledním stupněm postupu podle tohoto vynálezu je stanovení, zda nově syntetizované sloučeniny inhibují enzym a následné stanovení, zda vyvolávají požadovanou konformační • · • · změnu. Aktivní sloučeniny mohou být například souběžně testovány na aktivitu při in vitro testu a analyzovány pomocí proteinové krystalografie za účelem zahájení dalšího kola optimalizace.

Pro dekonvoluci, neboli identifikaci důležitých složek místa, ve kterém dochází k vázání ATP, se používají enzymologické studie. Bylo zjištěno, že největší podíl afinity pochází z adeninové části ATP a že fosfáty, zejména α-fosfát, ve skutečnosti afinitu narušují. Analýza může být provedena například pomocí testu ATPasy, jenž byl popsán v publikaci Duncan a spolupracovníci, Biochemistry, 1988, 27, 3709-3714.

Testy inhibice D-Ala-D-Ala ligasy

Inhibice D-Ala-D-Ala ligasy může být testována pomocí pyruvátkinasového/laktátdehydrogenasového (PK/LDH) testu popsaného v příkladu 2. Při procesu syntézy bakteriální buněčné stěny katalyzuje ligasa konverzi adenosintrifosfátu (ATP) na adenosindifosfát (ADP) současně s ligací dvou zbytků D-alaninu. Pyruvátkinasa (PK) poté regeneruje ATP z ADP vzniklého při tomto procesu, přičemž zároveň dochází ke konverzi fosfopyruvátu na pyruvát. Laktátdehydrogenasa (LDH) katalyzuje redukci pyruvátu na laktát konverzí NADH na NAD⁺. Monitorováním rychlosti produkce NAD⁺ je možné stanovit aktivitu D-Ala-D-Ala ligasy.

Bisubstrátové analogy

Bisubstrátové analogy, které se vážou nejen k místu D-Ala-D-Ala ligasy, ve kterém dochází k vázání ATP, ale rovněž • · k místu, ve kterém dochází k vázání D-Ala, jsou rovněž předpokládanými vhodnými sloučeninami, jež mohou být vytipovány postupem podle tohoto vynálezu. Takovéto analogy by obsahovaly části připomínající ATP a D-Ala, které by byly spojeny prostřednictvím flexibilního nebo rigidního řetězce (jako je například alkylová, alkenylová, alkinylová nebo polyaromatická spojovací skupina, nebo derivát nebo hybrid jedné nebo více z těchto skupin). Bisubstrátové analogy mohou vykazovat zvýšený účinek a/nebo specificitu pro D-Ala-D-Ala ligasy.

Testy antibakteriálního účinku

Sloučeniny podle předmětného vynálezu je možné s použitím standardních metod hromadně testovat na antibakteriální účinek.

Při příkladu jednoho z těchto testů, který je popsán v příkladu 5, se používá technika mikroředění živné půdy za účelem měření in vitro účinku sloučenin podle tohoto vynálezu proti dané bakteriální kultuře, přičemž pomocí tohoto testu je možné zjistit hodnoty minimálních inhibičních koncentrací (MIC).

Při obvyklém postupu je možné sloučeniny podle tohoto vynálezu hromadně testovat na antibakteriální účinek proti mnoha různým bakteriálním kmenům. Sloučeniny se testují na sílu a šíři účinků proti různým kmenům za účelem identifikace potenciálních vedoucích sloučenin. Uvedené sloučeniny se mohou hromadně testovat na bakteriostatický účinek (tj. na schopnost bránit růstu bakterií) a/nebo na bakteriocidní účinek (tj. na schopnost hubit bakterie).

• ·

Takto vybrané vedoucí sloučeniny mohou být dále optimalizovány, například změnou substituentů za vzniku odpovídajících derivátů. Uvedené deriváty se mohou připravovat po jednom nebo je možné je připravit pomocí metod paralelní nebo kombinatorické syntézy. Ve všech případech mohou být uvedené deriváty testovány pro zjištění údajů týkajících se vztahu mezi strukturou a účinností (SAR) dané sloučeniny, které mohou být dále použity pro další optimalizaci uvedených vedoucích sloučenin.

Metody optimalizace struktury sloučen za účelem dosažení inhibičního účinku na enzym

Jakmile je identifikován potenciální inhibitor (např. srovnáním účinku dané sloučeniny při enzymovém testu s účinkem vybraného standardu, jako je AMP-PNP), je možné pro optimalizaci struktury inhibitoru použít způsoby navrhování léčiv založené na strukturních údajích. Použití sloučenin, jejichž struktura připomíná strukturu léčiva a které byly předem testovány in silico pomocí počítačových modelů aktivního místa, může zvýšit již tak vysokou výkonnost hromadného testování vedoucích sloučenin. Tak je například možné krystalizovat daný inhibitor a enzym ve formě komplexu a stanovit krystalovou strukturu tohoto komplexu. Strukturní informace získaná z uvedené krystalové struktury může být následně použita pro formulaci hypotéz týkajících se farmakoforu. Například pokud je z dané krystalové struktury patrné například, že v daném krystalu existuje v aktivním místě enzymu nevyužitý akceptor pro vytvoření vodíkové vazby (například karbonylová skupina glutamátového zbytku), a to v ··*· · · určité vzdálenosti (např. 3 Á) od donoru pro vytvoření vodíkové vazby (např. protonované aminoskupiny) inhibitoru, je možné navrhnout novou strukturu potenciálního inhibitoru, ve které se donor vodíkové vazby bude nacházet ve vhodné vzdálenosti od akceptoru vodíkové vazby aktivního místa enzymu. Tento postup je možné opakovat a získat tak více účinné a specifické inhibitory enzymu.

Pro vytvoření počítačového modelu je možné provést počítačové vyhledání farmakoforu, při kterém se používají strukturní informace zjištěné rentgenovou krystalografií. Komerčně dostupné sloučeniny mohou být vkládány do aktivního místa enzymu a vybrány pro hromadné testování, přičemž pro tento výběr se jako jeden, ale na nezbytně jediný, z hodnotících prvků používá skóre jednotlivých sloučenin zjištěné při jejich vložení do aktivního místa enzymu (tj. vkládací skóre).

Další analogy je možné zakoupit nebo syntetizovat a následně hromadně testovat. Experimenty s těmito analogy je možné použít pro potvrzení hypotézy vyslovené na základě výsledků předcházejících hromadných testů nebo pro návrh nových hypotéz, které mohou být podobně otestovány zopakováním shora popsaného postupu. V některých případech mohou být identifikovány alternativní templáty a sloučeniny na bázi těchto templátů mohou být zakoupeny nebo syntetizovány za účelem otestování těchto nových hypotéz. Může být žádoucí identifikovat farmaceuticky relevantní templáty a/nebo templáty, které mohou nejlépe otestovat hypotézy týkající se komplementárního vázání. Ve všech případech se uvedené sloučeniny obvykle hromadně testují proti enzymovému cíli a ft • · • · · ···· · · rovněž se tyto sloučeniny testují na in vitro antibakteriální účinek.

Kromě toho jsou v dané oblasti techniky způsoby molekulárního modelování známé, a to včetně hardwaru a softwaru vhodného pro vytvoření a využití modelů receptorů a konformací enzymu.

V současné době jsou dostupné a vhodné pro racionální navrhování léčiv a pro procesy počítačového modelování, vytváření modelu a počítačové identifikace, výběru a hodnocení potenciálních antimikrobiálních sloučenin, jež se používají při způsobech popsaných v tomto textu, četné počítačové programy. Skupina těchto počítačových programů zahrnuje například produkt GRID (dostupný od Oxford University, Velká Británie), produkt MCSS (dostupný od společnosti Accelrys, Inc., San Diego, CA, USA), produkt AUTODOCK (dostupný od společnosti Oxford Molecular Group), produkt FLEX X (dostupný od společnosti Tripos, St. Louis, MO, USA), produkt DOCK (dostupný od University of California, San Francisco, CA, USA), produkt CAVEAT (dostupný od University of California, Berkeley, CA, USA), produkt HOOK (dostupný od společnosti Accelrys, Inc.,

San Diego, CA, USA) a 3D databázové systémy, jako je produkt MACCS-3D (dostupný od společnosti MDL Information Systems, San Leandro, CA, USA), produkt UNITY (dostupný od společnosti Tripos, St. Louis, MO, USA) a produkt CATALYST (dostupný od společnosti Accelrys, Inc., San Diego, CA, USA). Potenciální antimikrobiální sloučeniny mohou být rovněž navrženy počítačově „de novo, a to s použitím softwarových balíků, jako je produkt LUDI (dostupný od společnosti Biosym Technologies, San Diego, CA, USA), produkt LEGEND (dostupný od společnosti

Accelrys, Inc., San Diego, CA, USA) a produkt LEAPFROG (dostupný od společnosti Tripos Associates, St. Louis, MO,

USA). Deformační energii sloučeniny a elektrostatickou repulzi je možné stanovit pomocí programů, jako je produkt GAUSSIAN 92, produkt AMBER, produkt QUANTA/CHARMM a produkt INSIGHT II/DISCOVER. Tyto počítačové výpočty a modelovací techniky je možné provádět na jakémkoli vhodném hardwaru, včetně například pracovních stanic dostupných od společností Silicon Graphics, Sun Microsystems a dalších. Výše uvedený výčet technik, způsobů, hardwaru a softwarových balíků je jen reprezentativní a neslouží jako vyčerpávající seznam. V daném oboru jsou známy další techniky počítačového modelování, které mohou být rovněž použity podle tohoto vynálezu. V této souvislosti je možné odkázat například na publikaci N. C. Cohen, Molecular Modelling in Drug Design, Academie Press (1996) ( a odkazy uvedené v této publikaci) a na software uvedený na různých internetových stránkách.

Optimalizace inhibičního účinku vůči D-Ala-D-Ala ligase může být nezávislá na optimalizaci antibakteriálního účinku. Uvedené různé účinky mohou být od sebe odlišeny pomocí kmene bakterií upraveného pro overexpresi D-Ala-D-Ala ligasy (tj. vytvořením kmene bakterií, který je rezistentní vůči inhibitorům D-Ala-D-Ala ligasy) a následným prokázáním, že antibakteriální účinek dané vedoucí sloučeniny není nijak ovlivněn uvedenou overexpresi.

Předmět vynálezu bude dále popsán pomocí následujících příkladů. Uvedené příklady slouží jen pro ilustraci a nijak neomezují rozsah tohoto vynálezu.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Způsoby krystalizace proteinu, sběru dat a určení struktury

Strukturní informace byly získány buď společnou krystalizací D-Ala-D-Ala ligasy v přítomnosti ligandů nebo nasáknutím ligandů do předem připravených krystalů proteinu. Pomocí prvního přístupu byly získány krystaly ligasy komplexované s inhibitory v kvalitě potřebné pro provedení měření rentgenové difrakce (hexagonální jehličky; 0,1 mm x 0,1 mm x 0,2 mm) po pěti dnech krystalizace při teplotě 18 °C, a to difúzí par do 4mikrolitrových kapiček, které obsahovaly 5 miligramů/mililitr proteinu, 35 mM acetátového pufru (pH 4,5), 275 hmotnostněobjemového procenta polyethylenglykolu 6000, 4 procenta DMSO a 15-100-násobný molární přebytek inhibitoru oproti hodnotě Ki.

Difrakční data byla shromažďována při teplotě -180 °C na zobrazovacím platu RAXIS IV++, které bylo namontováno na rotujícím anodovém generátoru Rigaku RuH3R, jenž byl vybavený měděnou anodou, 0,5milimetrovou katodou a osmiovými zrcátky (Osmic mirrors). Parametry buněčné jednotky byly stanoveny z jediného 1° oscilačního obrazu pomocí zpracovávacího softwaru DENZO (viz. publikace Z. Otwinowski a W. Minor, Processing of X-ray Diffraction Data Collected in Oscillation Mode, Methods in Enzymology, Vol. 276: Macromolecular Crystallography, část A, str. 307-326, 1997, editoři C. W. Carter, Jr. a R. M. Sweet, Academie Press). Úplné soubory dat byly získány z jediného krystalu, a to shromážděním 100 až 180 oscilačních obrazů, které byl měřeny v 1° intervalech po dobu 15 minut při • · ·· • · · · • · · · ···· • · · · ·· · vzdálenosti detektoru 100 milimetrů. Jak krystaly komplexu ligasa-inhibitor připravené společnou krystaiizaci, tak komplexy ligasa-inhibitor připravené nasáknutím inhibitoru do krystalu proteinu spadají do prostorové grupy Ρ2χ2ι2ι, přičemž uvedená asymetrická jednotka obsahuje dvě molekuly a buněčná cela má následující rozměry: a = 69,6 Á, b = 82,6 Á a c = 96,7 Á. Typické soubory dat se z 98 procent nacházejí v rozmezí do 2,0 Á s Rsym 4-9 %.

Publikované atomové koordináty pro ligasu komplexovanou s fosfinátovým inhibitorem (viz. publikace Fan a spolupracovníci, Science, 1994, 266(5184), 439-443) byly použity jakožto selekční model pro vyřešení krystalové struktury komplexu ligasa:AMPPNP, a to pomocí molekulárního nahrazování, které bylo provedeno programem XPLOR (viz. publikace Brunger a spolupracovníci, Science, 1987, 235, 458-460), přičemž upřesněná struktura AMPPNP byla následně použita jakožto výchozí model za účelem upřesnění struktury následných komplexů. Struktura ligasy komplexované se sloučeninou identifikovanou pomocí metod popsaných v tomto textu byla upřesňována provedením několika cyklů simulovaného zahřívání s následným upřesněním polohy a omezení pohybu B-faktoru, které bylo prováděno pomocí programu XPLOR.

Příklad 2

Stanovení IC₅₀ D-Ala-D-Ala ligasy

Purinové deriváty z příkladu 1 byly v den hromadného testování rozpuštěny dimethylsulfoxidu (DMSO), přičemž byly připraveny lOOmilimolární roztoky jednotlivých analogů a v

99·· · · • * · • · · • 99 · · • · · · · · ’

99 ·· · případě potřeby bylo pro rozpuštění použito míchadlo typu vortex. Roztoky byly až do skončení hromadného testování uchovávány při teplotě místnosti.

V den testování byl připraven čerstvý zásobní lOmilimolární roztok NADH (který byl získán od společnosti Sigma), a to rozpuštěním 32 mikromolů NADH ve 3,2 mililitru dvakrát destilované vody. Roztok NADH byl uchováván na ledu. Zásobní roztoky obsahující 50 mM fosfoenolpyruvátu (PEP, od společnosti Sigma), 500 μΜ HERMES, 30 mM adenosintrifosfátu (ATP, od společnosti Sigma), 200 mM D-alaninu (od společnosti Sigma) a 4x základní pufr (tj. 100 mM Hepes, 40 mM chloridu hořečnatého a 40 mM chloridu draselného) byly rovněž skladovány na ledu. Zásobní roztok pyruvátkinasy/laktátdehydrogenasy (PK/LDH) byl rovněž získán od společnosti Sigma.

Pro každou sérii purinových testovaných sloučenin byla použita dvě 96jímková plata, která byla označena jako inhibitorové, respektive enzymové plato. Testovaným sloučeninám odpovídaly v jednotlivých platech řady jímek A-G. D-Cykloserinu (získanému od společnosti Sigma), který byl použit pro srovnání, odpovídaly v jednotlivých platech řady jímek H.

Enzymový roztok byl ponechán vytemperovat na teplotu 25 °C.

Zředěné roztoky byly připraveny následujícím postupem:

mikrolitrů dimethylsulfoxidu (DMSO) bylo přidáno do každé jímky ve sloupcích 1 až 11 v řadách A až G inhibitorového plata. Do každé jímky ve sloupcích 1 až 11 v řadě H bylo přidáno 50 mikrolitrů lx základního pufru nebo dimethyl44 • · • 4 • 44« • 4 44·

4 4 4 • · · 4 ·· 44

4 4 ·4

4 4 4 · 4···

4 4 ·

sulfoxidu (DMSO) (podle toho, v jakém rozpouštědle byl rozpuštěn cykloserin sloužící pro srovnání). Do jímek ve sloupci 12 v řadách A až G bylo přidáno vždy 100 mikrolitrů roztoku daného purinu o koncentraci 100 mM (tj. roztok první sloučeniny byl přidán do jímek ve sloupci A, roztok druhé sloučeniny byl přidán do jímek ve sloupci B atd.). Do jímky ve sloupci 12 v řadě H bylo přidáno 100 mikrolitrů roztoku cykloserinu o koncentraci 100 mM.

V každé řadě bylo 50 mikrolitrů roztoku testované sloučeniny přeneseno z jímky ve sloupci 12 do jímky ve sloupci 11, čímž došlo k promíchání tohoto roztoku s dimethylsulfoxidem (DMSO). Poté bylo v každé řadě 50 mikrolitrů roztoku z jímky ve sloupci 11 přeneseno do jímky ve sloupci 10, 50 mikrolitrů roztoku z jímky ve sloupci 10 bylo přeneseno do jímky ve sloupci 9 a tak dále až k jímce ve sloupci 2. Do jímek ve sloupci 1 nebyl přenesen žádný roztok. Byl zaznamenán čas na počátku a konci ředění.

Do každé jímky enzymového plata bylo přidáno 120 mikrolitrů enzymového roztoku. Roztoky substrátu byly ponechány ohřát na teplotu 25 °C.

Uvedené deriváty purinu a enzymy byly následně inkubovány Protože reakce byly iniciovány po sloupcích, bylo přidávání derivátů purinu prováděno rovněž po sloupcích. V čase t = minut bylo po 5 mikrolitrech roztoků derivátů purinu v jímkách ve sloupcích 1 až 4 inhibitorového plata přidáno do odpovídajících jímek enzymového plata. V čase t = 4 minuty bylo po 5 mikrolitrech roztoků derivátů purinu v jímkách ve sloupcích 5 až 8 inhibitorového plata přidáno do odpovídají4 • · · ···· *

4·4 ·

·*< 44 » *

4 4 4«

4

4 4 4 4

444 4 t 4

4 cích jímek enzymového plata. V čase t = 8 minut bylo po mikrolitrech roztoků derivátů purinu v jímkách ve sloupcích 9 až 12 inhibitorového plata přidáno do odpovídajících jímek enzymového plata. Inhibitorové plato bylo následně zmraženo.

V čase t = 18 až 19 minut byl odebrán roztok substrátu a přenesen při teplotě 25 °C do UV/Vis spektrometru Spectromax®.

V čase t = 20 minut bylo během 30 sekund do každé jímky ve sloupcích 1 až 4 přidáno 125 mikrolitrů roztoku substrátu a byla měřena absorbance vzniklých směsí při vlnové délce 340 nanometrů. V čase t = 24 minut a t = 28 minut byl tento postup zopakován pro jímky ve sloupcích 5 až 8, respektive 9 až 12.

Koncentrace sloučenin podle tohoto vynálezu v jímkách ve sloupcích 1 až 12 tak byly 0 μΜ, 1,9 μΜ, 3,9 μΜ, 7,8 μΜ,

15,6 μΜ, 31,2 μΜ, 62,5 μΜ, 125 μΜ, 250 μΜ, 500 μΜ, 1 mM, respektive 2 mM.

Hodnoty snížení absorbance byly vynásobeny -4,06 za účelem převedení jednotek mOD/min na nM/s (OD = ÁLM; λ = 6200 1/Mcm;

L = 0,66 centimetru; mOD/s = 6200 x 0,66 (mM/s) x 60;

(mOD/s) x 4,06 = nM/s); získaný výsledek byl vynásoben -1, protože absorbance NADH klesá se vzrůstajícím množstvím vznikajícího produktu).

Pomocí programu Kaleidograph® byly sestrojeny grafy závislosti rychlosti reakce na koncentraci inhibitoru a hodnoty IC₅o nebo Ki byly stanoveny poté, co byly na základě zjištěných údajů sestrojeny rovnice křivek uvedených závislostí. Aktivita enzymu v přítomnosti dimethylsulfoxidu (DMSO) byla použita jakožto lOOprocentní srovnávací aktivita.

Koncentrace cykloserinu v lx základním pufru byla přibližně 150 μΜ.

Výše popsaná testovací metoda je založena na předpokladu, že uvedené deriváty purinu nejsou kompetitivními inhibitory.

Příklad 3

Procento inhibice analogů podle tohoto vynálezu

Byl zopakován testovací postup popsaný v příkladu 2, avšak s tou výjimkou, že inhibitorová plata byla připravena tak, že jímky obsahovaly 5milimolární roztoky inhibitorů (oproti sériově zředěným roztokům při předcházejícím testu), takže konečná koncentrace inhibitoru ve výsledné reakční směsi byla 100 μΜ.

Příklad 4

Stanovení hodnot Ki a mechanismu inhibice

Byl zopakován testovací postup popsaný v příkladu 2, přičemž byly použity tři různé substrátové roztoky, a to každý na jiném enzymovém platu. Konečné koncentrace v reakčních směsích byly následující: (A) 2 mM ATP a 1 mM D-alaninu; (B) mM ATP a 32 mM D-alaninu; a (C) 50 μΜ ATP a 32 mM D-alaninu. Pro všechna tři enzymová plata bylo použito stejné inhibito31 rové plato. Pro srovnání byl při testu použit adenosin (od společnosti Sigma) a cykloserin (od společnosti Sigma).

Příklad 5

Mikrozřeďovací test antimikrobiální citlivosti

Byly připraveny zásobní roztoky testovaných sloučenin v N,N-dimethylformamidu (DMF) o koncentraci 5 miligramů/mililitr. Poté byly připraveny pracovní roztoky v živné půdě Můller-Hinton (MHB) o výchozí koncentraci 64 mikrogramů/mililitr (tj. byl připraven roztok 25,6 mikrolitru zásobního roztoku v 974,4 mikrolitrech MHB = roztok testované sloučeniny o koncentraci 128 mikrogramů/mililitr, který byl při níže popsaném procesu zředěn ekvivalelntním objemem bakteriálního inokula).

Bakteriální inokula byla připravena vždy z přes noc inkubované kultury (tj. čerstvé kolonie pěstované na agarovém platu v 5 mililitrech MHB; kmen H. influenzae byl pěstován v MHB s přídavkem kvasného extraktu, hematínu a NAD), která byla odstřeďována 2x5 minut rychlostí 3000 otáček/minutu (v případě kmenů S. pneumoniae a H. influenzae 2 x 10 minut rychlostí 3000 otáček za minutu) a dispergována v 5 mililitrech čerstvého média MHB, takže získaná bakteriální suspenze se ředila tak, aby v každé jímce mikroplata bylo získáno 100 jednotek tvořících kolonii (CFU) (konečný objem směsi činil 100 mikrolitrů).

Uvedené jímky mikroplata byly následně plněny 50 mikrolitry dvojnásobně zředěného roztoku testované sloučeniny, při32 čemž výchozí koncentrace testované sloučeniny byla 64 mikrogramů/mililitr. Jímky ve sloupcích 2 až 12 byly plněny 50 mikrolitry bakteriálního inokula (konečný objem směsi v každé jímce činil 100 mikrolitrů/jímku). Plata byla inkubována 18 až 24 hodin při teplotě 37 °C (kmen S. pneumoniae byl inkubován v atmosféře obohacené oxidem uhličitým).

Poté byla pomocí přístroje TECAN SpectroFluor Plus® měřena optická hustota obsahu jednotlivých jímek při vlnové délce 590 nanometrů (OD590) a minimální inhibiční koncentrace (MIC) byla definována jakožto koncentrace, při které docházelo k 90procentní inhibici růstu bakterií.

Příklad 6

Stanovení minimální inhibiční koncentrace (MIC) pomocí overexprese kmene E. coli

Postup popsaný v příkladu 5 byl zopakován s následujícími modifikacemi:

Jako médium byla použita živná půda luria (LB) s přídavkem antibiotik (20 miligramů/litr chloramfenikolu pro vektory pBAD, 100 miligramů/litr ampicilinu pro vektory pTAC pro plasmidovou selekci) nebo M9 minimální médium s D-manitolem jakožto zdrojem uhlíku.

Bakterie, které byly použity pro inokulum v LB, byly připraveny takto: kultura získaná kultivací přes noc byla zředěna v poměru 1:50 čerstvým médiem LB a inkubována na třepačce při 250 otáčkách za minutu a teplotě 37 °C. Po • · • · · • · · • · · « · · · · · · • · · · · · · dosažení stádia mid-log (OD₆oo = 0,5 až 1,0, po přibližně 3 hodinách) byl do směsi přidán operonový regulátor (glukosa, arabinosa nebo IPTG) a bakterie byly inkubovány další 3 hodiny. Po uplynutí 3 hodin byla znovu změřena hodnota OD₆oo, která sloužila pro odhad počtu bakterií a kultura byla zředěna médiem LB (antibiotika - chloramfenikol nebo ampicilin a regulátory byly přidány v dvojnásobných koncentracích).

Konečné inokulum obsahovalo přibližně 10 000 CFU/jímku.

Bakterie, které byly použity pro inokulum v M9 minimálním médiu, byly připraveny takto: kultura získaná kultivací přes noc byla odstřeďována 2x5 minut rychlostí 3000 otáček/minutu, promyta médiem M9, zředěna v poměru 1:50 M9 minimálním médiem a ponechána 14 hodin inkubovat při teplotě 37 °C (Οϋεοο přibližně 500). Do směsi byl přidán operonový regulátor a bakterie byly inkubovány další 3 hodiny. Po uplynutí 3 hodin byla znovu změřena hodnota Οϋβοο, která sloužila pro odhad počtu bakterií a kultura byla zředěna médiem M9 minimálním médiem (antibiotika - chloramfenikol nebo ampicilin a regulátory byly přidány v dvojnásobných koncentracích).

Konečné inokulum obsahovalo přibližně 10 000 CFU/jímku.

Optická hustota byla kvůli pomalejšímu růstu bakterií v minimálním médiu odečítána po 24 a 48 hodinách.

• * • · · · · · · · · • · · · · · ····· • · · · · · · • · · · · · ·

Příklad 7

Vkládání virtuální knihovny 700 derivátů purinu do aktivního místa enzymu

Soubor 700 primárních alifatických aminů s molekulovou hmotností menší než 300, neobsahujících reaktivní nebo toxické funkční skupiny a dostupných od společnosti Aldrich byl vybrán ze seznamu Available Chemicals Directory (ACD, MDL Information System, San Leandro, CA, USA).

Knihovna 700 purinů substituovaných v poloze 6 uvedenými vybranými aminy byla vygenerována pomocí modulu Analog Builder programu Cerius2 (od společnosti MSI, Accelrys Inc., San Diego, CA, USA).

U těchto 700 analogů byla pomocí programu Catalyst (od společnosti Accelrys Inc., San Diego, CA, USA) provedena konformační studie. Takto byl pro každou sloučeninu vygenerován reprezentativní soubor konformerů. Pro vyloučení duplikátů byla následně provedena klastrová analýza. Dva korformery stejné sloučeniny se považovaly za duplicitní pokud směrodatná odchylka mezi odpovídajícími koordinátami po superpozici rigidních částí byla menší než 1,0 Á. V těchto případech byl dále zkoumán jen jeden z těchto dvou konformerů.

• ·

Vybrané konformery byly pomocí programu EUDOC (který poskytl

Dr. Yuan-Ping Pang z Mayo Clinic) vloženy do aktivního místa

D-Ala-D-Ala ligasy. Následující tabulka uvádí příklad vstupního souboru použitého při výpočtech spojených s vkládání konformerů do aktivního místa enzymu.

Search Module (l=ligand prediction; 2=virtual screening): 2

Number of different ligands: 14258 • · · · · • · · · · · · · • · ··· · · · · · • · · · · ·

Box	origin	on	the	x-axis:	-44.5
Box	origin	on	the	y-axis:	-11.5
Box	origin	on	the	z-axis:	9

Box	size	on	the	x-axis:	9.0
Box	size	on	the	y-axis:	3.5
Box	size	on	the	z-axis:	5.5

Rotational increment (10, 20, nebo 30 stupňů): 30 Translational increment (0 až 6.0Á): 0.5 Cutoff of intermolecular interaction energies (0 až -60 kcal/mol): 1000.0

Platform (1=MPP; 2=Homocluster; 3=Heterocluster): 1 Number of available processors: 10

Orientace každé sloučeniny s nejnižší vypočtenou vazebnou energií byla znovu skórována pomocí souboru 5 dalších skórovacích funkcí, jež byly implementovány v programu CSCORE (od společnosti Tripos lne., St. Louis, MO, USA) a pomocí programu SCORE (získaného od Beijing University). Na základě shodnosti skóre bylo sestaveno pořadí sloučenin a podle tohoto pořadí bylo vybráno 100 kandidátských sloučenin určených pro syntézu.

···· · ·

Příklad 8

Porovnání sekvencí D-Ala-D-Ala ligas

Sekvence následujících 51 bakteriálních D-Ala-D-Ala ligas byly zpracovány do tabulky, která je zobrazena na přiloženém obrázku 10. Důležité strukturní prvky jsou rovněž vyznačeny na obrázku 10 (viz. kontaktní kódy).

Seq 0001 Seq 0002 Seq 0003 Seq 0004 Seq 0005 Seq 0006 Seq 0007 Seq 0008 Seq 0009 Seq 0010 Seq 0011 Seq 0012 Seq 0013 Seq 0014 Seq 0015 Seq 0016 Seq 0017 Seq 0018 Seq 0019 Seq 0020 Seq 0021 Seq 0022 Seq 0023 Seq 0024 Seq 0025 Seq 0026 Seq 0027 Seq 0028 Seq 0029 Seq 0030 Seq 0031 Seq 0032 Seq 0033 >00_ECOLI_DDLB P07862 >0lA_CHLPN_DDL Q9Z701 >0lB_CHLTR_DDL 084767 >02_YERPES_DDL Sanger_632 >03_HAEIN_DDL P44405 >04_HAEDUC_DDL HTSC_730 >05_PSEUDAE_DDL 11348402 >06_PSEUPDT_DDL TIGR >07_XYLFAS_DDL 11272188 >08_BORPER_DDL Sanger_520 >09_THIFER_DDL TIGR_6140 >10_NEISMNA_DDL 11272192 >11_NEISMNB_DDL 11272194 >12_NEISGON_DDL OUACGT_485 >13_BUCAP_DDL 051927 >14_BACHAL_DDL 10174238 >15_GEOSUL_DDL TIGR_35554 >16_RICPR_DDL Q9ZDS6 >17_ZYM0B_DDL 5834367 >18_AQOIAEO_DDL 066806 >19_THEMA_DDL P46805 >20_CLOSDIF_DDL Sangerl496 >21_ENTFCM_VANA P25051 >22_ENTFCM_VANB Q06893 >23_ENTFCM_VAND 5353567 >24_STRPTOY_DDL 2228595 >25_AMYCOR_DDL 4405962 >26_ENTGAL_VANC P29753 >27_ENTHR_DDL Q47827 >28_ENTFCM_DDL 12231521 >29_ENTFCS_DDLF Q47758 >30_STRPN_DDL 6634564 >31 STRPY DDL OUACGT 1315

Escherichia coli (305 zb.).

Chlamydophila pneumoniae (340 zb.).

Chlamydia trachomatis (337 zb.).

Yersinia pestis kmen CO-92 chrom 4 (304 zb.). Haemophilus influenzae (306 zb.).

Haemophilus ducreyi kmen 35000HP (297 zb.). Pseudomonas aeruginosa kmen PAO1 (319 zb.). Pseudomonas putida KT2440 (292 zb.).

Xylella fastidiosa kmen 9a5c (320 zb.).

Bordetella pertussis Contig845 (296 zb.). Thiobacillus ferrooxidans (296 zb.).

Neisseria meningitidis group A kmen Z2491 (304 zb.). Neisseria meningitidis group B kmen MD58 (304 zb.). Neisseria gonorrhoeae Ngon_Contigl (296 zb.).

Buchnera aphidicola (306 zb.).

Bacillus halodurans (305 zb.).

Geobacter sulfurreducens gsulf_5 (299 zb.). Rickettsia prowazekii (321 zb.).

Zymomonas mobilis (321 zb.).

Aquifex aeolicus thermophile (291 zb.).

Thermotoga maritima (303 zb.).

Clostridium difficile Contig890 (294 zb
Enterococcus	faecium	VanA	(343	zb.) .
Enterococcus	faecium	VanB	(342	zb.) .
Enterococcus	faecium	VanD	(343	zb.) .

Streptomyces toyocaensis (340 zb.). Amycolatopsis orientalis (348 zb.). Enterococcus gallinarum (343 zb.). Enterococcus hirae (358 zb.).

Enterococcus faecium AAG49141.1 (358 zb.). Enterococcus faecalis DDL_f (348 zb.). Streptococcus pneumoniae (347 zb.). Streptococcus pyogenes Contig_l (331 zb.).

• · • · · · · ···· · · · · ·· · · · ····· • · · · · ·

Seq 0034 :	>32_STAPHCOL_DDL TIGR_1280 : >33_STAPHMRSA_DDL Sanger
Seq	0035 :
Seq	0036 :	: >34_BACSU_DDL P96612
Seq	0037 :	: >35_BACSTER_DDL UOKR_1442
Seq	0038 :	: >36_DEIRAD_DDL 7471790
Seq	0039 :	: >37_SYNEC_DDL P73632
Seq	0040 ;	: >38_ECOLI_DDLA P23844
Seq	0041 :	: >39_SALTY_DDLA P15051
Seq	0042 i	: >40_MYCTUB_DDL P95114
Seq	0043 :	i >41 MYCTUB_DDL_CLIN TIGR
Seq	0044 :	: >42_MYCAV_DDL TIGR/NIADD
Seq	0045	: >43_MYCSMG_DDL Q9ZGN0
Seq	0046	: >44_LEGPNU_DDL CUCGC_446
Seq	0047	: >45_LEUCMES_DDL Q48745
Seq	0048	: >4 6_BORBCJRG_DDL 051218
Seq	0049	: >47_TREPA_DDL 083676
Seq	0050	: >48_VIBCHO_DDL
Seq	0051	: >49_HELPYR_DDL P56191

Staphylococcus aureus COL Contig_8089 (338 zb.).

Staphylococcus aureus MRSA Contig_17 (338 zb.).

Bacillus subtilis (354 zb.).

Bacillus stearothermophilus Contig_505 (345 zb.). Deinococcus radiodurans kmen R1 (339 zb.). Synechocystis sp. kmen PCC 6803 (354 zb.).

Escherichia coli DDLA (364 zb.).

Salmonella typhimurium DDLA (363 zb.).

Mycobacterium tuberculosis kmen H37rv (373 zb.). Mycobacterium tuberculosis CSU#93-klinický (373 zb.). Mycobacterium avium kmen 104 contig 5490 (364 zb.). Mycobacterium smegmatis (373 zb.).

Legionella pneumophila (343 zb.).

Leuconostoc mesenteroides (377 zb.).

Borrelia burgdorferi kmen B31 (356 zb.).

Treponema pallidum (396 zb.).

Vibrio cholerae kmen ASM893 (319 zb.).

Helicobacter pylori (347 zb.).

Ačkoli byl předmětný vynález popsán ve spojení s jeho podrobným popisem, je třeba výše uvedený popis chápat jen jako ilustrativní a nijak neomezující rozsah předmětného vynálezu, který je definován následujícími patentovými nároky. Další aspekty, výhody a modifikace vyplývající nebo provedené na základě předcházejícího textu spadají do rozsahu následujících patentových nároků.

• 4

4 • · • · ·· 4 • · ·

4 4 • ··· · • 4 ·

4

Claims

PATENTOVÉ

NÁROKY

Způsob odhadu potenciálu chemické entity asociovat se s molekulou nebo molekulárním komplexem zahrnujícím vazebnou doménu definovanou strukturními koordinátami aminokyselin Lysl44, Glul80, Lysl81, Leul83, Glul87, Asp257,a Glu270 D-Ala-D-Ala ligasy bakterie E. coli podle obrázku 8; nebo s homologem uvedené sloučeniny nebo molekulárního komplexu, přičemž uvedený homolog zahrnuje vazebnou doménu, jejíž směrodatná odchylka od atomů tvořících základní řetězec uvedených aminokyselin není větší než 10 Á, vyznačující se tím, že zahrnuje tyto stupně:

použití výpočetního prostředku pro provedení operace vložení uvedené chemické entity do vazebné domény definované jako strukturní koordináty aminokyselin Lysl44, Glul80, Lysl81, Leul83, Glul87, Asp257 a Glu270 D-Ala-D-Ala ligasy bakterie E. coli ± standardní odchylka od atomů tvořících základní řetězec uvedených aminokyselin nepřevyšující 10 Á; a analýzu výsledků uvedené operace za účelem kvantifikace asociace mezi uvedenou chemickou entitou a uvedenou vazebnou doménou.

Způsob identifikace potenciálního inhibitoru D-AlaD-Ala ligasy, vyznačující se tím, že zahrnuje následující stupně:

• · · · ···· · · použití atomových koordinát Lysl44, Glul80, Lysl81,

Leul83, Glul87, Asp257 a Glu270 D-Ala-D-Ala ligasy bakterie E. coli podle obrázku 8 ± standardní odchylky od atomů tvořících základní řetězec uvedených aminokyselin nepřevyšující 10 Á pro vytvoření trojrozměrné struktury vazebné domény D-Ala-D-Ala ligasy;

použití uvedené trojrozměrné struktury pro návrh nebo výběr potenciálního inhibitoru;

syntézu nebo získání daného inhibitoru; a kontaktování uvedeného inhibitoru s D-Ala-D-Ala ligasou za účelem stanovení schopnosti uvedeného potenciálního inhibitoru inhibovat D-Ala-D-Ala.
3. Způsob podle nároku 2, vyznačujíc! se tím, že uvedený stupeň zahrnuje navržení takové sloučeniny, která při vložení do uvedené trojrozměrné struktury bude obsahovat donor pro vytvoření vodíkové vazby ve vzdálenosti od 2,4 Á do 3,5 Á od jednoho nebo obou atomů kyslíku karboxylátové skupiny Glul80, jež je součástí postranního řetězce, donor pro vytvoření vodíkové vazby ve vzdálenosti od 2,4 Á do 3,5 Á od amidového atomu kyslíku Lysl81, jenž je součástí základního řetězce, akceptor pro vytvoření vodíkové vazby ve vzdálenosti od 2,4 Á do 3,5 Á od amidového atomu dusíku Leul83, jenž je součástí základního řetězce, donor pro vytvoření vodíkové vazby ve vzdáleností od 2,74 Á do 3,5 Á od amidového atomu kyslíku Leul83, jenž je součástí základního řetězce, a akceptor pro vytvoření vodíkové vazby ve vzdálenosti od 2,4 Á do »· • · · • · · · • ···♦» • · ♦ ·· ·

3,5 Á od atomu dusíky Lysl44, jenž je součástí postranního řetězce.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že uvedená sloučenina dále zahrnuje hydrofobní interakce ve vzdálenosti 3,5 až 4,5 Á od atomu uhlíku CD1 a atomu síry SD postranního řetězce Leu269, respektive Metl54.
5. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že uvedený potenciální inhibitor je bisubstrátový analog.
6. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že dále zahrnuje stanovení Ki uvedeného potenciálního inhibitoru ligasy pomocí enzymatického testu.
7. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že dále zahrnuje detekci interakcí mezi uvedeným potenciálním inhibitorem a ligasou pomocí studií stopped-flow.
8. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že dále zahrnuje detekci interakcí mezi uvedeným potenciálním inhibitorem a ligasou pomocí měření zhášení inherentní fluorescence tryptofanu obsaženého v ligase.
9. Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že dále zahrnuje detekci interakcí mezi uvedeným potenciálním inhibitorem a ligasou pomocí měření bránění proteolýze ligasy, přičemž uvedené bránění proteolýze koreluje se stabilizací ligasy uvedeným potenciálním inhibitorem.

• · · • · · · β» • · · • · ··· « * · • · · • ·

Způsob podle nároku 2, vyznačující se tím, že dále zahrnuje stanovení účinku uvedeného potenciálního inhibitoru na růst bakterií divokého typu v porovnání s kmeny overexprimujícími D-Ala-D-Ala ligasu.

• ·

Způsob identifikace potenciálního inhibitoru D-AlaD-Ala ligasy nebo jejího homologu, vyznačující se tím, že zahrnuje:

návrh nebo výběr sloučeniny, která způsobí přiblížení Ilel42 D-Ala-D-Ala ligasy nebo jeho protějšku v homologu na vzdálenost 12 Á od Met259 D-Ala-D-Ala ligasy nebo jeho protějšku v homologu a přiblížení Metl54 D-Ala-D-Ala ligasy nebo jeho protějšku v homologu na vzdálenost 12 Á od Leu269;

syntézu nebo získání uvedeného inhibitoru; a kontaktování uvedeného inhibitoru s D-Ala-D-Ala ligasou za účelem stanovení schopnosti uvedeného potenciálního inhibitoru inhibovat D-Ala-D-Ala.
12. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že dále zahrnuje stanovení Ki uvedeného potenciálního inhibitoru ligasy pomocí enzymatického testu.
13. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že dále zahrnuje detekci interakcí mezi uvedeným potenciálním inhibitorem a ligasou pomocí studií stopped-flow.

• · • · • · • · « • · · 4
14. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že dále zahrnuje detekci interakcí mezi uvedeným potenciálním inhibitorem a ligasou pomocí měření zhášení inherentní fluorescence tryptofanu obsaženého v ligase.
15. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že dále zahrnuje detekci interakcí mezi uvedeným potenciálním inhibitorem a ligasou pomocí měření bránění proteolýze ligasy, přičemž uvedené bránění proteolýze koreluje se stabilizací ligasy uvedeným potenciálním inhibitorem.
16. Způsob podle nároku 11, vyznačující se tím, že dále zahrnuje stanovení účinku uvedeného potenciálního inhibitoru na růst bakterií divokého typu v porovnání s kmeny overexprimujícími D-Ala-D-Ala ligasu.