CZ20024012A3 - Rekombinantní antigenní doména lidské thyreoidální peroxidázy produkovaná v prokaryontních buňkách a její použití - Google Patents

Description

Toto řešení náleží do oblasti molekulární genetiky, konstrukce rekombinantních DNA molekul a expresi rekombinantních proteinů či peptidů.

Dosavadní stav techniky

Lidská thyreoidální peroxidáza (HTPO) je prevalentním antigenem, proti kterému vznikají autoprotilátky u osob postižených Hashimotovou chorobou. Hashimotovou chorobou je postiženo, přinejmenším subklinicky, 15% populace (Volpe, R., In Werner's The Thyroid, 5th Edition (Ingbar, S.H., metal., Eds.), J.B.Lippincott Co., Philadelphia, pp. 1266-1291 (1986); Gordin, A., et al., Acta Endocrinol. 90:33-42 (1979)). Pro testování přítomnosti protilátek proti HTPO je nezbytné mít k dispozici daný antigen. V současné době je používáno mnoho metod pro produkci rekombinantního HTPO antigenu, které lze v zásadě rozdělit do dvou skupin: A) produkce v prokaryontních buňkách a B) produkce v eukaryontních buňkách. Vzhledem ktomu, že HTPO, jako eukaryontní protein, podléhá posttranslačním úpravám, je zřejmé, že produkce HTPO v prokaryontních buňkách vede k nefunkčnímu proteinu, který navíc nemá správnou konformaci. Tato skutečnost vede k jeho nízké nebo většinou žádné reaktivitě s protilátkami proti HTPO (Libert, R., et al., EMBOJ. 6:4193-4176 (1987); Hirayu, H„ et al., J. Clin. Endocrinol. Metab. 64:578-584 (1987); Dinsart, C., et al., 17th Annual Meeting of the Eurooean Thyroid Association, Abstract #235 (1988)). Je tedy jasné, že pouze produkce v eukaryontních buňkách zajistí funkční. Nevýhodou produkce v eukaryontních buňkách oproti produkci v prokaryontních buňkách je náročnost a nákladnost produkce samé a v neposlední řadě též purifikace. Produkce rekombinantní HTPO v eukaryontních buňkách je předmětem několika patentů (např. W09102061), kde je tato problematika řešena izolací, resp. namnožením sekvence mRNA kódující enzymaticky aktivní HTPO a produkce této HTPO v eukaryontních buňkách. Kromě obecných nevýhod produkce proteinů v eukaryontních buňkách je další nevýhodou zajména získání velmi malého množství proteinu HTPO a v neposlední řadě finanční náročnost Dále např. patent WO93/23073 se zabývá produkcí specifických imunogenních epitopů HTPO v oblasti aminokyselin 456-933 podle známé sekvence HTPO. Naše řešení je založeno na produkci peptidu obsahujícího aminokyselinovou sekvenci 393-446 podle známé sekvence HTPO, tedy zcela mimo rozsah patentu WO93/23073.

Podstata vynálezu

Námi předkládané řešení je založeno na analýze HTPO proteinu, vyhledání potenciálních antigenních domén a porovnání s mapou potenciálních posttranslačních modifikací. Výsledkem je krátká (54 aminokyselin) peptidová sekvence (antigenní doména) obsahující aminokyselinovou sekvenci 393-446 podle známé sekvence HTPO, která je vysoce imunogenní a zároveň nepodléhá posttranslačním modifikacím. Další výhodou našeho řešení je, že kódující DNA sekvence pro tento peptid leží na jediném exonu genu pro lidskou HTPO. Lze tedy pomocí PCR a oligonukleotidů A a B o základní sekvenci

A: 5'-N N N N N N N N N G G A G A C G G C C G C G C C A G C G-3';

B: 5'-N NNNNNNNNNTCAATGGTGATGGTGATGGTGCTGGT GCA G A G C G C C C A C G A-3';

kde N je kterýkoliv ze čtyř nukleotidů A.G.C.T získat kódující sekvenci pro tento peptid antigenní domény přímo z lidské DNA a není třeba vyhledávat kódující mRNA resp. cDNA. Pro produkci a následnou izolaci tohoto peptidu antigenní domény se kódující DNA modifikuje tak aby obsahovala DNA kódující peptid či protein (značka) pomocí něhož lze fúzní protein izolovat ve vysoké čistotě (např. 6x His sekvence). Purifikace je nutná, protože při použití proteinu produkovaného prokaryontními buňkami v jakémkoliv eukaryontním systému může tento obsahovat zbytkové prokaryontní proteiny, které mohou být toxické Takto modifikovaná DNA se vloží do prokaryontního nebo eukaryontního expresního vektoru. Takto vznikne plasmid pXX-HTPOAg-HIS. Tímto vektorem se transformují bakteriální nebo eukaryontní buňky, které produkují peptid antigenní domény, tj. fúzní

- 3 protein antigenní domény a např. 6x His sekvence. Z lyzátu kultury se izoluje fúzní protein ve vysoké čistotě. Tento přečištěný protein se použije pro detekci protilátek vzniklých proti HTPO.

Přehled obrázků na výkresech

Konstrukce rekombinantního plasmidového vektoru pXX-HTPOAg-HIS je ukázána na obrázku 1.

Příklad provedení vynálezu

Za použití DNA/RNA syntetizátoru (ABI 394 ;Applied Biosystems, Foster City, USA) byly nasyntetizovány oligonukleotidy A a B o sekvenci A: 5'-C G G A A TTCGGA GA CGGCCGCGCCA GCG-3'·

B: 5'-TGA G GA TCCTCAATGGTGATGGTGATGGTGCTGGTG CA GAGCGCCCACGA-3'.

Pomocí těchto oligonukleotidů za použití lidské genomové DNA jako předlohy byla namnožena pomocí PCR DNA sekvence kódující antigenní doménu HTPO o aminokyselinové sekvenci:

NH2-GD GRA SE VPSL TALHTLWLREHNRLAAALKALNAHW SADA VYQEARKVVGALHQHHHHHH-COOH.

Tato DNA sekvence obsahuje štěpná místa pro restrikční endonukleázy BamHI na jednom konci a EcoRI na druhém, přičemž BamHI místo je na amino konci kódovaného peptidu a je v pozici umožňující začlenění tohoto fragmentu do plasmidu pUC19 do čtecího rámce DNA sekvence kódující fragment beta-galaktosidázy. Plasmid pUC19 i namnoženou sekvenci byl podroben štěpení enzymy BamHI a EcoRI. Obě štěpené směsi byly smíchány a za použití enzymu DNA ligázy spojeny. Takto připraveným rekombinantním plasmidem nazvaným pUC-HTPOAg-HIS byly transformovány buňky Escherichia coli kmene DH5alfa. Klon Escheríchia coli kmene DH5alfa obsahující plasmid pUC-HTPOAg-HIS byl dále množen v objemu média 2 litry se selekčním antibiotikem a po dosažení množství buněk měřené OD600=2 byla indukována produkce proteinu pomocí IPTG (isopropyl-beta-D-thiogalaktopyranosid). Buňky byly zlyzovány a s celkovým lyzátem byla provedena analýza pomocí SDSPAGE (polyakrylamidová gelová elektroforéza za použití laurylsíranu sodného). Identita produkovaného proteinu (resp. antigenního peptidu) byla ověřena reakcí s hyperimunním sérem proti lidské HTPO. Celkový lyzát byl poté přečištěn na koloně zachycující proteiny obsahující sekvenci šesti histidinů na karboxylovém konci. Nezachytivší se proteiny byly odstraněny promytím kolony 300 mM fosfátovým pufrem. Proteiny obsahující sekvenci šesti histidinů na karboxylovém konci byly z kolony vymyty 1,5 M roztokem imidazolu. Tato frakce byla poté opět analyzována pomocí SDS-PAGE a identita přečištěného proteinu (resp. antigenního peptidu) byla opět ověřena reakcí s hyperimunním sérem proti lidské HTPO.

Průmyslová využitelnost

Rekombinantí peptid antigenní domény lze využít pro přípravu monoklonálních protilátek proti tomuto peptidu, resp. proti HTPO, a jejich výrobu. Dále je možné tento peptid antigenní domény využít při výrobě diagnostického kitu pro detekci protilátek proti HTPO v lidském, nebo jiném, séru.

Claims (9)

1. Polypeptid antigenní domény HTPO o sekvenci aminokyselin NH2-G D G R A SEVPSLTALHTLWLREHNRLAAALKALNAHWSADAVY QEARKVVGALHQHHHHH H-COOH.

2. Oligonukleotidy sloužící pro namnožení DNA kódující polypeptid antigenní domény HTPO z lidské genomové DNA a připojení sekvence šesti histidinů o sekvenci A: 5'-/V NNNNNNNNGGAGACGGCCGCGCCAGC G-3'; B: 5'-N NNNNNNNNNTCAATGGTGATGGTGATGGT GCTGGTGCAGAGCGCCCACG A-3'; kde N je kterýkoliv ze čtyř nukleotidů A.G.C.T.

3. Namnožená a izolovaná molekula DNA podle nároku 2, kódující peptidovou sekvenci podle nároku 1.

4. Biologicky funkční plasmid nebo virový DNA či RNA vektor obsahující molekulu DNA podle nároku 3.

5. Prokaryontní nebo eukaryontní hostitelská buňka stabilně transformovaná nebo transfekovaná vektorem podle nároku 4 způsobem umožňujícím hostitelské buňce exprimovat za vhodných podmínek peptid antigenní domény HTPO.

6. Prokaryontní hostitelská buňka podle nároku 5, kterou je Escherichia coli.

7. Polypeptid podle nároku t Vyznačující se schopností reagovat s protilátkami proti HTPO.

8. Použití polypeptidu podle nároku 7 pro detekci protilátek proti HTPO.

9. Kit pro serologickou diagnostiku autoipnunitpích_ onemocnění vzniklých vytvořením protilátek proti HTPO, /obsahuj ícNpolypeptid podle nároku 7 pro