CZ20032618A3 - Způsob identifikace počtu druhů a sčítání kokcidiálních sporocyst - Google Patents

Description

Způsob identifikace a sčítání kokcidiálních sporocyst

Oblast techniky

Vynález se týká způsobu identifikace a sčítání kokcidiálních sporocyst.

Dosavadní stav techniky

Kokcidióza je choroba živočichů, jejichž střevní sliznice je napadena a poškozena prvokem podtřídy Coccidia. Ekonomické důsledky kokcidiózy nohou být závažné, zejména v drůbežářském průmyslu, kde Šíření choroby podporuje velké množství ptáků soustředěných v chovných zařízeních. Infikace živočichů kokcidiálním prvokem je většinou druhově specifická. Nicméně jediného hostitele může infikovat více různých druhů prvoka. Kuřata mohou být například infikována několika druhy prvoka rodu Coccidia, přičemž šest z nich je považováno za mírně až závažně patogenní.

Životní cyklus kokcidiálního parazita je komplexní. Například prvoci rodu Eimeria, Isospora, Cystoisospora nebo Cryptosporidium potřebují zpravidla pro dokončení celého svého životní cyklu pouze jediného hostitele, ačkoliv Cystoisospora může používat i mezihostitele. Za přirozených podmínek začíná životní cyklus polknutím sporulovaných oocyst z okolního prostředí. Pokud sporulované oocysty polkne citlivý živočich, potom se stěna sporulované oocysty protrhne a uvolní uvnitř obsažené sporocysty. U drůbeže je uvolnění sporocyst důsledkem mechanického porušení sporulované oocysty ve druhém žaludku. Uvnitř sporocyst

01-2090-03-Če ·· «V «· ·· jsou sporozoity, což je infekční stádium daného organismu. U drůbeže dochází k porušení povlaku sporocysty a biochemickému uvolnění sporozoitů v důsledku působení chymotrypsinu a žlučových solí v tenkém střevě. Uvolněné sporozoity následně napadají střevní sliznici nebo epiteliální buňky v dalších oblastech. Konkrétní místo infikace lze označit za charakteristický znak jednotlivých druhů prvoků, kteří se na infikaci podílejí. Například prvok rodu Eimeria, E. tenella byl lokalizován ve slepém střevu; E, necatrix se vyskytuje v přední a střední části tenkého střeva; E. acervulina a E. pecox se vyskytuje v horní polovině tenkého střeva; E. brunet ti se vyskytuje ve spodní části tenkého střeva, v rektu, ve slepém střevu a v kloace; zatímco E. mi tis se nachází ve spodní části tenkého střeva.

Potom, co se sporozoity ocitnou uvnitř buněk živočišného hostitele, se vyvinou ve vícejaderné meronty, rovněž označované jako schizonty. Z každého jádra merontu se vyvine infekční tělo, označované jako merozoit, které vniká do nových buněk a celý proces se opakuje. Po různém počtu asexuálních generací se z merozoitu vyvinou bud' mikrogametocyty, nebo makrogamety. Z mikrogametocytů se vyvine mnoho mikrogamet, které zase oplodní makrogamety. Okolo výsledných zygot se nakonec vytvoří rezistentní povlak. Zygoty po encystaci, označované jako oocysty, se šíří v nesporulované formě výkaly (trusem). Infikovaní ptáci mohou šířit oocysty v trusu po dobu několika dnů nebo týdnů. Za příznivých teplotních a vlhkostních podmínek se oocysty stávají infekčními v důsledku procesu označovaného jako sporulace. Sporulované oocysty potom pozřou ptáci při běžném zobání a celý cyklus se opakuje. Orální pozření

01-2090-03-Če * · * · · · *· · · ϊ ··· « · · fl · · · · · · · ·« ·· ·· ·· ·· · životaschopných sporulovaných oocyst je jediným možným přirozeným způsobem infikace.

Infikace kokcidiálním prvokem vede postupně k vytvoření imunity, což znamená, že se všichni členové skupiny (hejna, stáda) stávají postupně vůči této chorobě imunními a výskyt choroby se snižuje. Tato samoredukující povaha kokcidiálních infekcí je dobře známa u kuřat a ostatní drůbeže. Nicméně získaná imunita je druhově specifická, takže zavedení dalších, tj. odlišných, druhů kokcidiálních prvoků povede k novému propuknutí choroby.

Ke kontrole kokcidiózy u drůbeže jsou v současné době používány dva způsoby. První způsob kontroly je založen na chemoterapii. Pro kontrolu kokcidiózy u drůbeže je v současné době k dispozici celá řada léčiv. Nicméně vzhledem k počtu druhů, které chorobu způsobují, existuje pouze omezený počet léčiv účinných proti všem těmto druhům. Na druhou stranu je pravdou, že jediné léčivo může být účinné i proti více druhům prvoka. Například při moderním chovu brojlerů je podávání léčiv určených pro kontrolu kokcidiózy rutinní metodou, díky které je dosahováno významných úspor výrobních nákladů.

Za závažné omezení účinnosti chemoterapie je označován vývoj rezistence vůči léčivu určenému pro kontrolu choroby. Průzkumy prováděné ve Spojených státech amerických, v Jižní Americe a v Evropě odhalily široké rozšíření rezistence u kokcidiálních prvoků. Vzhledem k tomu, že rezistence vůči léčivu je genetický jev, může zůstat v populaci zakódována po mnoho let od svého vzniku až do okamžiku, kdy se omezí v důsledku přirozeného selekčního tlaku a genetického driftu.

01-2090-03-Če • · · • ·« · ·

Kromě toho pozornost veřejnosti stále více přitahuje používání léčiv u živočichů, kteří jsou určeni pro zpracování v potravinářském průmyslu. Spotřebitelé se stále více zajímají o možnost přítomnosti zbytků léčiv v potravinách. Tento zájem vyvíjí zase tlak na chovatele drůbeže, kteří se snaží používání léčiv pro kontrolu kokcidiózy omezovat.

Alternativou chemoterapie je vakcinace ptáků proti kokcidiálním prvokům. Výhoda vakcinace spočívá v možnosti výrazně redukovat nebo eliminovat potřebu podání antikokcidiálních léčiv, čímž se omezují náklady chovatelů drůbeže, zabraňuje se vývoji kmenů rezistentních vůči léčivu a snižuje se zájem spotřebitelů o zbytky léčiv v drůbežích produktech.

Vzhledem k tomu, že získaná imunita je specifická pro konkrétní druhy kokcidiálního prvoka použitého ve vakcíně, musí vakcíny obsahovat buď směs druhů, nebo musí obsahovat druhy, o nichž je známo, že představují problém pro konkrétní populaci živočichů, kteří mají být vakcinováni. Použití vakcín obsahujících pouze druhy, o kterých je známo, že představují problém pro danou populaci, vyžaduje identifikaci těchto druhů v infikované populaci. Vakcíny obsahující několik druhů se vyrábějí kombinací čistých linií různých druhů prvoka. Pro udržení stejné kvality kontroly je tedy nezbytné periodicky tyto linie testovat a zajistit tak, aby nedošlo ke kontaminaci dalšími druhy Coccídia.

Tradičně je identifikace druhů kokcidiálního prvoka založena na rozdílech ve velikosti a tvaru oocysty, a stejně tak na místě infikace u postižených živočichů. Samotná velikost oocysty nemusí představovat nejpřesnější

01-2090-03-Če • ♦ « · « · ··· prostředek pro identifikaci, protože existují značné překryvy velikosti mezi jednotlivými druhy. Současně používaná vizuální metoda je pomalá, drahá a subjektivní, protože každý jednotlivý prvok musí být mikroskopicky pozorován osobou vyškolenou pro vizuální identifikaci různých druhů. Objevily se sice snahy usnadnit tento vizuální způsob identifikace použitím počítačových zobrazovacích analytických systémů, viz například Kučera a kol. (Folia Parasitologica 38: str. 107 aS 113, 1991), nicméně tyto metody jsou stále časově náročné a postrádají schopnost uspokojivě izolovat oocysty vícedruhových vzorků. Výsledky měření prováděného za použití tohoto systému jsou rovněž často zkresleny přítomností malých částic navázaných na oocystách. Výrobu kokcidiálních vakcín, aů specificky vyrobených nebo míšených, by tedy zlepšil prostředek pro rychlou, přesnou a objektivní identifikaci kokcidiálních druhů,

Relativně nedávno byla jako alternativa k identifikaci buněk pomocí mikroskopické analýzy použita analýza pomocí průtokových cytometrů. Zatímco konvenční světelná mikroskopie se často používá ke stanovení kvalitativních a subjektivních charakteristických znaků buněk nebo dalších objektů, jako je například intenzita odraženého světla, průtoková cytometrie umožňuje kvantitativní měření a porovnání světelné intenzity odražené buňkami nebo objekty. Nejběžnějším využitím průtokové cytometrie je určení příslušných procent specifických podskupin buněk v populaci za použití fluorescenčně značených monoklonálních protilátek. Použití monoklonálních protilátek detekujících různé lidské antigeny umožňuje použít průtokovou cytometrii ke stanovení antigenního profilu širokého spektra benigních a neoplastíckých buněk (Seminars in Diagnostic Pathology,

01-2090-03-Če • · · 9 9 9 9 · 9 ·· · 9 9 9 999 9 «9 ·· 99 99 99 ··

6(1): str. 1 až 2, 1989). Významným využitím průtokové cytometrie je rovněž měření koncentrací intracelulárního ionizovaného vápníku v živých buňkách za použití Indo-1 a UV-excitovatelného fluorescenčního Ca²⁺ indikátoru (Gilman-Sachs, A., Analytícal Chem., 66: str. 700A až 707A, 1994). Průtoková cytometrie se rovněž používá při analýze hematopoietických buněk a při analýze obsahu DNA pro základní výzkum. Výraz „průtoková cytometrie se často používá jako synonymum pro třídič fluorescenčně aktivovaných buněk (FACS).

Typický průtokový cytometr má několik součástí včetně světelného zdroje, zpravidla laseru; komory pro uložení vzorku, průtokového článku a proudu nosné tekutiny tvořící plášť.; fotodetektoru (používaného k detekci světelného rozptylu) a fotomultiplanární zkumavky (PMT) (používané při detekci přijatého světla a jeho převedení na elektrické signály); systému pro zpracování elektrického signálu, který převede analogové signály na digitální signály; a počítače pro přímé operace, ukládání získaných signálů a zobrazení dat (Gilman-Sachs, viz výše).

U typického průtokového cytometru jsou částice nebo buňky usměrňovány tak, aby proudily za sebou v jediném proudu. Zpravidla jsou částice nebo buňky pneumaticky hnány skrze potrubí, odkud jsou vstřikovány do vysokorychlostní trysky. Tryska obsahující obalovou tekutinu, zpravidla pod tlakem, hydrodynamicky usměrňuje částice nebo buňky do úzkého otvoru tak, aby buňky opouštěly trysku za sebou v jediné řadě a byly tlačeny do středu proudu, výsledkem čehož je laminární koaxiální proud. Typickými nosnými tekutinami pro vytvoření pláště jsou například deionizovaná voda nebo roztok chloridu sodného, například Isoton II (BECKMAN COULTER), který lze například naředit vodou

01-2090-03-Če ♦ · · • β · • 9 9 · *· *· • 9 · • ·«· ··

MILLI-Q. Potom, co částice nebo buňky opustí trysku, proudí rychle skrze osvětlovanou zónu, kde procházejí kolem světelného zdroje, zpravidla kolem analytického laseru. Nejběžněji používaným laserem je argonový laser, který může emitovat velmi úzký eliptický (průřez) světelný paprsek v rozmezí od 16x 40 pm do 40x 700 pm, v závislosti na optice udávající tvar světelného paprsku, která je použita v průtokovém cytometru (Gilman-Sachs, viz výše). Nejběžněji používanou vlnovou délkou je 480 nm, což je excitační vlnová délka dvou běžných fluorochromů. Pro většinu analýz je Často postačující 15mW vzduchem chlazený laser. Nicméně v kombinaci s určitými barvivý lze pro speciální aplikace použít i další typy laserů (He-Ne, Kr a He-Cd).

Částice nebo buňky jsou zpravidla vedeny skrze ozařovanou zónu rychlostí 1000 částic nebo buněk za sekundu, nicméně je možné použít i vyšší rychlosti. Během průchodu částic ozařovanou zónou zachytí každá částice nebo buňka laserový paprsek a rozptýlí část laserového světla do všech směrů. Dopadající světlo se následně detekuje vhodně umístěnými detektory, jakými jsou například fotobuňky nebo PMT, které měří velikost pulsu reprezentující rozsah rozptýleného světla (údaje zaznamenávané pro každou buňku zahrnují například „zaznamenanou událost).

Jakmile objekt projde před laserovým paprskem, potom jsou rozptýlené světlo nebo fluorescence emitovaná z buňky převedeny na elektrický signál, který je úměrný specifickému parametru pro daný objekt. Tato informace o populaci buněk může být zobrazena ve formě frekvenčního histogramu na obrazovce počítače. Při rozptylování světla sporocystou se světlo rozptyluje do různých směrů s různým stupněm intenzity. Směr a intenzita rozptýleného světla udává analytikovi informaci o přibližném průměru, tvaru a

01-2090-03-Če *· í ·’ · í í *.

• · · · «··· ·· ·· ·· ·· zrnitosti (denzitě) buňky. Při použití argonového laseru dosahuje limitní detekční intenzita rozptýleného světla zpravidla přibližně vlnovou délku 37 nm. Čím sofistikovanější je průtokový cytometr, tím více obsahuje fotodetektorů, a pro každý objekt lze tedy získat přesnější parametry.

Typický detekční systém sestává z detektoru přímého světelného rozptylu (FSC) a detektoru bočního (úhel bočního rozptylu = pravý úhel (90°)) rozptylu (SSC). Přímý světelný rozptyl se používá ke stanovení velikosti částice. V okamžiku, kdy buňka protne laserový paprsek se světlo emitované ze světelného zdroje rozptýlí buňkou v rozsahu 360 stupňů. Světlo rozptýlené v přímém směru (tj . vzhledem ke směru laserového paprsku) je zhruba úměrné velikosti buňky. Empiricky bylo prokázáno, že světlo rozptýlené buňkami v malých úhlech (0,5° až 2,0°) přímého směru je úměrné velikosti buňky. Malé buňky nerozptylují světlo takovou měrou jako větší buňky. FSC Měření je svou povahou podobné analýze otisku stínu buňky.

Světlo, které rozptyluje a sbírá pod pravým úhlem (tj. světlo detekované pod úhlem 90°, vztaženo k ose vycházejícího laserového paprsku (SSC nebo ortogonálně)), určuje komplexnost buňky a cytoplasmickou zrnitost (denzitu). Toto měření se zpravidla používá pro rozlišení granulovaných a negranulovaných buněk. Informace získané z FSC a SSC se označují jako „vnitřní neboli vlastní informace, protože vychází z velikosti, tvaru a komplexnosti buňky. Další informace, tedy „vnější neboli nevlastní informace, jakou je například druh povrchového antigenu nebo obsah DNA, lze získat za použití barviv vhodných k obarvení barviv organismů, zejména fluoroforů. Nejběžnějšími buněčnými parametry měřenými průtokovým

01-2090-03-Če • Ϊ · A · A AA«A ♦ A ♦ cytometrem jsou velikost, tvar, zrnitost, obsah proteinů, obsah DNA a koncentrace intracelulárního vodíku a vápníku. Signály z FSC i SCC se zpravidla korelují, ve snaze detekovat subpopulace lymfocytů, monocytů a granulocytů ve vzorcích periferní krve.

Průtokové cytometry dále zahrnuj í prostředky pro zaznamenávání a ukládání dat, jakým je například počítač. Fotonové emise sbírané z fotobuňky a PMT se převádí na analogické napětí. Tyto analogové signály se následně digitalizují analogově digitálními převodníky (ADC) a ukládají na magnetická média. Informace uložené na magnetických mediích se následně použijí za pomoci počítače k sestavení histogramů dvou nebo tří proměnných, například histogramu přímého světelného rozptylu vs. boční světelný rozptyl nebo histogramu světelného rozptylu vs. fluorescenční intenzita. Tyto histogramy mohou poskytovat informace o různých vlastnostech sledovaných při identifikaci částice. Průtokové cytometry tedy rychle potvrdí přítomnost a počet buněk v populaci, a pro tyto účely se často využívají v mnoha oborech. Viz např. použití průtokového cytometru pro určení počtu krvinek, patent US 5 627 037, kde se průtoková cytometrie používá ke stanovení absolutního počtu jedné nebo více populací buněk, jakými jsou například buňky subpopulací krvinek, které se nacházejí v nelyžované celé krvi. Pro sčítání více než jedné populace buněk, například pro sčítání CD4+ a CD8+ lymfocytů, jsou zapotřebí buněčné markéry, jakými jsou například anti-CD4 a anti-CD8. Zpravidla je použití průtokové cytometrie v mikrobiologii, a zejména při identifikaci prvoka, omezené.

Průtoková cytometrie se používá jako prostředek pro stanovení počtu prvoka ve vzorku. Reynolds a kol. (J. Appl.

01-2090-03-Če • · · • · · • ··· · *' · * · · · • · · · · « • · * · · · · · · 4

Microbiol., 87: str. 804 až 813, 1999) a Bennett a kol.

(J. Paraaitol., 85: str. 1165 až 1168, 1999) použili průtokovou cytometrii ke stanovení počtu jednoho druhu oocyst Cryptoaporidium parvum ve vzorcích.

Pro detekci přítomnosti a kvantifikaci buněk infikovaných prvokem Toxoplasma gondii (Gay-Andrieu a kol.,

J. Paraaitol., 85: str. 545 až 549, 1999) a pro kvantifikaci a detekci přítomnosti jednoho druhu parazita, oocysty C. parvum, například u lidí (Valdez a kol.,

J. Clin. Microbiol., 35: str. 2013 až 2017, 1997), koní (Cole a kol., J. Clinical Microbiol., 37: str. 457 až 460,

1999) a myší (Arrowood a kol., J. Paraaitol., 81(3): str. 404 až 409, 1995) se použily druhově specifické fluorescenčně značené protilátky v kombinaci s průtokovou cytometrii. Pro vytřídění oocyst C. parvum ze zbytku odebraného vzorku před mikroskopickou analýzou se použila průtoková cytometrie (Vesey a kol., J. Appl. Bacteriol.,

75: str. 87 až 90, 1993). Průtoková cytometrie se rovněž použila pro zkoumání změn ve velikosti a tvaru E. tenella sporozoitu a v integritě membrány v důsledku odezvy na ionofory (Fuller a kol., J. Paraaitol., 81: str. 985 až 988, 1995; Raether a kol., Paraaitol. Res., 77: str. 386 až 394, 1991). Kromě toho se průtoková cytometrie používající přímý světelný rozptyl a fluorescenci používá pro rozlišení čtyř druhů mikrosporidianových parazitů ryb (Sparguea lophii, Glugea stephani, Glugea atherinae Berrebi a Microsporidium ovoideum) a k odlišení monoprokaryotických a diprokaryotických spor S. lophii. (Amigo a kol., J. Euk. Microbiol., 41(3), 1994). Je třeba poznamenat, že způsob podle Amiga vyžaduje obarvení jader spór.

V kombinaci s průtokovou cytometrii se k identifikaci prvoka rovněž používají fluorescenčně značené nukleo9 ·

01-2090-03-Če • # 9 · 9 • 9 9 9

9 9 ·* ·· ·· • · 9

999 • 9 kyselinové sondy. Vesey a kol. (J. Appl. Microbiol., 85: str. 429 až 440, 1998) použil rRNA sondy pro detekci přítomnosti oocyst C. parvum. Byl zde sice použit pouze jediný druh prvoka, nicméně autoři se domnívají, že lze druhově specifickou rRNA sondu použít pro identifikaci druhů.

Průtokovou cytometrii lze použít pro roztřídění buněk. U průtokového cytometru vybaveného a určeného pro třídění buněk je tryska v okamžiku, kdy ji opouští obalová tekutina rozvibrována na vysokou frekvenci, a štěpí tak tekutinu na kapky. V ideálním případě každá kapka obsahuje jednu buňku. Jakmile se zjistí, že kapka obsahuje požadovanou buňku, potom se této kapce dodá náboj. Nabitá kapka je vedena skrze nabité desky, kde je odchýlena od původního směru a tříděna do sběrných nádob.

Průtoková cytometrie se používá pro analýzu oocyst populací E. tenella na základě velikosti a tvaru. Fuller a McDougald (J. Protozool., 36: str. 143 až 146, 1989) uvádí, že analýza přímého světelného rozptylu na základě velikosti byla sice použitelná, ale byla omezena značným překryvem velikostí jednotlivých druhů oocyst, a stejně tak značnou rozměrovou proměnlivostí uvnitř jednoho druhu. Dále se zde uvádí, že kombinace překryvu a proměnlivost velikosti u smíšených populací oocyst může vést k získání nejednoznačného údaje, ze kterého nelze extrahovat jeden druh. Navíc se zde uvádí, že komparativní analýza vsázek oocyst nebo identifikace druhů na základě velikosti je dále komplikovaná nedostatkem standardů vhodných pro použití v průtokové cytometrii. Dále je zde zmíněna domněnka, že purifikace oocyst průtokovou cytometrii bude pravděpodobně neúspěšná. Nicméně z jejich studií vyplývá závěr, že průtoková cytometrie může být úspěšná při izolaci velkého • *4 4

4 4 1 >4 • 4 4

444 ♦ 4 z pole

01-2090-03-Če <5 ί • 4 4 4 • 4 4 počtu oocyst s podobnou velikostí ze směsi izolované a při izolaci jednotlivých oocyst za účelem získání absolutní čistoty. Nicméně současně se zde uvádí, že i při použití tohoto druhu purifikace je třeba k ověření druhové identifikace použít další techniky, jiné než průtoková cytometrie, jakými jsou například isoenzymová analýza.

Ve všech výše zmíněných případech byly použity bud' oocysty, nebo kokcidiální prvoci postrádající vnější povlak nebo slupku, např. sporozoity. Ukázalo se, že při použití oocyst lze získat pouze nejednoznačná data. Použití sporozoitú nebo jiných kokcidiálních prvokú bez vnějšího povlaku nebo slupky vyžaduje zvýšenou opatrnost při manipulaci a zkracuje časovou periodu, během které lze získat přesné měření identity. Výše popsané techniky neposkytují pohodlný a přesný způsob identifikace a stanovení počtu kokcidiálního prvoka, a existuje tedy potřeba vyvinout metodu, která by umožnila rychle stanovit počet a druhovou identifikace kokcidiálního prvoka a která by měla vyšší stupeň jednoznačnosti a určitosti než současně používané metody.

Rychlá druhová identifikace by měla několik důležitých využití, například při chovu drůbeže. Schopnost rychle a přesně určit, které druhy kokcidiálního prvoka způsobují propuknutí choroby, by veterinářům umožnilo stanovit, které z dostupných antíkokcidiálních léčiv bude nejúčinnější. Pokud se použije pouze nejúčinnější léčivo, potom je méně pravděpodobné, že bude mít prvok dostatek času na to, aby si vyvinul rezistenci. Navíc znalost konkrétního druhu prvoka umožní podávat vakcíny specificky vyrobené tak, aby si živočich vytvořil imunitu proti druhu, o kterém je známo, že způsobuje chorobu ve skupině zvířat (hejno nebo stádo). Tato metoda by byla rovněž použitelná při kontrole

01-2090-03-Če • · · * · · * · · » ·♦ 99 *

• · • · « » » 9 · • 9 9 9 · • · · 9 999

9 9 9

99 9 kvality v případě výroby vakcíny tím, Se by poskytovala rychlý a přesný prostředek pro stanovení toho, zda nebyly Čisté linie prvoka použitého pro výrobu vakcín kontaminovány dalšími druhy prvoka, a pokud ke kontaminaci došlo, tak potom v jakém rozsahu. Cílem předloženého vynálezu je uspokojit všechny tyto potřeby.

Podstata vynálezu

Nyní se překvapivě zjistilo, že při použití sporocyst je možné rychle a přesně identifikovat, stanovit počet a roztřídit smíšené populace kokcidiálního prvoka podle druhů, bez nutnosti použití specifických protilátek nebo sond. Vynález tedy poskytuje jednoduchou a rychlou metodu pro roztřídění a identifikaci kokcidiálního prvoka ve smíšené populaci.

Vynález se týká způsobu identifikace kokcidiálního prvoka ve vzorku použitím průtokového cytometru. Použitý vzorek prvoka lze získat bud' z přirozeně se vyskytující populace, nebo z laboratorně přechovávané populace prvoka. V rámci vynálezu je předložen vzorek prvoka ve stádiu sporocysty. Sporocysty mohu být přirozeně se vyskytující nebo je lze získat pomocí známých metod z oocyst. Tyto sporocysty se následně analyzují průtokovou cytometrií a třídí na základě jejich velikosti (za použití přímého světelného rozptylu) a zrnitosti (za použití bočního světelného rozptylu), které se používají pro definici oblastí datových výstupů charakteristických znaku pro jednotlivé druhy prvoka. Zjistilo se, že sporocysty, na rozdíl od ostatních životních stádií kokcidiálního prvoka, poskytují, pokud se analyzují za použití průtokového

01-2090-03-Če

9 9 • 999

9···· ·

9 9 9 · 9 999 «999 9999 9«

99 99 99 99 9 cytometru a za zde stanovaných podmínek, spolehlivý vzorek charakteristických znaků, který umožňuje jeho rychlou a přesnou identifikaci, stanovení počtu druhů a roztřídění smíšené populace kokcidiálního prvoka podle druhů, a to bez použití specifických protilátek nebo sond. U výhodného provedení představují parametry použité pro identifikaci druhu nebo druhů kokcidiálního prvoka FSC a SSC.

Jeden aspekt vynálezu tedy poskytuje způsob určení počtu a druhu kokcidiálního prvoka ve vzorku, který zahrnuje dodání vzorku sporocyst uvedeného prvoka; definici oblastí datových výstupů průtokového cytometru na základě měření zvoleného z množiny sestávající z přímého světelného rozptylu, bočního světelného rozptylu a fluorescence; analýzu sporocyst uvedeného vzorku za použití průtokového cytometru; a určení počtu nebo procentického zastoupení jednotlivých druhů kokcidiálního prvoka ve vzorku.

Další aspekt vynálezu zahrnuje způsob stanovení druhů a počtu prvoka rodu Eimeria, který zahrnuje definici oblastí datových výstupů průtokového cytometru na základě přímého světelného rozptylu a bočního světelného rozptylu, přičemž oblasti datových výstupů jsou charakteristické tím, že obsahují přibližně alespoň 85 % záznamů sledovaných druhů sporocyst; dodání vzorku sporocyst z populace; analýzu uvedeného vzorku za použití průtokového cytometru; a stanovení počtu jednotlivých druhů kokcidiálního prvoka ve vzorku.

Ještě další aspekt poskytuje způsob určení počtu a druhů kokcidiálního prvoka v environmentálním vzorku, který zahrnuje definici oblastí datových výstupů průtokového cytometru na základě přímého světelného rozptylu a bočního světelného rozptylu, přičemž oblasti datových výstupů jsou

01-2090-03-Če ·»· » w » ·«· • * · · · · · « · « * · ··* · « »f«« • · e · · · · · ·« » *· ·· ·« » ·· · charakteristické tím, Se obsahují alespoň 50 % záznamů sledovaných druhů sporocyst; izolaci prvoka ze vzorku; pokud se prvok nachází ve stádiu oocysty, potom včetně sporulace a izolace sporocyst; analýzu sporocyst za použití průtokového cytometru; a určení počtu nebo procentického zastoupení jednotlivých druhů kokcidiálního prvoka ve vzorku.

Ještě další aspekt vynálezu poskytuje způsob určení počtu a druhů kokcidiálního prvoka rodu Eimeria v environmentálním vzorku, který zahrnuje definici oblastí datových výstupů průtokového cytometru na základě přímého světelného rozptylu a bočního světelného rozptylu, přičemž oblasti datových výstupů jsou charakteristické tím, že obsahují alespoň 85 % záznamů sledovaných druhů sporocyst; izolaci prvoka ze vzorku; pokud se prvok nachází ve stádiu oocysty, potom včetně sporulace a izolace sporocyst; analýzu sporocyst za použití průtokového cytometru; a určení počtu nebo procentického zastoupení jednotlivých druhů kokcidiálního prvoka ve vzorku.

Ještě další aspekt vynálezu poskytuje způsob léčby živočicha infikovaného kokcidiální infekcí, který zahrnuje získání vzorku z těla živočicha, reprezentativního živočicha ve skupině nebo prostředí, ve kterém je živočich chován; izolaci kokcidiálního prvoka ze vzorku; pokud se prvok nachází ve stádiu oocysty, potom včetně sporulace a izolace sporocyst; definici oblastí datových výstupů průtokového cytometru na základě přímého světelného rozptylu a bočního světelného rozptylu, přičemž oblasti datových výstupů jsou charakteristické tím, že obsahují alespoň 50 % záznamů sledovaných druhů sporocyst; analýzu sporocyst za použití průtokového cytometru; a léčbu

01-2090-03-Če

0 0 0 0 0 ·· · · * 0 00 • 00 0 0 000 00 00 00 00 » · • 0 0 0 • 0 0000 •00 t

živočicha antikokcidiálním léčivem nebo léčivy účinnými proti identifikovaným druhům kokcidiálního prvoka.

Způsob léčby živočicha infikovaného prvokem rodu Eimería zahrnuje získání vzorku z těla živočicha, reprezentativního živočicha nebo prostředí, ve kterém je živočich chován; izolaci prvoka ze vzorku; pokud se prvok nachází ve stádiu oocysty, potom včetně sporulace a izolace sporocyst; definici oblastí datových výstupů průtokového cytometru na základě přímého světelného rozptylu a bočního světelného rozptylu, přičemž oblasti datových výstupů jsou charakteristické tím, že obsahují přibližně alespoň 85 % záznamů sledovaných druhu sporocyst; analýzu uvedeného vzorku za použití průtokového cytometru; a léčbu živočicha zaměřenou cíleně na identifikované druhy prvoka.

Ještě další aspekt vynálezu poskytuje způsob určení počtu a druhů kokcidiálního prvoka ve farmaceutické kompozici, který zahrnuje získání vzorku kompozice; pokud se prvok nachází ve stádiu oocysty, potom včetně sporulace a izolace sporocyst; definici oblastí datových výstupů průtokového cytometru na základě přímého světelného rozptylu a bočního světelného rozptylu, přičemž oblasti datových výstupů jsou charakteristické tím, že obsahují alespoň 50 % záznamů sledovaných druhů sporocyst; analýzu sporocyst za použití průtokového cytometru; stanovení počtu nebo procentického zastoupení ' jednotlivých druhů kokcidiálního prvoka ve vzorku; a výpočet počtu jednotlivých druhů ve farmaceutické kompozici.

Vynález se dále týká způsobu určení druhů kokcidiálního prvoka ve vzorku. Tento způsob zahrnuje vedení analytu obsahujícího suspenzi neznámých sporocyst vzorku uvedeného prvoka v kapalném médiu skrze průtokový cytometr; dopadání

01-2090-03-Če • · • » 9 9 9 • 9

9 9 · *·** • · « · «» ·» · světla na uvedený analyt vedený průtokovým cytometrem; a měření alespoň jednoho charakteristického znaku uvedeného vzorku. Charakteristický znak lze zvolit z množiny sestávající z přímého světelného rozptylu, z bočního světelného rozptylu a fluorescence. Rozsah hodnot získaných z měření se použije ke stanovení souboru měření získaných z uvedeného analytu, s ohledem na alespoň jeden z uvedených charakteristických znaků. Potom se porovná soubor měření získaný pro uvedený analyt s alespoň jedním referenčním souborem měření, s ohledem na alespoň jeden charakteristický znak, který se získá, pokud se alespoň jedna referenční suspenze známých sporocyst vede uvedeným průtokovým cytometrem, a za účelem stanovení druhů prvoka v uvedeném analytu se provede korelace referenčního souboru pro analyt s alespoň jedním referenčním souborem měření.

Vynález se dále týká způsobu, u kterého představují soubory měření pro analyt a soubory měření pro referenční suspenzi množinu oblastí datových výstupů z průtokového cytometru. Všechny oblasti datových výstupů leží v poli majícím rozměry množiny charakteristických znaků. Pokud je alespoň 85 % dat naměřených průtokovým cytometrem pro uvedenou množinu charakteristických znaků uvedeného analytu obsaženo v uvedené množině referenčních oblastí datových výstupů, potom uvedená množina oblastí datových výstupů pro uvedený analyt naznačuje, že uvedený analyt obsahuje sporocysty, jejichž identita koreluje se známou identitou uvedené množiny oblastí datových výstupů.

Vynález dále zahrnuje způsob určení druhů kokcidiálního prvoka ve vzorku, který zahrnuje vedení analytu obsahujícího suspenzi neznámých sporocyst vzorku uvedeného prvoka v kapalném médium skrze průtokový cytometr; dopadání světla na analyt vedený skrze průtokový cytometr,· měření

01-2090-03-Če • * · • * · * • · · · ·« ·· • · • · • · ·· «·· « alespoň jednoho charakteristického znaku uvedeného vzorku. Alespoň jeden charakteristický znak se zvolí z množiny sestávající z přímého světelného rozptylu, z bočního světelného rozptylu a fluorescence. Potom se určí soubor měření získaných z uvedeného analytu s ohledem na alespoň jeden charakteristický znak, a následně se uvedený soubor měření pro uvedený analyt porovná s referenčním souborem měření, s ohledem na alespoň jeden charakteristický znak, který je odvozen z měření získaných vedením známých sporocyst průtokovým cytometrem; a určí se druhy prvoka v uvedeném analytu.

Popis obrázků na výkresech

Tyto a další znaky, aspekty a výhody vynálezu se stanou zřejmějšími po prostudování následujícího popisu, přiložených patentových nároků a doprovodných výkresů, kde:

Obr. 1 ukazuje výsledky analýzy sporocyst E. acervulina prováděné za použití průtokového cytometru. Obvod identifikovaný jako R1 ' označuje oblast datových výstupů charakteristických pro sporocysty E. acervulina.

Obr. 2 ukazuje výsledky analýzy sporocyst E. maxima prováděné za použití průtokového cytometru. Obvod identifikovaný jako R3 označuje oblast datových výstupů charakteristických pro sporocysty E. maxima.

Obr. 3 ukazuje výsledky analýzy sporocyst E. tenella prováděné za použití průtokového cytometru. Obvod identifikovaný jako R4 označuje oblast datových výstupů charakteristických pro sporocysty E. tenella.

01-2090-03-Če • * · • · · · ♦ · · * ·« *· • ··*« β*

Obr. 4 ukazuje výsledky analýzy smísené populace sporocyst E. acervulina, E. maxima a E. tenella prováděné za použití průtokového cytometru. Obvody identifikované jako Rl, R3 a R4 označují oblasti datových výstupů charakteristických pro sporocysty E. acervulina, E. maxima, resp. E. tenella. Oblast R2 se použila pro kalibraci.

Jednotky na všech obrázcích jsou volně volitelné.

Definice

FSC = přímý světelný rozptyl;

SSC = boční světelný rozptyl;

PBS = fosfátem pufrovaný solný roztok (8,0 g Naci, 0,2 g KH₂PO₄, 0,2 g KC1, 1,15 g Na₂HPO₄ vil H₂O, pH 7,2) .

Výraz „živočich označuje libovolného obratlovce včetně lidských bytostí.

Výraz „analyt označuje kompozici obsahující sporocysty neznámého druhu a/nebo čistoty. To je rozdíl oproti referenční suspenzi nebo referenčnímu vzorku.

Výraz „vzorek označuje reprezentativní část celku, nicméně může označovat i celek jako takový. Vzorkem může být tedy reprezentativní část kompozice, ale rovněž kompozice celá.

Výraz „oblast datových výstupů označuje soubor měření, který zahrnuje frekvenční distribuci kombinací měření, jakými jsou například přímý světelný rozptyl, boční světelný rozptyl a fluorescence, která se získala analýzou analytu obsahujícího sporocysty nebo referenční suspenze,

01-2090-03'Če * · • · • · · ·· ·* » ···» ·· * přičemž tento soubor měření je charakterizován geometrickým obvodem.

Výraz „frekvenční distribuce označuje počet výskytů datové hodnoty v analytu nebo referenční suspenzi. Frekvenční distribuce může rovněž zahrnovat počet hodnot spadajících do stanoveného pevného rozmezí. Data lze sumarizovat tak, že se všechny získané datové hodnoty roztřídí do tabulky podle vymezených rozmezí a následně se sečte výskyt datových hodnot z každého rozmezí ve frekvenční distribuci. Příklad dvourozměrných frekvenčních distribucí je znázorněn na obr. 1 až 4. Pro prezentaci frekvenční distribuce lze rovněž použít grafickou podobu, jakou představuje například sloupcový graf nebo histogram.

Výraz „histogram označuje grafické zobrazení ukazující distribuci zaznamenaných sporocyst ve vzorku rozdělením souboru získaných dat do nepřekrývajících se intervalů a sečtením počtu hodnot, které spadají do každého intervalu.

Výraz „oocysta znamená ínaktivní stádium životního cyklu kokcidiálního prvoka majícího pevný vnější povlak. Po vzniku není oocysta schopná infikace a lze ji rovněž označovat jako nesporulovanou oocystu. Oocysty se po uvolnění z infikované buňky nachází ve střevech živočichů a vylučují se ve stolici.

Výraz „referenční suspenze může zahrnovat suspenzi obsahující jeden známý druh sporocyst, suspenzi obsahující referenční kuličky domnělé velikosti nebo suspenzi obsahující množinu známých druhů sporocyst ve známých koncentracích. Tyto suspenze jsou zde rovněž označovány jako referenční vzorek.

01-2090-03-Če « 9 · * 9 9 • » · · ·· 9 9 • » * • · · · • 9 · • · 999 9 9 9 »9 ·

Výraz „sporulovaná oocysta označuje oocystu, která prošla přirozeným zráním nebo umělou manipulací, takže je schopna infikovat citlivého hostitele. Během zrání se množina sporocyst, z nichž každá je opatřena membránou a vnější slupkou nebo pouzdrem, vyvine uvnitř oocysty a vytvoří tak „cystu uvnitř cysty. Například u prvoka E. tenella obsahuje sporulovaná oocysta čtyři sporocysty, z nichž každá má svoji vnější slupku nebo pouzdro.

Výraz „sporocysta označuje stádium životního cyklu kokcidiálního prvoka majícího vnější povlak nebo pouzdro obsahující množinu sporozoitů, které jsou omezeně infekčním činidlem prvoka. U prvoka E. tenella například každá sporocysta obsahuje dva sporozoity.

Výrazy „encystovaný prvok, „encystovaná oocysta a „encystovaný sporocyst označují organismy, které se nachází uvnitř cysty nebo nají svůj vlastní vnější povlak nebo slupku.

Výrazy „excystovaný prvok a „excystováný sporozoit označují organismus, který se přirozeným nebo mechanickým způsobem uvolnil z cysty. Podle zde uvedené definice tedy nelze sporocystu považovat za excystovaného prvoka; protože sporocysta je zpravidla mechanicky excystována z oocysty. Sporozoit se ze sporocysty zpravidla uvolňuje enzymaticky.

Výraz „zaznamenaná sporocysta označuje sporocystu, která byla detekována a analyzována průtokovým cytometrem.

Cílem následujícího popisu je pomoci odborníkům v daném oboru realizovat vynález. Nicméně tento podrobný popis nelze považovat za přesné vymezení rozsahu vynálezu,

01-2090-03-Če • · · • · ·♦ » ····· I · « ·· * a je tedy zřejmé, že pokud odborník v daném oboru provede určité modifikace zde diskutovaných provedení, potom se nedostane mimo rozsah vynálezu.

Všechny publikace, patenty, patentové přihlášky a další odkazy citované v této přihlášce vynálezu jsou zde zabudovány pouze formou odkazu.

Vzorek, ze kterého se kokcidiální prvok získá, může pocházet z různých zdrojů. U jednoho provedení se vzorek získá z těla živočicha, který má být léčen nebo vakcinován. Alternativně se vzorek získá z reprezentativního živočicha neboli vzorku živočichů větší skupiny živočichů, jakou je například stádo nebo hejno. Vzorek může zahrnovat výkaly, vzorky tkáně nebo kombinaci obou typů vzorků. Příkladem vhodného vzorku tkáně jsou výtěry z trávicího traktu, zejména z intestinální výstelky živočichů. Vzorky výkalů lze získat přímo od živočicha, nicméně je lze shromáždit i z prostředí, ve kterém jsou živočichové chováni, například ze steliva nebo hnoje. Vzorky lze rovněž získat z jiných zdrojů v prostředí, kde jsou zvířata ustájena nebo chována, jakým je například stelivo nebo hnůj, půda, voda, krmivo atd.

Po získání vhodného vzorku(ů) se izoluje prvok. V daném oboru je známo několik metod pro izolaci prvoka, které lze v rámci vynálezu použít. Přehled několika metod izolace oocyst lze nalézt v Ryler a kol. {Parasitology 73: str. 311 až 326, 1976). U jedné metody popsané v patentu US 3 147 186 se oocysty izolují smísením materiálu s kapalinou, při kterém se nechají těžší částice usadit na dně, zatímco lehčí oocysty se vznáší v kapalině. Horní vrstva obsahující oocysty se následně odstraní. Další způsob zahrnuje použití roztoků dostatečné měrné hustoty,

01-2090-03-Če ·* • · » · ·*«« • · · · zpravidla 1,2, ve kterých oocysty plavou k hladině roztoku. Tyto roztoky se zpravidla připravují z vody, do které se přidá cukr (například sacharóza), ZnS0₄ nebo NaCl, které zvyšují měrnou hustotu na požadovanou hodnotu. Flotační metody mohou často zahrnovat předběžný krok, během kterého se materiál filtruje přes síto nebo jemnou gázu a při kterém se odstraní velké částice. Po smísení s roztokem se směs oocyst odstřeďuje a oocysty se izolují z povrchové vrstvy. Krok odstřeďování lze několikrát opakovat.

Další metoda zahrnuje gradienční odstřeďování. Použitý gradient může být diskontinuální nebo kontinuální. Příkladem typického gradientu pro kokcidiální oocysty je 0% až 50% sacharóza. U této metody se materiál obsahující oocysty umístí na vrchol gradientu a odstřeďuje. Po odstřeďování se izoluje vrstva obsahující oocysty. Za účelem zvýšení čistoty výsledného oocystového přípravku lze tento způsob zopakovat. Stejně jako u flotační metody může i této metodě předcházet filtrace materiálu.

Další metody izolace oocyst zahrnují použití kolon se skleněnými korálky (Ryler a kol., Parasitology, 73: str. 311 až 326, 1976) a hydrogenuhličitanetherovou metodu (Smith a Ruff, Poultry Sci., 54: str. 2081 až 2086, 1975). U metody kolony se skleněnými korálky se vodná suspenze výkalů přidá do směsi skleněných korálků a detergentu, jakým je například 5% Tween 80. Připravená směs se následně zavede do kolony naplněné skleněnými korálky a oocysty se nechají proudit kolonou, zatímco velká část nežádoucích výkalů zůstane v koloně zachycena. Proud vytékající z kolony lze následně zahustit odstřeďováním.

U hydrogenuhličitanetherové metody se trus infikovaných kuřat přefiltruje, například přes jemnou gázu,

01-2090-03-Če • « * · 9 « · · ·· · · * ··· přičemž kapalná frakce se zachytí a pevná frakce se zlikviduje. Kapalná frakce se následně zahustí odstřeďováním. Pevná frakce se izoluje a supernatant se zlikviduje. Izolovaná pevná frakce se následně resuspenduje v roztoku 1% hydrogenuhličitanu sodného. Do resuspendované pevné frakce, která má nyní formu suspenze, se následně přidá ether v objemu, který přibližně odpovídá objemu 1% roztoku hydrogenuhličitanu sodného. Směs se následně odstřeďuje. Odpadní zátka a supernatant se zlikvidují a sediment se propláchne resuspendací ve vodě. Tato suspenze se následně odstřeďuje a supernatant se zlikviduje. Sediment se potom izoluje pro následné použití (Smith a Ruff, Poultry Sci., 54: str. 2081 až 2086, 1975).

Ještě další metoda zahrnuje kombinaci přesívání, kontinuálního odstřeďování a filtrace. U této metody se předběžné purifikace dosáhne přesetím materiálu přes síta, která mají postupně se zmenšující otvory. Další purifikace se dosáhne kontinuálním odstřeďováním, při kterém se používá roztok mající výhodně měrnou hustotu 1,01 g/1 až 1,2 g/1. Jako další purifikační krok lze označit filtraci materiálu obsahujícího oocysty po odstřeďování, přičemž k filtraci se použije membrána mající velikost pórů, které umožní zachycení oocyst.

Pokud je například vzorek tvořen výkaly, potom jej lze smísit minimálně se dvěma objemy (hmotn./obj.) nasyceného vodného roztoku NaCl za vzniku suspenze. V případě potřeby lze suspenzi následně zpracovat v mixéru nebo hnětači a získat tak homogenní konzistenci suspenze. Suspenze se odstřeďuje přibližně při 800x G po dobu 10 min při 4 °C. Supernatant se jímá přeléváním přes dvojitou vrstvu 24x24 jemnou textilní tkaninu. Přefiltrovaný supernatant se naředí dvěma objemy pitné vody a odstřeďuje přibližně při

01-2090-03-Če • 9 > »9 9 »9 99

1600x G 10 min při 4 °C. Peletovaný prvok, zpravidla ve stádiu oocysty, se propláchne vodou a peletuje odstřeďováním přibližně 1600x G 10 min při 4 °C a vše se třikrát zopakuje. Prvok se následně třikrát propláchne ve 2,5% roztoku dvojchromanu draselného za použití stejného postupu, jaký byl použit při proplachování vodou. Po konečném propláchnutí lze prvoka skladovat ve 2,5% roztoku dvojchromanu draselného při 4 °C nebo jej přemístit do nádoby určené pro sporulaci.

Alternativně lze k izolaci prvoka použít postupnou filtraci založenou na velikosti. U alternativního postupu se výkaly umístí do nádoby ochlazené na teplotu přibližně 4,4 °C až 10 °C a smísí s vodou, výhodně při poměru přibližně 0,9 kg výkalů na 4,5 1 vody. Směs se míchá za vzniku suspenze a následně přečerpá na vibrační rošt opatřený síty, výhodně s velikostí ok 50 mesh až 250 mesh, kde dojde k odstranění velkých částic hmoty. Materiál, který projde sítem, se jímá a přečerpává do kontinuální proudové odstředivky, jejíž teplota se rovněž udržuje v rozmezí 4,4 °C až 10 °C. Výsledný koncentrát pevného materiálu obsahující oocysty se jímá a přidá do stejného objemu koncentrované sacharózy nebo kukuřičného sirupu vyšší fruktózy (HFCS). Do získané směsi se přidá stejný objem vody, takže celkový finální objem dosáhne přibližně čtyřnásobku objemu počátečních pevných látek. Měrná hustota finální směsi je výhodně dostatečná pro udržení oocyst ve vznosu a výhodně se pohybuje v rozmezí přibližně od 1,01 g/1 až do 1,2 g/1 a výhodněji dosahuje přibližně 1,09 g/1. Finální směs se následně přečerpá do kontinuální odstředivky rychlostí, která umožňuje oocystám zůstat v kapalné fázi. Pevný podíl se zlikviduje. Zahuštění oocyst a odstranění reziduálního cukru lze realizovat kontinuálním

01-2090-03-Če * · · • · ♦ · • · · · *« 99 • · · • ♦ · » · · · ·· ··

9 · »··* • · ·

9 proudovým odstřeďováním při vysoké rychlosti plnění, která umožní lehčím oocystám plavat na homogenním roztoku vody a sacharózy. Alternativně lze materiál odstřeďovat v rotační odstředivce. V tomto případě se supernatant odstraní a oocysty ve výsledných peletách se resuspendují ve vodě. Reziduální cukr lze navíc odstranit filtrací za použití filtru s velikostí pórů, kterou projdou oocysty. V případě použití filtrace je výhodné tangenciální proudění. Izolované oocysty se umístí do sterilní vody nebo 2,5% roztoku dvojchromanu draselného a skladují při 2 °C až 8 °C až do sporulace.

Kokcidiální prvok obsažený ve vzorku se bude zpravidla nacházet ve vývojovém stádiu oocysty. V těchto případech je u oocyst vyvolána sporulace. Metody sporulace kokcidiální oocyst jsou v daném oboru známy.

Sporulace je aerobní proces, ke kterému dochází při teplotě mezi 1 °C až 43 °C, výhodně mezi 15 °C až 38 °C, výhodněji mezi 20 °C až 30 °C a ještě výhodněji mezi přibližně 28 °C až 30 °C. Sporulační systémy mohou být bud' statické nebo systémy využívající nuceného provzdušňování. U statických systémů se kapalina obsahující oocysty udržuje ve vzduchové nebo kyslíkové atmosféře. U systému s nuceným provzdušňováním se nechá sporulační kapalinou probublávat vzduch nebo kyslík. Alternativně se provzdušňování dosáhne mícháním nebo protřepáváním kapaliny. Sporulační roztoky zpravidla rovněž obsahují 2 % až 3 % dvojchromanu draselného.

Sporulaci lze například provádět tak, že se oocysty umístí do nádoby naplněné vodným roztokem 2,5% dvojchromanu draselného a otvor se uzavře bavlněnou nebo gumovou zátkou. Nádoba se protřepává na orbitální protřepávačce při

01-2090-03-Če * 9 • 9

9 9

9 9 9 « 9 9 9

99

9 9 9999

9 9 ·

frekvenci otáčení 250 min¹ 48 h až 72 h při teplotě 28 °C až 30 °C, Alternativně lze roztok obsahující oocysty konstantně míchat a současně tímto roztokem nechat probublávat vzduch při průtoku přibližně 707 1/h až 2122 1/h. Během sporulačního procesu se v pravidelných intervalech odebírají vzorky a testují na sporulaci mikroskopickým zkoumáním oocyst s cílem určit, zda obsahují sporocysty.

Po sporulaci lze sporulované oocysty jímat filtrací, odstředbváním nebo jiným odborníkům v daném oboru známým přijatelným zahušíovacím postupem. Sporulované oocysty lze například zahustit lOmin odstřeďováním přibližně při 1600x G při 4 °C, přičemž supernatant se zlikviduje. Po zahuštění lze sporulované oocysty dezinfikovat, například suspendací v 5,25% chlornanu sodném 10 min při 4 °C. Po dezinfekci se sporulované oocysty izolují z chlornanu sodného naředěním a odstřeďováním při 1600x G po 10 min při 4 °C nebo jiným přijatelným způsobem. Sporulované oocysty se následně čtyřikrát až šestkrát propláchnou sterilní vodou. Po propláchnutí lze sporulované oocysty skladovat ve 2,5% roztoku dvojchromanu draselného, fosfátem pufrovaném solném roztoku (PBS) obsahujícím 30 pg/ml gentamicinu nebo dalšího přijatelného dezinfekčního nebo konzervačního činidla.

Po sporulaci se ze sporulovaných oocyst získají sporocysty. Odborníkům v daném obru jsou známy různé metody pro izolaci sporocyst ze sporulovaných oocyst a tyto metody zahrnují mechanické, chemické a enzymatické porušení stěny oocysty. Nyní bude popsán reprezentativní příklad metody mechanického porušení. Sporulované oocysty se naředí do koncentrace přibližně 2x 10⁶/ml v PBS. 1 ml 2x 10⁶/ml Suspenze sporulovaných oocyst se přidá do l,5ml

01-2090-03-Če * 4 ·

4 4 4

4 · 4

44 »

4 4 4 4 > 4 4 4 ·

44

444 4 4 4 mikroodstředivkových kyvet obsahujících 125 μΐ skleněných korálků o průměru 0,5 mm. Kyvety obsahující sporulované oocysty a skleněné korálky se odstřeďují vysokou rychlostí 5 min a potom se ochladí na ledu. Po odstředění se 10 μΐ vzorku zkoumá pod mikroskopem za účelem zjištění rozsahu porušení oocysty. Pokud zůstane velký počet oocyst nedotčených, potom lze odstřeďování opakovat v jednominutových intervalech až do okamžiku, kdy budou porušeny v podstatě všechny oocysty.

Po odstřeďování se supernatant odstraní a uschová. Skleněné korálky se následně propláchnou PBS a supernatant se uschová a sloučí se supernatantem získaným po odstřeďování. Supernatant se následně 2 min odstřeďuje přibližně při 9020x G u vzorků obsahujících E. maxima nebo E. tenella a 3 min u vzorků obsahujících E. acervulina nebo smísené populace. Supernatant se zlikviduje. Pelety se resuspendují v 0,2 ml PBS. Pelety budou sice výhodně obsahovat zejména sporocysty, nicméně odborníkům v daném oboru je zřejmé, že zde budou rovněž přítomny nepoškozené oocysty, prázdné povlaky oocyst a sporozoity. Získaný přípravek se výhodně dále purifikuje za účelem zvýšení obsahu přítomných sporocyst, přičemž tato purifikace se provádí v daném oboru obecně známými metodami. Izolaci sporocyst lze například provádět odstřeďováním za použití 50% Percoll způsobem, který popsal Dulski a Turner (Avian Diseases, 32: str. 235 až 239, 1988), zde uvedeno formou odkazu. Stručně řečeno, peleta získaná výše uvedeným způsobem se resuspenduje v 1 ml 50% Percoll, odstřeďuje výše popsaným způsobem a supernatant se zlikviduje. Výsledná peleta se opět suspenduje v 50% Percoll, odstřeďuje a supernatant se opět zlikviduje. Finální peleta se resuspenduje v PBS. Koncentrace prvoka na 1 ml se • 4

01-2090-03-Če

4 4

4 4 » 4 4 4

44

44

4444 následně stanoví za použití hemacytometru nebo jiné metody, která je schopna stanovit počet buněk.

Počet sporocyst v každém vzorku, který má být analyzován, se bude lišit s použitým průtokovým cytometrem. Výhodně bude vzorek dostatečně velký na to, aby poskytl spolehlivou a opakovatelnou identifikaci sledovaného kokcidiálního prvoka. Při testování několika velikostí vzorku může být potřebné určení optimální velikosti vzorku, nicméně toto určování je rutinním procesem, který je odborník v daném oboru schopen realizovat bez nutnosti experimentálních studií.

Finální koncentrace vzorku může být různá a je omezena kapacitou průtokového cytometru použitého v rámci vynálezu. Naředěný vzorek umožní delší dobu analýzy a umožní tím získat spolehlivou sadu dat. Vzorek, který je zcela zahuštěn, nelze pomocí některých průtokových cytometrů analyzovat s potřebnou přesností.

U jednoho provedení se v každém vzorku, který je analyzován průtokovou cytometrií, analyzuje přibližně 80 000 sporocyst. Tyto sporocysty se umístí do nádoby a naředí PBS. výhodně se použije nádoba, která je kompatibilní s průtokovým cytometrem. U jednoho provedení se sporocysty umístí do polystyrénových zkumavek, například zkumavek o rozměrech 12x 75 mm (FISHER č. 14-961010), které se do 600 μΐ doplní PBS. Finální vzorek tedy obsahuje přibližně 80 000 sporocyst na 600 μΐ. Zjistilo se, že takové koncentrace poskytují v běžných časových periodách spolehlivá data.

Případně lze sporocysty barvit pomocí barvy nebo barviva, a tím usnadnit analýzu. Lze použít libovolné v

01-2090-03-Če • * • ··· daném oboru známé barvivo nebo barvu, které jsou schopny obarvit kokcidiální sporocysty. U jednoho výhodného provedení je barvou nebo barvivém fluorescenční barva nebo barvivo. Neomezujícím příkladem vhodného barviva je ethidiumbromid, který lze pro obarvení sporocyst použít v koncentracích 2 pg/ml až 10 pg/ml.

Vzorek sporocyst se analyzuje za použití průtokového cytometru, Vzorek sporocyst, tj. suspenze obsahující jeden nebo více neznámých druhů sporocyst, zejména z rodu Eimeria, představuje „analyt, a je tedy analyzován za použití průtokového cytometru, V případech, kdy spotřebitel požaduje určení a ověření čistoty a obsahu druhů přítomných v této vakcíně, může analyt rovněž zahrnovat komerčně dostupné vakcíny kokcidiózy. Bez ohledu na počáteční koncentraci a bez ohledu na zdroj analytu lze analyt naředit nebo zahustit na koncentraci, která je přijatelná pro použití v průtokovém cytometru použitém v rámci vynálezu. Výhodně analyt obsahuje 80 000 sporocyst na 600 pl.

Průtokové cytometry, které lze použít v rámci vynálezu, zahrnují neomezujícím způsobem Becton-Dickinson FACScan (Becton-Dickinson Corp., Mountaín View, CA) nebo jeho ekvivalent. Průtokový cytometr použitý v rámci vynálezu lze použít ve spojení se software, který usnadní analýzu dat generovaných průtokovým cytometrem. Software, který lze použít, zahrnuje neomezujícím způsobem CellQuest software (Becton-Dickinson Corp.). Software se použije pro analýzu frekvenční distribuce referenčních suspenzí pro usnadnění tvorby referenčních oblastí datových výstupů. Software se rovněž použije pro analýzu frekvenční distribuce dat generovaných analyty. Výhodný je software, který umožňuje rozlišit procento dat analytu, které se vyskytuje v referenčních oblastech datových výstupů.

01-2090-03-Če • «

Analyt, který obsahuje suspenzi neznámých nebo domněle známých sporocyst vzorku prvoků v kapalném médiu, je veden průtokovým cytometrem. Světelný zdroj, kterým je zpravidla argonový laser, se použije pro dopadání světla na analyt proudící průtokovým cytometrem.

Průtokový cytometr se nastaví na měření alespoň jednoho charakteristického znaku analytu, takže například lze průtokový cytometr nastavit na zaznamenávání dat přímého světelného rozptylu (FSC) a bočního světelného rozptylu (SSC). Pokud se použije fluorescenční barvivo, potom lze průtokový cytometr rovněž nastavit tak, aby zaznamenával intenzitu světelných emisí při vlnové délce charakteristické pro použité barvivo nebo barviva. Fluorescenční intenzitu lze měřit za použití logaritmické nebo lineární stupnice. Při měření jasné fluorescence se Často používá lineární stupnice. Při měření tlumené fluorescence se zpravidla používá logaritmická stupnice.

Před analýzou neznámých vzorků se provede kalibrace přístroje. Ke kalibraci lze použít referenční kuličky známé velikosti (například COULTER Check Fluorosphere Beads) (Coulter Corp., Hialean, FL) , světelného rozptylu a pokud je to možné, fluorescenční charakteristiky a/nebo lze použít jednodruhové populace sporocyst (referenční suspenzi). Data získaná z kalibračních vzorků lze použít pro definici referenčních oblastí datových výstupů, tj. frekvenční distribuci kombinací měření, jakými jsou přímý světelný rozptyl, boční světelný rozptyl a fluorescence, získaných analýzou referenční suspenze obsahující referenční kuličky nebo známého druhu, případně druhů, sporocyst. Lze použít libovolnou kombinaci FSC, SSC a/nebo fluorescence, která umožní identifikaci sledovaných kokcidiálních druhů. Výhodně mají referenční suspenze

01-2090-03-Če • · · * · · · • · · · ·· ·· • · · • » * • · · · o ·· • *··♦ použité ke kalibraci přístroje nebo k vytvoření referenčních oblastí datových výstupů koncentrace v podstatě stejné s koncentrací vzorku, který má být analyzován. Výhodně mají referenční suspenze a analyt stejnou koncentraci. Nejvýhodněji dosahuje koncentrace referenční suspenze a analytu 80 000 sporocyst na 600 pl.

Data získaná z průtokového cytometru při analýze vzorku, který obsahuje sporocysty neznámého druhu nebo druhů, lze následně zpracovat například za použití vhodného softwaru pro ukládání a analýzu. Software, jakým je například CellQuest, usnadňuje získání dat, což znamená, že tento software zpracovává a ukládá data získaná při analýze analytu. Tento software lze použít pro uložení nastavených hodnot použitého měřícího přístroje (jak při analýze analytů, tak při analýze referenčních suspenzí). Těmito nastavenými hodnotami jsou například použité napětí, protože rozdíly v napětí budou výraznou měrou ovlivňovat výsledky. Takový software lze rovněž použít pro následnou analýzu, tj. k porovnání získaných dat s referenčními oblastmi datových výstupů. Takový software může ukládat soubory dat generované měřením alespoň jednoho charakteristického znaku vzorku. Tento charakteristický znak lze zvolit z množiny sestávající z přímého světelného rozptylu, bočního světelného rozptylu a fluorescence. Zjistilo se, že různé druhy sporocyst vykazují různé soubory dat získané na základě měření jednoho nebo více výše jmenovaných charakteristických znaků. Soubor neboli oblast datových výstupů generovaný vzorkem obsahujícím neznámý druh nebo neznámé druhy prvoka lze následně porovnat s referenčními soubory, například s referenčními oblastmi datových výstupů, a stanovit tak druh nebo druhy přítomné v analytu. Referenční soubor obsahuje známou • 0

01-2090-03-Če • · 0 0 • 0 0 0 0 « 0 0 0 0 ·· 00 00 • ♦ 0 4 •« 0 0 0000 • 000 00 · frekvenční distribuci, s ohledem na alespoň jeden charakteristický znak známých sporocyst nebo alespoň jednu referenční suspenzi ve stejném rozmezí hodnot, které se získaly, pokud se známé sporocysty nebo alespoň jedna referenční suspenze vedla průtokovým cytometrem za referenčních podmínek.

Software pro analýzu dat provádí toto srovnání tak, že porovná frekvenční distribuci pro alespoň jeden z výše zmíněných charakteristických znaků, výhodně frekvenční distribuci pro více než jeden charakteristický znak, se souborem měření stejného charakteristického znaku nebo kombinace charakteristických znaků získaných při měření analytu. Software může poskytnout rychlou a přesnou kvantitativní analýzu dat, která poskytne například informaci o procentu frekvenční distribuce analytu, které leží v referenční oblasti datových výstupů.

Průtokové cytometry mohou analyzovat velký počet prvoků během krátké časové periody. Některé průtokové cytometry jsou schopny analyzovat až 10 000 buněk/s. V reálném čase, tj. zatímco vzorek prochází průtokovým cytometrem, je zpravidla zobrazován histogram zahrnující alespoň jeden parametr. Počet sporocyst ve vzorku je možné kvantifikovat pomocí různých počítačových programů. Tyto programy mohou rychle sečíst počet sporocyst nebo zaznamenat sporocysty ve vzorku. V podstatě je možné kvantifikovat počet sporocyst, které jsou pozitivní pro příslušný parametr, v populaci smíšených druhů. Software lze rovněž použít pro sečtení počtu zaznamenaných sporocyst, jejichž frekvenční distribuce spadá do referenční oblasti datových výstupů.

01-2090-03-Če • ♦ • » · • · · • · · • · ·· • · · ♦ • · ···· • · · ·♦ A

Referenční suspenze zpravidla obsahují stejné nebo ekvivalentní médium jako analyt. U jednoho provedení médium obsahuje lx PES. Použité médium může být odlišné, ale je výhodné, pokud je médium pro referenční suspenzi a pro analyt v podstatě stejné.

Referenční soubor neboli oblast datových výstupů se získá vedením referenční suspenze známých sporocyst skrze průtokový cytometr a dopadáním světla na uvedenou suspenzi za podmínek, které jsou v podstatě stejné s podmínkami použitými při analýze neznámého vzorku. Tyto podmínky výhodně zahrnují v podstatě stejnou kapalinu pro vytvoření pláště, průtok, teplotu, vlnovou délku laseru, nastavení energie laseru a, jak již bylo zmíněno výše, měření alespoň jednoho stejného charakteristického znaku (FSC, SSC a/nebo fluorescence). U jednoho provedení se použije stejný průtokový cytometr a podmínky jak pro referenční suspenzi, tak pro neznámý vzorek. U dalšího provedení se průtokovým cytometrem vedou známé sporocysty za účelem stanovení referenčního souboru měření použitého pro nakreslení obvodu referenční oblasti datových výstupů. U výhodného provedení se průtokovým cytometrem vede množina suspenzí obsahujících známé sporocysty za účelem stanovení množiny souborů měření, jejichž kompilací se vytvoří kompozitní soubor měření, který definuje referenční soubor měření.

Obvody referenční oblasti datových výstupů definují oblast, ve které leží hodnoty spadající do souboru měření alespoň jednoho charakteristického znaku konkrétního druhu. Například na obr. 1 definuje R1 referenční oblast datových výstupů pro E. acervulina. Pokud se z analytu získají data a alespoň 50 % těchto dat leží v oblasti datových výstupů známého druhu, potom z této informace vyplývá, že analyt obsahuje tento známý druh. Přesnost identifikace je vyšší,

01-2090-03-Če fr ·· • · · · • * ·»»» • · * ·♦ · pokud do oblasti datových výstupů známého druhu spadá alespoň 85 % dat získaných z analytu. Ještě větší určitost poskytuje měření, při kterém v oblasti datových výstupů známého druhu leží alespoň 90 % dat získaných z analytu. Pro účely kvalitativní kontroly může být výhodné stanovit jako kritérium požadavek, aby alespoň 95 % dat získaných z analytu leželo v oblasti datových výstupů známého druhu.

V dalším aspektu vynálezu se pro vytvoření množiny referenčních oblastí datových výstupů analyzuje množina referenčních suspenzí, z nichž každá obsahuje stejný druh nebo druhy. Tento velký počet dat je dále analyzován, ve snaze vytvořit dobře definovanou referenční oblast datových výstupů, která bude lépe reprezentovat známý druh nebo druhy, u dalšího aspektu vynálezu se referenční soubor dat vytváří kompilací množiny souborů měření získaných bud' při analýze suspenzí obsahujících známé oocysty, nebo při analýze známých suspenzí za účelem vytvoření kompozitního souboru měření. Kompilace množiny oblastí datových výstupů pro známý druh nebo druhy za účelem vytvoření kompozitního souboru měření je výhodná, protože pozadí tvořené zbytkem vzorku a nepoškozené oocysty, které nebyly odstraněny během purifikace sporocyst, mohou ovlivňovat obvod libovolného souboru měření. Navíc, aniž bychom se vázali na některou konkrétní teorii, je třeba poznamenat, že nekonzistence referenčních dat je pravděpodobně způsobena změnami v pufru použitém pro suspendaci sporocyst. Parametry pro provádění průtokové cytometrie, tj. naměřené charakteristické znaky a obvody referenčních oblastí datových výstupů, lze ukládat v souborech dat, které lze následně přenášet do jiného průtokového cytometru majícího slučitelný software.

Soubory měření pro analyt obsahují frekvenční distribuci měření pro množinu rozmezí hodnot pro alespoň

01-2090-03-Če » · i · ♦ • · »· * · · ** ·« • · · • φφ · · • φ jeden z výše zmíněných charakteristických znaků. Po získání se soubory měření analytu porovnají se souborem měření alespoň jednoho referenčního vzorku. Toto porovnání se výhodně provádí v rozsahu stejné množiny rozmezí hodnot jako v případě vedení referenční suspenze průtokovým cytometrem za referenčních podmínek. Výhodněji se soubor měření získaných pro analyt porovná s množinou souborů měření získaných pro referenční suspenze, přičemž tyto referenční suspenze obsahují sporocysty různých druhů. U jednoho provedení se soubor měření neboli oblast datových výstupů pro environmentální vzorek, který může obsahovat jeden nebo více druhů kokcidiálního prvoka rodu Eimeria, porovná s referenčními soubory, které obsahují soubory měření získané pro referenční suspenze obsahující kokcidiálního prvoka rodu Eimeria, přičemž referenční suspenze může například obsahovat sporocysty E. tenella, E. acervulina a E. maxima. Soubor měření environmentálního vzorku lze například porovnat s oblastmi datových výstupů R1 až R4, které jsou znázorněny na obr. 1 až obr. 4.

Za použití průtokového cytometru se sestaví soubor měření, který výhodně obsahuje kombinace měření množiny různých charakteristických znaků analytu. Soubor měření stanovený pro analyt obsahuje frekvenční distribuci naměřených hodnot charakteristického znaku nebo frekvenční distribuci kombinací naměřených hodnot množiny charakteristických znaků. U histogramu lze frekvenční distribuci vyjádřit počtem měření charakteristického znaku spadajícím do jednotlivých rozmezí hodnot množiny postupných rozmezí hodnot nebo spadajícím do jednotlivých rozmezí hodnot množiny kontinuálních kombinací rozmezí hodnot. Referenční soubor sestává z frekvenční distribuce naměřených hodnot nebo kombinací naměřených hodnot pro

01-2090-03-Če • ♦ • ♦ · · * ♦ · stejný charakteristický znak nebo kombinaci charakteristických znaků, které byly měřeny u analytu, v obou případech získaných za referenčních podmínek; a pokud je vyjádřen ve formě histogramu, potom výhodně odebraných ve stejných rozmezích hodnot nebo kombinacích rozmezí hodnot použitých pro sestrojení histogramu pro daný analyt. Výhodně se soubor dat pro analyt stanoví za stejných podmínek, za jakých se získal referenční soubor dat.

Soubor měření získaný pro analyt nebo pro referenční suspenzi tvoří oblast datových výstupů průtokového cytometru. Oblasti datových výstupů lze generovat na základě analýzy referenčních suspenzí a analytů obsahujících neznámé počty a druhy kokcidiálního prvoka. Oblasti datových výstupů spadají do pole, které má rozměry množiny měřených charakteristických znaků. Přesnost identifikace je vyšší, pokud je alespoň přibližně 85 % dat generovaných analytem charakterizovaných jako data obsažená v oblasti datových výstupů generované průtokovým cytometrem pro množinu charakteristických znaků referenční suspenze.

Získaná data jsou zpravidla znázorněna v závislosti na počtu měřených parametrů ve formě dvourozměrných nebo trojrozměrných histogramů. V histogramech mohou být následně identifikovány oblasti nebo píky, které jsou charakteristické pro sledované druhy. Takové histogramy odrážejí frekvenci alespoň dvou charakteristických znaků z množiny měřených charakteristických znaků, tj. FSC, SSC, nebo fluorescence. Pokud je ve vzorku přítomen více než jeden druh, potom lze pro stanovení poměrného zastoupení každého druhu ve vzorku použít statistickou analýzu dat.

Pokud to spadá mezí schopností průtokového cytometru, potom lze tento cytometr rovněž použit pro roztřídění

01-2090-03-Če prvoků ve vzorku podle druhů za použití dat získaných při měření parametrů charakteristických pro uvedené druhy.

U výhodného provedení se získaná data použijí pro sestavení dvourozměrných histogramů SSC vs. FSC. Tyto histogramy ukazují soubory měření, které obsahují frekvenční distribuci množiny kombinací těchto měření v rozsahu množiny kombinací rozmezí hodnot pro uvedenou množinu kombinací měření. U jednoho provedení se oblasti datových výstupů definují za použití dat získaných z referenčních kuliček nebo referenčních suspenzí nakreslením obvodu okolo oblastí SSC vs. FSC histogramů, které obsahují výskyty dat pro sledovaný druh. Tento obvod lze například nakreslit ručně na výtisku histogramu ukazujícím soubor měření pro referenční suspenzi. U jednoho provedení lze přes množinu souborů měření obsahujících frekvenční distribuci měření v celém rozsahu hodnot pro alespoň jeden charakteristický znak postupně klást acetátovou fólii nebo jiný průhledný materiál a obvody, které jsou na těchto fóliích nakresleny pro každý následný referenční soubor měření, vytvoří kompilaci množiny referenčních oblastí datových výstupů. Kompilací množiny referenčních souborů se vytvoří kompozitní soubor měření. Obvod kompozitního referenčního souboru měření se následně nakreslí tak, aby uvnitř zachycoval většinu frekvenčních distribucí generovaných množinou známých sporocyst. U ještě dalšího provedení se obvod kompilovaného referenčního souboru měření nakreslí tak, aby zachycoval frekvenční distribuci generovanou množinou referenčních suspenzí. Pro nakreslení těchto obvodů lze alternativně použít software. Parametry použité pro nakreslení obvodu mohou zahrnovat neomezujícím způsobem průměr a/nebo nej častější hodnotu frekvenční distribuce generované referenční suspenzí.

01-2090-03-Če • *

U jednoho provedení zachycuje nakreslený obvod přibližně 85 % zaznamenaných dat. Výhodně tento obvod zachycuje přibližně 90 % zaznamenaných dat. Odborníkovi v daném oboru je zřejmé, že za část zaznamenaných dat je zodpovědný zbytek vzorku nebo kontaminace v referenční suspenzi, a nelze je tedy brát v úvahu při sestrojování obvodu. Bez ohledu na to, zda se obvod nakreslí ručně nebo za použití počítače, se tento geometrický obvod následně uloží za použití vhodného software do počítače. U výhodného provedení je kompozitní obvod definován postupně porovnávanými obvody nakreslenými okolo dat, která jsou generována pro množinu referenčních suspenzí obsahujících stejné známé druhy kokcidiálního prvoka. U jednoho provedení je kompozitní obvod odvozen na základě analýzy acetátové fólie, na které byla nakreslena množina obvodů referenčních oblastí datových výstupů a na základě eliminace nepravidelností a rozdílů mezi jednotlivými referenčními oblastmi datových výstupů. Software lze rovněž použít pro kompilaci a analýzu množiny referenčních oblastí datových výstupů za účelem odvození kompilované oblasti datových výstupů. Takový software může eliminovat nepravidelnosti a rozdíly mezi jednotlivými obvody a/nebo stanovit střední a/nebo nej častěji se vyskytující hodnotu množiny obvodů. Kompozitní obvody definují referenční soubor měření, který je zde rovněž označován jako referenční oblast datových výstupů.

Přestože lze oblast datových výstupů definovat na základě výsledků jediné analýzy referenčních kuliček nebo referenční suspenze, je výhodné, pokud se tato oblast datových výstupů definuje na základě kompozitu několika analýz. U jednoho provedení je oblast datových výstupů definována kompozitem alespoň tří analýz referenční

01-2090-03-Če • · » · » • · · · · · * * · · · · • · ·» >· • · · * »·· • . I suspenze, přičemž referenční suspenze obsahuje přibližně 2500 až přibližně 5000 sporocyst vypočtených na test před ukončením analýzy. U ještě dalšího provedení je obvod oblasti datových výstupů definován kompozitem alespoň deseti analýz, u dalšího provedení kompozitem alespoň dvaceti analýz a u ještě dalšího provedení kompozitem alespoň třiceti analýz. Obr. 1 znázorňuje analýzu E. acervulina s obvodem Rl, který definuje kompozitní oblast datových výstupů pro E. acervulina. Obr. 2 znázorňuje analýzu E. maxima s obvodem R3, který definuje kompozitní oblast datových výstupů pro E. maxima. Obr. 3 ukazuje analýzu E. tenella s obvodem R4, který definuje kompozitní oblast datových výstupů pro tento druh. oblast R2 se použila pro kalibrační účely. Pokud je přítomen více než jeden druh sporocyst, potom lze procento každého druhu vypočíst tak, Že se počet sporocyst v jedné oblasti vydělí celkovým počtem sporocyst ve všech oblastech obsahujících sporocysty.

U ještě dalšího výhodného provedení obsahuje analyzovaný vzorek přibližně 170 sporocyst až přibližně 40 sporocyst na 1 pg. U výhodnějšího provedení vzorek obsahuje přibližně 150 sporocyst až přibližně 115 sporocyst na 1 pg.

U nejvýhodnějšího provedení vzorek obsahuje přibližně 130 sporocyst na 1 pg. Takovou koncentraci lze získat suspendováním přibližně 80 000 sporocyst v 600 pg PBS. To vede k získání 130 000 sporocyst na 1 ml nebo 130 sporocyst na 1 pg. Zjistilo se, že taková koncentrace umožňuje rychlou analýzu v případě použití typického průtokového cytometru. Vzorky lze připravit ve vyšší nebo nižší koncentraci. Méně koncentrované vzorky vyžadují delší dobu pro analýzu dostatečného minimálního počtu sporocyst průtokovým cytometrem. Koncentrovanější vzorky mohou

01-2090-03-Če • » · • · · • · · * ·· ·· • »· * • · ··· • · ♦ •β .

snižovat přesnost měření, v závislosti na koncentraci tohoto vzorku a na kapacitě příslušného průtokového cytometru použitého v rámci vynálezu. Odborník v daném oboru je schopen po zjištění kapacity uvedeného měřícího přístroje stanovit dostatečnou koncentraci bez předchozích experimentů.

Pokud je v suspenzi o celkovém objemu 0,6 ml přítomno 80 000 sporocyst a pokud se předpokládá, Že vzorek obsahuje jeden druh prvoka, potom je výhodné vést vzorek analytu průtokovým cytometrem až do okamžiku, kdy je nalyzováno přibližně 5000 sporocyst. Domněle jednodruhový vzorek nebo analyt se tedy analyzují až do okamžiku sečtení 5000 sporocyst. Pokud se předpokládá, že vzorek obsahuje více druhů sporocyst, například pokud se jedná o environmentální vzorek nebo pokud se testuje čistota složení vakcíny, potom je výhodné tento vzorek analyzovat až do okamžiku, kdy je sečteno přibližně 2500 sporocyst. Domněle vícedruhový vzorek nebo analyt se tedy analyzují až do okamžiku sečtení 2500 sporocyst.

Předložený vynález má široké uplatnění. Tento způsob lze například použít pro vývoj speciální vakcinace a/nebo léčebných programů. U vývoje léčebných programů lze vzorky získat buď od jednotlivých infikovaných zvířat nebo od reprezentativních zvířat dané skupiny. Alternativně nebo navíc lze vzorky získat z prostředí, ve kterém jsou zvířata chována, například ze steliva nebo hnoje, krmivá, vody atd. Vzorky lze následně analyzovat zde popsaným způsobem a stanovit tak druhy přítomného kokcidiálního prvoka a v případě, že je přítomen více než jeden druh, potom i relativní počet jednotlivých druhů. Tuto informaci lze následně použít při navrhování léčebných programů používajících léčiva, která jsou účinná proti přítomným

01-2090-03-Če druhům. Způsoby léčby kokcidiózy jsou v daném oboru známy a lze je vyhledat ve standardní veterinární literatuře, například v The Merck Veterinary Manual, 8. vydání, Merck & Co., 1998.

U dalšího provedení lze způsob podle vynálezu použít pro navržení vhodných vakcinačních programů. V současné době používají vakcíny proti kokcidióze pro dodání imunity živé prvoky. Protože vakcinace má za následek subklinický případ kokcidiózy, nežádoucím způsobem ovlivňuje produkci následné vakcinace. Předpokládá se, že tyto nežádoucí účinky může snížit omezení vakcinace pouze na ty kokcidiální druhy, které jsou v prostředí, v němž jsou zvířata chována, skutečně přítomny.

U tohoto provedení se vzorek odebere z prostředí, v němž jsou zvířata chována nebo výhodněji z prostředí, v němž zvířata mají být chována. Vzorek lze získat z libovolného vhodného zdroje, který zahrnuje neomezujícím způsobem stelivo, hnůj, vodu, krmivo, vybavení chovného zařízení, klece a zásobníky krmivá. Vzorky se následně analyzují způsobem podle vynálezu, který stanoví, zda je kokcidiální prvok přítomen, a v kladném případě určí, jaké druhy prvoka jsou přítomny. Na základě získaných výsledků lze následně zvířata vakcinovat proti těm druhům prvoka, jejichž přítomnost byla zjištěna ve vzorku prostředí, ve kterém jsou zvířata chována. Způsob podle vynálezu lze tedy použít ke zjištění, zdali je vůbec kokcidiální prvok v prostředí přítomen. V těch případech, kdy se zjistí, že testované prostředí neobsahuje žádný druh prvoka, který by působil patogenním způsobem na druhy živočichů, které jsou v daném prostředí chovány, může chovatel do budoucna snížit náklady tím, Že omezí uvedenou vakcinaci.

01-2090-03-Če

Způsob podle vynálezu bude rovněž nacházet uplatnění při kontrole kvality kokcidiálních vakcín. Jak již bylo diskutováno výše, mnoho kokcidiálních vakcín obsahuje směs několika druhů kokcidiálního prvoka. Tyto vakcíny se vyrábějí smísením kokcidiálních prvoků izolovaných z těla hostitelských zvířat infikovaných čistou linií obsahující jeden druh. Aby se zabránilo kontaminaci dalšími druhy, je třeba získané kokcidiální prvoky trvale monitorovat. Až do této doby se pro toto monitorování používala mikroskopická analýza. Vynález nyní poskytuje rychlou a přesnou metodu ověření čistoty kokcidiálního prvoka produkovaného naočkovanými hostiteli. Způsob podle vynálezu lze dále použít při ověřování složení druhů prvoka v konečné vakcíně na monitoru při směšování nebo pro zjišťování dalších chyb, které by mohly mít za následek jiné druhové složení konečné vakcíny.

Příklady provedení vynálezu

Následující příklady mají pouze ilustrativní charakter a nikterak neomezují rozsah vynálezu, který je jednoznačně vymezen přiloženými nároky.

Příklad 1

Identifikace druhů Eimeria v jednodruhových vzorcích

Zde popsanými metodami se izolovaly oocysty E. tenella, E. acervulina a E. maxima. Koncentrace sporulovaných oocyst se stanovila za použití hemacytometru a nastavila na lx 10⁶ oocyst/ml u E. maxima a 2x 10⁶ oocyst/ml u E. acervulina a E. tenella. Přibližně 125 pl

01-2090-03-Če • 4 • 4 • « 4

V 444 • 4 skleněných korálků o průměru 0,5 mm se přidalo do kyvet mikroodstředivky obsahujících 1 ml sporulovaných oocyst v PBS. Kyvety se následně odstřeďovaly na odstředivce FISHER (Fisher Scientific) při rychlosti nastavené na stupeň 7 až 8 po dobu 5 min. Po odstředění se odebralo 10 μΐ vzorku na kontrolu porušení oocyst. Pokud nebyla v podstatě žádná z oocyst poškozená, potom se vzorek opakovaně odstřeďoval v jednominutových intervalech až do okamžiku, kdy byly v podstatě všechny oocysty porušeny.

Po odstřeďování se skleněné korálky nechaly usadit a supernatant se přemístil do čisté kyvety mikroodstředivky. Korálky se následně propláchly odstřeďováním s 500 μΐ PBS a tekutý supernatant se jímal a přidal k již získanému supernatantu. Kyvety obsahující sloučený supernatant se následně odstřeďovaly přibližně při 9020x G po dobu 2 min v případě kyvet obsahujících E. maxima nebo E. tenella nebo 3 min v případě kyvet obsahujících E. acervulina. Výsledné pelety se resuspendovaly v 1 ml 50% Percoll, odstřeďovaly výše uvedeným způsobem a supernatant se zlikvidoval. Tento způsob se zopakoval a peleta se resuspendovala v 200 μΐ PBS a zjistila se koncentrace sporocyst. Pro účely analýzy průtokovou cytometrii se do každé polystyrénové zkumavky umístilo přibližně 80 000 sporocyst a přidaným PBS doplnilo do objemu přibližně 600 μΐ.

Identifikace druhů se provedla za použití průtokového cytometru Becton Dickinson FACScan a software CellQuest při vlnové délce 488 nm. Korálky COULTER Check Fluorosphere (2 kapky v přibližně 2 ml PBS) se použily pro standardizaci přístroje tím, že se objevily ve specifikované oblasti (R2) FCS vs. SSC histogramu (obr. 1). Vzorky obsahující jeden druh sporocyst se následně analyzovaly a definovaly se oblasti datových výstupů. Oblast 1 (Rl) byla oblastí

01-2090-03-Če navrženou pro sporocysty E. acervulina (obr. 1), oblast 3 (R3) byla oblastí navrženou pro sporocysty E. maxima (obr. 2) a oblast 4 (R4) byla oblastí navrženou pro sporocysty E. tenella (obr. 3). Po nadefinování oblastí datových výstupů se do souborů dat uložila nastavení cytometru a obvody pro každý druh prvoka a tyto uložené hodnoty se použily při následných testech.

Potom, co byly navrženy oblasti pro všechny druhy, se připravily sporocysty E. tenella, E. maxima a E. acervulina a analyzovaly se výše popsaným způsobem. U jednotlivých druhů bylo procento souboru měření pro každý druh spadající do referenční oblasti datových výstupu určených pro tento druh 95,4 %, 92,4 % a 87,7 % pro E. acervulina, E. maxima, respektive pro E. tenella (tabulka 1). Celkové hodnoty uvedené v tabulce 1 nedosahují 100 % v důsledku pozadí zbytku přítomnosti nepoškozených oocyst, které nebyly odstraněny během izolace sporocyst, a v důsledku skutečnosti, že mezi oblastmi pro sporocysty E. acervulina a E. tenella existuje určitý překryv.

Tabulka 1

Druhy Eimeria	% v E. acervulina oblasti (Rl)	% v E. maxima oblasti (R3)	% v E. tenella oblasti (R4)
acervulina	95,4	2,8	1,8
maxima	5,5	92,4	2,1
tenella	10,5	1,8	87,7

01-2090-03-Če

Přiklad 2

Identifikace Eimeria druhů ve smíšených vzorcích

S cílem stanovit, zda je možné identifikovat a kvantifikovat smíšené populace Eimeria, se v PBS smísily oocysty E. acervulina (2x 10^s) , oocysty E. maxima (5x 10⁵) a oocysty E. tenella (lx 10⁶) , přičemž sporocysty se získaly způsobem popsaným v příkladu 1 pro E. acervulina. Procento sporocyst každého druhu se stanovilo pomocí mikroskopické analýzy (tabulka 2). Následně se procento sporocyst každého druhu stanovilo za použití stejného vzorku průtokovou cytometrii (obr. 4). Rovněž se připravil druhý a třetí vzorek obsahující oocysty směsi druhů, a tyto vzorky se rovněž analyzovaly průtokovou cytometrii. Potom se na základě sporulačních a izolačních dat vypočetlo teoretické procento každého druhu sporocyst. Výsledky jsou uvedeny v tabulce 2 a ukazují, že procento sporocyst každého druhu získané pomocí průtokové cytometrie je velmi blízké skutečné nebo teoretické hodnotě.

Tabulka 2

Vzorek sporocyst	Způsob	% Výskytů v oblastí E. acervulina	% Výskytů v oblasti E. maxima	% Výskytů v oblasti E. tenella
První	Mikroskop	53,1	11,7	36,7
První	Cytometr	55,7	18,3	26,0
Druhý	Cytometr	59,2	16,6	24,2
Třetí	Cytometr	51,8	10,2	38,1
Průměr*	Cytometr	55,6	15,0	29,4
Teoretický		55,2	14,0	30,8

Průměr prvního, druhého a třetího vzorku stanovený průtokovou cytometrii

01-2090-03-Če ··*<

Z výše uvedeného popisu vynálezu a předložených příkladů je zřejmé, že bylo dosaženo několika aspektů vynálezu.

Je zřejmé, že vynález byl podrobně popsán pomocí ilustrativních příkladů, které měly usnadnit odborníkům v daném oboru pochopení principů vynálezu a jeho praktickou použitelnost. Konkrétní formulace a způsoby podle vynálezu se neomezují na popis specifických zde uvedených provedení, ale jsou vymezeny následujícími patentovými nároky. Některé příklady a části popisu zahrnují určité závěry týkající se možného způsobu fungování vynálezu, nicméně tyto závěry by neměly mít omezující charakter, ale pouze charakter vysvětluj ící.

Dále je třeba chápat, že specifická provedení vynálezu neomezují rozsah vynálezu a odborník v daném oboru může, v případě, kdy se přidrží předcházejících příkladů a podrobného popisu, využít i mnoha alternativ, modifikací a jiných úprav. Závěrem je třeba uvést, že všechny tyto alternativy, modifikace a úpravy spadají do rozsahu vynálezu, který je jednoznačně vymezen následujícími patentovými nároky.

Claims (83)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob určení počtu druhů kokcidiálního prvoka ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje:

   definici oblastí datových výstupů průtokového cytometru na základě měření zvoleného z množiny sestávající z přímého světelného rozptylu, bočního světelného rozptylu a fluorescence;

   dodání vzorku sporocyst z populace;

   analýzu uvedeného vzorku za použití průtokového cytometru a určení počtu nebo procentického zastoupení jednotlivých druhů kokcidiálního prvoka v uvedeném vzorku.
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že základem pro oblast datových výstupů je měření sestávající z přímého světelného rozptylu a bočního světelného rozptylu.
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený vzorek obsahuje přibližně od 170 sporocyst do přibližně 40 sporocyst na pg.

   01-2090-03-Če
4. 4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený vzorek obsahuje přibližně od 150 sporocyst do přibližně 115 sporocyst na pg.
5. 5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený vzorek obsahuje přibližně 130 sporocyst na pg.
6. 6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že oblasti datových výstupů jsou charakteristické tím, že obsahují přibližně alespoň 50 % záznamů sporocyst sledovaných druhů.
7. 7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že oblasti datových výstupů jsou charakteristické tím, že obsahují přibližně alespoň 85 % záznamů sporocyst sledovaných druhů.
8. 8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že oblasti datových výstupů jsou charakteristické tím, že obsahují přibližně alespoň 90 % záznamů sporocyst sledovaných druhů.
9. 9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že oblasti datových výstupů jsou charakteristické tím, že obsahují přibližně alespoň 95 % záznamů sporocyst sledovaných druhů.

   01-2090-03-Če
10. 10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že uvedený prvok je rodu Eimeria.
11. 11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že uvedený prvok je zvolen z množiny sestávající z B. tenella, E. acervulina a B. maxima.
12. 12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že dále zahrnuje zabarvení uvedeného prvoka alespoň jedním barvivém, které předchází analýze uvedeného prvoka průtokovou cytometrií.
13. 13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že uvedeným barvivém je fluorescenční barvivo.
14. 14. Způsob podle nároku 13, vyznačující se tím, že základem oblastí datových výstupů je dále fluorescenční intenzita.
15. 15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se tím, že uvedeným fluorescenčním barvivém je ethidiumbromid.
16. 16. Způsob stanovení druhů a počtu prvoka rodu Eimeria, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    01-2090-03-Če • · · ·· ·· definici oblastí datových výstupů průtokového cytometru na základě přímého světelného rozptylu a bočního světelného rozptylu, přičemž oblasti datových výstupů jsou charakteristické tím, že obsahují přibližně alespoň 85 % záznamů sporocyst sledovaných druhů;

    dodání vzorku sporocyst z populace;

    analýzu uvedeného vzorku za použití průtokového cytometru; a stanovení počtu jednotlivých druhů kokcidiálního prvoka ve vzorku.
17. 17. Způsob určení druhů kokcidiálního prvoka v environmentálním vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    definici oblastí datových výstupů průtokového cytometru na základě přímého světelného rozptylu a bočního světelného rozptylu, přičemž oblasti datových výstupů jsou charakteristické tím, že obsahují přibližně alespoň 50 % záznamů sporocyst sledovaných druhů;

    izolaci prvoka ze vzorku; a pokud jsou prvoci ve stádiu oocyst, potom i sporulaci a izolaci sporocyst;

    analýzu uvedeného vzorku za použití průtokového cytometru; a stanovení počtu jednotlivých druhů prvoka ve vzorku.

    01-2090-03-Če

    4 4 * 4 t

    4 4 4 4 4

    4 4 4 4 4 4 4 • 4 4 4 4 4

    44 44 ! · · • 444 4
18. 18. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že oblasti datových výstupů obsahují přibližně alespoň 85 % záznamů sporocyst sledovaných druhů.
19. 19. Způsob podle nároku 17, vyznačující se tím, že uvedený prvok je rodu Eimeria.
20. 20. Způsob podle nároku 19, vyznačující se tím, že uvedený prvok se zvolí z množiny sestávající z E. tenella, E. acervulina a E. maxima.
21. 21. Způsob podle nároku 20, vyznačující se tím, že dále zahrnuje obarvení uvedeného prvoka alespoň jedním barvivém, které předchází analýze uvedeného prvoka průtokovou cytometrií.
22. 22. Způsob podle nároku 21, vyznačující se tím, že uvedeným barvivém je fluorescenční barvivo.
23. 23. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že základem oblastí datových výstupů je dále fluorescenční intenzita.
24. 24. Způsob podle nároku 22, vyznačující se tím, že uvedeným fluorescenčním barvivém je ethidiumbromid.

    01-2090-03-Če
25. 25. Způsob určení druhů prvoka rodu Eimeria v environmentálním vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    definici oblastí datových výstupů průtokového cytometru na základě přímého světelného rozptylu a bočního světelného rozptylu, přičemž oblasti datových výstupů jsou charakteristické tím, že obsahují přibližně alespoň 85 % záznamů sporocyst sledovaných druhů;

    izolaci prvoka ze vzorku; a pokud se prvok nachází ve stádiu oocysty, potom i sporulaci a izolaci sporocyst;

    analýzu uvedeného vzorku za použití průtokového cytometru; a stanovení počtu jednotlivých druhů prvoka ve vzorku.
26. 26. Způsob léčby živočicha infikovaného kokcidiální infekcí, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    získání vzorku z těla živočicha, reprezentativního živočicha nebo prostředí, ve kterém je živočich chován;

    izolaci kokcidiálního prvoka ze vzorku; a pokud se prvok nachází ve stádiu oocysty, potom i sporulaci a izolaci sporocyst;

    definici oblastí datových výstupů průtokového cytometru na základě přímého světelného rozptylu a bočního světelného rozptylu, přičemž oblasti datových výstupů jsou charakteristické tím, že obsahují přibližně alespoň 50 % záznamů sporocyst sledovaných druhů;

    01-2090-03-Če

    9 9 9

    9 9 9 • 9 9 9

    99 9«

    9 9 9 9

    9 99999

    9 9 9

    99 9 analýzu uvedeného vzorku za použití průtokového cytometru; a léčbu živočicha cíleně zaměřenou na zjištěné druhy kokcidiálního prvoka.
27. 27. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že oblasti datových výstupů obsahují přibližně alespoň 85 % záznamů sporocyst sledovaných druhů.
28. 28. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že uvedený prvok je rodu Eimeria.
29. 29. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že uvedený prvok se zvolí z množiny sestávající z E. tenella, E. acervulína a E. maxima.
30. 30. Způsob podle nároku 26, vyznačující se tím, že dále zahrnuje obarvení uvedeného prvoka alespoň jedním barvivém, které předchází analýze uvedeného prvoka průtokovou cytometrií.
31. 31. Způsob podle nároku 30, vyznačující se tím, že uvedeným barvivém je fluorescenční barvivo.

    01-2090-03-Če • · · · · φ φ φ φ · · ··*· · · · · · « · ·· ·· ·· φφ φφ ·
32. 32. Způsob podle nároku 30, vyznačující se tím, že základem oblastí datových výstupů je dále fluorescenční intenzita.
33. 33. Způsob podle nároku 31, vyznačující se tím, že uvedeným fluorescenčním barvivém je ethidiumbromid.
34. 34. Způsob léčby živočicha infikovaného prvokem rodu Eimeria, vyznačující se tím, že obsahuje:

    získání vzorku z těla živočicha, reprezentativního živočicha nebo prostředí, ve kterém je živočich chován;

    izolaci prvoka ze vzorku; a pokud se prvok nachází ve stádiu oocysty, potom i sporulaci a izolaci sporocyst;

    definici oblastí datových výstupů průtokového cytometru na základě přímého světelného rozptylu a bočního světelného rozptylu, přičemž oblasti datových výstupů jsou charakteristické tím, že obsahují přibližně alespoň 85 % záznamů sporocyst sledovaných druhů;

    analýzu uvedeného vzorku za použití průtokového cytometru; a léčbu živočicha cíleně zaměřenou na zjištěné druhy prvoka.
35. 35. Způsob určení počtu a druhů kokcidiálního prvoka ve farmaceutické kompozici, vyznačující se tím, že zahrnuj e:

    01-2090-03-Če • t ♦ · · » · · · · · ♦ ♦ • * * · · « · · ·· ·· ·« t· • · · « • * ···« • · · ·· · získání vzorku kompozice; a pokud se prvok ve vzorku nachází ve stádiu oocysty, potom i sporulaci a izolaci sporocyst;

    definici oblastí datových výstupů průtokového cytometru na základě přímého světelného rozptylu a bočního světelného rozptylu, přičemž oblasti datových výstupů jsou charakteristické tím, že obsahují přibližně alespoň 50 % záznamů sporocyst sledovaných druhů;

    analýzu uvedeného vzorku za použití průtokového cytometru;

    určení počtu jednotlivých druhů kokcidiálního prvoka ve vzorku; a výpočet počtu jednotlivých druhů ve farmaceutické kompozici.
36. 36. Způsob podle nároku 35, vyznačující se tím, že oblasti datových výstupů obsahují přibližně alespoň 85 % záznamů sporocyst sledovaných druhů.
37. 37. Způsob podle nároku 35, vyznačující se tím, že uvedený prvok je rodu Eimeria.
38. 38. Způsob podle nároku 37, vyznačující se tím, že uvedený prvok se zvolí z množiny sestávající z E. tenella, E. acervulina a E. maxima.

    01-2090-03-Če • · • · « • ···· • · · · ve
39. 39. Způsob určení druhů kokcidiálního prvoka vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    vedení analytu obsahujícího suspenzi neznámých sporocyst vzorku uvedeného prvoka v kapalném médium skrze průtokový cytometr;

    dopadání světla na analyt vedený skrze průtokový cytometr;

    měření alespoň jednoho charakteristického znaku uvedeného vzorku, přičemž tato charakteristika se zvolí z množiny sestávající z přímého světelného rozptylu, z bočního světelného rozptylu a z fluorescence;

    určení souboru měření získaných z analytu s ohledem na alespoň jeden charakteristický znak;

    porovnání souboru měření získaného pro uvedený analyt s referenčním souborem měření s ohledem na alespoň jeden charakteristický znak odvozený z měření získaných při vedení alespoň jedné referenční suspenze průtokovým cytometrem; a určení druhů prvoka v uvedeném analytu.
40. 40. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že uvedená alespoň jedna suspenze obsahuje v podstatě stejné médium jako uvedený analyt a uvedený referenční soubor se získá vedením alespoň jedné referenční suspenze skrze průtokový cytometr a dopadáním světla na tuto referenční suspenzi za referenčních podmínek zahrnujících koncentraci, obalovou tekutinu, průtok, teplotu, vlnovou délku laseru a nastavení energie laseru, které jsou v podstatě stejné jako

    01-2090-03-Če • 0 • 0 0 0

    0 0 00

    0 0 0 0 * · · 0 • · 0 0 ·· 00 • · * · • · ·0000 * > 0 podmínky, za kterých se uvedeným průtokovým cytometrem vede uvedený analyt.
41. 41. Způsob podle nároku 40, vyznačující se tím, že uvedený alespoň jeden charakteristický znak uvedeného referenčního souboru je stejný jako charakteristický znak souboru měření, který je určen pro uvedený analyt.
42. 42. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že uvedený referenční soubor zahrnuje kompozitní soubor měření odvozený z množiny referenčních suspenzí, z nichž každá obsahuje stejné sporocysty známé identity.
43. 43. Způsob podle nároku 42, vyznačující se tím, že množina referenčních suspenzí obsahuje přibližně 10 referenčních suspenzí.
44. 44. Způsob podle nároku 42, vyznačující se tím, že množina referenčních suspenzí obsahuje přibližně 20 referenčních suspenzí.
45. 45. Způsob podle nároku 42, vyznačující se tím, že množina referenčních suspenzí obsahuje přibližně 30 referenčních suspenzí.

    01-2090-03-Če • ·
46. 46. Způsob podle nároku 41, vyznačující se tím, že soubor měření určený pro uvedený analyt zahrnuje frekvenční distribuci měření v určitém rozsahu hodnot pro alespoň jeden charakteristický znak; a stanovená frekvenční distribuce se porovná s referenčním souborem obsahujícím známou frekvenční distribuci s ohledem na alespoň jeden charakteristický znak pro alespoň jednu referenční suspenzi ve stejném rozsahu hodnot, který se získá, pokud se uvedená alespoň jedna suspenze vede skrze uvedený průtokový cytometr za uvedených referenčních podmínek.
47. 47. Způsob podle nároku 46, vyznačující se tím, Že soubor měření určený pro uvedený analyt obsahuje frekvenční distribuci hodnot naměřených v určité množině rozmezí hodnot pro alespoň jeden charakteristický znak; a stanovená frekvenční distribuce se porovná s referenčním souborem obsahujícím známou frekvenční distribuci s ohledem na alespoň jeden charakteristický znak pro alespoň jednu referenční suspenzi ve stejné množině rozmezí hodnot, která se získá, pokud se uvedená alespoň jedna suspenze vede skrze uvedený průtokový cytometr za uvedených referenčních podmínek.
48. 48. Způsob podle nároku 46, vyznačující se tím, že se soubor měření určený pro uvedený analyt porovná s množinou referenčních souborů získaných z množiny referenčních suspenzí obsahujících různé sporocysty známé identity, přičemž každý z referenčních souborů obsahuje frekvenční distribuci uvedených charakteristických znaků v určitém rozsahu hodnot, který se získá, pokud se alespoň jedna

    01-2090-03-Če

    9 * • 9 • 9 9·

    9 9 9

    9 *· · • · 9 9

    99 · referenční suspenze obsahující konkrétní známou sporocystu vede za uvedených referenčních podmínek průtokovým cytometrem.

    množiny rozsahu množinu hodnot analytu v uvedenou
49. 49. Způsob podle nároku 48, vyznačující se tím, že měření zjištěná pro uvedený analyt zahrnují frekvenční distribuci kombinací naměřených charakteristických znaků uvedeného kombinace rozmezí hodnot pro charakteristických znaků; a zjištěná frekvenční distribuce se porovná s množinou referenčních souborů pro množinu různých známých sporocyst, přičemž každý z uvedených referenčních souborů obsahuje frekvenční distribuci kombinací naměřených hodnot stejné charakteristických znaků, které se měřily při frekvenční distribuce pro uvedený analyt.

    množiny získání
50. 50. Způsob podle nároku 49, vyznačující se tím, že každý z referenčních souborů obsahuje kompozitní soubor měření odvozený z množiny vzorů získaných z množiny referenčních suspenzí, z nichž každá obsahuje konkrétní sporocystu známé identity.
51. 51. Způsob podle nároku 49, vyznačující se tím, že všechny uvedené vzory měření zjištěné pro uvedený analyt a uvedené referenční soubory tvoří oblast datových výstupů průtokového cytometru v poli majícím rozměry hodnot množiny měřených charakteristických znaků, přičemž pokud je alespoň 85 % kombinací datových hodnot naměřených průtokovým

    01-2090-03-Če • · « • * ·· · ·· ·· ·· • · ·· · cytometrem pro uvedenou množinu charakteristických znaků uvedeného analytu obsaženo v jedné oblasti datových výstupů referenčního souboru, potom je to známka toho, že uvedený analyt obsahuje sporocysty, jejichž identita koreluje s identitou známých sporocyst obsažených v alespoň jedné referenční suspenzi, ze které se uvedená referenční oblast datových výstupů generovala.
52. 52. Způsob podle nároku 51, vyznačující se tím, že množina referenční oblasti datových výstupů obsahuje oblast, která zahrnuje alespoň přibližně 85 % kombinací naměřených hodnot nebo charakteristických znaků uvedeného analytu.
53. 53. Způsob podle nároku 52, vyznačující se tím, že množina referenčních oblastí datových výstupů obsahuje oblast, která zahrnuje alespoň přibližně 90 % kombinací naměřených hodnot nebo charakteristických znaků uvedeného analytu.
54. 54. Způsob podle nároku 53, vyznačující se tím, že množina referenčních oblastí datových výstupů obsahuje oblast, která zahrnuje alespoň přibližně 95 % kombinací naměřených hodnot nebo charakteristických znaků uvedeného analytu.
55. 55. Způsob podle nároku 51, vyznačující se tím, že uvedený analyt obsahuje množinu neznámých druhů sporocyst.

    01-2090-03-Če • · • · φ • · · · • · · » ·♦ ·« • · · • · ·«· • · · • a ·
56. 56. Způsob podle nároku 51, vyznačující se tím, že uvedený analyt obsahuje domnělou množinu druhů sporocyst a uvedený způsob se použije pro určení čistoty uvedeného analytu.

    různých j ak byly
57. 57. Způsob podle nároku 39, vyznačující se tím, že uvedený soubor měření stanovených pro uvedený analyt obsahuje kombinaci měření množiny charakteristických znaků uvedeného analytu, naměřeny průtokovým cytometrem; a uvedený referenční soubor obsahuje kombinaci měření stejné množiny různých charakteristických znaků, která se získá, pokud se alespoň jedna referenční suspenze vede skrze průtokový cytometr.
58. 58. Způsob podle nároku 57, vyznačující se tím, že se stanovený soubor porovná s množinou referenčních souborů získanou z množiny referenčních souborů získaných pro různé sporocysty známých identit, přičemž každý z referenčních souborů obsahuje kombinace naměřených hodnot stejné množiny různých charakteristických znaků.
59. 59. Způsob podle nároku 58, vyznačující se tím, že uvedený vzorek obsahuje množinu neznámých sporocyst a zjištěný vzor se porovná s množinou referenčních souborů získaných z množiny referenčních suspenzí obsahujících různé sporocysty známé identity, přičemž každý z uvedených referenčních souborů obsahuje kombinaci naměřených hodnot stejné množiny různých charakteristických znaků, a

    01-2090-03-Če • · 4 • 4 44 · porovnání poskytne informaci jak o identitě, tak o koncentraci sporocyst v uvedeném analytu.
60. 60. Způsob podle nároku 59, vyznačující se tím, že se analyzuje domněle vícedruhový analyt, dokud se nezíská 2500 záznamů.
61. 61. Způsob podle nároku 59, vyznačující se tím, že se analyzuje domněle jednodruhový analyt, dokud se nezíská 5000 záznamů.
62. 62. Způsob podle nároku 59, vyznačující se tím, že se třídí alespoň jedna populace sporocyst z uvedeného analytu, přičemž uvedená roztříděná alespoň jedna populace je charakteristická tím, že má uvedený stanovený soubor měření, přičemž přibližně alespoň 85 % uvedeného souboru měření je obsaženo v referenčním souboru měření.
63. 63. Způsob určení druhů kokcidiálního prvoka ve vzorku, vyznačující se tím, že zahrnuje:

    vedení analytu obsahujícího suspenzi neznámých sporocyst vzorku uvedeného prvoka v kapalném médium skrze průtokový cytometr;

    dopadání světla na analyt vedený skrze průtokový cytometr;

    měření alespoň jednoho charakteristického znaku uvedeného vzorku, přičemž uvedený charakteristický znak se zvolí z

    01-2090-03-Če • · · A • · Α·ΑΑ množiny sestávající z přímého světelného rozptylu, bočního světelného rozptylu a fluorescence;

    určení souboru měření získaných z analytu s ohledem na alespoň jeden charakteristický znak;

    porovnání souboru měření získaného pro uvedený analyt s referenčním souborem měření s ohledem na alespoň jeden charakteristický znak získaný měřením při vedení známých sporocyst průtokovým cytometrem; a určení druhů prvoka v uvedeném analytu.
64. 64. Způsob podle nároku 63, vyznačující se tím, že uvedený referenční soubor se získá vedením uvedených známých sporocyst skrze uvedený průtokový cytometr ve v podstatě stejném médiu, v jakém byl uvedený analyt veden průtokovým cytometrem, a dopadání světla na uvedené známé sporocysty za referenčních podmínek zahrnujících koncentraci, obalovou tekutinu, průtok, teplotu, vlnovou délku laseru a nastavení energie laseru, které jsou v podstatě stejné jako podmínky, za kterých se uvedený analyt vede skrze uvedený průtokový cytometr.
65. 65. Způsob podle nároku 64, vyznačující se tím, že uvedený alespoň jeden charakteristický vzor uvedeného referenčního souboru je stejný jako charakteristický znak souboru měření, který se určil pro uvedený analyt.

    01-2090-03-Če • 44# • 4 4 4 · • 4 4 4 4 ·« 44 * ♦ · 4 • 4 444 •44 44 φ
66. 66. Způsob podle nároku 65, vyznačující se tím, že uvedený referenční soubor obsahuje kompozitní soubor měření odvozený z množiny referenčních suspenzí, z nichž každá obsahuje stejné sporocysty známé identity.
67. 67. Způsob podle nároku 65, vyznačující se tím, že soubor měření zjištěný pro uvedený analyt obsahuje frekvenční distribuci měření v určitém rozsahu hodnot pro alespoň jeden charakteristický znak; a stanovená frekvenční distribuce se porovná s referenčním souborem obsahujícím známou frekvenční distribuci s ohledem na alespoň jeden charakteristický znak pro známé sporocysty ve stejném rozsahu hodnot, jaký se získá, pokud se uvedené známé sporocysty vedou přes uvedený průtokový cytometr za uvedených referenčních podmínek.
68. 68. Způsob podle nároku 67, vyznačující se tím, že soubor měření určený pro uvedený analyt obsahuje frekvenční distribuci hodnot naměřených v určité množině rozmezí hodnot pro alespoň jeden charakteristický znak; a stanovená frekvenční distribuce se porovná s referenčním souborem obsahujícím známou frekvenční distribuci s ohledem na alespoň jeden charakteristický znak pro uvedené známé sporocysty ve stejné množině rozmezí hodnot získané, pokud se uvedené známé sporocysty vedou uvedeným průtokovým cytometrem za uvedených referenčních podmínek.
69. 69. Způsob podle nároku 67, vyznačující se tím, že se uvedený soubor měření zjištěný pro uvedený analyt porovná s

    01-2090-03-Če • · · • · · « • · · · · ·· * · · · » • · * · ··· • * · · • ·· · množinou referenčních souborů získaných vedením množiny známých sporocyst skrze uvedený průtokový cytometr, přičemž každý z referenčních souborů obsahuje frekvenční distribuci s ohledem na uvedené charakteristické znaky v určitém rozsahu hodnot získaných, pokud se uvedené známé sporocysty vedou za uvedených referenčních podmínek skrze uvedený průtokový cytometr.
70. 70. Způsob podle nároku 69, vyznačující se tím, že soubor měření zjištěný pro uvedený analyt obsahuje frekvenční distribuci kombinací naměřených hodnot množiny charakteristických znaků uvedeného analytu v rozsahu kombinace rozmezí hodnot pro uvedenou množinu charakteristických znaků; a zjištěná frekvenční distribuce se porovná s množinou referenčních souborů pro množinu různých známých sporocyst, přičemž každý z uvedených referenčních souborů obsahuje frekvenční distribuci kombinací naměřených hodnot stejné množiny charakteristických znaků, které jsou naměřeny při získání frekvenční distribuce pro uvedený analyt.
71. 71. Způsob podle nároku 70, vyznačující se tím, že každý z uvedených referenčních souborů obsahuje kompozitní soubor měření odvozený z množiny souborů získaných z množiny známých sporocyst.
72. 72. Způsob podle nároku 70, vyznačující se tím, že každý z uvedených souborů měření stanovených pro uvedený analyt a uvedených referenčních souborů tvoří oblast

    01-2090-03-Če datových výstupů uvedeného průtokového cytometru v poli, které má rozměry hodnot uvedené množiny naměřených charakteristických znaků, a pokud je alespoň 85 % kombinací datových hodnot naměřených průtokovým cytometrem pro uvedenou množinu charakteristických znaků uvedeného analytu obsaženo uvnitř jedné z uvedených referenčních oblastí datových výstupů, potom uvedený analyt obsahuje sporocysty, jejichž identita koreluje s identitou známých sporocyst, z nichž byla generována uvedená referenční oblast datových výstupů.
73. 73. Způsob podle nároku 72, vyznačující se tím, že množina referenčních oblastí datových výstupů obsahuje oblast, která zahrnuje přibližně alespoň 85 % kombinací naměřených hodnot charakteristických znaků uvedeného analytu.
74. 74. Způsob podle nároku 73, vyznačující se tím, že množina referenčních oblastí datových výstupů obsahuje oblast, která obsahuje přibližně alespoň 90 % kombinací naměřených hodnot charakteristických znaků uvedeného analytu.
75. 75. Způsob podle nároku 74, vyznačující se tím, že množina referenčních oblastí datových výstupů obsahuje oblast, která obsahuje přibližně alespoň 95 % kombinací naměřených hodnot charakteristických znaků uvedeného analytu.

    01-2090-03-Če
76. 76. Způsob podle nároku 72, vyznačující se tím, že uvedený analyt obsahuje množinu neznámých druhů sporocyst.
77. 77. Způsob podle nároku 72, vyznačující se tím, že uvedený analyt obsahuje domnělou množinu druhů sporocyst a uvedený způsob se použije pro určení čistoty uvedeného analytu.
78. 78. Způsob podle nároku 63, vyznačující se tím, že soubor měření stanovených pro uvedený analyt obsahuje kombinaci měření množiny různých charakteristických znaků uvedeného analytu měřených v průtokovém cytometru; a uvedený referenční soubor obsahuje kombinaci měření stejné množiny různých charakteristických znaků získaných, pokud se známé sporocysty vedou uvedeným průtokovým cytometrem.
79. 79. Způsob podle nároku 78, vyznačující se tím, že stanovený soubor se porovná s množinou referenčních souborů získaných z množiny referenčních souborů získaných pro různé sporocysty známé identity, přičemž jednotlivé referenční soubory obsahují kombinaci naměřených hodnot stejné množiny různých charakteristických znaků.
80. 80. Způsob podle nároku 79, vyznačující se tím, že uvedený vzorek obsahuje množinu neznámých sporocyst a uvedený určený vzor se porovná s množinou referenčních souborů získaných z množiny referenčních suspenzí obsahující různé známé sporocysty, přičemž každý z

    01-2090-03-Če v * v

    9 9 * • 9 9 9 ·· 99 • 9 9

    9 · 9 • · 9 9

    9 * 9999 uvedených referenčních vzorů obsahuje kombinaci naměřených hodnot stejné množiny různých charakteristických znaků, a uvedené srovnání tak poskytuje informaci jak o identitě, tak o koncentraci sporocyst v uvedeném analytu.
81. 81. Způsob podle nároku 80, vyznačující se tím, že dále zahrnuje analýzu domněle vícedruhového analytu, dokud se nezíská 2500 záznamů.
82. 82. Způsob podle nároku 80, vyznačující se tím, že dále zahrnuje analýzu domnělého jednodruhového analytu, dokud se nezíská 5000 záznamů.
83. 83. Způsob podle nároku 80, vyznačující se tím, že dále zahrnuje vytřídění alespoň jedné populace sporocyst z uvedeného analytu, přičemž uvedená alespoň jedna vytříděná populace je charakteristická tím, že má uvedený stanovený soubor měření, kde je přibližně alespoň 85 % uvedeného souboru měření obsaženo v referenčním souboru měření.