CZ20023662A3 - Sloučeniny a způsoby léčení a prevence bakteriální infekce - Google Patents

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká sloučenin a způsobů léčení bakteriálních infekcí, jako je infekce antraxem.

Dosavadní stav techniky

Původce antraxu (Bacillus anthracis) je potenciální hrozbou jako prostředek biologické války nebo biologického terorismu, protože vystavení aerosolizovaným sporám B. anthracis je pro savce, jako je člověk, smrtelné. Hlavní faktory virulence produkované tímto organismem jsou kapsle z poly-D-glutamové kyseliny a antraxový toxin (ATx). Jak kapsle, tak toxin pomáhají bakteriím při kolonizaci a úniku imunitnímu systému. Samotný ATx dokáže způsobit smrt hostitele. Očkování proti toxinu chrání hostitele před infekcí.

Atraxový toxin je členem skupiny bakteriálních toxinů označovaných jako A-B toxiny. A-B toxiny se skládají ze dvou skupin; skupina A je enzymatická část toxinu, která katalyzuje toxický účinek na cytoplazmatický cíl v cílové buňce. Skupina B se váže na buněčný receptor a usnadňuje přestup skupiny a skrz buněčnou membránu do buněčné cytoplasmy. B skupiny z A-B toxinů tetanu, botulinu, diftérie a antraxu tvoří v membránách kanály. Předpokládá se, že tyto kanály případně slouží jako průchod pro přestup skupiny A skrz membránu. Skupiny A a B antraxového toxinu jsou v bakteriálních buňkách exprimovány jako oddělené polypeptidy. A a B podjednotky dalších A-B toxinů jsou produkovány jako polypeptidy s jedním řetězcem nebo jako oddělené řetězce, které jsou sestaveny do oligomerních toxinů ještě před uvolněním z baktérie. Existují dvě alternativní podjednotky antraxového toxinu nazývané jako edémový faktor (EF) a letální faktor (LF). Nekovalentní • · komplexy EF nebo LF a podjednotky B, ochranného antigenu (PA), se nazývají edémový toxin a letální toxin. PA usnadňuje přestup EF a LF skrz membránu.

PA je exprimován jako monomerní polypeptid o velikosti 83 kDa. Monomerní PA se váže k povrchovému receptoru savčí buňky a je proteolyticky štěpen. C-koncový fragment o velikosti (63 kDa) (PA63) zůstává vázán na buňku a N-koncový fragment o velikosti 20 kDa (PA20) se od PA63 odpojí. Toto proteolytické štěpení a následné odpojení PA20 propůjčuje PA63 dvě nové vlastnosti: (1) schopnost oligomerovat do heptamerní struktury kruhového tvaru rozpojitelné pomocí SDS, která se nazývá prepór, a (2) schopnost vázat EF a LF. Oligomery obsahující PA63-EF, PA63-LF nebo kombinaci PA63-EF a PA63-LF jsou endocytosovány a přesouvány do kyselé části, kde se PA63 prepór vkládá do membrány a vytvoří pór. Během, nebo po vytvoření póru, EF a LF přestupují skrz endosomální membránu do cytoplasmy. EF je calmodulin dependentní adenylátová cyklasa, která dokáže chránit baktérii před zničením fagocyty. LF je metaloproteasa, která dokáže ničit makrofágy, nebo, v nižších koncentracích, vyvolat nadprodukci cytokinů makrofágy, což může vést ke smrti hostitele.

Kritický krok v této intoxikační cestě je vytvoření póru pomocí PA. Nízká hodnota pH slouží jako spouštěcí impuls pro přeměnu PA63 prepóru na pór. Tato přeměna je doprovázena transformací oligomeru ze stavu podléhajícího disociaci SDS na stav odolný SDS a vytvořením transmembránového β-válce sestávajícího ze 14 řetězců. Předpokládá se, že tyto kroky jsou nutné pro přestup EF a LF přes endosomální membránu a tím jsou nutné i pro působení toxinu.

Podstata vynálezu

Shrnutí vynálezu

V prvním aspektu poskytuje předkládaný vynález skupinu B tvořící pór z binárního toxinu A-B. Skupina B obsahuje mutaci, která vede k inhibici její schopnosti tvořit pór. V jednom vhodném provedení vede tato mutace u proteinu k inhibici schopnosti tvořit pór in vivo. V dalším vhodném provedení nemá mutantní skupina B dostatečnou schopnost tvorby póru in vitro a/nebo in vivo. V dalším vhodném provedení je skupina b ochranný antigen (PA) antraxu. V ještě dalším vhodném provedení má mutantní PA aminokyselinovou sekvenci, která je přinejmenším z 80 %, 90 %, 95 % nebo 98 % identická se sekvencí přirozeného PA proteinu (jako je sekvence id. č. 21, obr. 13) a má jednu z následujících mutací: K397A, K397D,

K397C, K397Q, D425A, D425N, D425E, D425K, F427A, K397 + D425K dvojitou mutaci, K395D + K397D + D425K + D426K čtyřnásobnou mutaci, K397D + D425K + F427A trojitou mutaci, F427A + AD2L2 dvojitou mutaci, K397D + F427A + AD2L2 trojitou mutaci, F427A + AD2L2 dvojitou mutaci, K397D + D425K + F427A + AD2L2 čtyřnásobnou mutaci, F427D nebo F427K. V dalším vhodném provedení má mutantní PA stejnou sekvenci jako kterákoliv ze sekvencí id. č. 1 až 11 a 13 až 18 (tabulka 1) . Další vhodné mutantní PA zahrnují PA mutanty, ve kterých je zbytek 397 jakákoliv aminokyselina s výjimkou lysinu (sekvence id. č. 19), PA mutanty, ve kterých je zbytek 425 jakákoliv aminokyselina s výjimkou kyseliny asparagové (sekvence id. č. 20), PA mutanty, ve kterých je zbytek 427 jakákoliv aminokyselina s výjimkou fenylalaninu (sekvence id. č. 23) a mutantní PA, které mají mutaci v doméně 2 (zbytky 259 až 487). Další vhodné mutantní skupiny B zahrnují toxiny Clostridium difficile, C. perfringens, C. spiroforme, C. botulinum, Bacillus cereus nebo B. thuringiensis, které mají jednu nebo více mutací vypsaných v tabulce 6 nebo mají mutaci v oblasti, která odpovídá doméně 2 v PA. Fragmenty výše uvedených mutantních skupin B, ve kterých má fragment sníženou schopnost tvořit pór v porovnání s přirozenou skupinou B odpovídajícího toxinu, také spadají do předkládaného vynálezu. Do předkládaného vynálezu také spadají fúzní proteiny, které mají mutantní skupinu B podle předkládaného vynálezu nebo fragment takové mutantní skupiny B kovalentně vázaný k j inému polypeptidu nebo proteinu. Z prvního aspektu předkládaného vynálezu je vyloučeno vynechání aminokyselin 302 až 325 (smyčka D2L2) v PA.

V druhém aspektu poskytuje předkládaný vynález prostředek očkovací látky, který má mutantní skupinu B z prvního aspektu nebo AD2L2 PA (mutantní PA, ve kterém jsou vynechány zbytky 302 až 325) nebo jeho fragment, ve farmaceuticky přijatelném nosiči. Ve vhodném provedení lze očkovací látku deaktivovat chemickými nebo fyzikálními prostředky.

Ve třetím aspektu předkládaný vynález poskytuje způsoby prevence nebo léčení bakteriální infekce u savce jako je člověk. Tento způsob zahrnuje podávání očkovací látky z druhého aspektu savci. V jednom vhodném provedení je očkovací látka podávána s farmaceuticky přijatelným nosičem nebo adjuvans. Očkovací látku lze podávat orálně, intramuskulárně, intravenózně, subkutánně, inhalací nebo jakoukoliv jinou cestou vhodnou pro poskytnutí dávky dostatečné pro prevenci nebo léčení bakteriální infekce. V dalším žádaném provedení se očkovací látka, která obsahuje mutantní ochranný antigen antraxu, podává pro prevenci nebo léčení infekce antraxem.

Ve čtvrtém aspektu poskytuje předkládaný vynález mutantní skupinu B tvořící pór z binárního toxinu A-B. Mutantní skupina B obsahuje mutaci, která vede k inhibici její schopnosti tvořit pór. Mutantní skupina B také inhibuje schopnost tvořit pór u přirozené skupiny B u odpovídajícího toxinu in vitro a/nebo in vivo. V jednom vhodném provedení vede tato mutace k inhibici schopnosti tvořit pór u proteinu in vivo. V dalším vhodném provedení nemá mutantní skupina B dostatečnou schopnost tvořit pór in vitro a/nebo in vivo. V ještě dalším « · · • · ··· · vhodném provedení je skupina B ochranný antigen (PA) antraxu. Mutantní skupina B se případně váže ke skupině A odpovídajícího toxinu. Například mutantní PA se případně váže k A skupinám edémového faktoru nebo letálního faktoru. Mutantní skupina B případně soutěží s přirozenou skupinou B ve vazbě k receptoru na povrchu savčí buňky. Mutantní skupina B se případně také váže k přirozené skupině B odpovídajícího toxinu. Takový mutant případně oligomeruje s přirozenou skupinou B tak, že vznikne komplex, který má sníženou schopnost tvořit pór. V jednom vhodném provedení nemá komplex dostatečnou schopnost tvořit pór a tím i převést skupinu A (např. EF nebo LF) přes membránu do cytoplasmy hostitelské buňky.

V jednom vhodném provedení čtvrtého aspektu má mutantní PA aminokyselinovou sekvenci, která je přinejmenším z 80 %, 90 %, 95 % nebo 98 % identická se sekvencí přirozeného PA proteinu (jako je sekvence id. č. 21, obr. 13) a má jednu z následujících mutací: K397 + D425K dvojitou mutaci, ŮD2L2 (ve které jsou odstraněny zbytky 302 až 325 PA), K395D + K397D + D425K + D426K čtyřnásobnou mutaci, D425K, F427A, K397D + D425K + F427A trojitou mutaci, F427A + AD2L2 dvojitou mutaci, K397D + F427A + AD2L2 trojitou mutaci, K397D + D425K + F427A + AD2L2 čtyřnásobnou mutaci, F427D nebo F427K. V dalším vhodném provedení má mutantní PA stejnou sekvenci jako kterákoliv ze sekvencí id. č. 8 až 18 (tabulka 1) . V dalším provedení je v přirozeném PA změněna aminokyselina 395, 397, 425, 426 nebo jejich kombinace. V ještě dalším provedení je v PA změněn zbytek v doméně 2. V dalším vhodném provedení je v mutantu vynecháno alespoň 5, alespoň 10 nebo alespoň 20 aminokyselin v D2L2 smyčce PA nebo odpovídajícího regionu skupiny B jiného binárního toxinu A-B tvořícího pór. Mutant má případně vynechánu celou nebo část smyčky D2L2 a vynechány aminokyseliny, které jsou N- nebo C- koncové ke smyčce. Další vhodné mutantní skupiny B zahrnují toxiny Clostridium • ·

J ·· • · » ♦ * · · : · · • · · · · difficile, C. perfringens, C. spiroforme, C. botulinum, Bacillus cereus nebo B. thuringiensis, které mají jednu nebo více mutací vypsaných v tabulce 6 nebo mají mutaci v oblasti, která odpovídá doméně 2 v PA. Fragmenty výše uvedených mutantních skupin B, ve kterých má fragment sníženou schopnost tvořit pór v porovnání s přirozenou skupinou B odpovídajícího toxinu a inhibují schopnost tvořit pór u přirozené skupiny B, také spadají do předkládaného vynálezu. Do předkládaného vynálezu také spadají fúzní proteiny, které mají mutantní skupinu B podle předkládaného vynálezu nebo fragment takové mutantní skupiny B kovalentně vázaný k j inému polypeptidu nebo proteinu.

V pátém aspektu se předkládaný vynález týká způsobu prevence nebo léčení bakteriální infekce u savce jako je člověk. Tento způsob zahrnuje podávání mutantní skupiny B podle čtvrtého aspektu nebo jejího fragmentu, která inhibuje schopnost tvořit pór u přirozené skupiny B, savci. V jednom provedení se PA mutant podle čtvrtého aspektu nebo jeho fragment podává jako prevence nebo pro léčení infekce antraxem u savců, kteří byli vystaveni působení spor B. anthracis. V dalším provedení se protein podává profylakticky. V jednom vhodném provedení se mutantní skupina B podává s farmaceuticky vhodným nosičem. Mutant lze podávat orálně, intramuskulárně, intravenózně, subkutánně, inhalací nebo jakoukoliv jinou cestou vhodnou pro poskytnutí dávky dostatečné pro prevenci nebo léčení infekce antraxem. V jednom provedení tento způsob také zahrnuje podávání protilátky skupiny anti-B, jako je protilátka, která váže přirozenou skupinu B, ale ne dominantní negativní mutantní skupinu B, savci. V jednom konkrétním provedení se protilátka váže k přirozenému PA, ale ne k dominantnímu negativnímu PA mutantu.

V šestém aspektu poskytuje předkládaný vynález nukleovou kyselinu kódující mutantní skupinu B (např. mutantní PA) z prvního ze čtyř aspektů.

I* * · • ·

V sedmém aspektu se předkládaný vynález týká vektoru, který obsahuje nukleovou kyselinu podle šestého aspektu.

V osmém aspektu se předkládaný vynález týká čištěné protilátky, která se specificky váže k přirozenému PA nebo mutantnímu PA proteinu vypsanému v tabulce 1. V jednom provedeni se protilátka váže ke smyčce D2L2, K397, D425, D426 nebo F427 proteinu PA. Protilátka je případně monoklonální nebo polyklonální protilátka. V příbuzném aspektu se předkládaný vynález týká čištěné protilátky, která se specificky váže k přirozené skupině B binárního A-B toxinu tvořícího pór s větší afinitou než se váže ke skupině B podle předkládaného vynálezu z odpovídajícího toxinu. V dalším příbuzném aspektu se předkládaný vynález týká čištěné protilátky, která se specificky váže ke skupině B podle předkládaného vynálezu s vyšší afinitou než se váže k přirozené skupině B z odpovídajícího toxinu.

V jednom provedení prvního nebo čtvrtého aspektu jsou konkrétně vyloučeny takové molekuly PA jejichž jediná mutace je záměna zbytku umístěného na hydrofilní straně transmembránového póru za cystein. V dalším provedení těchto aspektů jsou konkrétně vyloučeny takové molekuly PA jejichž jediná mutace je záměna aminokyseliny umístěné na hydrofilní straně transmembránového póru. V provedení konkrétně vyloučeném z prvního nebo čtvrtého aspektu jsou takové molekuly PA, které mají jako jedinou změnu mutaci v Glu302, HÍS304, Asn306, Glu308, His310, Ser312,

Asp315, Gly317, Ser319, Ser321, Gly323 přirozeného PA. V jednom provedení těchto aspektů jsou konkrétně vyloučeny molekuly PA, které mají jako jedinou mutaci změnu aminokyselinové sekvence ve smyčce D2L2. V dalším provedení jsou konkrétně vyloučeny molekuly PA, které mají jako jedinou mutaci změnu nebo vynechání aminokyseliny, která tvoří transmembránový pór. V dalším provedení je konkrétně vyloučen AD2L2 PA. V dalším provedení jsou z jednoho z těchto

Phe313, Phe314, nebo Ser325 u • ·

aspektů konkrétně vyloučeny molekuly PA, které mají C-koncový tryptický fragment o velikosti 63 kDA (PA63) a mají jako jedinou mutaci změnu aminokyseliny, která tvoří trasmembránový pór. V různých dalších provedeních konkrétně vyloučených z jednoho z těchto aspektů jsou další pór tvořící binární toxiny A-B, které mají mutaci odpovídající konkrétně vyloučené mutaci PA. V různých provedeních těchto aspektů, váže mutantní skupina B přirozenou skupinu B z téhož toxinu A-B s vyšší rovnovážnou konstantou (tj . s vyšší afinitou) než váže přirozená skupina B jiné přirozené molekuly z téhož toxinu A-B. Ve vhodných provedeních váže mutantní protein PA přirozený PA s alespoň 2, 5, 10 nebo 20 krát vyšší afinitou než přirozený PA váže jiné přirozené molekuly PA.

Je třeba chápat, že i jiné toxiny tvořící pór, kromě toxinu antraxu, lze také použít ve sloučeninách a způsobech podle předkládaného vynálezu. Například toxiny tvořící pór, jako jsou jiné toxiny A-B, mající mutace (např. bodové mutace nebo mutace vynecháním), které inhibují schopnost toxinu tvořit pór nebo inhibují schopnost přirozeného toxinu tvořit pór spadají do předkládaného vynálezu. Toxiny tvořící pór s těmito mutacemi lze použít do prostředků očkovacích látek nebo způsobů podle předkládaného vynálezu pro prevenci nebo léčení infekce etiologickým činidlem toxinu. Lze použít i jiné binární toxiny A-B, i když tímto výčtem není vynález nijak omezen, heterooligomerní toxiny (toxiny AB5), jako je toxin cholery, nebo toxiny A-B s jediným polypeptidem, jako je toxin tetanu, botulin nebo diftérie. Další toxiny, které lze použít zahrnují α-hemolysin ze Staphylococcus aureus, aerolysin z Aeromonas hydrophila, α-toxin z Clostridium septicum a cytotoxin z Pseudomonas aeruginosa. Předkládaný vynález se také týká jakéhokoliv dalšího toxinu tvořícího pór, jako jsou cholesterol dependentní cytolysiny, hexamerní toxiny nebo heptamerní toxiny. Příklady hexamerních a heptamerních toxinů zahrnují toxiny, které jsou příbuzné k a-toxinu • · · ··

» «

Staphylococcus. V jednom provedení je konkrétně vyloučen mutant vznikly vynecháním z toxinu VacA z Helicobacter pylori.

„Mutace znamená změnu v sekvenci nukleové kyseliny tak, že aminokyselinová sekvence kódovaná sekvencí nukleové kyseliny má alespoň jednu změnu v aminokyselinové sekvenci v porovnání s přirozenou sekvencí. Mutace je případně, ale tímto výčtem není nijak omezena, mutace vložením, mutace vynecháním, mutace posunutím rámce nebo mutace s chybným smyslem.

„Toxin tvořící pór znamená toxin, který tvoří transmembránový vodný pór.

„Toxin A-B tvořící pór znamená toxin tvořící pór se dvěma funkčními skupinami; jedné skupiny (B), která tvoří pór v ochranné membráně buňky hostitele, a druhé skupiny (A) , která prochází skrz ochrannou membránu a enzymaticky modifikuje konkrétní substráty uvnitř buňky hostitele.

„Binární toxin A-B tvořící pór znamená toxin A-B tvořící pór, ve kterém skupiny A a B toxinu tvořícího pór jsou oddělené proteiny a interaguj í během intoxikace buňky hostitele. Příkladem binárního toxinu je toxin antraxu.

„Skupina B znamená složku toxinu A-B tvořícího pór, která se váže na konkrétní povrchový receptor hostitelské buňky, interaguje se skupinou A toxinu a pomáhá skupině a dostat se do buňky. Mnoho skupin B, jako je PA, také tvoří

transmembránové póry.	(PA)	označuje	polypeptid,	který má
„Ochranný	antigen
alespoň 60 %,	70 %,	80 %	nebo 90	% alespoň	j edné z
biologických	aktivit	PA	polypeptidu antraxu	popsaného
v předkládaném	vynálezu.	Polypeptid je	případně kódován genem

PA, který popsal Vodkin a kol. (Cell, 34: 693 až 697, 1983).

Polypeptid je případně shodný s přirozeným PA popsaným Millerem a kol. (Biochemistry 38(32): 10432 až 10441, 1999) (sekvence id. č. 21) nebo jiným přirozeným PA polypeptidem z kmenu Bacillus anthracis. PA polypeptid lze případně • ·· *» ·· * 4 » 4 » » « • · · · klonovat a exprimovat v heterologním hostiteli, jako je Escherichia coli nebo Bacillus subtilis. Rozumí se, že homology a analogy, které mají charakteristiky PA antraxu, jsou také popsané v předkládaném vynálezu a lze je použít ve způsobech podle předkládaného vynálezu.

„PA63 znamená karboxy-koncovou část, která vzniká z proteolytického odštěpením N-koncového segmentu o velikosti 2 0 kDa z PA polypeptidu. PA63 tvoří heptamerní prepór a váže dvě alternativní skupiny A, edémový faktor (EF) a letální faktor (LF). Celý komplex se přesouvá do endosomu, kde se PA63 vpravuje do membrány, tvoří transmembránový pór a přemisťuje EL a LF do cytoplasmy hostitelské buňky.

„Transmembránový pór znamená transmembránový vodný kanál. Například transmembránový pór je případně β-válcovitý kanál tvořený střídavě hydrofilními a hydrofobními zbytky PA63 tak, že hydrofobní zbytky tvoří vnější část povrchu válce přiléhajícího k membráně a hydrofilní zbytky sousedí s vodným lumenem póru, který se rozprostírá napříč membránou hostitelské buňky.

„Hydrofilní povrch transmembránového póru znamená aminokyseliny PA, které sousedí s vodným lumenem póru, který se rozprostírá napříč membránou hostitelské buňky.

„Aminokyselina, která tvoří transmembránový pór znamená aminokyselinu PA, která je umístěna v β-válcovitém kanálu transmembránového póru.

„Smyčka D2L2 znamená amfipathickou smyčku, která spojuje vlákna 2β2 a 2β3 PA polypeptidu a PA63 polypeptidu, jak je popsáno v předkládaném vynálezu.

„Inhibice schopnosti tvořit pór znamená snížení množství pórů vytvořených v membránách nebo snížení rychlosti nebo množství skupiny A (např. EF nebo LF) která se přemístí do cytoplasmy hostitelské buňky. Toto snížení vzniku póru nebo přemístění toxinu je přímo úměrné k, a lze jej předpovědět, snížení aktivity při přemisťování přes povrch buňky, LFnDTA • · toxicitě nebo testu uvolňování rubidia, který je popsaný v předkládaném vynálezu. Tato snížená aktivita je přímo úměrná snížení množství radioaktivně značeného ligandu, který se přemístí do buněk, při testu přestupu buněčným povrchem, snížení inhibice proteinové syntézy díky přemístění ligandu do buněk v testu LFnDTA toxicity nebo snížení uvolňování radioaktivně značených iontů z buněk při testu uvolňování rubidia. Navíc je tato snížená aktivita přímo úměrná snížení toxicity způsobené přemístěním toxického ligandu do buněk. V jednom vhodném provedení je snížení tvorby póru nebo přemístění skupiny A alespoň 20 %, vhodněji alespoň 40 % a nejvhodněji alespoň 80 % relativně k přirozené skupině B odpovídajícího toxinu. V dalším vhodném provedení je snížení tvorby póru nebo přemístění EF nebo LA mutantním PA alespoň 20 %, vhodněji alespoň 40 % a nejvhodněji alespoň 80 % relativně k přirozenému PA63.

„Nedostatek schopnosti tvořit pór znamená, že se netvoří významné množství pórů v membránách nebo se nepřemísťuje významné množství EF nebo LF do cytoplasmy hostitelské buňky. Tento nedostatek významné tvorby pórů nebo aktivity při přemisťování toxinu je přímo úměrný k, a lze jej předpovědět, snížení aktivity při přemisťování přes povrch buňky, LFnDTA toxicitě nebo testu uvolňování rubidia, který je popsaný v předkládaném vynálezu. V jednom vhodném provedení je množství vznikajících pórů nebo množství přemístěného toxinu méně než pětinásobek množství detekovaného v kontrolním testu provedeném bez PA. Vhodněji je množství méně než dvojnásobek množství detekovaného v kontrolním testu provedeném bez PA.

„Fragment znamená polypeptid, který má oblast po sobě jdoucích aminokyselin, které jsou stejné jako v případě odpovídající oblasti v mutantním PA. Fragment má buď sníženou schopnost tvořit póry nebo přemisťovat toxiny v porovnání s přirozeným PA. Fragment také případně inhibuje schopnost přirozeného PA tvořit pór. Toto snížení vzniku póru nebo ’

♦ ·♦ *· ·· # β » ♦ · * · · · · · • · · · · · • · · · · • · · ·** · · * ♦· 9 · přemístění toxinu je přímo úměrné k, a lze jej předpovědět, snížení aktivity při přemisťování přes povrch buňky, LFnDTA toxicitě nebo testu uvolňování rubidia, který je popsaný v předkládaném vynálezu. Tato snížená aktivita je přímo úměrná snížení množství radioaktivně značeného ligandu, který se přemístí do buněk, při testu přestupu buněčným povrchem, snížení inhibice proteinové syntézy díky přemístění ligandu do buněk v testu LFnDTA toxicity nebo snížení uvolňování radioaktivně značených iontů z buněk při testu uvolňování rubidia. V jednom vhodném provedení je snížení tvorby póru nebo přemístění EF nebo LF alespoň 20 % relativně k přirozenému PA63. Vhodněji je toto snížení alespoň 40 % relativně k přirozenému PA63 a nejvhodněji je toto snížení alespoň 80 %. Inhibice schopnosti tvořit pór v porovnání s přirozeným PA je přímo úměrná k, a lze ji předpovědět, snížení aktivity ve výše popsaném testu za použití ekvimolární směsi přirozeného PA a PA fragmentu v porovnání s použitím přirozeného PA samostatně. V jednom vhodném provedení je snížení alespoň 20 %, 40 %, 60 %, 80 % nebo 99 % v porovnání s aktivitou při použití přirozeného PA samostatně. Vhodné je, aby fragment byl imunogenní a vyvolával produkci ochranných protilátek proti přirozenému PA. V dalším vhodném provedení podávání fragmentu savci, jak je popsáno v příkladu 9, brání nebo oslabuje infekci antraxem po dobu alespoň 1 měsíce, vhodněji 3 měsíců nebo nejvhodněji 6měsíců. Příklady možných fragmentů zahrnují C-koncový tryptický fragment PA mutantu o velikosti 63 kDA nebo mutantní PA, který obsahuje vynechání aminokyselin, které tvoří transmembránový pór.

„Čištěná protilátka znamená protilátku, která je alespoň ze 60 % hmotnostních zbavena proteinů a přirozených organických molekul, se kterými je přirozeně spojena. Vhodné je když je prostředek tvořen alespoň 75 % hmotnostními, vhodněji 90 % hmotnostními a nejvhodněji alespoň 99 % hmotnostními protilátky. Čištěnou protilátku lze získat

například afinitní chromatografií za použití rekombinantně produkovaného proteinu nebo peptidů s konzervativním motivem a standardními technikami.

„Specificky váže znamená, že protilátka rozpoznává a váže se k, například, přirozenému PA nebo mutantnímu PA, ale v podstatě nerozpoznává a neváže se k jiným molekulám, které nejsou PA, ve vzorku, např. biologickém vzorku, který přirozeně obsahuje proteiny. Vhodná protilátka specificky váže jakýkoliv z mutantních PA č. 1 až 18 v Tabulce 1. Další vhodné protilátky váží PA přirozeného typu s alespoň 2, 5, 10 nebo 20 krát vyšší afinitou než váží jeden nebo více z mutantních PA z Tabulky 1.

Shodnost sekvence se typicky měří za použití software pro sekvenční analýzu se standardními parametry, které jsou v něm uvedeny (např. Sequence Analysis Software Package z Genetics Computer Group, University of Wisconsin Biotechnology Center, 1710 University Avenue, Madison, WI 53705). Tento program porovnává podobné sekvence tak, že přiřazuje určitý stupeň homologie různým nahrazením, vynecháním a dalším úpravám. Konzervativní nahrazení typicky zahrnují nahrazení v následujících skupinách: glycin, alanin, vylin, isoleucin, leucin; kyselina asparagová, kyselina glutamová, aspraragin, glutamin,· serin, threonin; lysin, arginin; a fenylalanin, tyrosin.

Další rysy a výhody předkládaného vynálezu budou zřejmé z následujícího podrobného popisu.

Stručný popis obrázků

Obr 1. je schématická ilustrace intoxikační cesty ATx toxinu. PA složka ATx se váže na receptor na povrchu savčí buňky a dodává enzymové skupiny A toxinu, edémový faktor (EF) a letální faktor (LF), do cytosolu způsobem, který již byl popsán výše.

*· ♦ * ·· ♦ · • « I ««· ··

Obr. 2A je obrázek SDS-PAGE gelů ukazující vznik PA mutantních proteinů a vznik SDS-rezistentních oligomerů přirozeného typu, K397Q a AD2L2 PA. Obr. 2B je obrázek přirozeného gelu ukazující vznik prepórů přirozeného typu, K397A a D425A PA.

Obr. 3 je sloupcový graf ukazující množství ⁸⁶Rb uvolněného z buněk zatížených ⁸⁶Rb po inkubaci přirozeným typem, K397A nebo D425A PA v porovnání s kontrolou bez PA.

4A je sloupcový graf ukazující množství ³⁵S-LFn

Obr.	4A
(N-konec	1-255
buňkami,	které
D425A PA.	Obr.

je graf ukazující snížené přemístění ³⁵S-LFn do buněk, které je zprostředkováno K397A nebo D425A PA v porovnání s PA přirozeného typu.

Obr. 5 je graf ukazující procenta ³H-Leu v TCA nerozpustném podílu (proteinová frakce) po inkubaci buněk přirozeného typu, K397A nebo D425A PA v testu LFnDTA toxicity. Přemístění LFnDTA, který obsahuje LFn fúzovaný s A-řetězcem toxinu diftérie, do buněk vede k ribosylaci EF-2, což vede k inhibici proteinové syntézy a zvýšení množství ³H-Leu v proteinové frakci.

Obr. 6A je sloupcový graf ukazující podobnou vazbu ³⁵S-LFn k buňkám inkubovaným s přirozeným typem, AD2L2, dvojitým mutantem K397D + D425K, nebo směsí přirozeného typu a AD2L2 nebo K397D + D425K PA. Obr. 6B je sloupcový graf ukazující snížení přemístění ³⁵S-LFn zprostředkovaného PA přirozeného typu pomocí AD2L2 nebo K397D + D425K PA.

Obr. 7 je graf ukazující vyšší procento ³H-Leu v TCA nerozpustné frakci po inkubaci AD2L2 nebo K397D + D425K PA a PA přirozeného typu v porovnání s přirozeným typem PA samostatně. Tento výsledek je v souladu se snížením inhibice syntézy proteinů způsobené PA přirozeného typu v testu toxicity LFnDTA.

• · ♦ ♦ ·· ·# ·

Obr. 8A je graf ukazující snížení inhibice proteinů způsobené PA přirozeného typu v testu toxicity LFnDTA. Zvýšení koncentrací mutantních PA proteinů uvolňuje inhibici absorpce ³H-Leu do TCA nerozpustné frakce zprostředkovanou PA přirozeného typu. Obr. 8B je graf ukazující, že pro uvolnění inhibice absorpce ³H-Leu jsou potřeba mnohem vyšší množství PA-SSR relativně k PA přirozeného typu v porovnání s množstvími potřebnými pro mutanty vypsané v Obr. 8A.

Obr. 9 je graf ukazující snížení inhibice syntézy proteinů zprostředkované PA přirozeného typu v testu LFnDTA toxicity díky přítomnosti rostoucích koncentrací dominantního negativního PA mutantu. Vliv dominantních negativních mutantů K397D + D425K ( ), AD2L2 (), F427A (o), D425K (Δ) a K397D (0) a kontrolního mutantu SSSR ( ) jsou uvedeny v tomto obrázku.

Obr. 10 je graf ukazující snížení inhibice syntézy proteinů zprostředkované PA přirozeného typu v testu LFnDTA toxicity díky přítomnosti rostoucích koncentrací následujících dominantních negativních PA mutantů: K397D + D425K ( ), F427A + AD2L2 (□), K397D + D425K + F427A (o) a K397D + F427A + AD2L2 ( )

Obr. 11 je sloupcový graf ukazující inhibici proteinové syntézy heteroheptamerem vytvořeným smícháním PA přirozeného typu PA s mutantním PA (K397D + D425K, AD2L2, F427A nebo D425K) a pak štěpení molekul PA trypsinem. Také byla měřena inhibice proteinové syntézy ekvivalentním množstvím směsi 1 : 1 odpovídajícího mutantu a homoheptameru přirozeného typu.

Obr. 12 je čárový graf ukazující vliv dominantních negativních mutantů K397D + D425K, AD2L2, F427A a D425K na nízkým pH hnaný přesun ³⁵S LFN přes plasmovou membránu. Uvedené výsledky jsou průměrem tří experimentů + exponenciálně vyrovnaný průměr.

Obr. 13 je aminokyselinová sekvence proteinu PA přirozeného typu použitá pro testy popsané v předkládaném vynálezu (sekvence id. č. 21) . PA mutantní proteiny popsané ·

• ·

4 4		•	44
4	•	44	4 ·
44		•	4
•	• 4	4	4
*	•	4	4
• ·

aktivitu. z Clostridium difficile („cpiota), C. spiroforme

C. perfringens botulinum (cbc2).

v předkládaném vynálezu jsou založeny na této sekvenci přirozeného typu.

Obr. 14 je polynukleotidová sekvence kódující PA protein přirozeného typu použitá pro testy popsané v předkládaném vynálezu (sekvence id. č. 22).

Obr. 15 je porovnání aminokyselinové sekvence PA s jinými binárními A-B toxiny, které mají ADP ribosyltransferasovou Vypsány jsou aminokyselinové sekvence toxinů („cdADPRT), ^„csiota) a C.

Toxiny C. perfringens a C. spiroforme jsou často označovány jako iota toxiny, zatímco botulinový toxin je označován jako C2. Dále porovnání zahrnuje sekvence toxinu produkovaného Bacillus cereus („VIP1), který je často označován jako VIP pro vegetativní insekticidní protein.

Obr. 16 je porovnání aminokyselinové sekvence PA s aminokyselinovou sekvencí toxinů z Clostridium difficile („cdADPRT), C. perfringens („cpiota), C. spiroforme („csiota) a C. botulinum (cbc2). Toto porovnání zahrnuje úplné sekvence toxinů.

Podrobný popis vynálezu

Nalezli jsme prostředky, kterými lze zastavit infekci bakteriemi produkujícími A-B toxin. Předkládaný vynález tak poskytuje prostředek pro použití jako protidávka ke konkrétním bakteriálním infekcím, včetně antraxu a gangrény. Protože tento prostředek je bezpečný a imunogenní, lze jej také použít jako očkovací látku.

Bylo zkonstruováno, exprimováno, čištěno a testováno mnoho mutantů PA antraxu, zda mají sníženou aktivitu v porovnání s PA přirozeného typu. Konkrétně byly tyto mutanty testovány na schopnost vázat PA ligandy a receptory; tvořit prepóry, SDS-rezistentní oligomery a póry; a přemisťovat ligandy přes membrány. Na základě rentgenové strukturní analýzy struktury

PA jsou mutantní zbytky navrženy tak, aby byly v lumenu PA prepóru. Mutantní PA nebo jejich fragmenty se sníženou nebo nedetekovatelnou schopností tvořit póry v membránách lze použít jako očkovací látky pro vytvoření ochranných protilátek, které budou bránit infekci antraxem. Navíc jsou případně tyto mutanty účinnější při léčení infekce antraxem než PA přirozeného typu, protože mají sníženou schopnost přemisťovat EF a LF produkovaný v Bacillus anthracis u infikovaného savce.

Tyto bodové mutanty a již dříve popsané mutanty vzniklé vynecháním, ve kterých chybí zbytky 302 až 325 domnělé smyčky 2 přemosťující membránu z domény 2 (AD2L2) (Miller a kol., Biochemistry 38: 10432 až 10441, 1999), byly dále charakterizovány tak, aby se zjistilo, zda jsou schopny působit jako dominantní negativní inhibitory snížení tvorby pórů pomocí PA přirozeného typu. Tato inhibice je případně důsledkem vazby ligandů nebo receptorů mutanty tak, že je méně molekul, které může PA přirozeného typu vázat. Mutanty také případně tvoří oligomery s PA přirozeného typu tak, že má sníženou nebo nedetekovatelnou schopnost tvořit póry a přemisťovat ligandy. Dominantní negativní PA mutanty a jejich fragmenty lze použít jako očkovací látku pro vytvoření ochranných protilátek pro prevenci nebo léčení infekce antraxem, jak již bylo popsáno výše. Navíc lze mutanty nebo fragmenty s dominantní negativní aktivitou použít jako terapeutická činidla pro léčení infekce antraxem inhibicí aktivity PA vylučovaného Bacillus anthracis u infikovaného savce. Protože dominantní negativní mutanty dokáží vyvolat produkci ochranných protilátek a inhibovat produkovaného infikující baktérií, lze je kombinaci očkovací látky a terapeuticky účinné látky, což je zvláště účinné pro léčení jedinců, kteří trpí nebo existuje možnost vzniku infekce antraxem. Vedle potřeby co nej rychleji zrušit působení toxinu je také důležité očkovat jedince, kteří aktivitu PA použít jako « ·· · ·· ·· ·♦ ··«« ·· · · · r · • ·· · ♦ ♦ · * • « · · · · · · ♦ · • ·« ♦· ··· ··* '·· ··· ··*· ·· ·♦·· byly vystaveni aerosolizovaným sporám B. anthracis. Toto očkování je nezbytné pro ochranu před prodlouženým působením antraxu klíčením spór, které případně zůstávají v těle po prodlouženou dobu (alespoň měsíce).

V této studii byly identifikovány některé mutanty PA, které nemají schopnost tvořit póry v membránách a přemisťovat ligandy a tím jsou potenciálními očkovacími látkami pro prevenci nebo léčení infekce antraxem (Tabulka 1) . Mutanty číslo 1 až 12 je možno proteolyticky aktivovat tak, aby vytvořily SDS-disociovatelný stav PA63 prepóru a vázaly se na buněčný receptor, EF a LF. Některé z mutací brání přeměně prepóru na SDS-rezistentní stav (Tabulka 1) . Tyto mutanty (K397A, K397C, K397D, D425A, D425N, D425K D425E, D425K, K397 + D425K a K395D + K397D + D425K + D426K) jsou také defektní při tvorbě póru a přemisťování přes membránu. Další skupinu mutantů (AD2L2 PA, K397Q a F427A) tvoří SDS-rezistentní oligomery, které se ale nevkládají do membrány a netvoří póry. Tyto výsledky byly neočekávané.

Tabulka 1

Aktivita ochranných antigenních mutantů.

Mutant číslo	Sekvence id. č.	Mutace	Tvoří SDS- rezistentní oligomer?	Tvoří kanály	Dominantně negativní?
1	1	K3 97A	Ne	Ne	Ne
2	2	K3 97D	Ne	Ne	Ne
3	3	K397C	Ne	Ne	Ne
4	4	K397Q	Ano	Ne	Ne
5	5	D425A	Ne	Ne	Ne
6	6	D425N	Ne	Ne	nestanoveno
7	7	D425E	Ne	Ne	Ne
8	8	D425K	Ne	Ne	Ano
9	9	F427A	Ano	Ne	Ano
10	10	K397D +	Ne	Ne	Ano

		D425K
11	11	K395D + K397D + D425K + D426K	Ne	Ne	Ano
12	12	AD2L2	Ano	Ne	Ano
13	13	K397D + D425K + F427A	nestanoveno	nestanoveno	Ano
14	14	F427A + AD2L2	nestanoveno	nestanoveno	Ano
15	15	K397D + F427A + AD2L2	nestanoveno	nestanoveno	Ano
16	16	K397D + D425K + F427A + AD2L2	nestanoveno	nestanoveno	Ano
17	17	F427D	nestanoveno	nestanoveno	Ano
18	18	F427K	nestanoveno	nestanoveno	Ano

Tyto P mutanty byly připraveny postupem popsaným v příkladu 1.

Několik mutantů (AD2L2, K397D + D425K dvojitý mutant,

K395D + K397D + D425K + D426K čtyřnásobný mutant, D425K,

F427A, K397D + D425K + F427A trojitý mutant, F427A + AD2L2 dvojitý mutant, K397D + F427A + AD2L2 trojitý mutant, K397D +

D425K + F427A + AD2L2 čtyřnásobný mutant, F427D a F427K) inhibuje přemístění ligandů přes membránu zprostředkované PA přirozeného typu. 0 PA mutantech AD2L2 a K397D + D425K bylo prokázáno, že tvoří s PA přirozeného typu oligomery, které nejsou schopné přemisťovat ligandy. Tyto výsledky byly neočekávané. Přítomnost jediné molekuly z těchto mutantů

v heptamerním prepóru je případně postačující pro blokování přeměny na pór. Tato schopnost blokovat vznik póru pomocí PA přirozeného typu, spolu se schopností soutěžit s PA přirozeného typu o vazbu s buněčnými receptory a odstraňování EF a LF z oběhu, činí tyto mutanty atraktivní pro použití při léčení a prevenci infekce antraxem.

Mutace dalších zbytků v PA případně také inhibuje vznik póru nebo vyvolává dominantní negativní aktivitu. Například zbytky, které elektrostaticky interagují s nabitými postranními řetězci Lys397 nebo Asp425 jsou případně také nutné pro vytvoření póru pomocí PA a mutace jednoho nebo kombinace těchto zbytků případně inhibuje vznik póru a výsledkem je dominantní negativní aktivita. Navíc je vynechání menších částí smyčky 302 až 325 D2L2 nebo vynechání aminokyselin přiléhajících ke smyčce a části nebo celé oblasti 302 až 325 případně také vede k těmto výsledkům.

Schopnost získat mutanty PA s nedetekovatelnou schopností tvořit póry nebo přemisťovat ligandy a mutanty, které slouží jako dominantní negativní inhibitory PA přirozeného typu, vede k názoru, že podobné mutanty lze získat i u jiných toxinů, jako je cť-hemolysin z Staphylococcus aureus, aerolysin z Aeromonas hydrophila, α-toxin z Clostridium septi cum, cytotoxin z Pseudomonas aeruginosa, heterooligomerní toxiny (toxiny AB5) nebo z B skupin toxinů tetanu, botulinu nebo diftérie. Navíc tyto výsledky podtrhují možnost identifikace dominantních negativních forem množství dalších oligomerních virulentních faktorů, a to od toxinů až po adhesiny.

U toxinu antraxu a dalších oligomerních systémů, ve kterých dochází k procesu skládání v kontaktu s extracelulárním prostředím, mohou být exogenně přidané mutantní podjednotky principiálně zahrnuty do finální struktury, čímž se zvyšuje šance, že takové podjednotky lze terapeuticky použít. Systémový antrax, ačkoliv je jako přirozená nemoc velmi řídký, je obávaný jako prostředek • ·· » ** ·* ·» _Λ 4 · ···· ··-»

ΟΊ · ·· · * · · · · « · « · ···· · ··· · · · · · ··· ·· ··· ···· ·♦ ·*·· biologické války a biologického terorismu, a dominantně negativní PA se zdá být cenným kandidátem na léčivo. Za předpokladu, že podávaný dominantně negativní PA se volně míchá s PA přirozeného typu produkovaného v těle B. anthacis, proteiny by se měly skládat na buňkách do formy neaktivních nefunkčních komplexů, čímž dochází k blokování působení LF i EF. Vedle zabránění zjevným příznakům, dominantně negativní mutanty případně také chrání fagocyty před destrukcí, čímž pomáhají hostiteli v likvidaci infekce. Po injikování PA přirozeného typu lidem nebyly pozorovány žádné vedlejší účinky, a proto by ani mutantní neaktivní forma proteinu neměla představovat žádné nebezpečí.

Dominantně negativní PA lze také využít jako základ pro nové očkovací látky proti antraxu. Jak také jeho jméno naznačuje, PA vyvolává produkci ochranných protilátek proti antraxu a skutečně je hlavním ímunogenem očkovací látky, která je v současnosti autorizována v USA. Mutanty AD2L2, K397D + D425K a F427A popsané v předkládaném vynálezu vykazují malý nebo žádný pokles imunogenicity v porovnání s PA přirozeného typu u krys Fisher. Také jsme nalezli mutanty, které jsou nečekaně dominantně negativní tak, že podávání mutantu v poměru 0,25 : 1 k PA přirozeného typu nevede u krysího modelu k jakýmkoliv zjistitelným příznakům infekce antraxem. Čištěný PA přirozeného typu je zvažován jako náhrada v současnosti používané očkovací látky, a pokud dominantně negativní forma PA prokáže svou terapeutickou účinnost, pak může tuto roli plnit stejně dobře, čímž se zamezí nutnosti vyvíjet dva téměř identické léky.

Následující příklady jsou ilustrací předkládaného vynálezu. Nejsou zamýšleny jako jakékoliv omezení předkládaného vynálezu. Pokud není uvedeno jinak, údaje pro PA mutanty K397A a D425A jsou reprezentativní pro data získaná pro PA mutanty číslo 1 až 12 vypsané v tabulce 1.

• 9t 9 ♦· *♦ ·· • t « · ·* · · · * ♦ • ·· · · » · ♦ • « * · · · · * · · t · * · · « · · »«· 9* ·** ·»»· ·» ··*·

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Obecné postupy

Buněčná kultura, média a chemikálie

Buňky křeččích vaječníků K1 (CHO-K1) byly získány ze sbírky kultur amerického typu. Buňky byly kultivovány v HAM F-12 doplněném 10% hovězím sérem, 500 jednotkami/ml penicilinu G, 2 mM L-glutaminu a 500 jednotkami/ml streptomycinsulfátu a udržovaném při 5 % CO₂ v navlhčené atmosféře. Buňky byly nasazeny na 24- nebo 96- jamkové mikrotitrační destičky (Costar, Cambridge, MA) v době 16 až 18 hodin před experimentem. Všechna média pro buněčnou kulturu byla získána od firmy Gibco BRL, pokud není výslovně uvedeno jinak. Všechny chemikálie byly získány od Sigma Chemical Co., pokud není výslovně uvedeno jinak.

Konstrukce a čištění PA proteinů

PA mutant AD2L2, který neobsahuje aminokyseliny 302 až 325 z PA byl exprimován a čištěn postupem, který již byl dříve popsán (Miller a kol., Biochemistry 38: 10432 až 10441, 1999). Bodové mutace č. 1 až 11 z tabulky 1 byly provedeny za pomocí QuickChange způsobu místně směrované mutageneze podle návodu výrobce (Stratagene, La Jolla, CA) . Plasmid z práce Miller a kol. (viz výše) kódující PA přirozeného typu byl použit jako templát. Bodové mutace byly klonovány do pET22-b(+) (Novagen) expresního vektoru a pro expresi transformovány do BL21 (DE3) (Novagen). Mutanti obsahující bodovou mutaci byly exprimovány a čištěny postupem, který již byl dříve popsán (Miller, 1999). Stručně shrnuto byly kultury kultivovány v LB při 37 °C na A₆₀o z 1,0. Exprese rekombinantního proteinu byla vyvolána přídavkem β-D-isopropylthiogalaktopyranosidu v množství 1 mM. Po tomto přídavku byly buňky kultivovány ještě další 3 hodiny ·« · «*· *» ·* < · »· · · ♦ · · ·· · « · · · « * · · «·«· * • · · · * · * • «· ··· ·«·· *· ·*»· při 30 °C a odděleny odstředěním po dobu 10 minut při 8000 x g.

Proteiny byly uvolněny z periplasmy osmotickým šokem. Buňky byly resuspendovány ve 20 mM Tris-HCl, pH 8,0, 30% glukose, vyjádřeno v procentech hmotnostních, a 1 mM EDTA a inkubovány za laboratorní teploty po dobu 10 minut za trvalého míchání. Buňky byly odděleny odstředěním, resuspendovány v 5 mM MgSO₄ obsahujícím 20 mM benzamidinu a inkubovány při 4 °C po dobu 10 minut za trvalého míchání. Po opětovném stlačení buněk odstředěním při 8000 x g, byl periplasmatický extrakt odlit. Pak byl přidán Tris-HCl o pH 8,0 tak, aby výsledná koncentrace byla 2 0 mM a celý vzorek byl nanesen na kolonu Q-sepharose HP. Nevázaný protein byl z kolony vymyt pufrem A (20 mM Tris, pH 8,0). Vázaný protein byl vymyt lineárním gradientem 0 % až 25 % objemových pufru B (20 mM Tris, pH 8,0, 1 M NaCl). Tyto frakce obsahující PA byly zahuštěny a pufr byl vyměněn pomocí kolony pd-10 (Amersham-Pharmacia) obsahující pufr A. Eluát obsahující PA byl nanesen na kolonu Mono-Q a vymyt gradientem pufru B 0 % až 25 % hmotnostních. Frakce obsahující PA byly analyzovány SDS-PAGE a skladovány při -80 °C. Koncentrace proteinů byly stanoveny za použití testovací sady na proteiny Bio-Rad podle návodu uvedeného výrobcem. Všechny kapalinové chromatografie byly provedeny na AKTA čistícím systému kapalinové chromatografie (Amersham-Pharmacia).

Ostatní mutanty (čísla 13 až 18 z tabulky 1) byly konstruovány, exprimovány a čištěny stejným způsobem.

Proteolytická aktivace PA

Pro proteolytické štěpení PA83 na štěpený PA (nPA) byl použit trypsin. PA byl zředěn na koncentraci 0,5 mg/ml v případě testu tvorby prepóru a na koncentraci 0,2 mg/ml v případě ostatních testů. Trypsin byl přidán tak, aby konečný poměr trypsinu ku PA byl 1 : 1000 (hmotnostně) , výsledná směs

•	•	♦9	99
«· > ·	• 9 * €	n		•	•
• ··	• ·	•		•	•
• · ·	i ·	4		•	•
• <e «·	«« « ···«		·*

byla inkubována za laboratorní teploty po dobu 2 0 minut a pak následovala inhibice trypsinu 10 molárním přebytkem trypsinového inhibitoru ze sójových bobů.

Test přemístění přes povrch buňky

Pro změření přemístění radioaktivně značeného LFn (N-koncové aminokyseliny 1 až 255 PA vázající domény LF) zprostředkovaného PA byl proveden test přemístění přes povrch buňky postupem, který již byl dříve popsán (Wesche a kol., Biochemistry, 37: 15737, 1998). Stručně shrnuto se nPA (2 x 10'⁸ M) nejprve naváže na buňky CHO a pak se k PA63 na povrchu buňky naváže ³⁵S LFn. Přebytek LFn se odstraní a buňky se promyjí a podrobí pulsu pH o hodnotě 5,0 při 37 °C. Puls nízkého pH napodobuje okyselení endosomu a vede k přemístění LFn přes plasmovou membránu do buňky, které zprostředkovává PA. Vzorky se pak upraví pronasou, která proteolyticky odbourává extracelulární ³⁵S LFn, ale ne ³⁵S LFn, který byl přemístěn do buněk. Pak byly buňky promyty a lýzovány. Pro stanovení celkového množství ³⁵S LFn, které se váže k buňkám, nebyly některé buňky upraveny pronasou. Po lýzování bylo množství ³⁵S LFn v roztoku nad usazeninou stanoveno scintilačním čítačem. Procenta přemístění byla vypočtena následujícím způsobem:

(DPM chráněný před pronasou) / (DPM vázaný k buňkám) x 100 = % přemístění

Pro stanovení toho, zda proteiny mutantního PA inhibují přemístění LFn PA přirozeného typu, byl tento test také proveden za použití ekvimolárních množství mutantního PA a PA přirozeného typu, které byly smíchány před podrobením účinku trypsinu a před přidáním k buňkám zředěny na 2 x 10'⁸ M PA (1 x 10’⁸ M každého proteinu) . Když byl PA v koncentraci 1 x 10⁸ M použit jako kontrola, pak byla účinnost přemístění pouze mírně ovlivněna snížením množství PA v porovnání s testem provedeným s 2 x 10'⁸ M PA přirozeného typu, což vede ·· • · • * • * • · ·«·· • ·· ·· > » oc * ·· ·

·· e* · ···· k názoru, že jakékoliv snížení v přemístění a vazbě není pouze důsledkem snížení koncentrace PA přirozeného typu.

Inhibice syntézy proteinů

Pro změření přemístění ligandů do buněk zprostředkovaného PA byla jako další metoda použita inhibice syntézy proteinů LFnDTA (Milné a kol., Mol. Microbiol., 15: 66, 1995). Pro otestování PA mutantů číslo 1 až 12 z tabulky 1, byly buňky CH0-K1 naneseny v množství 2,5 x 10⁴ buněk na jamku na destičku s 96 jamkami 16 hodin před přidání PA proteinu. PA83 (1 x 10'¹² M až 1 x ΙΟ⁷ M) byl inkubován s buňkami v přítomnosti 1 x 10~⁸ M LFnDTA po dobu 4 hodin. Pak bylo médium odstraněno a nahrazeno médiem HAM F-12 bez leucinu doplněném ³H-Leu v množství 1 mCi/ml. Po jedné hodině inkubace byly buňky promyty ledově studeným PBS a ledově studenou kyselinou trichloroctovou (10% roztok, vyjádřeno v procentech hmotnostních), aby se vysrážely proteiny. Množství ³H-Leu zabudovaného do materiálu nerozpustného TCA bylo stanoveno pomocí scintilačního čítače a bylo použito jako míra množství nově syntetizovaných proteinů.

Mutantní PA proteiny byly v tomto testu také testovány, zda uvolňují inhibici příjmu ³H-Leu způsobenou PA přirozeného typu. PA přirozeného typu byl přidán k CHO buňkám v koncentraci 1 x ΙΟ'⁹ M až 1 x 10'⁸ M LFnDTA. Také bylo přidáno zvýšené množství jednoho z mutantů. Buňky byly s toxinem inkubovány po dobu 4 hodin a vzorky byly zpracovány postupem, který již byl výše popsán.

Podobně byly testovány PA mutanty vypsané v obrázku 9. Buňky CHO-K1 (2,5 x 10⁴ buněk na jamku) na destičce s 96 jamkami byly inkubovány po dobu 18 hodin při teplotě 37 °C z PA přirozeného typu (100 pM) v přítomnosti LFN-DTA (100 pM) a různých množství jednotlivých PA mutantů (K397D + D425K, AD2L2, F427A, D425K, K397D nebo SSSR). Médium pak bylo odstraněno a nahrazeno HAM F-12 bez leucinu doplněném ³H-Leu

v množství 1 mCi/ml. Po jedné hodině inkubace při teplotě 37 °C byly buňky promyty ledově studeným PBS a ledově studenou 10% kyselinou trichloroctovou (TCA), vyjádřeno v procentech hmotnostních). nerozpustného zabudovaného do materiálu a vyjádřeno jako procenta bez přítomnosti PA. Při je průměr ze tří pokusů výsledky byly zjištěny i

Množství H-Leu TCA bylo měřeno množství, které se zabudovalo zvolených koncentracích PA přirozeného typu a LFnDTA byla syntéza proteinů v nepřítomnosti mutantního PA inhibována z 90 % (tečkovaná čára). Uveden + směrodatná odchylka. Podobné v případě, že výchozí inkubace trvala čtyři hodiny místo 18 hodin. Podobným způsobem byly testovány mutantní PA K397D + D425K + F427A, F427A + AD2L2 a K397D + F427A + AD2L2 vypsané na obrázku 10.

PA způsobená inhibice syntézy proteinů vyvolaná heteroheptamery přirozeného typu a mutantními PA byla porovnána s tou, která byla vyvolána odpovídajícími heptamery. Homoheptamery přirozeného typu PA63 a mutanty K397D + D425K, AD2L2, F427A, K397D a D425A byly připraveny postupem, který již byl popsán výše. Domnělé heteroheptamery byly připraveny smícháním každého mutantního PA s PA přirozeného typu v poměru 1 : 1 před podrobením účinku trypsinu a kolonovou chromatografií (obr. 11) . PA přirozeného typu (1 nM) , heteroheptamer (H) (konečná koncentrace 2 nM) nebo ekvimolární směs (Μ) (1 nM každého) odpovídajícího mutantního homoheptameru nebo heptameru přirozeného typu byly inkubovány s buňkami CHO-K1 v přítomnosti LFnDTA (100 pM) po dobu 18 hodin a inhibice syntézy proteinů byla měřena postupem popsaným pro obrázek 9. Koncentrace heptamerů jsou vyjádřeny v jednotkách monomerních podjednotek PA63. Syntéza proteinů je vyjádřena jako procento kontroly bez PA. Uveden je průměr tří experimentů + exponenciálně vyrovnaný průměr. Podobné výsledky byly zjištěny i po jedné hodině inkubace.

Vznik prepóru a SDS-rezistentního oligomeru

Vznik prepórů a SDS-rezistentních oligomerů byl měřen inkubací nPA v ekvimolárním množství LFn po dobu 30 minut za laboratorní teploty. Pro stanovení toho, zda prepóry vznikly byly vzorky podrobeny elektroforéze v 4% až 12% nativním gradientním gelu (FMC) za použití 50 mM CHES, pH 9,0, 2 mg/ml

CHAPS jako vyvíjecího pufru. Pro stanovení toho, zda nízká hodnota pH vyvolala vznik SDS-rezistentních heptamerů, byl přidán 100 mM acetát sodný o pH 4,5 v takovém množství, že výsledné pH roztoku dosáhlo 5,0 a pak byl vzorek inkubován po dobu 30 minut za laboratorní teploty. Vzorek pak byl rozpuštěn v SDS-PAGE vzorkovém pufru a podroben elektroforéze na 4% až 12% SDS-PAGE gradientovém gelu. Proteiny v gelu byly vizualizovány brilantní modří „coomassie.

Uvolňování rubidia

Buňky CHO-K1 byly naneseny v hustotě 2 x 10⁵ buněk na jamku a inkubovány při teplotě 37 °C po dobu 24 hodin. Médium pak bylo odsáto a nahrazeno médiem obsahujícím 1 pCi/ml ⁸⁶RbCl a inkubace probíhala dalších 16 hodin. Buňky pak byly chlazeny na ledu po dobu 20 minut a médium bylo odstraněno. Buňky byly promyty a byl přidán nPA (2 x 10'⁸ M) v médiu pufrovaném HEPES. Buňky byly inkubovány s nPA po dobu 2 hodin na ledu a pak byl přidán ledově studený pufr o hodnotě pH 5,0. Po 30 minutách byly odebrány vzorky z tekutiny nad buňkami a vyhodnoceny scintilačním čítačem, aby se stanovilo množství uvolněného ⁸⁶RB.

Tento standardní test lze také použít pro stanovení vlivu jiných póry tvořících toxinů na množství uvolněného ⁸⁶Rb. Tak lze tímto testem testovat i další mutantní toxiny podle předkládaného vynálezu, aby se stanovilo, zda mají sníženou schopnost tvořit transmembránové póry.

Příklad 2

• · · · · • * · · ··· ·· ···

Selhání většiny mutantů při tvorbě SDS-rezistentních oligomerů

Všechny proteiny mutantních PA č. 1 až 12 v tabulce 1 a PA přirozeného typu byly upraveny trypsinem způsobem, který již byl popsán výše, čímž byly vytvořeny štěpené PA (nPA) proteiny, které se při analýze pomocí SDS-PAGE pohybují jako nízkomolekulární látky (obrázek 2A) . Vznik

SDS-disociovatelných prepórů vyvolaný mutantními PA č. 1 až 12 v tabulce 1 byl zjišťován sníženou pohyblivostí v nativních gelech heptamerního PA63 komplexovaného s LFn v porovnání s monomerním nPA (obrázek 2B) . Vznik prepórů vyvolaný mutantními PA K3 97A a D425A byl dále podpořen vymytím prepórů z kolony MonoQ ve vyšší koncentraci soli než, ve které se vymývá monomerní PA. Mutantní nPA byly také analyzovány na vznik SDS-rezistentních oligomerů. Jako pozitivní kontrola byl PA přirozeného typu upraven LFn. Puls nízkého pH převádí PA přirozeného typu na SDS-rezistentní oligomery, které se při analýze pomocí SDS-PAGE pohybují jako komplexy s vysokou molekulovou hmotností. ŮD2L2 (PA s chybějícími zbytky 302 až 325) a K397Q (obrázek 2B). SDS-rezistentní oligomery PA přirozeného typu, K397Q, F427A a AD2L2 vzniklé působením pH o nízké hodnotě (obrázek 2A a tabulka 1).

Příklad 3

Selhání většiny mutantních PA při tvorbě pórů v membránách

Selhání většiny mutantních PA při tvorbě SDS-rezistentních oligomerů vede k názoru, že tvorba pórů v membránách bude také inhibována. tvorba pórů byla testována vázáním nPA proteinů na buňky upravené radioaktivním analogem draslíku, ⁸⁶Rb, pulsem nízkého pH a měřením uvolnění ⁸⁶Rb do okolního média postupem, který byl popsán v příkladu 1. Uvolňování ⁸⁶Rb vyvolané nPA přirozeného typu je způsobeno tím, že nPA tvoří v membráně póry prostupné pro ionty. Naopak žádný z mutantů č. 1 až 12 v tabulce 1 nevyvolal uvolňování ⁸⁶Rb (obrázek 3 a tabulka 1).

• ·

Tak byla neschopnost většiny mutantnich SDS-rezistentní oligomery (příklad 2) dána s neschopností těchto mutantů tvořit póry membránách.

PA tvořit do vztahu v buněčných

Příklad 4

Selhání mutantnich PA při přemisťování LFn přes membrány

Tvorba póru je nutným krokem pro přemisťování ligandů (tj. LF, EF nebo LFn) přes membrány zprostředkované PA. Test přemisťování přes povrch buňky byl použit přímo pro měření přemisťování PA ligandů do cytoplasmy buňky (příklad 1) . Žádný z mutantnich PA č. 1 až 12 v tabulce 1 neměl významně sníženou schopnost vázat LFn (obrázek 4A) , nicméně všechny z testovaných mutantů měly v tomto testu významně sníženou schopnost přemisťovat LFn (obrázky 4B a 12) . SSSR kontrolní mutant způsobil za těchto podmínek malou inhibici. Tato data vedou k názoru, že mutanty si udržují strukturní integritu a schopnost vázat se k buněčnému receptoru a LFn, ale nejsou schopny vytvořit póry nebo přemisťovat ligandy přes membrány.

Příklad 5

Selhání mutantnich PA při přemisťování LFnDTA přes membrány

Dalším způsobem použitým pro měření přemisťování PA ligandů přes membrány je test LFnDTA toxicity (příklad 1) . V tomto testu byly buňky CHO upraveny PA a ligandem obsahujícím LFn připojený k A-řetězci toxinu diftérie DTA (LFnDTA). Přemístěný A-řetězec toxinu diftérie ADP ribosyluje cytoplasmatický protein EF-2, což vede k inhibici syntézy proteinů a vyvolání buněčné smrti. Tento test je měřením přemisťování ligandů z endosomálního prostoru na opačnou stranu buňky, jak bylo měřeno v příkladu 4. Po inkubaci s LFnDTA a mutantním PA přirozeného typu byly buňky promyty a inkubovány v médiu bez leucinu doplněném ³H-leucinem. Pokud

není inhibována syntéza proteinů, pak bude ³H-leucin zabudován do nově syntetizovaných proteinů. Pokud je syntéza inhibována LFnDTA pak bude zabudováno jen málo ³H. Všechny testované mutanty v tomto testu neinhibovaly významným způsobem syntézu proteinů (obrázek 5) . Tento výsledek dále podporuje hypotézu, že nedostatek pórů vytvořených mutantními PA vede k sníženi přemisťování PA ligandů těmito mutanty.

Příklad 6

Inhibice tvorby pórů PA přirozeného typu pomocí mutantních PA

Protože všechny mutantní PA č. 1 až 12 v tabulce 1 byly defektní při tvorbě pórů, byly testovány, aby bylo zjištěno, zda tvoří neaktivní heterooligomery s PA přirozeného typu a tím inhibují přemisťování ligandů přes membránu způsobené PA. AD2L2, K397D + D425K a K395D + K397D + D425K + D426K PA inhibují tímto způsobem PA přirozeného typu. Po smíchání s ekvimolárním množstvím PA přirozeného typu, každý z těchto tří mutantů v testu přemisťování přes buněčný povrch významně inhiboval přemisťování ³⁵S-LFn do buněk (obrázek 6) . Vazba ³⁵S-LFn k buňkám nebyla inhibována (obrázek 6).

Příklad 7

Inhibice tvorby pórů PA přirozeného typu pomocí mutantních PA

Také byl měřen vliv těchto mutantních proteinů na PA zprostředkovanou LFnDTA toxicitu. Když AD2L2, K397D + D425K dvojitý mutant nebo K395D + K397D + D425K + D462K čtyřnásobný mutant PA byl smíchán s PA přirozeného typu v testu LFnDTA, došlo k snížení inhibice ³H-Leu zprostředkované PA přirozeného typu v testu LFnDTA o dva řády (obrázek 7). Tak mutanty inhibují přemisťování zprostředkované PA o 99 %. Aktivita, která zůstane v přítomnosti mutantních proteinů je pravděpodobně způsobena heptamery sestávajícími ze 7 molekul • · 4 · ·

PA přirozeného typu a 0 molekul mutantního PA (WT₇Mut₀) . Podle Pascalova trojúhelníku by 1 % heptamerů vytvořených z ekvimolární směsi PA přirozeného typu a mutantního PA mělo být stoprocentně přirozeného typu (WT₇Mut₀) (tabulka 2) . Tento vypočtený výsledek je v souladu s 1 % experimentálně naměřené zbytkové aktivity přítomné ve směsi. Inhibiční studie, ve kterých byly testovány různé poměry PA přirozeného typu ku AD2L2 nebo K397D + D425K mutantním PA byly testovány v testu LFnDTA, ukázaly, že jediná aktivní složka ve směsi je pravděpodobně WT₇Mut₀. Tak je většina heptamerů obsahujících jednu molekulu AD2L2 nebo K397D + D425K PA neaktivních (tabulka 2) , což dále podporuje názor o dominantní negativní povaze těchto inhibitorů.

Tabulka 2

Předpovězené a měřené složení PA oligomerů tvořených různými poměry mutantního PA k PA přirozeného typu

Předpovězená % celkové Zbytková aktivita populace heptamerů

Mutantní : přirozeného typu (mol : mol)	WT7Mut0	WTgMutx	WT5Mut2	ňD2L2 směs	K397D + D425A směs
1 : 1	0,78 %	6 %	22 %	0,7 % + 0,2	0,9 % + 0,06
0,75 : 1	2 %	10,4%	23,5 %	3,8 % + 2	1,2 % + 0,2
0,5 : 1	5,8 %	25,8 %	56,8 %	13,5 % + 0,5	5,8 % + 3,6
0,25 : 1	21 %	57 %	85 %	14,3 % + 2	10 % + 2

Předpovězené hodnoty představují procento všech heptamerů, u kterých je očekáváno, že budou mít alespoň uvedený počet molekul přirozeného typu ve směsi obsahující různé poměry mutantních PA a PA přirozeného typu. Sloupeček WT₇Mut₀ představuje procento všech heptamerů, u kterých se očekává, že budou obsahovat sedm molekul PA přirozeného typu. Sloupeček • ·

WT₆Muti představuje procento všech heptamerů, u kterých se očekává, že budou přirozeného typu (tj . PA přirozeného typu obsahovat alespoň šest molekul PA heptamery, které obsahují šest molekul a jednu molekulu mutantního PA nebo obsahují sedm molekul PA přirozeného typu a nula molekul mutantního PA) . Podobně sloupeček WT₅Mut₂ představuje procento všech heptamerů, u kterých se očekává, že budou obsahovat alespoň pět molekul PA přirozeného typu. Tyto hodnoty byly vypočteny s použitím Pascalova trojúhelníku. Hodnoty vypsané ve sloupečku „Zbytková aktivita jsou skutečné experimentální hodnoty zjištěné u těchto směsí.

Titrace mutantu pomocí PA přirozeného typu v testu LFnDTA byla provedena za účelem další charakterizace inhibice PA přirozeného typu. Zvyšující se množství jednoho z mutantů byla přidána k buňkám inkubovaným s PA přirozeného typu a LFnDTA (obrázek 8A) . Mutantní PA-SSSR, který má místo rozpoznávající furin zmutováno z ¹⁶⁴RKKR¹⁶⁷ na ¹⁶⁴SSSR¹⁶⁷ byl použit jako kontrola. Protože tento mutant nelze štěpit furinem nebo jinou proteasou podobnou furinu, a proto nemůže tvořit póry, může mutant pouze inhibovat PA soupeřením o receptor. Jak AD2L2, tak K397D + D425K silně inhibují přemisťování zprostředkované PA. Nejdůležitější je, že tyto mutanty neinhibují pouze soupeřením o receptor, protože pro vyvolání 50% inhibice je v případě těchto mutantů potřeba mnohem méně proteinu než je nutné v případě PA-SSSR (obrázek 7B) . Mutant obsahující jedinou inhibici z K397D + D425K neinhibuje tak dobře jako dvojitý mutant, ale inhibuje lépe než PA-SSSR. Tato data ukazují, že AD2L2, K397D + D425K a K395D + K397D + D425K + D426K PA jsou dominantní negativní inhibitory PA přirozeného typu.

Také byla měřena negativní inhibiční aktivita F427A, D425K, K397D + D425K + F427A, F427A + AD2L2, K397D + F427A + AD2L2 mutantních PA. V tomto testu byla zvyšující se množství ♦ · mutantních forem PA smíchána s konstantním množstvím PA přirozeného typu způsobem, který již byl popsán výše. Nejúčinnější člen této skupiny, K397D + D425K + F427A trojitý mutant prakticky úplně blokuje působení toxinu v poměru mutantu ku PA přirozeného typu 1:1. D2L2, K397D + D425K, F427A, F427A + AD2L2 a K397D + F427A + ŮD2L2 mutantní PA také měly inhibiční aktivitu. K397D + D425K + F427A + ÚD2L2, F427D a F427K mutantní PA také vykazovaly dominantní negativní aktivitu v testu toxicity LFnDTA. Naopak další mutant nezpůsobující přemisťování, K397D, nevyvolával při poměru 1 : 1 prakticky žádnou inhibici, což ukazuje, že ne všechny mutanty tohoto typu jsou silně inhibiční (obrázek 9) . SSSR kontrolní mutant nevyvolával žádnou měřitelnou inhibici působení toxinu, dokonce ani v desetinásobném přebytku oproti PA přirozeného typu, což vede k názoru, že soupeření o receptory nepřispívá významně k inhibičním aktivitám ostatních mutantů.

Hypotéza, že inhibice dominantně negativních mutantů závisí na schopnosti jejich skupin PA63 tvořit hybridní komplexy s PA63 přirozeného typu byla testována za použití čištěných homo- a hetero- heptamerů. PA v roztoku lze štěpit ve furinovém místě mírným působením trypsinu a výsledné fragmenty lze oddělit chromatografií trypsinem štěpené molekuly na aniontově výměnné koloně (Miller a kol., Biochemistry 38, 10432, 1999). Čištěný PA63 izolovaný tímto způsobem je heptamerní, což ukazuje, že rovnováha oligomerizace je silně posunuta ve prospěch této formy a je strukturně podobná nebo stejná jako prepór. Čištěné homoheptamery byly připraveny z PA přirozeného typu a každého z K397D + D425K, ŮD2L2, F427A, D425K a K397D mutantních PA se sníženou účinností přemisťování. Domnělé hetero-heptamery byly připraveny smícháním každého z mutantních PA v poměru 1 : 1 s PA přirozeného typu, následným působením trypsinu na směs a chromatografií produktů na aniontově výměnné koloně.

Byla měřena inhibice syntézy proteinů vyvolaná LFnDTA způsobená každým z heteroheptamerů a ekvivalentním množstvím směsi 1 : 1 odpovídajícího mutantu a homo-heptamerů přirozeného typu. Hetrero-heptamery obsahující K397D + D425K, AD2L2, F427A a D425K mutanty nezprostředkovaly působení LFnDTA, zatímco odpovídající směsi homo-heptamerů byly silně aktivní (obrázek 11) . Naopak domnělý hetero-heptamer vytvořený smícháním K397D s PA přirozeného typu byl aktivní jako směs homo-K397D PA a PA homo-přirozeného typu. tyto výsledky jsou v souladu s vlastnostmi těchto mutantů v experimentu na obrázku 9 a podporují dojem, že PA63 z dominantně negativních mutantů deaktivuje protein přirozeného typu tím, že se na něj váže. Nepřítomnost inhibiční aktivity K397D v hetero-heptamerním prostředku ukazuje na defekt buď ve schopnosti kooligomerizovat s proteinem přirozeného typu nebo ve schopnosti inhibovat jeho aktivitu v heptameru. Zjištění, že mutantní homo-heptamery neinhibují aktivitu přirozeného typu ukazuje, že za podmínek experimentu dochází k malému soupeření o receptory a k žádné nebo jen malé výměně mezi heptamery.

Jak již bylo popsáno výše, skutečnost, že K397D + D425K dvojitý mutant prakticky úplně blokuje aktivitu v těchto testech LFnDTA toxicity vede k názoru, že jediná molekula mutantu deaktivuje heptamer a oligomerizace je náhodná. Zdá se, že AD2L2, D425K a F427A mutanty jsou mírně méně inhibiční, což vede k názoru, že pro deaktivaci je případně potřeba více než jednu molekulu tohoto mutantu na heptamer a/nebo že jejich ko-oligomerizace s PA přirozeného typu nemusí být čistě náhodná. Na deaktivaci mají vliv také další faktory jako je pořadí přidávání B skupin k rostoucímu heptamernímu komplexu (např. B skupina, která se přidává první nebo poslední). Není úmyslem omezit předkládaný vynález na jakýkoliv mechanismus inhibice uvedený v popisu.

• ·

Příklad 8

Tvorba SDS-rezistentních oligomerů obsahujících mutantní PA a PA přirozeného typu

Pro vyzkoušení interakce AD2L2 a K397D + D425K mutantů s PA přirozeného typu byl smíchán ekvimolární poměr mutantu ku PA přirozeného typu, vše bylo štěpeno trypsinem a analyzováno pomocí SDS-PAGE na vznik SDS-rezistentního oligomerů. V případě smíchání kteréhokoliv z PA přirozeného typu vznikl nový druh SDS-rezistentního PA. Na rozdíl od samotného PA přirozeného typu, který produkoval v gelu šmouhu o difúzní vysoké molekulové hmotnosti, směs mutantu a PA přirozeného typu vedla ke vzniku ostrého pásu o vysoké molekulové hmotnosti. Tento ostrý pás se také lišil od těch, které lze vidět pro mutanty samotné: K397D + D425K samostatně netvořily SDS-rezistentní oligomer a AD2L2 PA samostatně tvořil oligomer, který se pohyboval v gelu jinde než pás vytvořený v případě, že byl přítomen také PA-přirozeného typu. Ačkoliv přesné složení nebo povaha tohoto pásu nebyla stanovena, tento pás dále vede k názoru, že mutanty interagují s PA přirozeného typu v SDS-rezistentních oligomerech, což vede ke změně pohyblivosti oligomerů v gelu.

Příklad 9

Inhibice toxinu in vivo

Vlastnosti, které prokazovaly dominantně negativní mutanty in vitro vedou k závěru, že by měly inhibovat působení toxinu i in vivo. Pro otestování této hypotézy byly změřeny tři z těchto mutantů (K397D + D425K, AD2L2 a F427A) na klasickém modelu in vivo pro působení anthraxového toxinu, krysách Fisher 344 (Ivins a kol., Appl. Environ. Microbiol. 55: 2098, 1989) . Samci krys (250 g až 300 g) , kterým byla intravenózně injikována směs 8 pg LF a 40 pg PA (přibližně desetinásobek minimální smrtelné dávky), začínají zhruba po 90 minutách umírat (tabulka 3) . Když byl PA přirozeného typu nahrazen «4 » »4 ·· ··

4 4 ·· 4 4 4 · 4

44 4 · 4 · kterýmkoliv z dominantně negativních mutantů, zvířata nevykazovala žádné příznaky intoxikace během dvou týdnů, po kterých byla zvířata usmrcena. Když byl dominantně negativní PA přidán ke směsi PA/LF přirozeného typu před injekcí, bud' v poměru 1 : 1 relativně k PA přirozeného typu (40 pg dominantně negativního PA) nebo v poměru 0,25 : 1 (10 pg dominantně negativního PA) injikovaná zvířata také přežila bez příznaků. SSSR mutant měl malý vliv na aktivitu toxinu. Tyto výsledky jsou v souladu s našimi výsledky in vitro a ukazují, že dominantně negativní mutanty dokáží zabránit působení toxinu antraxu in vivo dokonce i v poměru k PA přirozeného typu, který je nižší než stechiometrický (0,25 : 1).

Tabulka 3

Inhibice PA přirozeného typu mutantními PA in vivo

Množství proteinu (pg)
WT	AD2L2	K397D + D425K	F427A	SSR	TTM
40					90 + 11 minut
	40				přežití
		40			přežití
--			40		přežití
40	40				přežití
40		40			přežití
40			40		přežití
40				40	100 +3 minuty
40	10			__	přežití
40		10			přežití
40	--		10	--	přežití

Schopnost K397D + D425K + F427A trojitého mutantu („Trojitý) inhibovat aktivitu PA přirozeného typu in vivo byla porovnána se schopností K397D + D425K dvojitého mutantu („Dvojitý) (tabulka 4). Tento experiment byl proveden «· • « postupem popsaným výše za použití krys injikovaných směsí 40 pg Pa přirozeného typu, 10 pg LF a buď PBS nebo dominantně negativního mutantu.

Tabulka 4

Inhibice PA přirozeného typu mutantními PA in vivo
	Zvířata	Množství mutantního PA	TTM
PBD	2	--	~ 100 minut
Dvoj itý	2	40 pg	přežití
Troj itý	2	40 pg	přežití
Dvoj itý	4	4 pg	přežití
Troj itý	4	4 pg	přežití

Také byl měřen titr anti-PA a titr neutralizační protilátky vytvořené očkováním krys K397D + D425K, AD2L2 nebo F427A PA. Pro toto stanovení byly skupiny šesti zvířat očkovány každé třikrát v nultém, třetím a šestém týdnu 50 pg proteinu ve 200 pl Ribi Tri-Mix adjuvans (Sigma) intramuskulární injekcí do oblasti zadních končetin. Dva dny před první injekcí a 14 dnů po každé injekci byla každému zvířeti odebrána krev a sérum bylo uschováno. Šestnáct dnů po poslední injekci byla krysám podána smrtelná dávka LF (30 pg PA + 6 pg LF) intravenózní injekcí, jak je popsáno v tabulce 5. Průměr titrů protilátky anti-PA v séru byl stanoven standardním ELISA testem proti PA. Titry jsou uvedeny jako obrácená hodnota geometrického průměru zředění, při kterém reaktivita séra končí. Neutralizační protilátky byly titrovány v LFnDTA testu 1 x 10'¹⁰ M PA a 1 x 10'¹⁰ M LFnDTA. Zředěné protilátky byly inkubovány s PA při 37 °C jednu hodinu před začátkem testu. Inhibice syntézy proteinů byla měřena pomocí testu toxicity LFnDTA, který již byl popsán výše. Neutralizační titry jsou uvedeny jako obrácená hodnota geometrického průměru zředění potřebného pro inhibici aktivity • · ·«· · < · · · ··· ·· ··> *«·· ·· ···*

PA o 50 %. Jak je uvedeno v tabulce 5, K397D + D425K, AD2L2 a F427A mutantní PA vykazují malý nebo žádný pokles imunogenicity v porovnání s PA přirozeného typu u krys Fisher.

Neutralizační titr a titr anti-PA protilátky po třech injekcích byly podobné bez ohledu na použitý imunogen a všechna očkovaná zvířata přežila podání smrtelné dávky PA přirozeného typu plus LF podanou 16 dnů po poslední injekci.

Tabulka 5

Titr anti-PA a titr neutralizační protilátky vytvořené očkováním krys mutantními PA

	Zvířata	Anti-PA titr	Neutralizační titr	TTM
PBS	6	< 10	< 10	74,2 + 1,5
WT	5	43 300	2490	přežití
AD2L2	6	47 500	3350	přežití
K397D +	6	65 500	2260	přežití
D425K
F427A	6	132 000	6090	přežití

Příklad 10

Protilátky PA

Protilátky PA proteinu lze použít jako léčivo a/nebo jako diagnostické činidlo. Protilátky lze produkovat standardními postupy imunizací B-buněk obsahujících biologický systém, např. zvířat jako je myš nebo králík PA proteinem nebo jeho fragmentem tak, aby se stimulovala produkce anti-PA protilátek B-buňkami, a následně se protilátky izolují z biologického systému. Pro vytvoření monoklonálních protilátek lze ze zvířat s nejvyšší imunitní reakcí na PA protein stanovenou ELISA testem odebrat slezinu a B-buňky připojené k buňkám NS-1 myelomu tak, aby vznikly hybridomy. Hybridomy, které produkují protilátky, které váží PA lze vybrat za použití standardního testu ELISA nebo pomocí „western blott. Monoklonální buněčné ·* a ·< »» • # · « • r · · » ♦ » • ♦ · · · · · · » • « · · · »·· »«» «· κ · e> ·»·· *· «ta· linie produkující vysoký titr protilátky a specificky rozpoznávající PA protein se uchovají.

Buněčné linie lze také otestovat, aby se rozpoznaly linie, které produkují protilátky, které váží PA přirozeného typu s vyšší afinitou než mutantní PA protein. Tyto protilátky lze vytvořit podáváním fragmentů PA přirozeného typu, které obsahují zbytky jako K397, D425, D426 nebo F427, zvířatům.

Výsledné protilátky lze otestovat, aby se zjistilo, která protilátka váže PA přirozeného typu, ale neváže mutantní PA protein, ve kterém chybí nebo je změněn jeden nebo více zbytků K397, D425, D426 nebo F427. Například lze protilátky aplikovat na kolonu obsahující imobilizovaný mutantní PA protein a protilátky, které neváží mutantní PA protein, lze pak vybrat.

Lze také vyrobit takové protilátky, které reagují se zbytky smyčky D2L2, přičemž tyto protilátky, lze vyrobit podáváním fragmentu PA obsahujícího smyčku D2L2 zvířatům postupem, který již byl popsán výše. Protilátky, které reagují se zbytky ve smyčce D2L2 PA přirozeného typu lze také testovat tak, aby se vybraly protilátky, které neváží mutantní PA protein, ve kterém jeden nebo více zbytků ve smyčce D2L2 chybí. Alternativně lze produkovat takové protilátky, které váží mutantní PA s vyšší afinitou než molekulu PA přirozeného typu, podáváním fragmentu mutantního PA zvířatům postupem popsaným výše a výběrem protilátek s vyšší afinitou k mutantní formě PA. Tyto protilátky se případně váží ke zbytkům v mutantním PA, které nejsou přítomny v PA přirozeného typu.

Anti-PA protilátky lze použít pro zjištění PA proteinu v biologickém vzorku, jako je sérum, tak, že se tento vzorek uvede do kontaktu s protilátkou a pak se stanovují imunitní komplexy stejným způsobem jako se stanovuje PA protein ve vzorku. Tak lze tyto protilátky použít do sady pro stanovení toho, zda byl subjekt vystaven působení toxinu antraxu.

Protilátky PA lze také použít jako léčivo pro léčení nebo prevenci infekce antraxem. Pokud se protilátka, která váže PA

		·«	·»
• ·	ř	w ·	♦ 'W			v
		•	•	•		«
	* V	•		• »	•	»
4 ·	•	•	•	• ·	•
• ·	··				····

přirozeného typu, ale neváže dominantně negativní mutantní PA, podává subjektu pro pasivní imunizaci proti infekci antraxem, lze dominantně negativní mutantní PA také podávat stejnému subjektu jako lék, aby se inhibovala aktivita PA přirozeného typu. Protože podávaná protilátka anti-PA nereaguje s léčivým dominantně negativním mutantním PA, neměla by protilátka anti-PA snižovat schopnost dominantně negativního mutantního PA inhibovat PA přirozeného typu. Navíc lze protilátku anti-PA, která nereaguje s léčivým dominantně negativním mutantním PA případně použít pro stanovení množství PA přirozeného typu přítomného ve vzorku od subjektu, který byl léčen dominantně negativním mutantním PA.

Podobné protilátky lze vyprodukovat i pro další mutantní skupiny B podle předkládaného vynálezu.

Příklad 11

Podávání PA proteinů a jejich fragmentů

Není úmyslem, aby podávání PA proteinů nebo fragmentů podle předkládaného vynálezu bylo omezeno na konkrétní způsob podávání, dávkování nebo frekvenci podávání, předkládaný způsob zahrnuje všechny způsoby podávání, včetně orálního, intramuskulárního, intravenózního, subkutánního, inhalací nebo jinými cestami, které poskytnou dávku postačující pro prevenci nebo léčení infekce antraxem. Jeden nebo více mutantních PA proteinů nebo fragmentů lze podávat savci v jediné dávce nebo ve více dávkách. Kdy se podávání provádí ve více dávkách, pak lze dávky podávat jednu po druhé například po týdnu nebo po měsíci. Je třeba chápat, že pro jakýkoliv konkrétní subjekt by se režimy konkrétního dávkování měly postupem času upravovat podle individuální potřeby a profesionálního posouzení osoby provádějící podávání nebo dohlížející na podávání prostředků.

Farmaceutické prostředky obsahující jeden nebo více PA proteinů nebo fragmentů podle předkládaného vynálezu lze připravit postupem popsaným v knize Remington's Pharmaceutical

Sciences od E. W. Martina. Lze použít sloučeniny stabilizující léčivo, látky pro dopravování léčiva, nosiče léčiva nebo adjuvans. Například lze použít lidský sérum albumin nebo jiný lidský nebo zvířecí protein. Jako farmaceuticky přijatelné nosiče nebo látky dopravující léčivo jsou možné fosfolipidová vesikula nebo liposomální suspenze. Adjuvans, která lze použít v předkládaném vynálezu zahrnují sloučeniny hliníku, jako je hydroxid hlinitý, fosforečnan hlinitý a hydroxyfosforečnan hlinitý. Tyto prostředky lze připravit způsoby, které jsou odborníkům v dané problematice známy.

Podobně lze podávat i další mutantní B skupiny nebo fragmenty podle předkládaného vynálezu.

Příklad 12

Další mutanty tvořící póry

Z krystalové struktury PA byly zjištěny čtyři domény PA (Petosa a kol., Nátuře 385 (6619) : 833 až 838, 1997) . Doména 2 (zbytky 259 až 487) obsahuje velkou flexibilní smyčku, která podléhá hlavní konformační změně při přeměně prepóru na pór. Záměna, vynechání nebo vložení jedné nebo více aminokyselin v této oblasti případně vede k inhibici schopnosti proteinu tvořit pór in vivo a/nebo vede ke schopnosti mutantního PA inhibovat schopnost tvořit pór u PA přirozeného typu. Například lze změnit zbytky v doméně 2 PA, které jsou stejné jako odpovídající zbytky v jednom nebo více toxinech tvořících pór (jako jsou toxiny z Clostridium difficile, C. perfringens, C. spiroforme, C. botulinum, Bacillus cereus nebo B. thuringiensis, obrázky 15 a 16) . Tyto zbytky lze v PA změnit nebo vynechat tak, aby vznikly dominantně negativní PA mutanty. Následující zbytky z domény 2 v PA jsou invariantní mezi binárními A-B toxiny vypsanými na obrázcích 15 a 16: A259, P260, V262, V264, M266, E267, S272 E275 T298, N253,

N361, N363 R365, Y366, N368, G370, T371, Y375, V377, P389, T380, T381, V384, T393, 1394, P407, Y411, P412, A420, D425, • ·

F427, 1432, N435, Q438, L450, T452, Q454, G457, G474, W477 a 1484. Tyto zbytky lze vyměnit za jakoukoliv jinou aminokyselinu. Například lze tyto zbytky vyměnit za aminokyselinu s menším postranním řetězcem, jako je glycin nebo alanin nebo lze tyto zbytky vyměnit za aminokyseliny s větším nebo rozvětveným postranním řetězcem, jako je tryptofan, leucin nebo methionin. Dále lze nabité zbytky vyměnit za zbytky s neutrálním postranním řetězcem nebo zbytky s postranním řetězcem nesoucím opačný náboj. Další příklady takových zbytků, které lze použít pro nahrazení přirozených zbytků jsou vypsány v tabulce 1.

Kromě toxinu antraxu se předkládaný vynález týká také dalších toxinů tvořících póry. Tyto toxiny lze také změnit tak, že vzniknou toxiny se sníženou nebo neměřitelnou schopností oligomerizovat, tvořit transmembránové kanály nebo přemisťovat ligandy. Navíc lze vytvořit dominantně negativní mutanty z jiných póry tvořících mutantů. Například mutace, které odpovídají PA mutacím popsaným v předkládaném vynálezu, lze provést na jiných toxinech, které jsou homologické k PA (jako jsou toxiny z Clostridium difficile, C. perfringens, C. spiroforme, C. botulinum, Bacillus cereus nebo B. thuringiensis) (obrázky 15 a 16 a tabulka 6) . Zbytky v jiných toxinech, které odpovídají zbytkům v doméně 2 PA lze změnit postupem, který již byl popsán výše. Navíc lze u jiných pór tvořících toxinů vynechat alespoň 1, 3, 5, 8, 10, 15, 20 nebo 24 aminokyselin v oblasti odpovídající smyčce D2L2 PA. Také lze provést jednu nebo více bodových mutací zbytků odpovídajících mutovaným PA zbytkům popsaným v předkládaném vynálezu.

Jakoukoliv z těchto mutantních forem pór tvořících toxinů lze podávat savci za účelem léčení nebo prevence infekce patogeny (např. baktériemi), které produkují odpovídající toxin.

Tabulka 6

Mutace v dalších pór tvořících toxinech, které odpovídají mutacím v PA antraxu, které jsou popsány v předkládaném vynálezu. Zbytky v dalších pór tvořících toxinech, které odpovídají zbytkům, které byly změněny v PA lze také změnit na jakoukoliv jinou kyselinu.

PA	Toxin C.	Toxin C.	Toxin C.	Toxin C.	Toxin B.
antraxu	difficile	perfringens	spiroforme	botulinum	cereus
K3 97A	Q425A	Q424A	Q428A	Q3 98A	K879A
K3 97D	Q425D	Q424D	Q428D	Q398D	K879D
K397C	Q425C	Q424C	Q428C	Q398C	K879C
K397Q	Q425Q	Q424Q	Q428Q	Q398Q	K879Q
D425A	D453A	D452A	D456A	D426A	D907A
D425N	D453N	D452N	D456N	D426N	D907N
D425E	D453E	D452E	D456E	D426E	D907E
D425K	D453K	D452K	D456K	D426K	D907K
F427A	F455A	F454A	F458A	F428a	F909A
K397D +	Q425D +	Q424D +	Q428D +	Q398D +	K879D +
D425K	D453K	D452K	D456K	D426K	D907K
K395D +	K423D +	K422D +	K426D +	K396D +	T877D
K397D +	Q425D +	Q424D +	Q428D +	Q398D +	K879D +
D425K +	D453K +	D452K +	D456K +	D426K +	D907K +
D426K	Q454K	Q453K	Q457K	Q427K	D908K
AD2L2	Δ340-358	Δ339-357	Δ343-361	Δ307-331	Δ797-816
K397D +	Q425D +	Q424D +	Q428D +	Q398D +	K879D +
D425K +	D453K +	D452K +	D456K +	D426K +	D907K +
F427A	F455A	F454A	F458A	F428A	F909A
F427A +	F455A +	F454A +	F458A +	F428A +	F909A +
AD2L2	Δ340-358	Δ339-357	Δ343-361	Δ307-331	Δ797-816
K397D +	Q425D +	Q424D +	Q428D +	Q398D +	K879D +
F427A +	F455A +	F454A +	F458A +	F428A +	F909A +
AD2L2	Δ340-358	Δ339-357	Δ343-361	Δ307-331	Δ797-816
K397D +	Q425D +	Q424D +	Q428D +	Q398D +	K879D +

• * • · · · · ··· ·· ·······

D425K +	D453K +	D452K +	D456K +	D426K +	D907K +
F427A +	F455A +	F454A +	F458A +	F428A +	F909A +
AD2L2	Δ340-358	Δ339-357	Δ343-361	Δ307-331	Δ797-816
F427D	F455D	F454D	F458D	F428D	F909D
F427K	F455K	F454K	F458K	F428K	F909K

Alternativně lze za použití standardních postupů molekulární biologie provést na nukleových kyselinách kódujících pór tvořící mutanty (jako jsou cholesterol dependentní cytolysiny nebo hexamerní nebo heptamerní toxiny příbuzné k α-toxinu Staphylococcus) náhodnou mutagenezi. Kódované mutantní toxiny lze exprimovat a případně čistit za použití standardních způsobů. Test uvolňování rubidia popsaný v předkládaném vynálezu lze použít pro rozpoznání mutantních toxinů se sníženou schopností tvořit transmembránové kanály. Navíc lze pro rozpoznávání dominantně negativních mutantních toxinů, které snižují toxicitu odpovídajícího toxinu přirozeného typu v případě, že je mutantní toxin a toxin přirozeného typu podán zvířatům, použít živočišné modely.

Další provedení

Všechny publikace a patentové přihlášky zmíněné v této přihlášce jsou zde uvedeny jako reference ve stejném rozsahu jako kdyby každá nezávislá publikace nebo patentová přihláška byly konkrétně a jednotlivě označeny, že jsou zde uvedeny jako reference.

I když byl předkládaný vynález popsán na konkrétních příkladech, je třeba chápat, že jsou možné další úpravy a tato přihláška zahrnuje všechny variace, použití nebo úpravy vynálezu, které obecně sledují principy vynálezu a zahrnují takové odchylky od předkládaného vynálezu, které jsou známé nebo běžné v rámci dané problematiky, do které předkládaný vynález spadá, a lze je aplikovat na nezbytné rysy, které již byly uvedeny výše budou uvedeny dále v rámci patentových nároků.

Další provedení spadají do rámce patentových nároků.

Průmyslová využitelnost

Prostředky podle předkládaného vynálezu jsou průmyslově využitelné pro výrobu léčiv.

Seznam sekvencí <110> President and Fellows of Harvard College <120> Compounds and Methods for the Treatment and Prevention of Bacterial Infection <130> 00742/060CZ2 <150> PCT/USO1/14372 <151> 2001-05-04 <150> US 60/201,800 <151> 2000-05-04 <160> 35 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0 <210> 1 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 1

Glu

Val

Lys

Gin

Glu

Asn

Arg

Leu

Leu

Asn

Glu

Ser

Glu

Ser

1

5

10

Ser

Ser

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Asp

Leu

Asn

15

20

25

Phe

Gin

Ala

Pro

Met

Val

Val

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Gly

Asp

30

35

40

Leu

Ser

Ile

Pro

Ser

Ser

Glu

Leu

Glu

Asn

Ile

Pro

Ser

Glu

45

50

55

Asn

Gin

Tyr

Phe

Gin

Ser

Ala

Ile

Trp

Ser

Gly

Phe

Ile

Lys

60

65

70

Val

Lys

Lys

Ser

Asp

Glu

Tyr

Thr

Phe

Ala

Thr

Ser

Ala

Asp

75

80

Asn

His

Val

Thr

Met

Trp

Val

Asp

Asp

Gin

Glu

Val

Ile

Asn

85

90

95

Lys

Ala

Ser

Asn

Ser

Asn

Lys

Ile

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly

Arg

100

105

110

Leu

Tyr

Gin

Ile

Lys

Ile

Gin

Tyr

Gin

Arg

Glu

Asn

Pro

Thr

115

120

125

Glu

Lys

Gly

Leu

Asp

Phe

Lys

Leu

Tyr

Trp

Thr

Asp

Ser

Gin

130

135

140

Asn

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Leu

Gin

Leu

Pro

145

150

Glu

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Ser

Asn

Ser

Arg

Lys

Lys

Arg

Ser

155

160

165

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Asp

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

170

175

180

Ile

Pro

Asp

Ser

Leu

Glu

Val

Glu

Gly

Tyr

Thr

Val

Asp

Val

185

190

195

Lys

Asn

Lys

Arg

Thr

Phe

Leu

Ser

Pro

Trp

Ile

Ser

Asn

Ile

200

205

210

His

Glu

Lys

Lys

Gly

Leu

Thr

Lys

Tyr

Lys

Ser

Ser

Pro

Glu

215

220

Lys

Trp

Ser

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Tyr

Ser

Asp

Phe

Glu

Lys

225 230 235

Val	Thr Gly 240	Arg	Ile	Asp Lys Asn 245	Val	Ser Pro	Glu 250	Ala	Arg
His	Pro Leu	Val	Ala	Ala Tyr Pro	Ile	Val His	Val	Asp	Met
	255			260				265
Glu	Asn Ile	Ile	Leu	Ser Lys Asn	Glu	Asp Gin	Ser	Thr	Gin
		270			275				280
Asn	Thr Asp	Ser	Glu	Thr Arg Thr	Ile	Ser Lys	Asn	Thr	Ser
			285			290
Thr	Ser Arg	Thr	His	Thr Ser Glu	Val	His Gly	Asn	Ala	Glu
295				300		305
Val	His Ala	Ser	Phe	Phe Asp Ile	Gly	Gly Ser	Val	Ser	Ala
	310			315			320
Gly	Phe Ser	Asn	Ser	Asn Ser Ser	Thr	Val Ala	Ile	Asp	His
	325			330				335
Ser	Leu Ser	Leu	Ala	Gly Glu Arg	Thr	Trp Ala	Glu	Thr	Met
		340			345				350
Gly	Leu Asn	Thr	Ala	Asp Thr Ala	Arg	Leu Asn	Ala	Asn	Ile
			355			360
Arg	Tyr Val	Asn	Thr	Gly Thr Ala	Pro	Ile Tyr	Asn	Val	Leu
365				370		375
Pro	Thr Thr	Ser	Leu	Val Leu Gly	Lys	Asn Gin	Thr	Leu	Ala
	380			385			390
Thr	Ile Lys	Ala	Lys	Glu Asn Gin	Leu	Ser Gin	Ile	Leu	Ala
	395			400				405
Pro	Asn Asn	Tyr	Tyr	Pro Ser Lys	Asn	Leu Ala	Pro	Ile	Ala
		410			415				420
Leu	Asn Ala	Gin	Asp	Asp Phe Ser	Ser	Thr Pro	Ile	Thr	Met
			425		430
Asn	Tyr Asn	Gin	Phe	Leu Glu Leu	Glu	Lys Thr	Lys	Gin	Leu
435				440		445
Arg	Leu Asp	Thr	Asp	Gin Val Tyr	Gly	Asn Ile	Ala	Thr	Tyr
	450			455			460
Asn	Phe Glu	Asn	Gly	Arg Val Arg	Val	Asp Thr	Gly	Ser	Asn

465 470 475

Trp

Ile

Ile

505

Pro

Phe

Ile

Asn

Tyr

575

Ile

Ile

Arg

Ile

Glu

645

Arg

Lys

Leu

Val ·· ·· * · • · • ; . · · ··· ·· ··· ···· ·· ···

Gin Glu Thr Thr Ala Arg

485 490

Asn Leu Val Glu Arg Arg 500

Pro Leu Glu Thr Thr Lys 515

Leu Lys Ile Ala Phe Gly 530

Gin Tyr Gin Gly Lys Asp 545

Asp Gin Gin Thr Ser Gin

555 560

Leu Asn Ala Thr Asn Ile

570

Leu Asn Ala Lys Met Asn 585

His Tyr Asp Arg Asn Asn 600

Val Val Lys Glu Ala His 615

Glu Gly Leu Leu Leu Asn

625 630

Leu Ser Gly Tyr Ile Val 640

Lys Glu Val Ile Asn Asp 655

Ser Leu Arg Gin Asp Gly 670

Tyr Asn Asp Lys Leu Pro 685

Lys Val Asn Val Tyr Ala

696 700

Asn Pro Ser Glu Asn Gly 710

Ser Glu Val Leu Pro Gin Ile

480

Ile Phe Asn Gly Lys Asp Leu 495

Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp 510

Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala 520 525

Asn Glu Pro Asn Gly Asn Leu 535 540

Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe 550

Ile Lys Asn Gin Leu Ala Glu 565

Thr Val Leu Asp Lys Ile Lys 580

Leu Ile Arg Asp Lys Arg Phe 590 595

Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser 605 610

Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr

620

Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile 635

Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu 650

Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser 660 665

Thr Phe Ile Asp Phe Lys Lys 675 680

Tyr Ile Ser Asn Pro Asn Tyr 690

Thr Lys Glu Asn Thr Ile Ile 705

Λ · ·· • · · ·· ·· ♦· • * · ♦ · • · · * • · · · · • · · · ···· ·· ···«

Asp Thr Ser Thr Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu Ile Phe Ser 715 720 725

Lys Lys Gly Tyr Glu Ile Gly Glx

730 735 <210> 2 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 2

Glu Val 1

Lys Gin Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser Glu

Ser

5

10

Ser

Ser

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Asp

Leu

Asn

15

20

25

Phe

Gin

Ala

Pro

Met

Val

Val

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Gly

Asp

30

35

40

Leu

Ser

Ile

Pro

Ser

Ser

Glu

Leu

Glu

Asn

Ile

Pro

Ser

Glu

45

50

55

Asn

Gin

Tyr

Phe

Gin

Ser

Ala

Ile

Trp

Ser

Gly

Phe

Ile

Lys

60

65

70

Val

Lys

Lys

Ser

Asp

Glu

Tyr

Thr

Phe

Ala

Thr

Ser

Ala

Asp

75

80

Asn

His

Val

Thr

Met

Trp

Val

Asp

Asp

Gin

Glu

Val

Ile

Asn

85

90

95

Lys

Ala

Ser

Asn

Ser

Asn

Lys

Ile

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly

Arg

100

105

110

Leu

Tyr

Gin

Ile

Lys

Ile

Gin

Tyr

Gin

Arg

Glu

Asn

Pro

Thr

115

120

125

Glu

Lys

Gly

Leu

Asp

Phe

Lys

Leu

Tyr

Trp

Thr

Asp

Ser

Gin

130

135

140

Asn

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Leu

Gin

Leu

Pro

145 150

	50	• · · • « · • · ·♦ ·	• • · • · • ··	• ♦ • « · · ·	• • • · • ···
Glu Leu Lys	Gin Lys Ser Ser Asn Ser Arg	Lys	Lys	Arg	Ser
155	160	165
Thr Ser Ala	Gly Pro Thr Val Pro Asp Arg	Asp	Asn	Asp	Gly
170	175		180
Ile Pro Asp	Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr	Thr	Val	Asp	Val
185	190			195
Lys Asn Lys	Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp	Ile	Ser	Asn	Ile
	200 205				210
His Glu Lys	Lys Gly Leu Thr Lys Tyr Lys	Ser	Ser	Pro	Glu
	215 220
Lys Trp Ser	Thr Ala Ser Asp Pro Tyr Ser	Asp	Phe	Glu	Lys
225	230	235
Val Thr Gly	Arg Ile Asp Lys Asn Val Ser	Pro	Glu	Ala	Arg
240	245		250
His Pro Leu	Val Ala Ala Tyr Pro Ile Val	His	Val	Asp	Met
255	260			265
Glu Asn Ile	Ile Leu Ser Lys Asn Glu Asp	Gin	Ser	Thr	Gin
	270 275				280
Asn Thr Asp	Ser Glu Thr Arg Thr Ile Ser	Lys	Asn	Thr	Ser
	285 290
Thr Ser Arg	Thr His Thr Ser Glu Val His	Gly	Asn	Ala	Glu
295	300	305
Val His Ala	Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly	Ser	Val	Ser	Ala
310	315		320
Gly Phe Ser	Asn Ser Asn Ser Ser Thr Val	Ala	Ile	Asp	His
325	330			335
Ser Leu Ser	Leu Ala Gly Glu Arg Thr Trp	Ala	Glu	Thr	Met
	340 345				350
Gly Leu Asn	Thr Ala Asp Thr Ala Arg Leu	Asn	Ala	Asn	Ile
	355 360
Arg Tyr Val	Asn Thr Gly Thr Ala Pro Ile	Tyr	Asn	Val	Leu
365	370	375
Pro Thr Thr	Ser Leu Val Leu Gly Lys Asn	Gin	Thr	Leu	Ala
380	385		390

Thr	Ile	Lys Ala Lys Glu Asn Gin Leu Ser Gin	Ile	Leu 405	Ala
395	400
Pro	Asn	Asn Tyr Tyr	Pro Ser Lys Asn Leu Ala	Pro	Ile	Ala
		410	415			420
Leu	Asn	Ala Gin Asp	Asp Phe Ser Ser Thr Pro	Ile	Thr	Met
		425	430
Asn	Tyr	Asn Gin Phe	Leu Glu Leu Glu Lys Thr	Lys	Gin	Leu
435			440 445
Arg	Leu	Asp Thr Asp	Gin Val Tyr Gly Asn Ile	Ala	Thr	Tyr
	450		455	460
Asn	Phe	Glu Asn Gly	Arg Val Arg Val Asp Thr	Gly	Ser	Asn
		465	470		475
Trp	Ser	Glu Val Leu	Pro Gin Ile Gin Glu Thr	Thr	Ala	Arg
		480	485			490
Ile	Ile	Phe Asn Gly	Lys Asp Leu Asn Leu Val	Glu	Arg	Arg
		495	500
Ile	Ala	Ala Val Asn	Pro Ser Asp Pro Leu Glu	Thr	Thr	Lys
505			510 515
Pro	Asp	Met Thr Leu	Lys Glu Ala Leu Lys Ile	Ala	Phe	Gly
	520		525	530
Phe	Asn	Glu Pro Asn	Gly Asn Leu Gin Tyr Gin	Gly	Lys	Asp
		535	540		545
Ile	Thr	Glu Phe Asp	Phe Asn Phe Asp Gin Gin	Thr	Ser	Gin
		550	555			560
Asn	Ile	Lys Asn Gin	Leu Ala Glu Leu Asn Ala	Thr	Asn	Ile
		565	570
Tyr	Thr	Val Leu Asp	Lys Ile Lys Leu Asn Ala	Lys	Met	Asn
575			580 585
Ile	Leu	Ile Arg Asp	Lys Arg Phe His Tyr Asp	Arg	Asn	Asn
	590		595	600
Ile	Ala	Val Gly Ala	Asp Glu Ser Val Val Lys	Glu	Ala	His
		605	610		615
Arg	Glu	Val Ile Asn	Ser Ser Thr Glu Gly Leu	Leu	Leu	Asn
		620	625			630

• ·

Ile Asp Lys

Asp

Ile Arg 635

Lys

Ile

Leu

Ser 640

Gly

Tyr

Ile

Val

Glu

Ile

Glu

Asp

Thr

Glu

Gly

Leu

Lys

Glu

Val

Ile

Asn

Asp

645

650

655

Arg

Tyr

Asp

Met

Leu

Asn

Ile

Ser

Ser

Leu

Arg

Gin

Asp

Gly

660

665

670

Lys

Thr

Phe

Ile

Asp

Phe

Lys

Lys

Tyr

Asn

Asp

Lys

Leu

Pro

675

680

685

Leu

Tyr

Ile

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr

Lys

Val

Asn

Val

Tyr

Ala

690

695

700

Val

Thr

Lys

Glu

Asn

Thr

Ile

Ile

Asn

Pro

Ser

Glu

Asn

Gly

705

710

Asp

Thr

Ser

Thr

Asn

Gly

Ile

Lys

Lys

Ile

Leu

Ile

Phe

Ser

715

720

725

Lys

Lys

Gly

Tyr

Glu

Ile

Gly

Glx

730

735

<210> 3 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 3

Glu Val Lys Gin Glu Asn Arg 1 5

Ser Ser Gin Gly Leu Leu Gly 15 20

Phe Gin Ala Pro Met Val Val

35

Leu Ser Ile Pro Ser Ser Glu

Asn Gin Tyr Phe Gin Ser Ala 60

Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ser

Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Asn 25

Thr Ser Ser Thr Thr Gly Asp 40

Leu Glu Asn Ile Pro Ser Glu

55

Ile Trp Ser Gly Phe Ile Lys 65

Val	Lys	Lys	Ser	Asp Glu Tyr Thr Phe Ala Thr	Ser	Ala	Asp
75	80
Asn	His	Val	Thr	Met Trp Val	Asp Asp Gin Glu	Val	Ile	Asn
85				90	95
Lys	Ala	Ser	Asn	Ser Asn Lys	Ile Arg Leu Glu	Lys	Gly	Arg
	100			105	110
Leu	Tyr	Gin	Ile	Lys Ile Gin	Tyr Gin Arg Glu	Asn	Pro	Thr
		115			120		125
Glu	Lys	Gly	Leu	Asp Phe Lys	Leu Tyr Trp Thr	Asp	Ser	Gin
			130		135			140
Asn	Lys	Lys	Glu	Val Ile Ser	Ser Asp Asn Leu	Gin	Leu	Pro
				145	150
Glu	Leu	Lys	Gin	Lys Ser Ser	Asn Ser Arg Lys	Lys	Arg	Ser
155				160	165
Thr	Ser	Ala	Gly	Pro Thr Val	Pro Asp Arg Asp	Asn	Asp	Gly
	170			175		180
Ile	Pro	Asp	Ser	Leu Glu Val	Glu Gly Tyr Thr	Val	Asp	Val
		185			190		195
Lys	Asn	Lys	Arg	Thr Phe Leu	Ser Pro Trp Ile	Ser	Asn	Ile
			200		205			210
His	Glu	Lys	Lys	Gly Leu Thr	Lys Tyr Lys Ser	Ser	Pro	Glu
				215	220
Lys	Trp	Ser	Thr	Ala Ser Asp	Pro Tyr Ser Asp	Phe	Glu	Lys
225				230	235
Val	Thr	Gly	Arg	Ile Asp Lys	Asn Val Ser Pro	Glu	Ala	Arg
	240			245		250
His	Pro	Leu	Val	Ala Ala Tyr	Pro Ile Val His	Val	Asp	Met
		255			260		265
Glu	Asn	Ile	Ile	Leu Ser Lys	Asn Glu Asp Gin	Ser	Thr	Gin
			270		275			280
Asn	Thr	Asp	Ser	Glu Thr Arg	Thr Ile Ser Lys	Asn	Thr	Ser
				285	290
Thr	Ser	Arg	Thr	His Thr Ser	Glu Val His Gly	Asn	Ala	Glu
295				300	305

54

4 4 4 4 • 4 4 4 · 44 4

• 4 • 44 4 4 4 4 4

4 44 4*· 4 • 4 4 ·4 4 4 444 4444

Val

His

Ala

Ser

Phe

Phe

Asp

Ile

Gly

Gly

Ser

Val

Ser

Ala

310

315

320

Gly

Phe

Ser

Asn

Ser

Asn

Ser

Ser

Thr

Val

Ala

Ile

Asp

His

325

330

335

Ser

Leu

Ser

Leu

Ala

Gly

Glu

Arg

Thr

Trp

Ala

Glu

Thr

Met

340

345

350

Gly

Leu

Asn

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

Arg

Leu

Asn

Ala

Asn

Ile

355

360

Arg

Tyr

Val

Asn

Thr

Gly

Thr

Ala

Pro

Ile

Tyr

Asn

Val

Leu

365

370

375

Pro

Thr

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Gly

Lys

Asn

Gin

Thr

Leu

Ala

380

385

390

Thr

Ile

Lys

Ala

Lys

Glu

Asn

Gin

Leu

Ser

Gin

Ile

Leu

Ala

395

400

405

Pro

Asn

Asn

Tyr

Tyr

Pro

Ser

Lys

Asn

Leu

Ala

Pro

Ile

Ala

410

415

420

Leu

Asn

Ala

Gin

Asp

Asp

Phe

Ser

Ser

Thr

Pro

Ile

Thr

Met

425

430

Asn

Tyr

Asn

Gin

Phe

Leu

Glu

Leu

Glu

Lys

Thr

Lys

Gin

Leu

435

440

445

Arg

Leu

Asp

Thr

Asp

Gin

Val

Tyr

Gly

Asn

Ile

Ala

Thr

Tyr

450

455

460

Asn

Phe

Glu

Asn

Gly

Arg

Val

Arg

Val

Asp

Thr

Gly

Ser

Asn

465

470

475

Trp

Ser

Glu

Val

Leu

Pro

Gin

Ile

Gin

Glu

Thr

Thr

Ala

Arg

480

485

490

Ile

Ile

Phe

Asn

Gly

Lys

Asp

Leu

Asn

Leu

Val

Glu

Arg

Arg

495

500

Ile

Ala

Ala

Val

Asn

Pro

Ser

Asp

Pro

Leu

Glu

Thr

Thr

Lys

505

510

515

Pro

Asp

Met

Thr

Leu

Lys

Glu

Ala

Leu

Lys

Ile

Ala

Phe

Gly

520

525

530

Phe

Asn

Glu

Pro

Asn

Gly

Asn

Leu

Gin

Tyr

Gin

Gly

Lys

Asp

535 540 545

55

·· · • < « · • · »·· <

• »· • » • »·

· * • · * • · · · • » · ·»« ····

Ile

Thr

Glu

Phe

Asp

Phe

Asn

Phe

Asp

Gin

Gin

Thr

Ser

Gin

550

555

560

Asn

Ile

Lys

Asn

Gin

Leu

Ala

Glu

Leu

Asn

Ala

Thr

Asn

Ile

565

570

Tyr

Thr

Val

Leu

Asp

Lys

Ile

Lys

Leu

Asn

Ala

Lys

Met

Asn

575

580

585

Ile

Leu

Ile

Arg

Asp

Lys

Arg

Phe

His

Tyr

Asp

Arg

Asn

Asn

590

595

600

Ile

Ala

Val

Gly

Ala

Asp

Glu

Ser

Val

Val

Lys

Glu

Ala

His

605

610

615

Arg

Glu

Val

Ile

Asn

Ser

Ser

Thr

Glu

Gly

Leu

Leu

Leu

Asn

620

625

630

Ile

Asp

Lys

Asp

Ile

Arg

Lys

Ile

Leu

Ser

Gly

Tyr

Ile

Val

635

640

Glu

Ile

Glu

Asp

Thr

Glu

Gly

Leu

Lys

Glu

Val

Ile

Asn

Asp

645

650

655

Arg

Tyr

Asp

Met

Leu

Asn

Ile

Ser

Ser

Leu

Arg

Gin

Asp

Gly

660

665

670

Lys

Thr

Phe

Ile

Asp

Phe

Lys

Lys

Tyr

Asn

Asp

Lys

Leu

Pro

675

680

685

Leu

Tyr

Ile

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr

Lys

Val

Asn

Val

Tyr

Ala

690

695

700

Val

Thr

Lys

Glu

Asn

Thr

Ile

Ile

Asn

Pro

Ser

Glu

Asn

Gly

705

710

Asp

Thr

Ser

Thr

Asn

Gly

Ile

Lys

Lys

Ile

Leu

Ile

Phe

Ser

715

720

725

Lys

Lys

Gly

Tyr

Glu

Ile Gly

Glx

730 735 <210> 4 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 4

Glu Val Lys Gin Glu Asn Arg Leu 1 5

Ser Ser Gin Gly Leu Leu Gly Tyr 15 20

Phe Gin Ala Pro Met Val Val Thr

35

Leu Ser Ile Pro Ser Ser Glu Leu

50

Asn Gin Tyr Phe Gin Ser Ala Ile

Val Lys Lys Ser Asp Glu Tyr Thr 75

Asn His Val Thr Met Trp Val Asp

90

Lys Ala Ser Asn Ser Asn Lys Ile

100 105

Leu Tyr Gin Ile Lys Ile Gin Tyr

115 120

Glu Lys Gly Leu Asp Phe Lys Leu

130

Asn Lys Lys Glu Val Ile Ser Ser 145

Glu Leu Lys Gin Lys Ser Ser Asn

155 160

Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro

170 175

Ile Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu

185 190

Lys Asn Lys Arg Thr Phe Leu Ser

200

His Glu Lys Lys Gly Leu Thr Lys 215 fc ** ** ···· ·· · i • *· · * * * · • « · · « · * * ·· 4·*· »· ·»··

Leu Asn Glu Ser Glu Ser

Tyr Phe Ser Asp Leu Asn 25

Ser Ser Thr Thr Gly Asp 40

Glu Asn Ile Pro Ser Glu

Trp Ser Gly Phe Ile Lys

70

Phe Ala Thr Ser Ala Asp 80

Asp Gin Glu Val Ile Asn 95

Arg Leu Glu Lys Gly Arg 110

Gin Arg Glu Asn Pro Thr 125

Tyr Trp Thr Asp Ser Gin

135 140

Asp Asn Leu Gin Leu Pro 150

Ser Arg Lys Lys Arg Ser 165

Asp Arg Asp Asn Asp Gly 180

Gly Tyr Thr Val Asp Val 195

Pro Trp Ile Ser Asn Ile

205 210

Tyr Lys Ser Ser Pro Glu 220 ·4·· • · · · · ·«· *· ··· *···

Lys	Trp	Ser	Thr Ala	Ser	Asp Pro Tyr	Ser	Asp	Phe	Glu	Lys
225				230		235
Val	Thr	Gly	Arg Ile	Asp	Lys Asn Val	Ser	Pro	Glu	Ala	Arg
	240				245			250
His	Pro	Leu	Val Ala	Ala	Tyr Pro Ile	Val	His	Val	Asp	Met
		255		260				265
Glu	Asn	Ile	Ile Leu	Ser	Lys Asn Glu	Asp	Gin	Ser	Thr	Gin
			270		275					280
Asn	Thr	Asp	Ser Glu	Thr	Arg Thr Ile	Ser	Lys	Asn	Thr	Ser
			285			290
Thr	Ser	Arg	Thr His	Thr	Ser Glu Val	His	Gly	Asn	Ala	Glu
295				300			305
Val	His	Ala	Ser Phe	Phe	Asp Ile Gly	Gly	Ser	Val	Ser	Ala
	310				315			320
Gly	Phe	Ser	Asn Ser	Asn	Ser Ser Thr	Val	Ala	Ile	Asp	His
		325			330				335
Ser	Leu	Ser	Leu Ala	Gly	Glu Arg Thr	Trp	Ala	Glu	Thr	Met
			340		345					350
Gly	Leu	Asn	Thr Ala	Asp	Thr Ala Arg	Leu	Asn	Ala	Asn	Ile
			355			360
Arg	Tyr	Val	Asn Thr	Gly	Thr Ala Pro	Ile	Tyr	Asn	Val	Leu
365				370			375
Pro	Thr	Thr	Ser Leu	Val	Leu Gly Lys	Asn	Gin	Thr	Leu	Ala
	380				385			390
Thr	Ile	Lys	Ala Lys	Glu	Asn Gin Leu	Ser	Gin	Ile	Leu	Ala
		395			400				405
Pro	Asn	Asn	Tyr Tyr	Pro	Ser Lys Asn	Leu	Ala	Pro	Ile	Ala
			410		415					420
Leu	Asn	Ala	Gin Asp	Asp	Phe Ser Ser	Thr	Pro	Ile	Thr	Met
			425			430
Asn	Tyr	Asn	Gin Phe	Leu	Glu Leu Glu	Lys	Thr	Lys	Gin	Leu
435				440			445
Arg	Leu	Asp	Thr Asp	Gin	Val Tyr Gly	Asn	Ile	Ala	Thr	Tyr

450

455

460 • ·· · *· ·· • · Λ · · · · · · · ·

Asn Phe Glu

Asn Gly Arg Val Arg Val Asp Thr Gly Ser

Asn

465

470

475

Trp

Ser

Glu

Val

Leu

Pro

Gin

Ile

Gin

Glu

Thr

Thr

Ala

Arg

480

485

490

Ile

Ile

Phe

Asn

Gly

Lys

Asp

Leu

Asn

Leu

Val

Glu

Arg

Arg

495

500

Ile

Ala

Ala

Val

Asn

Pro

Ser

Asp

Pro

Leu

Glu

Thr

Thr

Lys

505

510

515

Pro

Asp

Met

Thr

Leu

Lys

Glu

Ala

Leu

Lys

Ile

Ala

Phe

Gly

520

525

530

Phe

Asn

Glu

Pro

Asn

Gly

Asn

Leu

Gin

Tyr

Gin

Gly

Lys

Asp

535

540

545

Ile

Thr

Glu

Phe

Asp

Phe

Asn

Phe

Asp

Gin

Gin

Thr

Ser

Gin

550

555

560

Asn

Ile

Lys

Asn

Gin

Leu

Ala

Glu

Leu

Asn

Ala

Thr

Asn

Ile

565

570

Tyr

Thr

Val

Leu

Asp

Lys

Ile

Lys

Leu

Asn

Ala

Lys

Met

Asn

575

580

585

Ile

Leu

Ile

Arg

Asp

Lys

Arg

Phe

His

Tyr

Asp

Arg

Asn

Asn

590

595

600

Ile

Ala

Val

Gly

Ala

Asp

Glu

Ser

Val

Val

Lys

Glu

Ala

His

605

610

615

Arg

Glu

Val

Ile

Asn

Ser

Ser

Thr

Glu

Gly

Leu

Leu

Leu

Asn

620

625

630

Ile

Asp

Lys

Asp

Ile

Arg

Lys

Ile

Leu

Ser

Gly

Tyr

Ile

Val

635

640

Glu

Ile

Glu

Asp

Thr

Glu

Gly

Leu

Lys

Glu

Val

Ile

Asn

Asp

645

650

655

Arg

Tyr

Asp

Met

Leu

Asn

Ile

Ser

Ser

Leu

Arg

Gin

Asp

Gly

660

665

670

Lys

Thr

Phe

Ile

Asp

Phe

Lys

Lys

Tyr

Asn

Asp

Lys

Leu

Pro

675

680

685

Leu

Tyr

Ile

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr

Lys

Val

Asn

Val

Tyr

Ala

690 695 700 ·· · ·· ·· ·· ·· ···· · · · ·· · · · · ··· · ···· · • · · · « · ·

Val

Thr

Lys Glu

Asn 705

Thr

Ile

Ile Asn

Pro Ser 710

Glu Asn Gly

Asp

Thr

Ser

Thr

Asn

Gly

Ile

Lys

Lys

Ile

Leu

Ile

Phe

Ser

715

720

725

Lys

Lys

Gly

Tyr

Glu

Ile

Gly

Glx

730

735

<210> 5 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 5

Glu Val 1

Lys Gin

Glu 5

Asn Arg Leu

Leu

Asn Glu 10

Ser

Glu Ser

Ser

Ser

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Asp

Leu

Asn

15

20

25

Phe

Gin

Ala

Pro

Met

Val

Val

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Gly

Asp

30

35

40

Leu

Ser

Ile

Pro

Ser

Ser

Glu

Leu

Glu

Asn

Ile

Pro

Ser

Glu

45

50

55

Asn

Gin

Tyr

Phe

Gin

Ser

Ala

Ile

Trp

Ser

Gly

Phe

Ile

Lys

60

65

70

Val

Lys

Lys

Ser

Asp

Glu

Tyr

Thr

Phe

Ala

Thr

Ser

Ala

Asp

75

80

Asn

His

Val

Thr

Met

Trp

Val

Asp

Asp

Gin

Glu

Val

Ile

Asn

85

90

95

Lys

Ala

Ser

Asn

Ser

Asn

Lys

Ile

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly

Arg

100

105

110

Leu

Tyr

Gin

Ile

Lys

Ile

Gin

Tyr

Gin

Arg

Glu

Asn

Pro

Thr

115

120

125

Glu

Lys

Gly

Leu

Asp

Phe

Lys

Leu

Tyr

Trp

Thr

Asp

Ser

Gin

130

135

140

Asn Lys

Lys

Glu

Val 145

Ile

Ser Ser Asp Asn Leu Gin Leu 150

Pro

Glu

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Ser

Asn

Ser

Arg

Lys

Lys

Arg

Ser

155

160

165

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Asp

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

170

175

180

Ile

Pro

Asp

Ser

Leu

Glu

Val

Glu

Gly

Tyr

Thr

Val

Asp

Val

185

190

195

Lys

Asn

Lys

Arg

Thr

Phe

Leu

Ser

Pro

Trp

Ile

Ser

Asn

Ile

200

205

210

His

Glu

Lys

Lys

Gly

Leu

Thr

Lys

Tyr

Lys

Ser

Ser

Pro

Glu

215

220

Lys

Trp

Ser

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Tyr

Ser

Asp

Phe

Glu

Lys

225

230

235

Val

Thr

Gly

Arg

Ile

Asp

Lys

Asn

Val

Ser

Pro

Glu

Ala

Arg

240

245

250

His

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Tyr

Pro

Ile

Val

His

Val

Asp

Met

255

260

265

Glu

Asn

Ile

Ile

Leu

Ser

Lys

Asn

Glu

Asp

Gin

Ser

Thr

Gin

270

275

280

Asn

Thr

Asp

Ser

Glu

Thr

Arg

Thr

Ile

Ser

Lys

Asn

Thr

Ser

285

290

Thr

Ser

Arg

Thr

His

Thr

Ser

Glu

Val

His

Gly

Asn

Ala

Glu

295

300

305

Val

His

Ala

Ser

Phe

Phe

Asp

Ile

Gly

Gly

Ser

Val

Ser

Ala

310

315

320

Gly

Phe

Ser

Asn

Ser

Asn

Ser

Ser

Thr

Val

Ala

Ile

Asp

His

325

330

335

Ser

Leu

Ser

Leu

Ala

Gly

Glu

Arg

Thr

Trp

Ala

Glu

Thr

Met

340

345

350

Gly

Leu

Asn

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

Arg

Leu

Asn

Ala

Asn

Ile

355

360

Arg

Tyr

Val

Asn

Thr

Gly

Thr

Ala

Pro

Ile

Tyr

Asn

Val

Leu

365

370

375

·· · · · • · · · · ♦ ·

Pro Thr Thr Ser	Leu Val	Leu Gly Lys Asn 385	Gin	Thr 390	Leu	Ala
	380
Thr	Ile Lys Ala	Lys Glu	Asn Gin Leu Ser	Gin	Ile	Leu	Ala
	395		400			405
Pro	Asn Asn Tyr	Tyr Pro	Ser Lys Asn Leu	Ala	Pro	Ile	Ala
	410		415				420
Leu	Asn Ala Gin	Asp Asp	Phe Ser Ser Thr	Pro	Ile	Thr	Met
		425	430
Asn	Tyr Asn Gin	Phe Leu	Glu Leu Glu Lys	Thr	Lys	Gin	Leu
435		440		445
Arg	Leu Asp Thr	Asp Gin	Val Tyr Gly Asn	Ile	Ala	Thr	Tyr
	450		455		460
Asn	Phe Glu Asn	Gly Arg	Val Arg Val Asp	Thr	Gly	Ser	Asn
	465		470			475
Trp	Ser Glu Val	Leu Pro	Gin Ile Gin Glu	Thr	Thr	Ala	Arg
	480		485				490
Ile	Ile Phe Asn	Gly Lys	Asp Leu Asn Leu	Val	Glu	Arg	Arg
		495	500
Ile	Ala Ala Val	Asn Pro	Ser Asp Pro Leu	Glu	Thr	Thr	Lys
505		510		515
Pro	Asp Met Thr	Leu Lys	Glu Ala Leu Lys	Ile	Ala	Phe	Gly
	520		525		530
Phe	Asn Glu Pro	Asn Gly	Asn Leu Gin Tyr	Gin	Gly	Lys	Asp
	535		540			545
Ile	Thr Glu Phe	Asp Phe	Asn Phe Asp Gin	Gin	Thr	Ser	Gin
	550		555				560
Asn	Ile Lys Asn	Gin Leu	Ala Glu Leu Asn	Ala	Thr	Asn	Ile
		565	570
Tyr	Thr Val Leu	Asp Lys	Ile Lys Leu Asn	Ala	Lys	Met	Asn
575		580	585
Ile	Leu Ile Arg	Asp Lys	Arg Phe His Tyr	Asp	Arg	Asn	Asn
	590		595		600
Ile	Ala Val Gly	Ala Asp	Glu Ser Val Val	Lys	Glu	Ala	His

605 610 615

Arg

Glu

Val

Ile 620

Asn Ser

Ser

Thr Glu Gly 625

Leu

Leu

Leu

Asn 630

Ile

Asp

Lys

Asp

Ile

Arg

Lys

Ile

Leu

Ser

Gly

Tyr

Ile

Val

635

640

Glu

Ile

Glu

Asp

Thr

Glu

Gly

Leu

Lys

Glu

Val

Ile

Asn

Asp

645

650

655

Arg

Tyr

Asp

Met

Leu

Asn

Ile

Ser

Ser

Leu

Arg

Gin

Asp

Gly

660

665

670

Lys

Thr

Phe

Ile

Asp

Phe

Lys

Lys

Tyr

Asn

Asp

Lys

Leu

Pro

675

680

685

Leu

Tyr

Ile

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr

Lys

Val

Asn

Val

Tyr

Ala

690

695

700

Val

Thr

Lys

Glu

Asn

Thr

Ile

Ile

Asn

Pro

Ser

Glu

Asn

Gly

705

710

Asp

Thr

Ser

Thr

Asn

Gly

Ile

Lys

Lys

Ile

Leu

Ile

Phe

Ser

715

720

725

Lys

Lys

Gly

Tyr

Glu

Ile

Gly

Glx

730 735 <210> 6 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 6

Glu Val 1

Lys

Gin Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu

Ser

Glu

Ser

5

10

Ser

Ser

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Asp

Leu

Asn

15

20

25

Phe

Gin

Ala

Pro

Met

Val

Val

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Gly

Asp

30

35

40

Leu

Ser

Ile

Pro

Ser

Ser

Glu

Leu

Glu

Asn

Ile

Pro

Ser

Glu

• ·

Asn Gin

Tyr

Phe 60

Gin

Ser Ala

Ile Trp Ser 65

Gly

Phe

Ile

Lys 70

Val

Lys

Lys

Ser

Asp

Glu

Tyr

Thr

Phe

Ala

Thr

Ser

Ala

Asp

75

80

Asn

His

Val

Thr

Met

Trp

Val

Asp

Asp

Gin

Glu

Val

Ile

Asn

85

90

95

Lys

Ala

Ser

Asn

Ser

Asn

Lys

Ile

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly

Arg

100

105

110

Leu

Tyr

Gin

Ile

Lys

Ile

Gin

Tyr

Gin

Arg

Glu

Asn

Pro

Thr

115

120

125

Glu

Lys

Gly

Leu

Asp

Phe

Lys

Leu

Tyr

Trp

Thr

Asp

Ser

Gin

130

135

140

Asn

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Leu

Gin

Leu

Pro

145

150

Glu

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Ser

Asn

Ser

Arg

Lys

Lys

Arg

Ser

155

160

165

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Asp

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

170

175

180

Ile

Pro

Asp

Ser

Leu

Glu

Val

Glu

Gly

Tyr

Thr

Val

Asp

Val

185

190

195

Lys

Asn

Lys

Arg

Thr

Phe

Leu

Ser

Pro

Trp

Ile

Ser

Asn

Ile

200

205

210

His

Glu

Lys

Lys

Gly

Leu

Thr

Lys

Tyr

Lys

Ser

Ser

Pro

Glu

215

220

Lys

Trp

Ser

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Tyr

Ser

Asp

Phe

Glu

Lys

225

230

235

Val

Thr

Gly

Arg

Ile

Asp

Lys

Asn

Val

Ser

Pro

Glu

Ala

Arg

240

245

250

His

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Tyr

Pro

Ile

Val

His

Val

Asp

Met

255

260

265

Glu

Asn

Ile

Ile

Leu

Ser

Lys

Asn

Glu

Asp

Gin

Ser

Thr

Gin

270

275

280

Asn

Thr

Asp

Ser

Glu

Thr

Arg

Thr

Ile

Ser

Lys

Asn

Thr

Ser

285 290 • · · · · 4

Thr 295	Ser Arg	Thr His	Thr 300	Ser Glu Val	His	Gly 305	Asn	Ala	Glu
Val	His Ala	Ser Phe	Phe	Asp Ile Gly	Gly	Ser	Val	Ser	Ala
	310			315			320
Gly	Phe Ser	Asn Ser	Asn	Ser Ser Thr	Val	Ala	Ile	Asp	His
	325		330				335
Ser	Leu Ser	Leu Ala	Gly	Glu Arg Thr	Trp	Ala	Glu	Thr	Met
		340		345					350
Gly	Leu Asn	Thr Ala	Asp	Thr Ala Arg	Leu	Asn	Ala	Asn	Ile
		355			360
Arg	Tyr Val	Asn Thr	Gly	Thr Ala Pro	Ile	Tyr	Asn	Val	Leu
365			370			375
Pro	Thr Thr	Ser Leu	Val	Leu Gly Lys	Asn	Gin	Thr	Leu	Ala
	380			385			390
Thr	Ile Lys	Ala Lys	Glu	Asn Gin Leu	Ser	Gin	Ile	Leu	Ala
	395			400				405
Pro	Asn Asn	Tyr Tyr	Pro	Ser Lys Asn	Leu	Ala	Pro	Ile	Ala
		410		415					420
Leu	Asn Ala	Gin Asp	Asp	Phe Ser Ser	Thr	Pro	Ile	Thr	Met
		425			430
Asn	Tyr Asn	Gin Phe	Leu	Glu Leu Glu	Lys	Thr	Lys	Gin	Leu
435			440			445
Arg	Leu Asp	Thr Asp	Gin	Val Tyr Gly	Asn	Ile	Ala	Thr	Tyr
	450			455			460
Asn	Phe Glu	Asn Gly	Arg	Val Arg Val	Asp	Thr	Gly	Ser	Asn
	465			470				475
Trp	Ser Glu	Val Leu	Pro	Gin Ile Gin	Glu	Thr	Thr	Ala	Arg
		480		485					490
Ile	Ile Phe	Asn Gly	Lys	Asp Leu Asn	Leu	Val	Glu	Arg	Arg
		495			500
Ile	Ala Ala	Val Asn	Pro	Ser Asp Pro	Leu	Glu	Thr	Thr	Lys
505			510			515
Pro	Asp Met	Thr Leu	Lys	Glu Ala Leu	Lys	Ile	Ala	Phe	Gly

520

525

530 • * » · · · > · * · · • · · » · · · · · · · • · ·

Phe

Asn

Glu

Pro

Asn

Gly

Asn

Leu

Gin

Tyr

Gin

Gly

Lys

Asp

535

540

545

Ile

Thr

Glu

Phe

Asp

Phe

Asn

Phe

Asp

Gin

Gin

Thr

Ser

Gin

550

555

560

Asn

Ile

Lys

Asn

Gin

Leu

Ala

Glu

Leu

Asn

Ala

Thr

Asn

Ile

565

570

Tyr

Thr

Val

Leu

Asp

Lys

Ile

Lys

Leu

Asn

Ala

Lys

Met

Asn

575

580

585

Ile

Leu

Ile

Arg

Asp

Lys

Arg

Phe

His

Tyr

Asp

Arg

Asn

Asn

590

595

600

Ile

Ala

Val

Gly

Ala

Asp

Glu

Ser

Val

Val

Lys

Glu

Ala

His

605

610

615

Arg

Glu

Val

Ile

Asn

Ser

Ser

Thr

Glu

Gly

Leu

Leu

Leu

Asn

620

625

630

Ile

Asp

Lys

Asp

Ile

Arg

Lys

Ile

Leu

Ser

Gly

Tyr

Ile

Val

635

640

Glu

Ile

Glu

Asp

Thr

Glu

Gly

Leu

Lys

Glu

Val

Ile

Asn

Asp

645

650

655

Arg

Tyr

Asp

Met

Leu

Asn

Ile

Ser

Ser

Leu

Arg

Gin

Asp

Gly

660

665

670

Lys

Thr

Phe

Ile

Asp

Phe

Lys

Lys

Tyr

Asn

Asp

Lys

Leu

Pro

675

680

685

Leu

Tyr

Ile

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr

Lys

Val

Asn

Val

Tyr

Ala

690

695

700

Val

Thr

Lys

Glu

Asn

Thr

Ile

Ile

Asn

Pro

Ser

Glu

Asn

Gly

705

710

Asp

Thr

Ser

Thr

Asn

Gly

Ile

Lys

Lys

Ile

Leu

Ile

Phe

Ser

715

720

725

Lys

Lys

Gly

Tyr

Glu

Ile

Gly

Glx

<210> 7 <211> 736 ·* · ·· ·· · • · · · * · » · ·· · · · ♦ • · · · · ♦ · · • « · · · * · ·· «·· ···· ·» ·· <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 7

Glu 1

Val

Lys Gin

Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu

Ser

Glu

Ser

5

10

Ser

Ser

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Asp

Leu

Asn

15

20

25

Phe

Gin

Ala

Pro

Met

Val

Val

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Gly

Asp

30

35

40

Leu

Ser

Ile

Pro

Ser

Ser

Glu

Leu

Glu

Asn

Ile

Pro

Ser

Glu

45

50

55

Asn

Gin

Tyr

Phe

Gin

Ser

Ala

Ile

Trp

Ser

Gly

Phe

Ile

Lys

60

65

70

Val

Lys

Lys

Ser

Asp

Glu

Tyr

Thr

Phe

Ala

Thr

Ser

Ala

Asp

75

80

Asn

His

Val

Thr

Met

Trp

Val

Asp

Asp

Gin

Glu

Val

Ile

Asn

85

90

95

Lys

Ala

Ser

Asn

Ser

Asn

Lys

Ile

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly

Arg

100

105

110

Leu

Tyr

Gin

Ile

Lys

Ile

Gin

Tyr

Gin

Arg

Glu

Asn

Pro

Thr

115

120

125

Glu

Lys

Gly

Leu

Asp

Phe

Lys

Leu

Tyr

Trp

Thr

Asp

Ser

Gin

130

135

140

Asn

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Leu

Gin

Leu

Pro

145

150

Glu

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Ser

Asn

Ser

Arg

Lys

Lys

Arg

Ser

155

160

165

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Asp

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

170

175

180

Ile

Pro

Asp

Ser

Leu

Glu

Val

Glu

Gly

Tyr

Thr

Val

Asp

Val

185

190

195

Lys

Asn

Lys

Arg

Thr

Phe

Leu

Ser

Pro

Trp

Ile

Ser

Asn

Ile

200 205 210 • 9 • · • « • I • · ·

His	Glu	Lys	Lys	Gly Leu Thr 215	Lys	Tyr	Lys Ser Ser Pro 220	Glu
Lys	Trp	Ser	Thr	Ala Ser Asp	Pro	Tyr	Ser Asp Phe Glu	Lys
225				230			235
Val	Thr	Gly	Arg	Ile Asp Lys	Asn	Val	Ser Pro Glu Ala	Arg
	240			245			250
His	Pro	Leu	Val	Ala Ala Tyr	Pro	Ile	Val His Val Asp	Met
		255			260	265
Glu	Asn	Ile	Ile	Leu Ser Lys	Asn	Glu	Asp Gin Ser Thr	Gin
			270			275		280
Asn	Thr	Asp	Ser	Glu Thr Arg	Thr	Ile	Ser Lys Asn Thr	Ser
				285			290
Thr	Ser	Arg	Thr	His Thr Ser	Glu	Val	His Gly Asn Ala	Glu
295				300			305
Val	His	Ala	Ser	Phe Phe Asp	Ile	Gly	Gly Ser Val Ser	Ala
	310			315			320
Gly	Phe	Ser	Asn	Ser Asn Ser	Ser	Thr	Val Ala Ile Asp	His
		325			330		335
Ser	Leu	Ser	Leu	Ala Gly Glu	Arg	Thr	Trp Ala Glu Thr	Met
			340			345		350
Gly	Leu	Asn	Thr	Ala Asp Thr	Ala	Arg	Leu Asn Ala Asn	Ile
				355		360
Arg	Tyr	Val	Asn	Thr Gly Thr	Ala	Pro	Ile Tyr Asn Val	Leu
365				370			375
Pro	Thr	Thr	Ser	Leu Val Leu	Gly	Lys	Asn Gin Thr Leu	Ala
	380			385			390
Thr	Ile	Lys	Ala	Lys Glu Asn	Gin	Leu	Ser Gin Ile Leu	Ala
		395			400		405
Pro	Asn	Asn	Tyr	Tyr Pro Ser	Lys	Asn	Leu Ala Pro Ile	Ala
			410			415		420
Leu	Asn	Ala	Gin	Asp Asp Phe	Ser	Ser	Thr Pro Ile Thr	Met
				425			430
Asn	Tyr	Asn	Gin	Phe Leu Glu	Leu	Glu	Lys Thr Lys Gin	Leu

435 440

445 * » »· ·· ** • «19 t ·«* · · * * • ·· · · · » « · · ·· ··· ··· ·· ·»· «♦·· ·· ····

Arg

Asn

Trp

Ile

Ile

505

Pro

Phe

Ile

Asn

Tyr

575

Ile

Ile

Arg

Ile

Glu

645

Arg

Lys

Leu Asp

450

Phe Glu

465

Ser Glu

Ile Phe

Ala Ala

Asp Met 520

Asn Glu

535

Thr Glu

Ile Lys

Thr Val

Leu Ile

590

Ala Val

605

Glu Val

Asp Lys

Ile Glu

Tyr Asp 660

Thr Phe

675

Thr

Asn

Val

480

Asn

Val

Thr

Pro

Phe

550

Asn

Leu

Arg

Gly

Ile

620

Asp

Asp

Met

Ile

Asp Gin

Gly Arg

Leu Pro

Gly Lys 495

Asn Pro

510 Leu Lys

Asn Gly

Asp Phe

Gin Leu

565

Asp Lys 580

Asp Lys

Ala Asp

Asn Ser

Ile Arg 635

Thr Glu

650

Leu Asn

Asp Phe

Val Tyr Gly 455

Val Arg Val 470

Gin Ile Gin

485

Asp Leu Asn

Ser Asp Pro

Glu Ala Leu

525

Asn Leu Gin

540

Asn Phe Asp 555

Ala Glu Leu

Ile Lys Leu

Arg Phe His 595

Glu Ser Val

610

Ser Thr Glu

625

Lys Ile Leu

Gly Leu Lys

Ile Ser Ser

665

Lys Lys Tyr 680

Asn Ile Ala Thr Tyr 460

Asp Thr Gly Ser Asn 475

Glu Thr Thr Ala Arg 490

Leu Val Glu Arg Arg 500

Leu Glu Thr Thr Lys 515

Lys Ile Ala Phe Gly 530

Tyr Gin Gly Lys Asp 545

Gin Gin Thr Ser Gin

560

Asn Ala Thr Asn Ile

570

Asn Ala Lys Met Asn 585

Tyr Asp Arg Asn Asn 600

Val Lys Glu Ala His 615

Gly Leu Leu Leu Asn 630

Ser Gly Tyr Ile Val 640

Glu Val Ile Asn Asp 655

Leu Arg Gin Asp Gly 670

Asn Asp Lys Leu Pro

685

69

* H * •

• ·»

« 99 9 9 9 «

♦ »

• ·

• · ·

• ·

•

• ·

»*·

··

A · MM

Leu

Tyr

Ile

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr

Lys

Val

Asn

Val

Tyr Ala

690

695

700

Val

Thr

Lys

Glu

Asn

Thr

Ile

Ile

Asn

Pro

Ser

Glu

Asn Gly

705

710

Asp

Thr

Ser

Thr

Asn

Gly

Ile

Lys

Lys

Ile

Leu

Ile

Phe Ser

715

720

725

Lys

Lys

Gly

Tyr

Glu

Ile

Gly

Glx

730

735

<210> 8 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 8

Glu Val Lys Gin Glu Asn 1 5

Ser Ser Gin Gly Leu Leu 15 20

Phe Gin Ala Pro Met Val

Leu Ser Ile Pro Ser Ser

Asn Gin Tyr Phe Gin Ser 60

Val Lys Lys Ser Asp Glu 75

Asn His Val Thr Met Trp 85 90

Lys Ala Ser Asn Ser Asn

100

Leu Tyr Gin Ile Lys Ile 115

Arg Leu Leu Asn Glu Ser 10

Gly Tyr Tyr Phe Ser Asp 25

Val Thr Ser Ser Thr Thr 35 40

Glu Leu Glu Asn Ile Pro

Ala Ile Trp Ser Gly Phe 65

Tyr Thr Phe Ala Thr Ser 80

Val Asp Asp Gin Glu Val 95

Lys Ile Arg Leu Glu Lys

105 110

Gin Tyr Gin Arg Glu Asn 120

Glu

Leu

Gly

Ser

Ile

Ala

Ile

Gly

Pro

125

Ser

Asn

Asp

Glu

Lys

Asp

Asn

Arg

Thr

Glu	Lys	Gly Leu Asp 130	Phe Lys	Leu	Tyr Trp Thr 135	Asp	Ser	Gin 140
Asn	Lys	Lys Glu Val	Ile Ser	Ser	Asp Asn Leu	Gin	Leu	Pro
		145			150
Glu	Leu	Lys Gin Lys	Ser Ser	Asn	Ser Arg Lys	Lys	Arg	Ser
155			160		165
Thr	Ser	Ala Gly Pro	Thr Val	Pro	Asp Arg Asp	Asn	Asp	Gly
	170		175		180
Ile	Pro	Asp Ser Leu	Glu Val	Glu	Gly Tyr Thr	Val	Asp	Val
		185		190			195
Lys	Asn	Lys Arg Thr	Phe Leu	Ser	Pro Trp Ile	Ser	Asn	Ile
		200			205			210
His	Glu	Lys Lys Gly	Leu Thr	Lys	Tyr Lys Ser	Ser	Pro	Glu
		215			220
Lys	Trp	Ser Thr Ala	Ser Asp	Pro	Tyr Ser Asp	Phe	Glu	Lys
225			230		235
Val	Thr	Gly Arg Ile	Asp Lys	Asn	Val Ser Pro	Glu	Ala	Arg
	240		245			250
His	Pro	Leu Val Ala	Ala Tyr	Pro	Ile Val His	Val	Asp	Met
		255		260			265
Glu	Asn	Ile Ile Leu	Ser Lys	Asn	Glu Asp Gin	Ser	Thr	Gin
		270			275			280
Asn	Thr	Asp Ser Glu	Thr Arg	Thr	Ile Ser Lys	Asn	Thr	Ser
		285			290
Thr	Ser	Arg Thr His	Thr Ser	Glu	Val His Gly	Asn	Ala	Glu
295			300		305
Val	His	Ala Ser Phe	Phe Asp	Ile	Gly Gly Ser	Val	Ser	Ala
	310		315			320
Gly	Phe	Ser Asn Ser	Asn Ser	Ser	Thr Val Ala	Ile	Asp	His
		325		330			335
Ser	Leu	Ser Leu Ala	Gly Glu	Arg	Thr Trp Ala	Glu	Thr	Met
		340			345			350
Gly	Leu	Asn Thr Ala	Asp Thr	Ala Arg Leu Asn	Ala	Asn	Ile

355

360

Arg

Tyr

Val

Asn

Thr

Gly

Thr

Ala

Pro

Ile

Tyr

Asn

Val

Leu

365

370

375

Pro

Thr

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Gly

Lys

Asn

Gin

Thr

Leu

Ala

380

385

390

Thr

Ile

Lys

Ala

Lys

Glu

Asn

Gin

Leu

Ser

Gin

Ile

Leu

Ala

395

400

405

Pro

Asn

Asn

Tyr

Tyr

Pro

Ser

Lys

Asn

Leu

Ala

Pro

Ile

Ala

410

415

420

Leu

Asn

Ala

Gin

Asp

Asp

Phe

Ser

Ser

Thr

Pro

Ile

Thr

Met

425

430

Asn

Tyr

Asn

Gin

Phe

Leu

Glu

Leu

Glu

Lys

Thr

Lys

Gin

Leu

435

440

445

Arg

Leu

Asp

Thr

Asp

Gin

Val

Tyr

Gly

Asn

Ile

Ala

Thr

Tyr

450

455

460

Asn

Phe

Glu

Asn

Gly

Arg

Val

Arg

Val

Asp

Thr

Gly

Ser

Asn

465

•

470

475

Trp

Ser

Glu

Val

Leu

Pro

Gin

Ile

Gin

Glu

Thr

Thr

Ala

Arg

480

485

490

Ile

Ile

Phe

Asn

Gly

Lys

Asp

Leu

Asn

Leu

Val

Glu

Arg

Arg

495

500

Ile

Ala

Ala

Val

Asn

Pro

Ser

Asp

Pro

Leu

Glu

Thr

Thr

Lys

505

510

515

Pro

Asp

Met

Thr

Leu

Lys

Glu

Ala

Leu

Lys

Ile

Ala

Phe

Gly

520

525

530

Phe

Asn

Glu

Pro

Asn

Gly

Asn

Leu

Gin

Tyr

Gin

Gly

Lys

Asp

535

540

545

Ile

Thr

Glu

Phe

Asp

Phe

Asn

Phe

Asp

Gin

Gin

Thr

Ser

Gin

550

555

560

Asn

Ile

Lys

Asn

Gin

Leu

Ala

Glu

Leu

Asn

Ala

Thr

Asn

Ile

565

570

Tyr

Thr

Val

Leu

Asp

Lys

Ile

Lys

Leu

Asn

Ala

Lys

Met

Asn

575

580

585

Ile

Leu

Ile

Arg

Asp

Lys

Arg

Phe

His

Tyr

Asp

Arg

Asn

Asn

590

595

600

Ile Ala Val

Gly

Ala Asp

Glu

Ser 610

Val

Val

Lys

Glu

Ala 615

His

605

Arg

Glu

Val

Ile

Asn

Ser

Ser

Thr

Glu

Gly

Leu

Leu

Leu

Asn

620

625

630

Ile

Asp

Lys

Asp

Ile

Arg

Lys

Ile

Leu

Ser

Gly

Tyr

Ile

Val

635

640

Glu

Ile

Glu

Asp

Thr

Glu

Gly

Leu

Lys

Glu

Val

Ile

Asn

Asp

645

650

655

Arg

Tyr

Asp

Met

Leu

Asn

Ile

Ser

Ser

Leu

Arg

Gin

Asp

Gly

660

665

670

Lys

Thr

Phe

Ile

Asp

Phe

Lys

Lys

Tyr

Asn

Asp

Lys

Leu

Pro

675

680

685

Leu

Tyr

Ile

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr

Lys

Val

Asn

Val

Tyr

Ala

690

695

700

Val

Thr

Lys

Glu

Asn

Thr

Ile

Ile

Asn

Pro

Ser

Glu

Asn

Gly

705

710

Asp

Thr

Ser

Thr

Asn

Gly

Ile

Lys

Lys

Ile

Leu

Ile

Phe

Ser

715

720

725

Lys

Lys

Gly

Tyr

Glu

Ile Gly

Glx

730

735

<210> 9 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 9

Glu 1

Val

Lys Gin Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser

Glu Ser

5

10

Ser

Ser

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Asp

Leu

Asn

15

20

25

Phe

Gin

Ala

Pro

Met

Val

Val

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Gly

Asp

Leu Ser

Ile 45

Pro

Ser

Ser Glu Leu Glu Asn 50

Ile

Pro

Ser 55

Glu

Asn

Gin

Tyr

Phe

Gin

Ser

Ala

Ile

Trp

Ser

Gly

Phe

Ile

Lys

60

65

70

Val

Lys

Lys

Ser

Asp

Glu

Tyr

Thr

Phe

Ala

Thr

Ser

Ala

Asp

75

80

Asn

His

Val

Thr

Met

Trp

Val

Asp

Asp

Gin

Glu

Val

Ile

Asn

85

90

95

Lys

Ala

Ser

Asn

Ser

Asn

Lys

Ile

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly

Arg

100

105

110

Leu

Tyr

Gin

Ile

Lys

Ile

Gin

Tyr

Gin

Arg

Glu

Asn

Pro

Thr

115

120

125

Glu

Lys

Gly

Leu

Asp

Phe

Lys

Leu

Tyr

Trp

Thr

Asp

Ser

Gin

130

135

140

Asn

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Leu

Gin

Leu

Pro

145

150

Glu

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Ser

Asn

Ser

Arg

Lys

Lys

Arg

Ser

155

160

165

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Asp

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

170

175

180

Ile

Pro

Asp

Ser

Leu

Glu

Val

Glu

Gly

Tyr

Thr

Val

Asp

Val

185

190

195

Lys

Asn

Lys

Arg

Thr

Phe

Leu

Ser

Pro

Trp

Ile

Ser

Asn

Ile

200

205

210

His

Glu

Lys

Lys

Gly

Leu

Thr

Lys

Tyr

Lys

Ser

Ser

Pro

Glu

215

220

Lys

Trp

Ser

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Tyr

Ser

Asp

Phe

Glu

Lys

225

230

235

Val

Thr

Gly

Arg

Ile

Asp

Lys

Asn

Val

Ser

Pro

Glu

Ala

Arg

240

245

250

His

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Tyr

Pro

Ile

Val

His

Val

Asp

Met

255

260

265

Glu

Asn

Ile

Ile

Leu

Ser

Lys

Asn

Glu

Asp

Gin

Ser

Thr

Gin

270 275 280

	74	• · · • • · • · • · *	• • · • · • • ·	9 · · • • • • · · ·	• • • · • • · 9
Asn Thr Asp Ser Glu Thr Arg	Thr Ile	Ser Lys	Asn	Thr	Ser
285		290
Thr Ser Arg Thr His Thr Ser	Glu Val	His Gly	Asn	Ala	Glu
295 300		305
Val His Ala Ser Phe Phe Asp	Ile Gly	Gly Ser	Val	Ser	Ala
310 315		320
Gly Phe Ser Asn Ser Asn Ser	Ser Thr	Val Ala	Ile	Asp	His
325	330			335
Ser Leu Ser Leu Ala Gly Glu	Arg Thr	Trp Ala	Glu	Thr	Met
340	345			350
Gly Leu Asn Thr Ala Asp Thr	Ala Arg	Leu Asn	Ala	Asn	Ile
355		360
Arg Tyr Val Asn Thr Gly Thr	Ala Pro	Ile Tyr	Asn	Val	Leu
365 370		375
Pro Thr Thr Ser Leu Val Leu	Gly Lys	Asn Gin	Thr	Leu	Ala
380 385			390
Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn	Gin Leu	Ser Gin	Ile	Leu	Ala
395	400			405
Pro Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser	Lys Asn	Leu Ala	Pro	Ile	Ala
410	415				420
Leu Asn Ala Gin Asp Asp Phe	Ser Ser	Thr Pro	Ile	Thr	Met
425		430
Asn Tyr Asn Gin Phe Leu Glu	Leu Glu	Lys Thr	Lys	Gin	Leu
435 440		445
Arg Leu Asp Thr Asp Gin Val	Tyr Gly	Asn Ile	Ala	Thr	Tyr
450 455			460
Asn Phe Glu Asn Gly Arg Val	Arg Val	Asp Thr	Gly	Ser	Asn
465	470			475
Trp Ser Glu Val Leu Pro Gin	Ile Gin	Glu Thr	Thr	Ala	Arg
480	485				490
Ile Ile Phe Asn Gly Lys Asp	Leu Asn	Leu Val	Glu	Arg	Arg
495		500
Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser	Asp Pro	Leu Glu	Thr	Thr	Lys
505 510		515

Pro Asp	Met	Thr	Leu Lys	Glu Ala Leu Lys 525	Ile	Ala 530	Phe	Gly
	520
Phe	Asn	Glu	Pro	Asn Gly	Asn Leu Gin Tyr	Gin	Gly	Lys	Asp
		535			540			545
Ile	Thr	Glu	Phe	Asp Phe	Asn Phe Asp Gin	Gin	Thr	Ser	Gin
			550		555				560
Asn	Ile	Lys	Asn	Gin Leu	Ala Glu Leu Asn	Ala	Thr	Asn	Ile
				565	570
Tyr	Thr	Val	Leu	Asp Lys	Ile Lys Leu Asn	Ala	Lys	Met	Asn
575				580		585
Ile	Leu	Ile	Arg	Asp Lys	Arg Phe His Tyr	Asp	Arg	Asn	Asn
	590				595		600
Ile	Ala	Val	Gly	Ala Asp	Glu Ser Val Val	Lys	Glu	Ala	His
		605			610			615
Arg	Glu	Val	Ile	Asn Ser	Ser Thr Glu Gly	Leu	Leu	Leu	Asn
			620		625				630
Ile	Asp	Lys	Asp	Ile Arg	Lys Ile Leu Ser	Gly	Tyr	Ile	Val
				635	640
Glu	Ile	Glu	Asp	Thr Glu	Gly Leu Lys Glu	Val	Ile	Asn	Asp
645				650		655
Arg	Tyr	Asp	Met	Leu Asn	Ile Ser Ser Leu	Arg	Gin	Asp	Gly
	660				665		670
Lys	Thr	Phe	Ile	Asp Phe	Lys Lys Tyr Asn	Asp	Lys	Leu	Pro
		675			680			685
Leu	Tyr	Ile	Ser	Asn Pro	Asn Tyr Lys Val	Asn	Val	Tyr	Ala
			690		695				700
Val	Thr	Lys	Glu	Asn Thr	Ile Ile Asn Pro	Ser	Glu	Asn	Gly
				705	710
Asp	Thr	Ser	Thr	Asn Gly	Ile Lys Lys Ile	Leu	Ile	Phe	Ser
715				720		725
Lys	Lys	Gly	Tyr	Glu Ile	Gly Glx
	730				735

·· ♦ ·· ·· ·· • · · » · ··· ·· · · · · · * · · · · · · · • · · · · · ·· ··· ···· ·· ···· <210> 10 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 10

Glu 1

Val

Lys

Gin Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu

Ser

Glu

Ser

5

10

Ser

Ser

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Asp

Leu

Asn

15

20

25

Phe

Gin

Ala

Pro

Met

Val

Val

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Gly

Asp

30

35

40

Leu

Ser

Ile

Pro

Ser

Ser

Glu

Leu

Glu

Asn

Ile

Pro

Ser

Glu

45

50

55

Asn

Gin

Tyr

Phe

Gin

Ser

Ala

Ile

Trp

Ser

Gly

Phe

Ile

Lys

60

65

70

Val

Lys

Lys

Ser

Asp

Glu

Tyr

Thr

Phe

Ala

Thr

Ser

Ala

Asp

75

80

Asn

His

Val

Thr

Met

Trp

Val

Asp

Asp

Gin

Glu

Val

Ile

Asn

85

90

95

Lys

Ala

Ser

Asn

Ser

Asn

Lys

Ile

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly

Arg

100

105

110

Leu

Tyr

Gin

Ile

Lys

Ile

Gin

Tyr

Gin

Arg

Glu

Asn

Pro

Thr

115

120

125

Glu

Lys

Gly

Leu

Asp

Phe

Lys

Leu

Tyr

Trp

Thr

Asp

Ser

Gin

130

135

140

Asn

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Leu

Gin

Leu

Pro

145

150

Glu

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Ser

Asn

Ser

Arg

Lys

Lys

Arg

Ser

155

160

165

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Asp

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

170

175

180

Ile

Pro

Asp

Ser

Leu

Glu

Val

Glu

Gly

Tyr

Thr

Val

Asp

Val

185 190 195

Lys Asn Lys Arg

Thr

Phe Leu Ser

Pro Trp 205

Ile

Ser

Asn

Ile 210

200

His

Glu

Lys

Lys

Gly

Leu

Thr

Lys

Tyr

Lys

Ser

Ser

Pro

Glu

215

220

Lys

Trp

Ser

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Tyr

Ser

Asp

Phe

Glu

Lys

225

230

235

Val

Thr

Gly

Arg

Ile

Asp

Lys

Asn

Val

Ser

Pro

Glu

Ala

Arg

240

245

250

His

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Tyr

Pro

Ile

Val

His

Val

Asp

Met

255

260

265

Glu

Asn

Ile

Ile

Leu

Ser

Lys

Asn

Glu

Asp

Gin

Ser

Thr

Gin

270

275

280

Asn

Thr

Asp

Ser

Glu

Thr

Arg

Thr

Ile

Ser

Lys

Asn

Thr

Ser

285

290

Thr

Ser

Arg

Thr

His

Thr

Ser

Glu

Val

His

Gly

Asn

Ala

Glu

295

300

305

Val

His

Ala

Ser

Phe

Phe

Asp

Ile

Gly

Gly

Ser

Val

Ser

Ala

310

315

320

Gly

Phe

Ser

Asn

Ser

Asn

Ser

Ser

Thr

Val

Ala

Ile

Asp

His

325

330

335

Ser

Leu

Ser

Leu

Ala

Gly

Glu

Arg

Thr

Trp

Ala

Glu

Thr

Met

340

345

350

Gly

Leu

Asn

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

Arg

Leu

Asn

Ala

Asn

Ile

355

360

Arg

Tyr

Val

Asn

Thr

Gly

Thr

Ala

Pro

Ile

Tyr

Asn

Val

Leu

365

370

375

Pro

Thr

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Gly

Lys

Asn

Gin

Thr

Leu

Ala

380

385

390

Thr

Ile

Lys

Ala

Lys

Glu

Asn

Gin

Leu

Ser

Gin

Ile

Leu

Ala

395

400

405

Pro

Asn

Asn

Tyr

Tyr

Pro

Ser

Lys

Asn

Leu

Ala

Pro

Ile

Ala

410

415

420

Leu

Asn

Ala

Gin

Asp

Asp

Phe

Ser

Ser

Thr

Pro

Ile

Thr

Met

425

430 • 0 • · • · • · '0 ·· ·· ♦ «00 • 0 · ·

0 0 « · » 0 0· »00 0« 0000

Asn Tyr Asn Gin Phe Leu Glu Leu Glu Lys Thr Lys Gin Leu

435 440 445

Arg Leu Asp Thr Asp Gin Val Tyr Gly Asn Ile Ala Thr Tyr

450 455 460

Asn Phe Glu Asn Gly Arg Val Arg Val Asp Thr Gly Ser Asn

465 470 475

Trp Ser Glu Val Leu Pro Gin Ile Gin Glu Thr Thr Ala Arg

480 485 490

Ile Ile Phe Asn Gly Lys Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg Arg

495 500

Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Glu Thr Thr Lys

505 510 515

Pro Asp Met Thr Leu Lys Glu Ala Leu Lys Ile Ala Phe Gly

520 525 530

Phe Asn Glu Pro Asn Gly Asn Leu Gin Tyr Gin Gly Lys Asp

535 540 545

Ile Thr Glu Phe Asp Phe Asn Phe Asp Gin Gin Thr Ser Gin

550 555 560

Asn Ile Lys Asn Gin Leu Ala Glu Leu Asn Ala Thr Asn Ile

565 570

Tyr Thr Val Leu Asp Lys Ile Lys Leu Asn Ala Lys Met Asn

575 580 585

Ile Leu Ile Arg Asp Lys Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn

590 595 600

Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His

605 610 615

Arg Glu Val Ile Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu Leu Leu Asn

620 625 630

Ile Asp Lys Asp Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly Tyr Ile Val

635 640

Glu Ile Glu Asp Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val Ile Asn Asp

645 650 655

Arg Tyr Asp Met Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg Gin Asp Gly

660 665 670 ··

Lys

Thr

Phe 675

Ile

Asp

Phe

Lys

Lys Tyr Asn Asp Lys Leu

Pro

680

685

Leu

Tyr

Ile

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr

Lys

Val

Asn

Val

Tyr

Ala

690

695

700

Val

Thr

Lys

Glu

Asn

Thr

Ile

Ile

Asn

Pro

Ser

Glu

Asn

Gly

705

710

Asp

Thr

Ser

Thr

Asn

Gly

Ile

Lys

Lys

Ile

Leu

Ile

Phe

Ser

715

720

725

Lys

Lys

Gly

Tyr

Glu

Ile

Gly

Glx

730

735

<210> 11 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 11

Glu Val Lys Gin Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ser 15 10

Ser Ser Gin Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Asn

20 25

Phe Gin Ala Pro Met Val Val Thr Ser Ser Thr Thr Gly Asp

35 40

Leu Ser Ile Pro Ser Ser Glu Leu Glu Asn Ile Pro Ser Glu

50 55

Asn Gin Tyr Phe Gin Ser Ala Ile Trp Ser Gly Phe Ile Lys

65 70

Val Lys Lys Ser Asp Glu Tyr Thr Phe Ala Thr Ser Ala Asp

80

Asn His Val Thr Met Trp Val Asp Asp Gin Glu Val Ile Asn 85 90 95

Lys Ala Ser Asn Ser Asn Lys Ile Arg Leu Glu Lys Gly Arg 100 105

110

• ·· ·· ·· ·· · · * * · • · · · * • · · · · · • · · · · ····«·· ·· ····

Leu Tyr Gin

Ile Lys

Ile Gin Tyr 120

Gin Arg Glu Asn

Pro 125

Thr

115

Glu

Lys

Gly

Leu

Asp

Phe

Lys

Leu

Tyr

Trp

Thr

Asp

Ser

Gin

130

135

140

Asn

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Leu

Gin

Leu

Pro

145

150

Glu

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Ser

Asn

Ser

Arg

Lys

Lys

Arg

Ser

155

160

165

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Asp

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

170

175

180

Ile

Pro

Asp

Ser

Leu

Glu

Val

Glu

Gly

Tyr

Thr

Val

Asp

Val

185 190 195

Lys Asn Lys Arg Thr Phe Leu Ser Pro

Trp

Ile

Ser

Asn

Ile 210

200

205

His

Glu

Lys

Lys

Gly

Leu

Thr

Lys

Tyr

Lys

Ser

Ser

Pro

Glu

215

220

Lys

Trp

Ser

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Tyr

Ser

Asp

Phe

Glu

Lys

225

230

235

Val

Thr

Gly

Arg

Ile

Asp

Lys

Asn

Val

Ser

Pro

Glu

Ala

Arg

240

245

250

His

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Tyr

Pro

Ile

Val

His

Val

Asp

Met

255

260

265

Glu

Asn

Ile

Ile

Leu

Ser

Lys

Asn

Glu

Asp

Gin

Ser

Thr

Gin

270

275

280

Asn

Thr

Asp

Ser

Glu

Thr

Arg

Thr

Ile

Ser

Lys

Asn

Thr

Ser

285

290

Thr

Ser

Arg

Thr

His

Thr

Ser

Glu

Val

His

Gly

Asn

Ala

Glu

295

300

305

Val

His

Ala

Ser

Phe

Phe

Asp

Ile

Gly

Gly

Ser

Val

Ser

Ala

310

315

320

Gly

Phe

Ser

Asn

Ser

Asn

Ser

Ser

Thr

Val

Ala

Ile

Asp

His

325

330

335

Ser

Leu

Ser

Leu

Ala

Gly

Glu

Arg

Thr

Trp

Ala

Glu

Thr

Met

340 345 350 ·· • * ·· »· · ····

Gly Leu Asn Thr Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asn	Ala	Asn	Ile
	355	360
Arg Tyr	Val Asn Thr Gly Thr	Ala Pro Ile Tyr	Asn	Val	Leu
365	370	375
Pro Thr	Thr Ser Leu Val Leu	Gly Lys Asn Gin	Thr	Leu	Ala
380	385	390
Thr Ile	Lys Ala Lys Glu Asn	Gin Leu Ser Gin	Ile	Leu	Ala
	395	400		405
Pro Asn	Asn Tyr Tyr Pro Ser	Lys Asn Leu Ala	Pro	Ile	Ala
	410	415			420
Leu Asn	Ala Gin Asp Asp Phe	Ser Ser Thr Pro	Ile	Thr	Met
	425	430
Asn Tyr	Asn Gin Phe Leu Glu	Leu Glu Lys Thr	Lys	Gin	Leu
435	440	445
Arg Leu	Asp Thr Asp Gin Val	Tyr Gly Asn Ile	Ala	Thr	Tyr
450	455		460
Asn Phe	Glu Asn Gly Arg Val	Arg Val Asp Thr	Gly	Ser	Asn
	465	470		475
Trp Ser	Glu Val Leu Pro Gin	Ile Gin Glu Thr	Thr	Ala	Arg
	480	485			490
Ile Ile	Phe Asn Gly Lys Asp	Leu Asn Leu Val	Glu	Arg	Arg
	495	500
Ile Ala	Ala Val Asn Pro Ser	Asp Pro Leu Glu	Thr	Thr	Lys
505	510	515
Pro Asp	Met Thr Leu Lys Glu	Ala Leu Lys Ile	Ala	Phe	Gly
520	525		530
Phe Asn	Glu Pro Asn Gly Asn	Leu Gin Tyr Gin	Gly	Lys	Asp
	535	540		545
Ile Thr	Glu Phe Asp Phe Asn	Phe Asp Gin Gin	Thr	Ser	Gin
	550	555			560
Asn Ile	Lys Asn Gin Leu Ala	Glu Leu Asn Ala	Thr	Asn	Ile
	565	570
Tyr Thr	Val Leu Asp Lys Ile	Lys Leu Asn Ala	Lys	Met	Asn

575

580

585

Ile	Leu 590	Ile	Arg	Asp Lys Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn	Asn
595	600
Ile	Ala	Val	Gly	Ala Asp Glu Ser Val Val Lys	Glu Ala	His
		605	610	615
Arg	Glu	Val	Ile	Asn Ser Ser Thr Glu Gly Leu	Leu Leu	Asn
			620	625		630
Ile	Asp	Lys	Asp	Ile Arg Lys Ile Leu Ser Gly	Tyr Ile	Val
				635 640
Glu	Ile	Glu	Asp	Thr Glu Gly Leu Lys Glu Val	Ile Asn	Asp
645				650 655
Arg	Tyr	Asp	Met	Leu Asn Ile Ser Ser Leu Arg	Gin Asp	Gly
	660			665	670
Lys	Thr	Phe	Ile	Asp Phe Lys Lys Tyr Asn Asp	Lys Leu	Pro
		675		680	685
Leu	Tyr	Ile	Ser	Asn Pro Asn Tyr Lys Val Asn	Val Tyr	Ala
			690	695		700
Val	Thr	Lys	Glu	Asn Thr Ile Ile Asn Pro Ser	Glu Asn	Gly
				705 710
Asp	Thr	Ser	Thr	Asn Gly Ile Lys Lys Ile Leu	Ile Phe	Ser
715				720 725
Lys	Lys	Gly	Tyr	Glu Ile Gly Glx
	730			735

<210> 12 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 12

Glu Val Lys Gin Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ser 1 5 10

Ser Ser Gin Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Asn 15 20 25

00 ♦· *· 00 0 0 0 0 0

0 « 0 »

0 0 0 0 «

0 0 0 «

0000000 00 00··

Phe Gin 30

Ala

Pro

Met Val

Val 35

Thr

Ser

Ser

Thr Thr Gly 40

Asp

Leu

Ser

Ile

Pro

Ser

Ser

Glu

Leu

Glu

Asn

Ile

Pro

Ser

Glu

45

50

55

Asn

Gin

Tyr

Phe

Gin

Ser

Ala

Ile

Trp

Ser

Gly

Phe

Ile

Lys

60

65

70

Val

Lys

Lys

Ser

Asp

Glu

Tyr

Thr

Phe

Ala

Thr

Ser

Ala

Asp

75

80

Asn

His

Val

Thr

Met

Trp

Val

Asp

Asp

Gin

Glu

Val

Ile

Asn

85

90

95

Lys

Ala

Ser

Asn

Ser

Asn

Lys

Ile

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly

Arg

100

105

110

Leu

Tyr

Gin

Ile

Lys

Ile

Gin

Tyr

Gin

Arg

Glu

Asn

Pro

Thr

115

120

125

Glu

Lys

Gly

Leu

Asp

Phe

Lys

Leu

Tyr

Trp

Thr

Asp

Ser

Gin

130

135

140

Asn

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Leu

Gin

Leu

Pro

145

150

Glu

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Ser

Asn

Ser

Arg

Lys

Lys

Arg

Ser

155

160

165

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Asp

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

170

175

180

Ile

Pro

Asp

Ser

Leu

Glu

Val

Glu

Gly

Tyr

Thr

Val

Asp

Val

185

190

195

Lys

Asn

Lys

Arg

Thr

Phe

Leu

Ser

Pro

Trp

Ile

Ser

Asn

Ile

200

205

210

His

Glu

Lys

Lys

Gly

Leu

Thr

Lys

Tyr

Lys

Ser

Ser

Pro

Glu

215

220

Lys

Trp

Ser

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Tyr

Ser

Asp

Phe

Glu

Lys

225

230

235

Val

Thr

Gly

Arg

Ile

Asp

Lys

Asn

Val

Ser

Pro

Glu

Ala

Arg

240

245

250

His

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Tyr

Pro

Ile

Val

His

Val

Asp

Met

255

260

265 ··

♦ » · ·· · ·*

Glu	Asn	Ile	Ile 270	Leu	Ser	Lys	Asn Glu Asp 275	Gin	Ser	Thr	Gin 280
Asn	Thr	Asp	Ser	Glu	Thr	Arg	Thr Ile Ser	Lys	Asn	Thr	Ser
				285			290
Thr	Ser	Arg	Thr	His	Thr	Ser	Glu Val His	Gly	Asn	Ala	Glu
295					300			305
Val	His	Ala	Ser	Phe	Phe	Asp	Ile Gly Gly	Ser	Val	Ser	Ala
	310					315			320
Gly	Phe	Ser	Asn	Ser	Asn	Ser	Ser Thr Val	Ala	Ile	Asp	His
		325					330			335
Ser	Leu	Ser	Leu	Ala	Gly	Glu	Arg Thr Trp	Ala	Glu	Thr	Met
			340				345				350
Gly	Leu	Asn	Thr	Ala	Asp	Thr	Ala Arg Leu	Asn	Ala	Asn	Ile
				355			360
Arg	Tyr	Val	Asn	Thr	Gly	Thr	Ala Pro Ile	Tyr	Asn	Val	Leu
365					370			375
Pro	Thr	Thr	Ser	Leu	Val	Leu	Gly Lys Asn	Gin	Thr	Leu	Ala
	380					385			390
Thr	Ile	Lys	Ala	Lys	Glu	Asn	Gin Leu Ser	Gin	Ile	Leu	Ala
		395					400			405
Pro	Asn	Asn	Tyr	Tyr	Pro	Ser	Lys Asn Leu	Ala	Pro	Ile	Ala
			410				415				420
Leu	Asn	Ala	Gin	Asp	Asp	Phe	Ser Ser Thr	Pro	Ile	Thr	Met
				425			430
Asn	Tyr	Asn	Gin	Phe	Leu	Glu	Leu Glu Lys	Thr	Lys	Gin	Leu
435					440		445
Arg	Leu	Asp	Thr	Asp	Gin	Val	Tyr Gly Asn	Ile	Ala	Thr	Tyr
	450					455			460
Asn	Phe	Glu	Asn	Gly	Arg	Val	Arg Val Asp	Thr	Gly	Ser	Asn
		465				470			475
Trp	Ser	Glu	Val	Leu	Pro	Gin	Ile Gin Glu	Thr	Thr	Ala	Arg
			480				485				490
Ile	Ile	Phe	Asn	Gly	Lys	Asp	Leu Asn Leu	Val	Glu	Arg	Arg

495 500 ·· ·· • · ·

Ile

Ala

Ala

Val

Asn

Pro

Ser

Asp

Pro

Leu

Glu

Thr

Thr

Lys

505

510

515

Pro

Asp

Met

Thr

Leu

Lys

Glu

Ala

Leu

Lys

Ile

Ala

Phe

Gly

520

525

530

Phe

Asn

Glu

Pro

Asn

Gly

Asn

Leu

Gin

Tyr

Gin

Gly

Lys

Asp

535

540

545

Ile

Thr

Glu

Phe

Asp

Phe

Asn

Phe

Asp

Gin

Gin

Thr

Ser

Gin

550

555

560

Asn

Ile

Lys

Asn

Gin

Leu

Ala

Glu

Leu

Asn

Ala

Thr

Asn

Ile

565

570

Tyr

Thr

Val

Leu

Asp

Lys

Ile

Lys

Leu

Asn

Ala

Lys

Met

Asn

575

580

585

Ile

Leu

Ile

Arg

Asp

Lys

Arg

Phe

His

Tyr

Asp

Arg

Asn

Asn

590

595

600

Ile

Ala

Val

Gly

Ala

Asp

Glu

Ser

Val

Val

Lys

Glu

Ala

His

605

610

615

Arg

Glu

Val

Ile

Asn

Ser

Ser

Thr

Glu

Gly

Leu

Leu

Leu

Asn

620

625

630

Ile

Asp

Lys

Asp

Ile

Arg

Lys

Ile

Leu

Ser

Gly

Tyr

Ile

Val

635

640

Glu

Ile

Glu

Asp

Thr

Glu

Gly

Leu

Lys

Glu

Val

Ile

Asn

Asp

645

650

655

Arg

Tyr

Asp

Met

Leu

Asn

Ile

Ser

Ser

Leu

Arg

Gin

Asp

Gly

660

665

670

Lys

Thr

Phe

Ile

Asp

Phe

Lys

Lys

Tyr

Asn

Asp

Lys

Leu

Pro

675

680

685

Leu

Tyr

Ile

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr

Lys

Val

Asn

Val.

Tyr

Ala

690

695

700

Val

Thr

Lys

Glu

Asn

Thr

Ile

Ile

Asn

Pro

Ser

Glu

Asn

Gly

705

710

Asp

Thr

Ser

Thr

Asn

Gly

Ile

Lys

Lys

Ile

Leu

Ile

Phe

Ser

715

720

725

Lys

Lys

Gly

Tyr

Glu

Ile

Gly

Glx

730

735

<210> 13 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 13

Glu

Val

Lys

Gin

Glu

Asn

Arg

Leu

Leu

Asn

Glu

Ser

Glu

Ser

1

5

10

Ser

Ser

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Asp

Leu

Asn

15

20

25

Phe

Gin

Ala

Pro

Met

Val

Val

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Gly

Asp

30

35

40

Leu

Ser

Ile

Pro

Ser

Ser

Glu

Leu

Glu

Asn

Ile

Pro

Ser

Glu

45

50

55

Asn

Gin

Tyr

Phe

Gin

Ser

Ala

Ile

Trp

Ser

Gly

Phe

Ile

Lys

60

65

70

Val

Lys

Lys

Ser

Asp

Glu

Tyr

Thr

Phe

Ala

Thr

Ser

Ala

Asp

75

80

Asn

His

Val

Thr

Met

Trp

Val

Asp

Asp

Gin

Glu

Val

Ile

Asn

85

90

95

Lys

Ala

Ser

Asn

Ser

Asn

Lys

Ile

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly

Arg

100

105

110

Leu

Tyr

Gin

Ile

Lys

Ile

Gin

Tyr

Gin

Arg

Glu

Asn

Pro

Thr

115

120

125

Glu

Lys

Gly

Leu

Asp

Phe

Lys

Leu

Tyr

Trp

Thr

Asp

Ser

Gin

130

135

140

Asn

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Leu

Gin

Leu

Pro

145

150

Glu

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Ser

Asn

Ser

Arg

Lys

Lys

Arg

Ser

155

160

165

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Asp

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

170

175

180

Ile Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr Thr Val Asp Val

185

190

195

Lys

Asn

Lys

Arg

Thr

Phe

Leu

Ser

Pro

Trp

Ile

Ser

Asn

Ile

200

205

210

His

Glu

Lys

Lys

Gly

Leu

Thr

Lys

Tyr

Lys

Ser

Ser

Pro

Glu

215

220

Lys

Trp

Ser

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Tyr

Ser

Asp

Phe

Glu

Lys

225

230

235

Val

Thr

Gly

Arg

Ile

Asp

Lys

Asn

Val

Ser

Pro

Glu

Ala

Arg

240

245

250

His

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Tyr

Pro

Ile

Val

His

Val

Asp

Met

255

260

265

Glu

Asn

Ile

Ile

Leu

Ser

Lys

Asn

Glu

Asp

Gin

Ser

Thr

Gin

270

275

280

Asn

Thr

Asp

Ser

Glu

Thr

Arg

Thr

Ile

Ser

Lys

Asn

Thr

Ser

285

290

Thr

Ser

Arg

Thr

His

Thr

Ser

Glu

Val

His

Gly

Asn

Ala

Glu

295

300

305

Val

His

Ala

Ser

Phe

Phe

Asp

Ile

Gly

Gly

Ser

Val

Ser

Ala

310

315

320

Gly

Phe

Ser

Asn

Ser

Asn

Ser

Ser

Thr

Val

Ala

Ile

Asp

His

325

330

335

Ser

Leu

Ser

Leu

Ala

Gly

Glu

Arg

Thr

Trp

Ala

Glu

Thr

Met

340

345

350

Gly

Leu

Asn

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

Arg

Leu

Asn

Ala

Asn

Ile

355

360

Arg

Tyr

Val

Asn

Thr

Gly

Thr

Ala

Pro

Ile

Tyr

Asn

Val

Leu

365

370

375

Pro

Thr

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Gly

Lys

Asn

Gin

Thr

Leu

Ala

380

385

390

Thr

Ile

Lys

Ala

Lys

Glu

Asn

Gin

Leu

Ser

Gin

Ile

Leu

Ala

395

400

405

Pro

Asn

Asn

Tyr

Tyr

Pro

Ser

Lys

Asn

Leu

Ala

Pro

Ile

Ala

410 415 420

Leu Asn Ala Gin Asp Asp Phe Ser Ser Thr Pro Ile Thr Met

425 430

Asn Tyr Asn Gin Phe Leu

Glu

Leu

Glu

Lys

Thr 445

Lys

Gin

Leu

435

440

Arg

Leu

Asp

Thr

Asp

Gin

Val

Tyr

Gly

Asn

Ile

Ala

Thr

Tyr

450

455

460

Asn

Phe

Glu

Asn

Gly

Arg

Val

Arg

Val

Asp

Thr

Gly

Ser

Asn

465

470

475

Trp

Ser

Glu

Val

Leu

Pro

Gin

Ile

Gin

Glu

Thr

Thr

Ala

Arg

480

485

490

Ile

Ile

Phe

Asn

Gly

Lys

Asp

Leu

Asn

Leu

Val

Glu

Arg

Arg

495

500

Ile

Ala

Ala

Val

Asn

Pro

Ser

Asp

Pro

Leu

Glu

Thr

Thr

Lys

505

510

515

Pro

Asp

Met

Thr

Leu

Lys

Glu

Ala

Leu

Lys

Ile

Ala

Phe

Gly

520

525

530

Phe

Asn

Glu

Pro

Asn

Gly

Asn

Leu

Gin

Tyr

Gin

Gly

Lys

Asp

535

540

545

Ile

Thr

Glu

Phe

Asp

Phe

Asn

Phe

Asp

Gin

Gin

Thr

Ser

Gin

550

555

560

Asn

Ile

Lys

Asn

Gin

Leu

Ala

Glu

Leu

Asn

Ala

Thr

Asn

Ile

565

570

Tyr

Thr

Val

Leu

Asp

Lys

Ile

Lys

Leu

Asn

Ala

Lys

Met

Asn

575

580

585

Ile

Leu

Ile

Arg

Asp

Lys

Arg

Phe

His

Tyr

Asp

Arg

Asn

Asn

590

595

600

Ile

Ala

Val

Gly

Ala

Asp

Glu

Ser

Val

Val

Lys

Glu

Ala

His

605

610

615

Arg

Glu

Val

Ile

Asn

Ser

Ser

Thr

Glu

Gly

Leu

Leu

Leu

Asn

620

625

630

Ile

Asp

Lys

Asp

Ile

Arg

Lys

Ile

Leu

Ser

Gly

Tyr

Ile

Val

635

640

Glu

Ile

Glu

Asp

Thr

Glu

Gly

Leu

Lys

Glu

Val

Ile

Asn

Asp

645

650

655

Arg

Tyr

Asp

Met

Leu

Asn

Ile

Ser

Ser

Leu

Arg

Gin

Asp

Gly

660

665

670

Lys

Thr

Phe

Ile

Asp

Phe

Lys

Lys

Tyr

Asn

Asp

Lys

Leu

Pro

675

680

685

Leu

Tyr

Ile

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr

Lys

Val

Asn

Val

Tyr

Ala

690

695

700

Val

Thr

Lys

Glu

Asn

Thr

Ile

Ile

Asn

Pro

Ser

Glu

Asn

Gly

705

710

Asp

Thr

Ser

Thr

Asn

Gly

Ile

Lys

Lys

Ile

Leu

Ile

Phe

Ser

715

720

725

Lys

Lys

Gly

Tyr

Glu

Ile

Gly

Glx

730

735

<210> 14 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 14

Glu Val Lys Gin Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ser 15 10

Ser Ser Gin Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Asn

20 25

Phe Gin Ala Pro Met Val Val Thr Ser Ser Thr Thr Gly Asp

35 40

Leu Ser Ile Pro Ser Ser Glu Leu Glu Asn Ile Pro Ser Glu

50 55

Asn Gin Tyr Phe Gin Ser Ala Ile Trp Ser Gly Phe Ile Lys

65 70

Val Lys Lys Ser Asp Glu Tyr Thr Phe Ala Thr Ser Ala Asp

80

Asn His Val Thr Met Trp Val Asp Asp Gin Glu Val Ile Asn

90 95

Lys Ala Ser Asn Ser Asn Lys Ile Arg Leu Glu Lys Gly Arg

100 105 110 a · · · • · · · · * • · » · · ······· ·· ···

Leu Tyr

Gin 115

Ile

Lys

Ile Gin

Tyr Gin Arg Glu Asn Pro

Thr

120

125

Glu

Lys

Gly

Leu

Asp

Phe

Lys

Leu

Tyr

Trp

Thr

Asp

Ser

Gin

130

135

140

Asn

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Leu

Gin

Leu

Pro

145

150

Glu

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Ser

Asn

Ser

Arg

Lys

Lys

Arg

Ser

155

160

165

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Asp

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

170

175

180

Ile

Pro

Asp

Ser

Leu

Glu

Val

Glu

Gly

Tyr

Thr

Val

Asp

Val

185

190

195

Lys

Asn

Lys

Arg

Thr

Phe

Leu

Ser

Pro

Trp

Ile

Ser

Asn

Ile

200

205

210

His

Glu

Lys

Lys

Gly

Leu

Thr

Lys

Tyr

Lys

Ser

Ser

Pro

Glu

215

220

Lys

Trp

Ser

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Tyr

Ser

Asp

Phe

Glu

Lys

225

230

235

Val

Thr

Gly

Arg

Ile

Asp

Lys

Asn

Val

Ser

Pro

Glu

Ala

Arg

240

245

250

His

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Tyr

Pro

Ile

Val

His

Val

Asp

Met

255

260

265

Glu

Asn

Ile

Ile

Leu

Ser

Lys

Asn

Glu

Asp

Gin

Ser

Thr

Gin

270

275

280

Asn

Thr

Asp

Ser

Glu

Thr

Arg

Thr

Ile

Ser

Lys

Asn

Thr

Ser

285

290

Thr

Ser

Arg

Thr

His

Thr

Ser

Glu

Val

His

Gly

Asn

Ala

Glu

295

300

305

Val

His

Ala

Ser

Phe

Phe

Asp

Ile

Gly

Gly

Ser

Val

Ser

Ala

310

315

320

Gly

Phe

Ser

Asn

Ser

Asn

Ser

Ser

Thr

Val

Ala

Ile

Asp

His

325

330

335

Ser

Leu

Ser

Leu

Ala

Gly

Glu Arg

Thr

Trp

Ala

Glu

Thr

Met

340 345 350

Gly Leu	Asn Thr Ala 355	Asp	Thr Ala Arg Leu Asn Ala Asn 360	Ile
Arg Tyr	Val Asn Thr	Gly	Thr Ala Pro Ile Tyr Asn Val	Leu
365		370	375
Pro Thr	Thr Ser Leu	Val	Leu Gly Lys Asn Gin Thr Leu	Ala
380			385 390
Thr Ile	Lys Ala Lys	Glu	Asn Gin Leu Ser Gin Ile Leu	Ala
	395		400 405
Pro Asn	Asn Tyr Tyr	Pro	Ser Lys Asn Leu Ala Pro Ile	Ala
	410		415	420
Leu Asn	Ala Gin Asp	Asp	Phe Ser Ser Thr Pro Ile Thr	Met
	425		430
Asn Tyr	Asn Gin Phe	Leu	Glu Leu Glu Lys Thr Lys Gin	Leu
435		440	445
Arg Leu	Asp Thr Asp	Gin	Val Tyr Gly Asn Ile Ala Thr	Tyr
450			455 460
Asn Phe	Glu Asn Gly	Arg	Val Arg Val Asp Thr Gly Ser	Asn
	465		470 475
Trp Ser	Glu Val Leu	Pro	Gin Ile Gin Glu Thr Thr Ala	Arg
	480		485	490
Ile Ile	Phe Asn Gly	Lys	Asp Leu Asn Leu Val Glu Arg	Arg
	495		500
Ile Ala	Ala Val Asn	Pro	Ser Asp Pro Leu Glu Thr Thr	Lys
505		510	515
Pro Asp	Met Thr Leu	Lys	Glu Ala Leu Lys Ile Ala Phe	Gly
520			525 530
Phe Asn	Glu Pro Asn	Gly	Asn Leu Gin Tyr Gin Gly Lys	Asp
	535		540 545
Ile Thr	Glu Phe Asp	Phe	Asn Phe Asp Gin Gin Thr Ser	Gin
	550		555	560
Asn Ile	Lys Asn Gin	Leu	Ala Glu Leu Asn Ala Thr Asn	Ile
	565		570
Tyr Thr	Val Leu Asp	Lys	Ile Lys Leu Asn Ala Lys Met	Asn
575		580	585

Ile Leu 590

Ile

Arg

Asp Lys Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn

Asn

595

600

Ile

Ala

Val

Gly

Ala

Asp

Glu

Ser

Val

Val

Lys

Glu

Ala

His

605

610

615

Arg

Glu

Val

Ile

Asn

Ser

Ser

Thr

Glu

Gly

Leu

Leu

Leu

Asn

620

625

630

Ile

Asp

Lys

Asp

Ile

Arg

Lys

Ile

Leu

Ser

Gly

Tyr

Ile

Val

635

640

Glu

Ile

Glu

Asp

Thr

Glu

Gly

Leu

Lys

Glu

Val

Ile

Asn

Asp

645

650

655

Arg

Tyr

Asp

Met

Leu

Asn

Ile

Ser

Ser

Leu

Arg

Gin

Asp

Gly

660

665

670

Lys

Thr

Phe

Ile

Asp

Phe

Lys

Lys

Tyr

Asn

Asp

Lys

Leu

Pro

675

680

685

Leu

Tyr

Ile

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr

Lys

Val

Asn

Val

Tyr

Ala

690

695

700

Val

Thr

Lys

Glu

Asn

Thr

Ile

Ile

Asn

Pro

Ser

Glu

Asn

Gly

705

710

Asp

Thr

Ser

Thr

Asn

Gly

Ile

Lys

Lys

Ile

Leu

Ile

Phe

Ser

715

720

725

Lys

Lys

Gly

Tyr

Glu

Ile

Gly

Glx

730 735 <210> 15 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 15

Glu Val Lys Gin Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ser 15 10

Ser Ser Gin Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Asn 20 • · · · * ··«···· ·♦ ····

Phe Gin Ala 30

Pro

Met

Val Val 35

Thr Ser Ser

Thr

Thr 40

Gly

Asp

Leu

Ser

Ile

Pro

Ser

Ser

Glu

Leu

Glu

Asn

Ile

Pro

Ser

Glu

45

50

55

Asn

Gin

Tyr

Phe

Gin

Ser

Ala

Ile

Trp

Ser

Gly

Phe

Ile

Lys

60

65

70

Val

Lys

Lys

Ser

Asp

Glu

Tyr

Thr

Phe

Ala

Thr

Ser

Ala

Asp

75

80

Asn

His

Val

Thr

Met

Trp

Val

Asp

Asp

Gin

Glu

Val

Ile

Asn

85

90

95

Lys

Ala

Ser

Asn

Ser

Asn

Lys

Ile

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly

Arg

100

105

110

Leu

Tyr

Gin

Ile

Lys

Ile

Gin

Tyr

Gin

Arg

Glu

Asn

Pro

Thr

115

120

125

Glu

Lys

Gly

Leu

Asp

Phe

Lys

Leu

Tyr

Trp

Thr

Asp

Ser

Gin

130

135

140

Asn

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Leu

Gin

Leu

Pro

145

150

Glu

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Ser

Asn

Ser

Arg

Lys

Lys

Arg

Ser

155

160

165

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Asp

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

170

175

180

Ile

Pro

Asp

Ser

Leu

Glu

Val

Glu

Gly

Tyr

Thr

Val

Asp

Val

185

190

195

Lys

Asn

Lys

Arg

Thr

Phe

Leu

Ser

Pro

Trp

Ile

Ser

Asn

Ile

200

205

210

His

Glu

Lys

Lys

Gly

Leu

Thr

Lys

Tyr

Lys

Ser

Ser

Pro

Glu

215

220

Lys

Trp

Ser

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Tyr

Ser

Asp

Phe

Glu

Lys

225

230

235

Val

Thr

Gly

Arg

Ile

Asp

Lys

Asn

Val

Ser

Pro

Glu

Ala

Arg

240

245

250

His

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Tyr

Pro

Ile

Val

His

Val

Asp

Met

255 260 265

Glu Asn

Ile

Ile 270

Leu Ser Lys

Asn Glu Asp 275

Gin

Ser

Thr

Gin 280

Asn

Thr

Asp

Ser

Glu

Thr

Arg

Thr

Ile

Ser

Lys

Asn

Thr

Ser

285

290

Thr

Ser

Arg

Thr

His

Thr

Ser

Glu

Val

His

Gly

Asn

Ala

Glu

295

300

305

Val

His

Ala

Ser

Phe

Phe

Asp

Ile

Gly

Gly

Ser

Val

Ser

Ala

310

315

320

Gly

Phe

Ser

Asn

Ser

Asn

Ser

Ser

Thr

Val

Ala

Ile

Asp

His

325

330

335

Ser

Leu

Ser

Leu

Ala

Gly

Glu

Arg

Thr

Trp

Ala

Glu

Thr

Met

340

345

350

Gly

Leu

Asn

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

Arg

Leu

Asn

Ala

Asn

Ile

355

360

Arg

Tyr

Val

Asn

Thr

Gly

Thr

Ala

Pro

Ile

Tyr

Asn

Val

Leu

365

370

375

Pro

Thr

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Gly

Lys

Asn

Gin

Thr

Leu

Ala

380

385

390

Thr

Ile

Lys

Ala

Lys

Glu

Asn

Gin

Leu

Ser

Gin

Ile

Leu

Ala

395

400

405

Pro

Asn

Asn

Tyr

Tyr

Pro

Ser

Lys

Asn

Leu

Ala

Pro

Ile

Ala

410

415

420

Leu

Asn

Ala

Gin

Asp

Asp

Phe

Ser

Ser

Thr

Pro

Ile

Thr

Met

425

430

Asn

Tyr

Asn

Gin

Phe

Leu

Glu

Leu

Glu

Lys

Thr

Lys

Gin

Leu

435

440

445

Arg

Leu

Asp

Thr

Asp

Gin

Val

Tyr

Gly

Asn

Ile

Ala

Thr

Tyr

450

455

460

Asn

Phe

Glu

Asn

Gly

Arg

Val

Arg

Val

Asp

Thr

Gly

Ser

Asn

465

470

475

Trp

Ser

Glu

Val

Leu

Pro

Gin

Ile

Gin

Glu

Thr

Thr

Ala

Arg

480

485

490

Ile

Ile

Phe

Asn

Gly

Lys

Asp

Leu

Asn

Leu

Val

Glu

Arg

Arg

495

500

Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Glu Thr Thr

Lys

505

510

515

Pro

Asp

Met

Thr

Leu

Lys

Glu

Ala

Leu

Lys

Ile

Ala

Phe

Gly

520

525

530

Phe

Asn

Glu

Pro

Asn

Gly

Asn

Leu

Gin

Tyr

Gin

Gly

Lys

Asp

535

540

545

Ile

Thr

Glu

Phe

Asp

Phe

Asn

Phe

Asp

Gin

Gin

Thr

Ser

Gin

550

555

560

Asn

Ile

Lys

Asn

Gin

Leu

Ala

Glu

Leu

Asn

Ala

Thr

Asn

Ile

565

570

Tyr

Thr

Val

Leu

Asp

Lys

Ile

Lys

Leu

Asn

Ala

Lys

Met

Asn

575

580

585

Ile

Leu

Ile

Arg

Asp

Lys

Arg

Phe

His

Tyr

Asp

Arg

Asn

Asn

590

595

600

Ile

Ala

Val

Gly

Ala

Asp

Glu

Ser

Val

Val

Lys

Glu

Ala

His

605

610

615

Arg

Glu

Val

Ile

Asn

Ser

Ser

Thr

Glu

Gly

Leu

Leu

Leu

Asn

620

625

630

Ile

Asp

Lys

Asp

Ile

Arg

Lys

Ile

Leu

Ser

Gly

Tyr

Ile

Val

635

640

Glu

Ile

Glu

Asp

Thr

Glu

Gly

Leu

Lys

Glu

Val

Ile

Asn

Asp

645

650

655

Arg

Tyr

Asp

Met

Leu

Asn

Ile

Ser

Ser

Leu

Arg

Gin

Asp

Gly

660

665

670

Lys

Thr

Phe

Ile

Asp

Phe

Lys

Lys

Tyr

Asn

Asp

Lys

Leu

Pro

675

680

685

Leu

Tyr

Ile

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr

Lys

Val

Asn

Val

Tyr

Ala

690

695

700

Val

Thr

Lys

Glu

Asn

Thr

Ile

Ile

Asn

Pro

Ser

Glu

Asn

Gly

705

710

Asp

Thr

Ser

Thr

Asn

Gly

Ile

Lys

Lys

Ile

Leu

Ile

Phe

Ser

715

720

725

Lys

Lys

Gly

Tyr

Glu

Ile

Gly

Glx

730 735 <210> 16 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 16

Glu

Val

Lys

Gin

Glu

Asn

Arg

Leu

Leu

Asn

Glu

Ser

Glu

Ser

1

5

10

Ser

Ser

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Asp

Leu

Asn

15

20

25

Phe

Gin

Ala

Pro

Met

Val

Val

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Gly

Asp

30

35

40

Leu

Ser

Ile

Pro

Ser

Ser

Glu

Leu

Glu

Asn

Ile

Pro

Ser

Glu

45

50

55

Asn

Gin

Tyr

Phe

Gin

Ser

Ala

Ile

Trp

Ser

Gly

Phe

Ile

Lys

60

65

70

Val

Lys

Lys

Ser

Asp

Glu

Tyr

Thr

Phe

Ala

Thr

Ser

Ala

Asp

75

80

Asn

His

Val

Thr

Met

Trp

Val

Asp

Asp

Gin

Glu

Val

Ile

Asn

85

90

95

Lys

Ala

Ser

Asn

Ser

Asn

Lys

Ile

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly

Arg

100

105

110

Leu

Tyr

Gin

Ile

Lys

Ile

Gin

Tyr

Gin

Arg

Glu

Asn

Pro

Thr

115

120

125

Glu

Lys

Gly

Leu

Asp

Phe

Lys

Leu

Tyr

Trp

Thr

Asp

Ser

Gin

130

135

140

Asn

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Leu

Gin

Leu

Pro

145

150

Glu

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Ser

Asn

Ser

Arg

Lys

Lys

Arg

Ser

155

160

165

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Asp

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

170 175 180

Ile Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu Gly Tyr Thr Val Asp Val

9Ί

185 190 195

Lys Asn Lys Arg Thr Phe Leu Ser Pro Trp	Ile	Ser	Asn	Ile 210
	200	205
His Glu	Lys Lys Gly	Leu Thr Lys Tyr Lys	Ser	Ser	Pro	Glu
	215	220
Lys Trp	Ser Thr Ala	Ser Asp Pro Tyr Ser	Asp	Phe	Glu	Lys
225		230	235
Val Thr	Gly Arg Ile	Asp Lys Asn Val Ser	Pro	Glu	Ala	Arg
240		245		250
His Pro	Leu Val Ala	Ala Tyr Pro Ile Val	His	Val	Asp	Met
	255	260			265
Glu Asn	Ile Ile Leu	Ser Lys Asn Glu Asp	Gin	Ser	Thr	Gin
	270	275				280
Asn Thr	Asp Ser Glu	Thr Arg Thr Ile Ser	Lys	Asn	Thr	Ser
	285	290
Thr Ser	Arg Thr His	Thr Ser Glu Val His	Gly	Asn	Ala	Glu
295		300	305
Val His	Ala Ser Phe	Phe Asp Ile Gly Gly	Ser	Val	Ser	Ala
310		315		320
Gly Phe	Ser Asn Ser	Asn Ser Ser Thr Val	Ala	Ile	Asp	His
	325	330			335
Ser Leu	Ser Leu Ala	Gly Glu Arg Thr Trp	Ala	Glu	Thr	Met
	340	345				350
Gly Leu	Asn Thr Ala	Asp Thr Ala Arg Leu	Asn	Ala	Asn	Ile
	355	360
Arg Tyr	Val Asn Thr	Gly Thr Ala Pro Ile	Tyr	Asn	Val	Leu
365		370	375
Pro Thr	Thr Ser Leu	Val Leu Gly Lys Asn	Gin	Thr	Leu	Ala
380		385		390
Thr Ile	Lys Ala Lys	Glu Asn Gin Leu Ser	Gin	Ile	Leu	Ala
	395	400			405
Pro Asn	Asn Tyr Tyr	Pro Ser Lys Asn Leu	Ala	Pro	Ile	Ala
	410	415				420

Leu Asn Ala Gin Asp Asp Phe Ser Ser Thr Pro Ile Thr Met

425 430

Asn

Tyr

Asn

Gin

Phe

Leu

Glu

Leu

Glu

Lys

Thr

Lys

Gin

Leu

435

440

445

Arg

Leu

Asp

Thr

Asp

Gin

Val

Tyr

Gly

Asn

Ile

Ala

Thr

Tyr

450

455

460

Asn

Phe

Glu

Asn

Gly

Arg

Val

Arg

Val

Asp

Thr

Gly

Ser

Asn

465

470

475

Trp

Ser

Glu

Val

Leu

Pro

Gin

Ile

Gin

Glu

Thr

Thr

Ala

Arg

480

485

490

Ile

Ile

Phe

Asn

Gly

Lys

Asp

Leu

Asn

Leu

Val

Glu

Arg

Arg

495

500

Ile

Ala

Ala

Val

Asn

Pro

Ser

Asp

Pro

Leu

Glu

Thr

Thr

Lys

505

510

515

Pro

Asp

Met

Thr

Leu

Lys

Glu

Ala

Leu

Lys

Ile

Ala

Phe

Gly

520

525

530

Phe

Asn

Glu

Pro

Asn

Gly

Asn

Leu

Gin

Tyr

Gin

Gly

Lys

Asp

535

540

545

Ile

Thr

Glu

Phe

Asp

Phe

Asn

Phe

Asp

Gin

Gin

Thr

Ser

Gin

550

555

560

Asn

Ile

Lys

Asn

Gin

Leu

Ala

Glu

Leu

Asn

Ala

Thr

Asn

Ile

565

570

Tyr

Thr

Val

Leu

Asp

Lys

Ile

Lys

Leu

Asn

Ala

Lys

Met

Asn

575

580

585

Ile

Leu

Ile

Arg

Asp

Lys

Arg

Phe

His

Tyr

Asp

Arg

Asn

Asn

590

595

600

Ile

Ala

Val

Gly

Ala

Asp

Glu

Ser

Val

Val

Lys

Glu

Ala

His

605

610

615

Arg

Glu

Val

Ile

Asn

Ser

Ser

Thr

Glu

Gly

Leu

Leu

Leu

Asn

620

625

630

Ile

Asp

Lys

Asp

Ile

Arg

Lys

Ile

Leu

Ser

Gly

Tyr

Ile

Val

635

640

Glu

Ile

Glu

Asp

Thr

Glu

Gly

Leu

Lys

Glu

Val

Ile

Asn

Asp

645

650

655

Arg

Tyr

Asp

Met

Leu

Asn

Ile

Ser

Ser

Leu

Arg

Gin

Asp

Gly

• · • « ·· ♦ « • · • 99 ·· ·· * 9 · ♦ ♦ · • · ·

9 9

9999

660

665

670

Lys

Thr

Phe

Ile

Asp

Phe

Lys

Lys

Tyr

Asn

Asp

Lys

Leu

Pro

675

680

685

Leu

Tyr

Ile

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr

Lys

Val

Asn

Val

Tyr

Ala

690

695

700

Val

Thr

Lys

Glu

Asn

Thr

Ile

Ile

Asn

Pro

Ser

Glu

Asn

Gly

705

710

Asp

Thr

Ser

Thr

Asn

Gly

Ile

Lys

Lys

Ile

Leu

Ile

Phe

Ser

715

720

725

Lys

Lys

Gly

Tyr

Glu

Ile

Gly

Glx

730

735 <210> 17 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 17

Glu Val Lys Gin Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser Glu Ser 15 10

Ser Ser Gin Gly Leu Leu Gly Tyr Tyr Phe Ser Asp Leu Asn

20 25

Phe Gin Ala Pro Met Val Val Thr Ser Ser Thr Thr Gly Asp

35 40

Leu Ser Ile Pro Ser Ser Glu Leu Glu Asn Ile Pro Ser Glu

50 55

Asn Gin Tyr Phe Gin Ser Ala Ile Trp Ser Gly Phe Ile Lys

65 70

Val Lys Lys Ser Asp Glu Tyr Thr Phe Ala Thr Ser Ala Asp

80

Asn His Val Thr Met Trp Val Asp Asp Gin Glu Val Ile Asn

90 95

Lys Ala Ser Asn Ser Asn Lys Ile Arg Leu Glu Lys Gly Arg

100 105 110

100

Leu Tyr Gin 115

Ile

Lys

Ile Gin

Tyr Gin Arg 120

Glu

Asn

Pro 125

Thr

Glu

Lys

Gly

Leu

Asp

Phe

Lys

Leu

Tyr

Trp

Thr

Asp

Ser

Gin

130

135

140

Asn

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Leu

Gin

Leu

Pro

145

150

Glu

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Ser

Asn

Ser

Arg

Lys

Lys

Arg

Ser

155

160

165

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Asp

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

170

175

180

Ile

Pro

Asp

Ser

Leu

Glu

Val

Glu

Gly

Tyr

Thr

Val

Asp

Val

185

190

195

Lys

Asn

Lys

Arg

Thr

Phe

Leu

Ser

Pro

Trp

Ile

Ser

Asn

Ile

200

205

210

His

Glu

Lys

Lys

Gly

Leu

Thr

Lys

Tyr

Lys

Ser

Ser

Pro

Glu

215

220

Lys

Trp

Ser

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Tyr

Ser

Asp

Phe

Glu

Lys

225

230

235

Val

Thr

Gly

Arg

Ile

Asp

Lys

Asn

Val

Ser

Pro

Glu

Ala

Arg

240

245

250

His

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Tyr

Pro

Ile

Val

His

Val

Asp

Met

255

260

265

Glu

Asn

Ile

Ile

Leu

Ser

Lys

Asn

Glu

Asp

Gin

Ser

Thr

Gin

270

275

280

Asn

Thr

Asp

Ser

Glu

Thr

Arg

Thr

Ile

Ser

Lys

Asn

Thr

Ser

285

290

Thr

Ser

Arg

Thr

His

Thr

Ser

Glu

Val

His

Gly

Asn

Ala

Glu

295

300

305

Val

His

Ala

Ser

Phe

Phe

Asp

Ile

Gly

Gly

Ser

Val

Ser

Ala

310

315

320

Gly

Phe

Ser

Asn

Ser

Asn

Ser

Ser

Thr

Val

Ala

Ile

Asp

His

325

330

335

Ser

Leu

Ser

Leu

Ala

Gly

Glu Arg

Thr

Trp

Ala

Glu

Thr

Met

340

345

350

101 ·· ·· • · · • · · • · · • « · · · ·

Gly Leu Asn Thr Ala Asp Thr Ala Arg Leu Asn Ala Asn

Ile

355

360

Arg

Tyr

Val

Asn

Thr

Gly

Thr

Ala

Pro

Ile

Tyr

Asn

Val

Leu

365

370

375

Pro

Thr

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Gly

Lys

Asn

Gin

Thr

Leu

Ala

380

385

390

Thr

Ile

Lys

Ala

Lys

Glu

Asn

Gin

Leu

Ser

Gin

Ile

Leu

Ala

395

400

405

Pro

Asn

Asn

Tyr

Tyr

Pro

Ser

Lys

Asn

Leu

Ala

Pro

Ile

Ala

410

415

420

Leu

Asn

Ala

Gin

Asp

Asp

Phe

Ser

Ser

Thr

Pro

Ile

Thr

Met

425

430

Asn

Tyr

Asn

Gin

Phe

Leu

Glu

Leu

Glu

Lys

Thr

Lys

Gin

Leu

435

440

445

Arg

Leu

Asp

Thr

Asp

Gin

Val

Tyr

Gly

Asn

Ile

Ala

Thr

Tyr

450

455

460

Asn

Phe

Glu

Asn

Gly

Arg

Val

Arg

Val

Asp

Thr

Gly

Ser

Asn

465

470

475

Trp

Ser

Glu

Val

Leu

Pro

Gin

Ile

Gin

Glu

Thr

Thr

Ala

Arg

480

485

490

Ile

Ile

Phe

Asn

Gly

Lys

Asp

Leu

Asn

Leu

Val

Glu

Arg

Arg

495

500

Ile

Ala

Ala

Val

Asn

Pro

Ser

Asp

Pro

Leu

Glu

Thr

Thr

Lys

505

510

515

Pro

Asp

Met

Thr

Leu

Lys

Glu

Ala

Leu

Lys

Ile

Ala

Phe

Gly

520

525

530

Phe

Asn

Glu

Pro

Asn

Gly

Asn

Leu

Gin

Tyr

Gin

Gly

Lys

Asp

535

540

545

Ile

Thr

Glu

Phe

Asp

Phe

Asn

Phe

Asp

Gin

Gin

Thr

Ser

Gin

550

555

560

Asn

Ile

Lys

Asn

Gin

Leu

Ala

Glu

Leu

Asn

Ala

Thr

Asn

Ile

565

570

Tyr

Thr

Val

Leu

Asp

Lys

Ile

Lys

Leu

Asn

Ala

Lys

Met

Asn

575

580

585

102

·♦ ·· » · ·

Ile Leu Ile Arg Asp Lys Arg Phe His Tyr Asp Arg Asn Asn 590 595 600

Ile Ala Val Gly Ala Asp Glu Ser Val Val Lys Glu Ala His

605

610

615

Arg

Glu

Val

Ile

Asn

Ser

Ser

Thr

Glu

Gly

Leu

Leu

Leu

Asn

620

625

630

Ile

Asp

Lys

Asp

Ile

Arg

Lys

Ile

Leu

Ser

Gly

Tyr

Ile

Val

635

640

Glu

Ile

Glu

Asp

Thr

Glu

Gly

Leu

Lys

Glu

Val

Ile

Asn

Asp

645

650

655

Arg

Tyr

Asp

Met

Leu

Asn

Ile

Ser

Ser

Leu

Arg

Gin

Asp

Gly

660

665

670

Lys

Thr

Phe

Ile

Asp

Phe

Lys

Lys

Tyr

Asn

Asp

Lys

Leu

Pro

675

680

685

Leu

Tyr

Ile

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr

Lys

Val

Asn

Val

Tyr

Ala

690

695

700

Val

Thr

Lys

Glu

Asn

Thr

Ile

Ile

Asn

Pro

Ser

Glu

Asn

Gly

705

710

Asp

Thr

Ser

Thr

Asn

Gly

Ile

Lys

Lys

Ile

Leu

Ile

Phe

Ser

715

720

725

Lys

Lys

Gly

Tyr

Glu

Ile

Gly

Glx

730 735 <210> 18 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 18

Glu 1

Val

Lys Gin Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser

Glu Ser

5

10

Ser

Ser

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Asp

Leu

Asn

15

20

25

Phe

Gin

Ala

Pro

Met

Val

Val

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Gly

Asp

103 ·♦ ** * * *

30

35

40

Leu

Ser

Ile

Pro

Ser

Ser

Glu

Leu

Glu

Asn

Ile

Pro

Ser

Glu

45

50

55

Asn

Gin

Tyr

Phe

Gin

Ser

Ala

Ile

Trp

Ser

Gly

Phe

Ile

Lys

60

65

70

Val

Lys

Lys

Ser

Asp

Glu

Tyr

Thr

Phe

Ala

Thr

Ser

Ala

Asp

75

80

Asn

His

Val

Thr

Met

Trp

Val

Asp

Asp

Gin

Glu

Val

Ile

Asn

85

90

95

Lys

Ala

Ser

Asn

Ser

Asn

Lys

Ile

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly

Arg

100

105

110

Leu

Tyr

Gin

Ile

Lys

Ile

Gin

Tyr

Gin

Arg

Glu

Asn

Pro

Thr

115

120

125

Glu

Lys

Gly

Leu

Asp

Phe

Lys

Leu

Tyr

Trp

Thr

Asp

Ser

Gin

130

135

140

Asn

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Leu

Gin

Leu

Pro

145

150

Glu

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Ser

Asn

Ser

Arg

Lys

Lys

Arg

Ser

155

160

165

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Asp

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

170

175

180

Ile

Pro

Asp

Ser

Leu

Glu

Val

Glu

Gly

Tyr

Thr

Val

Asp

Val

185

190

195

Lys

Asn

Lys

Arg

Thr

Phe

Leu

Ser

Pro

Trp

Ile

Ser

Asn

Ile

200

205

210

His

Glu

Lys

Lys

Gly

Leu

Thr

Lys

Tyr

Lys

Ser

Ser

Pro

Glu

215

220

Lys

Trp

Ser

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Tyr

Ser

Asp

Phe

Glu

Lys

225

230

235

Val

Thr

Gly

Arg

Ile

Asp

Lys

Asn

Val

Ser

Pro

Glu

Ala

Arg

240

245

250

His

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Tyr

Pro

Ile

Val

His

Val

Asp

Met

255

260

265

Glu

Asn

Ile

Ile

Leu

Ser

Lys

Asn

Glu

Asp

Gin

Ser

Thr

Gin

104

• *

Asn

Thr

295

Val

Gly

Ser

Gly

Arg

365

Pro

Thr

Pro

Leu

Asn

435

Arg

Asn

Trp

Ile

270

Thr Asp Ser Glu Thr 285

Ser Arg Thr His Thr 300

His Ala Ser Phe Phe

310

Phe Ser Asn Ser Asn

325

Leu Ser Leu Ala Gly 340

Leu Asn Thr Ala Asp 355

Tyr Val Asn Thr Gly 370

Thr Thr Ser Leu Val

380

Ile Lys Ala Lys Glu 395

Asn Asn Tyr Tyr Pro 410

Asn Ala Gin Asp Asp 425

Tyr Asn Gin Phe Leu 440

Leu Asp Thr Asp Gin 450

Phe Glu Asn Gly Arg 465

Ser Glu Val Leu Pro

480

Ile Phe Asn Gly Lys 495

Arg Thr

Ser Glu

Asp Ile 315

Ser Ser

330 Glu Arg

Thr Ala Arg

Thr Ala Pro

Leu Gly Lys 385

Asn Gin Leu

400

Ser Lys Asn 415

Phe Ser Ser

Glu Leu Glu

Val Tyr Gly 455

Val Arg Val 470

Gin Ile Gin

485

Asp Leu Asn

275 280

Ile Ser Lys Asn Thr Ser 290

Val His Gly Asn Ala Glu 305

Gly Gly Ser Val Ser Ala 320

Thr Val Ala Ile Asp His 335

Thr Trp Ala Glu Thr Met 345 350

Leu Asn Ala Asn Ile

360

Ile Tyr Asn Val Leu 375

Asn Gin Thr Leu Ala

390

Ser Gin Ile Leu Ala

405

Leu Ala Pro Ile Ala

420

Thr Pro Ile Thr Met

430

Lys Thr Lys Gin Leu 445

Asn Ile Ala Thr Tyr 460

Asp Thr Gly Ser Asn 475

Glu Thr Thr Ala Arg 490

Leu Val Glu Arg Arg 500

Ile Ala Ala Val Asn Pro Ser Asp Pro Leu Glu Thr Thr Lys

105

505 510 515

Pro Asp	Met	Thr	Leu Lys	Glu Ala 525	Leu	Lys	Ile	Ala 530	Phe	Gly
	520
Phe	Asn	Glu	Pro	Asn Gly	Asn Leu	Gin	Tyr	Gin	Gly	Lys	Asp
		535			540				545
Ile	Thr	Glu	Phe	Asp Phe	Asn Phe	Asp	Gin	Gin	Thr	Ser	Gin
			550			555				560
Asn	Ile	Lys	Asn	Gin Leu	Ala Glu	Leu	Asn	Ala	Thr	Asn	Ile
				565			570
Tyr	Thr	Val	Leu	Asp Lys	Ile Lys	Leu	Asn	Ala	Lys	Met	Asn
575				580				585
Ile	Leu	Ile	Arg	Asp Lys	Arg Phe	His	Tyr	Asp	Arg	Asn	Asn
	590				595				600
Ile	Ala	Val	Gly	Ala Asp	Glu Ser	Val	Val	Lys	Glu	Ala	His
		605			610					615
Arg	Glu	Val	Ile	Asn Ser	Ser Thr	Glu	Gly	Leu	Leu	Leu	Asn
			620			625					630
Ile	Asp	Lys	Asp	Ile Arg	Lys Ile	Leu	Ser	Gly	Tyr	Ile	Val
				635			640
Glu	Ile	Glu	Asp	Thr Glu	Gly Leu	Lys	Glu	Val	Ile	Asn	Asp
645				650				655
Arg	Tyr	Asp	Met	Leu Asn	Ile Ser	Ser	Leu	Arg	Gin	Asp	Gly
	660				665				670
Lys	Thr	Phe	Ile	Asp Phe	Lys Lys	Tyr	Asn	Asp	Lys	Leu	Pro
		675			680					685
Leu	Tyr	Ile	Ser	Asn Pro	Asn Tyr	Lys	Val	Asn	Val	Tyr	Ala
			690			695					700
Val	Thr	Lys	Glu	Asn Thr	Ile Ile	Asn	Pro	Ser	Glu	Asn	Gly
				705			710
Asp	Thr	Ser	Thr	Asn Gly	Ile Lys	Lys	Ile	Leu	Ile	Phe	Ser
715				720				725
Lys	Lys	Gly	Tyr	Glu Ile	Gly Glx
	730				735

106

« 4«	t »»	• 4	·*
	·« · ♦	♦ »	•
	* ·	• »
• · ·	• ·	• ·	*
	• B · ····	* *	• · ·

<210> 19 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 19

Glu Val Lys Gin Glu Asn Arg Leu 1 5

Ser Ser Gin Gly Leu Leu Gly Tyr 15 20

Phe Gin Ala Pro Met Val Val Thr

35

Leu Ser Ile Pro Ser Ser Glu Leu 45 50

Asn Gin Tyr Phe Gin Ser Ala Ile 60

Val Lys Lys Ser Asp Glu Tyr Thr 75

Asn His Val Thr Met Trp Val Asp

90

Lys Ala Ser Asn Ser Asn Lys Ile

100 105

Leu Tyr Gin Ile Lys Ile Gin Tyr

115 120

Glu Lys Gly Leu Asp Phe Lys Leu

130

Asn Lys Lys Glu Val Ile Ser Ser 145

Glu Leu Lys Gin Lys Ser Ser Asn 155 160

Thr Ser Ala Gly Pro Thr Val Pro 170 175

Ile Pro Asp Ser Leu Glu Val Glu 185

Leu Asn Glu Ser Glu Ser

Tyr Phe Ser Asp Leu Asn 25

Ser Ser Thr Thr Gly Asp 40

Glu Asn Ile Pro Ser Glu

Trp Ser Gly Phe Ile Lys

70

Phe Ala Thr Ser Ala Asp 80

Asp Gin Glu Val Ile Asn 95

Arg Leu Glu Lys Gly Arg 110

Gin Arg Glu Asn Pro Thr 125

Tyr Trp Thr Asp Ser Gin

135 140

Asp Asn Leu Gin Leu Pro 150

Ser Arg Lys Lys Arg Ser 165

Asp Arg Asp Asn Asp Gly 180

Gly Tyr Thr Val Asp Val

195

190

107 ·: «..» ·: · s : ϊ .

: . . · · · · · • · · · · ··· ··« ·· «♦» ···· ·· »**·

Lys Asn Lys Arg	Thr	Phe Leu Ser	Pro Trp 205	Ile	Ser	Asn	Ile 210
	200
His Glu	Lys Lys	Gly	Leu Thr Lys	Tyr Lys	Ser	Ser	Pro	Glu
		215		220
Lys Trp	Ser Thr	Ala	Ser Asp Pro	Tyr Ser	Asp	Phe	Glu	Lys
225			230		235
Val Thr	Gly Arg	Ile	Asp Lys Asn	Val Ser	Pro	Glu	Ala	Arg
240			245			250
His Pro	Leu Val	Ala	Ala Tyr Pro	Ile Val	His	Val	Asp	Met
	255		260				265
Glu Asn	Ile Ile	Leu	Ser Lys Asn	Glu Asp	Gin	Ser	Thr	Gin
	270			275				280
Asn Thr	Asp Ser	Glu	Thr Arg Thr	Ile Ser	Lys	Asn	Thr	Ser
		285		290
Thr Ser	Arg Thr	His	Thr Ser Glu	Val His	Gly	Asn	Ala	Glu
295			300		305
Val His	Ala Ser	Phe	Phe Asp Ile	Gly Gly	Ser	Val	Ser	Ala
310			315			320
Gly Phe	Ser Asn	Ser	Asn Ser Ser	Thr Val	Ala	Ile	Asp	His
	325		330				335
Ser Leu	Ser Leu	Ala	Gly Glu Arg	Thr Trp	Ala	Glu	Thr	Met
	340			345				350
Gly Leu	Asn Thr	Ala	Asp Thr Ala	Arg Leu	Asn	Ala	Asn	Ile
		355		360
Arg Tyr	Val Asn	Thr	Gly Thr Ala	Pro Ile	Tyr	Asn	Val	Leu
365			370		375
Pro Thr	Thr Ser	Leu	Val Leu Gly	Lys Asn	Gin	Thr	Leu	Ala
380			385			390
Thr Ile	Lys Ala	Lys	Glu Asn Gin	Leu Ser	Gin	Ile	Leu	Ala
	395		400				405
Pro Asn	Asn Tyr	Tyr	Pro Ser Lys	Asn Leu	Ala	Pro	Ile	Ala
	410			415				420
Leu Asn	Ala Gin	Asp	Asp Phe Ser	Ser Thr	Pro	Ile	Thr	Met

425 430

108 η ·» • •4 * • · * * • · · ··· ·· • ·« ·· · * ·» • · • · • · ·· • 9 9 «

*

9999 • ····

Asn

Tyr

Asn

Gin

Phe

Leu

Glu

Leu

Glu

Lys

Thr

Lys

Gin

Leu

435

440

445

Arg

Leu

Asp

Thr

Asp

Gin

Val

Tyr

Gly

Asn

Ile

Ala

Thr

Tyr

450

455

460

Asn

Phe

Glu

Asn

Gly

Arg

Val

Arg

Val

Asp

Thr

Gly

Ser

Asn

465

470

475

Trp

Ser

Glu

Val

Leu

Pro

Gin

Ile

Gin

Glu

Thr

Thr

Ala

Arg

480

485

490

Ile

Ile

Phe

Asn

Gly

Lys

Asp

Leu

Asn

Leu

Val

Glu

Arg

Arg

495

500

Ile

Ala

Ala

Val

Asn

Pro

Ser

Asp

Pro

Leu

Glu

Thr

Thr

Lys

505

510

515

Pro

Asp

Met

Thr

Leu

Lys

Glu

Ala

Leu

Lys

Ile

Ala

Phe

Gly

520

525

530

Phe

Asn

Glu

Pro

Asn

Gly

Asn

Leu

Gin

Tyr

Gin

Gly

Lys

Asp

535

540

545

Ile

Thr

Glu

Phe

Asp

Phe

Asn

Phe

Asp

Gin

Gin

Thr

Ser

Gin

550

555

560

Asn

Ile

Lys

Asn

Gin

Leu

Ala

Glu

Leu

Asn

Ala

Thr

Asn

Ile

565

570

Tyr

Thr

Val

Leu

Asp

Lys

Ile

Lys

Leu

Asn

Ala

Lys

Met

Asn

575

580

585

Ile

Leu

Ile

Arg

Asp

Lys

Arg

Phe

His

Tyr

Asp

Arg

Asn

Asn

590

595

600

Ile

Ala

Val

Gly

Ala

Asp

Glu

Ser

Val

Val

Lys

Glu

Ala

His

605

610

615

Arg

Glu

Val

Ile

Asn

Ser

Ser

Thr

Glu

Gly

Leu

Leu

Leu

Asn

620

625

630

Ile

Asp

Lys

Asp

Ile

Arg

Lys

Ile

Leu

Ser

Gly

Tyr

Ile

Val

635

640

Glu

Ile

Glu

Asp

Thr

Glu

Gly

Leu

Lys

Glu

Val

Ile

Asn

Asp

645

650

655

Arg

Tyr

Asp

Met

Leu

Asn

Ile

Ser

Ser

Leu

Arg

Gin

Asp

Gly

660 665 670

109

0 «

0 · • · 0 0 0 • 0 0 0 0«

• 0 0 0 0 0

0 0 0 0 0 0 0 0«

Lys

Thr

Phe

Ile

Asp

Phe

Lys

Lys

Tyr

Asn

Asp

Lys

Leu

Pro

675

680

685

Leu

Tyr

Ile

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr

Lys

Val

Asn

Val

Tyr

Ala

690

695

700

Val

Thr

Lys

Glu

Asn

Thr

Ile

Ile

Asn

Pro

Ser

Glu

Asn

Gly

705

710

Asp

Thr

Ser

Thr

Asn

Gly

Ile

Lys

Lys

Ile

Leu

Ile

Phe

Ser

715

720

725

Lys

Lys

Gly

Tyr

Glu

Ile

Gly

Glx

730 735 <210> 20 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 20

Glu

Val

Lys

Gin

Glu

Asn

Arg

Leu

Leu

Asn

Glu

Ser

Glu

Ser

1

5

10

Ser

Ser

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Asp

Leu

Asn

15

20

25

Phe

Gin

Ala

Pro

Met

Val

Val

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Gly

Asp

30

35

40

Leu

Ser

Ile

Pro

Ser

Ser

Glu

Leu

Glu

Asn

Ile

Pro

Ser

Glu

45

50

55

Asn

Gin

Tyr

Phe

Gin

Ser

Ala

Ile

Trp

Ser

Gly

Phe

Ile

Lys

60

65

70

Val

Lys

Lys

Ser

Asp

Glu

Tyr

Thr

Phe

Ala

Thr

Ser

Ala

Asp

75

80

Asn

His

Val

Thr

Met

Trp

Val

Asp

Asp

Gin

Glu

Val

Ile

Asn

85

90

95

Lys

Ala

Ser

Asn

Ser

Asn

Lys

Ile

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly

Arg

100

105

110

Leu

Tyr

Gin

Ile

Lys

Ile

Gin

Tyr

Gin

Arg

Glu

Asn

Pro

Thr

110 • · • 9 ·· » · ♦ • · * • · · »· ·«

Glu

Lys

Gly

Leu

Asp

Phe

Lys

Leu

Tyr

Trp

Thr

Asp

Ser

Gin

130

135

140

Asn

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Leu

Gin

Leu

Pro

145

150

Glu

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Ser

Asn

Ser

Arg

Lys

Lys

Arg

Ser

155

160

165

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Asp

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

170

175

180

Ile

Pro

Asp

Ser

Leu

Glu

Val

Glu

Gly

Tyr

Thr

Val

Asp

Val

185

190

195

Lys

Asn

Lys

Arg

Thr

Phe

Leu

Ser

Pro

Trp

Ile

Ser

Asn

Ile

200

205

210

His

Glu

Lys

Lys

Gly

Leu

Thr

Lys

Tyr

Lys

Ser

Ser

Pro

Glu

215

220

Lys

Trp

Ser

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Tyr

Ser

Asp

Phe

Glu

Lys

225

230

235

Val

Thr

Gly

Arg

Ile

Asp

Lys

Asn

Val

Ser

Pro

Glu

Ala

Arg

240

245

250

His

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Tyr

Pro

Ile

Val

His

Val

Asp

Met

255

260

265

Glu

Asn

Ile

Ile

Leu

Ser

Lys

Asn

Glu

Asp

Gin

Ser

Thr

Gin

270

275

280

Asn

Thr

Asp

Ser

Glu

Thr

Arg

Thr

Ile

Ser

Lys

Asn

Thr

Ser

285

290

Thr

Ser

Arg

Thr

His

Thr

Ser

Glu

Val

His

Gly

Asn

Ala

Glu

295

300

305

Val

His

Ala

Ser

Phe

Phe

Asp

Ile

Gly

Gly

Ser

Val

Ser

Ala

310

315

320

Gly

Phe

Ser

Asn

Ser

Asn

Ser

Ser

Thr

Val

Ala

Ile

Asp

His

325

330

335

Ser

Leu

Ser

Leu

Ala

Gly

Glu

Arg

Thr

Trp

Ala

Glu

Thr

Met

340

345

350

Gly

Leu

Asn

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

Arg

Leu

Asn

Ala

Asn

Ile

111

355 360

Arg Tyr Val Asn Thr Gly Thr Ala Pro Ile Tyr Asn Val Leu

365 370 375

Pro Thr Thr Ser Leu Val Leu Gly Lys Asn Gin Thr Leu Ala

380 385 390

Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gin Leu Ser Gin Ile Leu Ala

395 400 405

Pro Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Asn Leu Ala Pro Ile Ala

410 415 420

Leu Asn Ala Gin Asp Asp Phe Ser Ser Thr Pro Ile Thr Met

425 430

Asn

Tyr

Asn

Gin

Phe

Leu

Glu

Leu

Glu

Lys

Thr

Lys

Gin

Leu

435

440

445

Arg

Leu

Asp

Thr

Asp

Gin

Val

Tyr

Gly

Asn

Ile

Ala

Thr

Tyr

450

455

460

Asn

Phe

Glu

Asn

Gly

Arg

Val

Arg

Val

Asp

Thr

Gly

Ser

Asn

465

470

475

Trp

Ser

Glu

Val

Leu

Pro

Gin

Ile

Gin

Glu

Thr

Thr

Ala

Arg

480

485

490

Ile

Ile

Phe

Asn

Gly

Lys

Asp

Leu

Asn

Leu

Val

Glu

Arg

Arg

495

500

Ile

Ala

Ala

Val

Asn

Pro

Ser

Asp

Pro

Leu

Glu

Thr

Thr

Lys

505

510

515

Pro

Asp

Met

Thr

Leu

Lys

Glu

Ala

Leu

Lys

Ile

Ala

Phe

Gly

520

525

530

Phe

Asn

Glu

Pro

Asn

Gly

Asn

Leu

Gin

Tyr

Gin

Gly

Lys

Asp

535

540

545

Ile

Thr

Glu

Phe

Asp

Phe

Asn

Phe

Asp

Gin

Gin

Thr

Ser

Gin

550

555

560

Asn

Ile

Lys

Asn

Gin

Leu

Ala

Glu

Leu

Asn

Ala

Thr

Asn

Ile

565

570

Tyr

Thr

Val

Leu

Asp

Lys

Ile

Lys

Leu

Asn

Ala

Lys

Met

Asn

575

580

585

Ile

Leu

Ile

Arg

Asp

Lys

Arg

Phe

His

Tyr Asp

Arg

Asn

Asn

• ·

112 ·· · · • · · · • · · • · ·······

590

595

600

Ile

Ala

Val

Gly

Ala

Asp

Glu

Ser

Val

Val

Lys

Glu

Ala

His

605

610

615

Arg

Glu

Val

Ile

Asn

Ser

Ser

Thr

Glu

Gly

Leu

Leu

Leu

Asn

620

625

630

Ile

Asp

Lys

Asp

Ile

Arg

Lys

Ile

Leu

Ser

Gly

Tyr

Ile

Val

635

640

Glu

Ile

Glu

Asp

Thr

Glu

Gly

Leu

Lys

Glu

Val

Ile

Asn

Asp

645

650

655

Arg

Tyr

Asp

Met

Leu

Asn

Ile

Ser

Ser

Leu

Arg

Gin

Asp

Gly

660

665

670

Lys

Thr

Phe

Ile

Asp

Phe

Lys

Lys

Tyr

Asn

Asp

Lys

Leu

Pro

675

680

685

Leu

Tyr

Ile

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr

Lys

Val

Asn

Val

Tyr

Ala

690

695

700

Val

Thr

Lys

Glu

Asn

Thr

Ile

Ile

Asn

Pro

Ser

Glu

Asn

Gly

705

710

Asp

Thr

Ser

Thr

Asn

Gly

Ile

Lys

Lys

Ile

Leu

Ile

Phe

Ser

715

720

725

Lys

Lys

Gly

Tyr

Glu

Ile

Gly

Glx

730 735 <210> 21 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 21

Glu 1

Val

Lys Gin Glu Asn Arg Leu Leu Asn Glu Ser Glu

Ser

5

10

Ser

Ser

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Asp

Leu

Asn

15

20

25

Phe

Gin

Ala

Pro

Met

Val

Val

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Gly

Asp

113

Leu Ser

Asn Gin

Val Lys

Asn His

Lys Ala 100

Leu Tyr

Glu Lys

Asn Lys

Glu Leu

155

Thr Ser

170

Ile Pro

Lys Asn

His Glu

Lys Trp 225

Val Thr

240

His Pro

Glu Asn

Pro Ser Ser Glu Leu Glu Asn Ile Pro Ser Glu

Ile

Tyr Phe Gin Ser 60

Lys Ser Asp Glu 75

Val Thr Met Trp 90

Ser Asn Ser Asn

Gin Ile Lys Ile 115

Gly Leu Asp Phe 130

Lys Glu Val Ile 145

Lys Gin Lys Ser 160

Ala Gly Pro Thr

Asp Ser Leu Glu 185

Lys Arg Thr Phe 200

Lys Lys Gly Leu 215

Ser Thr Ala Ser

230

Gly Arg Ile Asp

Leu Val Ala Ala

255

Ile Ile Leu Ser

270

Ala Ile Trp Ser 65

Tyr Thr Phe Ala 80

Val Asp Asp Gin

Lys Ile Arg Leu 105

Gin Tyr Gin Arg 120

Lys Leu Tyr Trp 135

Ser Ser Asp Asn 150

Ser Asn Ser Arg

Val Pro Asp Arg 175

Val Glu Gly Tyr 190

Leu Ser Pro Trp 205

Thr Lys Tyr Lys 220

Asp Pro Tyr Ser

Lys Asn Val Ser 245

Tyr Pro Ile Val 260

Lys Asn Glu Asp 275

Gly Phe Ile Lys 70

Thr Ser Ala Asp

Glu Val Ile Asn

Glu Lys Gly Arg 110

Glu Asn Pro Thr

125

Thr Asp Ser Gin 140

Leu Gin Leu Pro

Lys Lys Arg Ser 165

Asp Asn Asp Gly 180

Thr Val Asp Val 195

Ile Ser Asn Ile

210

Ser Ser Pro Glu

Asp Phe Glu Lys 235

Pro Glu Ala Arg 250

His Val Asp Met 265

Gin Ser Thr Gin

280

114

Asn	Thr	Asp Ser Glu Thr Arg 285	Thr	Ile	Ser Lys 290	Asn	Thr	Ser
Thr	Ser	Arg Thr His Thr Ser	Glu	Val	His Gly	Asn	Ala	Glu
295		300			305
Val	His	Ala Ser Phe Phe Asp	Ile	Gly	Gly Ser	Val	Ser	Ala
	310	315			320
Gly	Phe	Ser Asn Ser Asn Ser	Ser	Thr	Val Ala	Ile	Asp	His
		325	330			335
Ser	Leu	Ser Leu Ala Gly Glu	Arg	Thr	Trp Ala	Glu	Thr	Met
		340		345				350
Gly	Leu	Asn Thr Ala Asp Thr	Ala	Arg	Leu Asn	Ala	Asn	Ile
		355			360
Arg	Tyr	Val Asn Thr Gly Thr	Ala	Pro	Ile Tyr	Asn	Val	Leu
365		370			375
Pro	Thr	Thr Ser Leu Val Leu	Gly	Lys	Asn Gin	Thr	Leu	Ala
	380	385				390
Thr	Ile	Lys Ala Lys Glu Asn	Gin	Leu	Ser Gin	Ile	Leu	Ala
		395	400				405
Pro	Asn	Asn Tyr Tyr Pro Ser	Lys	Asn	Leu Ala	Pro	Ile	Ala
		410		415				420
Leu	Asn	Ala Gin Asp Asp Phe	Ser	Ser	Thr Pro	Ile	Thr	Met
		425			430
Asn	Tyr	Asn Gin Phe Leu Glu	Leu	Glu	Lys Thr	Lys	Gin	Leu
435		440			445
Arg	Leu	Asp Thr Asp Gin Val	Tyr	Gly	Asn Ile	Ala	Thr	Tyr
	450	455				460
Asn	Phe	Glu Asn Gly Arg Val	Arg	Val	Asp Thr	Gly	Ser	Asn
		465	470				475
Trp	Ser	Glu Val Leu Pro Gin	Ile	Gin	Glu Thr	Thr	Ala	Arg
		480		485				490
Ile	Ile	Phe Asn Gly Lys Asp	Leu	Asn	Leu Val	Glu	Arg	Arg
		495			500
Ile	Ala	Ala Val Asn Pro Ser	Asp	Pro	Leu Glu	Thr	Thr	Lys

505 510 515

115 • »

Pro Asp 520	Met	Thr Leu	Lys Glu Ala 525	Leu	Lys	Ile	Ala 530	Phe	Gly
Phe Asn	Glu	Pro Asn	Gly Asn Leu	Gin	Tyr	Gin	Gly	Lys	Asp
	535		540				545
Ile Thr	Glu	Phe Asp	Phe Asn Phe	Asp	Gin	Gin	Thr	Ser	Gin
		550		555					560
Asn Ile	Lys	Asn Gin	Leu Ala Glu	Leu	Asn	Ala	Thr	Asn	Ile
		565			570
Tyr Thr	Val	Leu Asp	Lys Ile Lys	Leu	Asn	Ala	Lys	Met	Asn
575			580			585
Ile Leu	Ile	Arg Asp	Lys Arg Phe	His	Tyr	Asp	Arg	Asn	Asn
590			595				600
Ile Ala	Val	Gly Ala	Asp Glu Ser	Val	Val	Lys	Glu	Ala	His
	605		610					615
Arg Glu	Val	Ile Asn	Ser Ser Thr	Glu	Gly	Leu	Leu	Leu	Asn
		620		625					630
Ile Asp	Lys	Asp Ile	Arg Lys Ile	Leu	Ser	Gly	Tyr	Ile	Val
		635		640
Glu Ile	Glu	Asp Thr	Glu Gly Leu	Lys	Glu	Val	Ile	Asn	Asp
645			650			655
Arg Tyr	Asp	Met Leu	Asn Ile Ser	Ser	Leu	Arg	Gin	Asp	Gly
660			665				670
Lys Thr	Phe	Ile Asp	Phe Lys Lys	Tyr	Asn	Asp	Lys	Leu	Pro
	675		680					685
Leu Tyr	Ile	Ser Asn	Pro Asn Tyr	Lys	Val	Asn	Val	Tyr	Ala
		690		695					700
Val Thr	Lys	Glu Asn	Thr Ile Ile	Asn	Pro	Ser	Glu	Asn	Gly
		705			710
Asp Thr	Ser	Thr Asn	Gly Ile Lys	Lys	Ile	Leu	Ile	Phe	Ser
715			720			725
Lys Lys	Gly	Tyr Glu	Ile Gly Glx

730 735 <210> 22

116 • · <211> 2208 <212> DNA <213> Bacillus anthracis <400> 22

gaagttaaac	aggagaaccg	gttattaaat	gaatcagaat	caagttccca	50
ggggttacta	ggatactatt	ttagtgattt	gaattttcaa	gcacccatgg	100
tggttacctc	ttctactaca	ggggatttat	ctattcctag	ttctgagtta	150
gaaaatattc	catcggaaaa	ccaatatttt	caatctgcta	tttggtcagg	200
atttatcaaa	gttaagaaga	gtgatgaata	tacatttgct	acttccgctg	250
ataatcatgt	aacaatgtgg	gtagatgacc	aagaagtgat	taataaagct	300
tctaattcta	acaaaatcag	attagaaaaa	ggaagattat	atcaaataaa	350
aattcaatat	caacgagaaa	atcctactga	aaaaggattg	gatttcaagt	400
tgtactggac	cgattctcaa	aataaaaaag	aagtgatttc	tagtgataac	450
ttacaattgc	cagaattaaa	acaaaaatct	tcgaactcaa	gaaaaaagcg	500
aagtacaagt	gctggaccta	cggttccaga	ccgtgacaat	gatggaatcc	550
ctgattcatt	agaggtagaa	ggatatacgg	ttgatgtcaa	aaataaaaga	600
acttttcttt	caccatggat	ttctaatatt	catgaaaaga	aaggattaac	650
caaatataaa	tcatctcctg	aaaaatggag	cacggcttct	gatccgtaca	700
gtgatttcga	aaaggttaca	ggacggattg	ataagaatgt	atcaccagag	750
gcaagacacc	cccttgtggc	agcttatccg	attgtacatg	tagatatgga	800
gaatattatt	ctctcaaaaa	atgaggatca	atccacacag	aatactgata	850
gtgaaacgag	aacaataagt	aaaaatactt	ctacaagtag	gacacatact	900
agtgaagtac	atggaaatgc	agaagtgcat	gcgtcgttct	ttgatattgg	950
tgggagtgta	tctgcaggat	ttagtaattc	gaattcaagt	acggtcgcaa	1000
ttgatcattc	actatctcta	gcaggggaaa	gaacttgggc	tgaaacaatg	1050
ggtttaaata	ccgctgatac	agcaagatta	aatgccaata	ttagatatgt	1100
aaatactggg	acggctccaa	tctacaacgt	gttaccaacg	acttcgttag	1150
tgttaggaaa	aaatcaaaca	ctcgcgacaa	ttaaagctaa	ggaaaaccaa	1200
ttaagtcaaa	tacttgcacc	taataattat	tatccttcta	aaaacttggc	1250
gccaatcgca	ttaaatgcac	aagacgattt	cagttctact	ccaattacaa	1300
tgaattacaa	tcaatttctt	gagttagaaa	aaacgaaaca	attaagatta	1350
gatacggatc	aagtatatgg	gaatatagca	acatacaatt	ttgaaaatgg	1400
aagagtgagg	gtggatacag	gctcgaactg	gagtgaagtg	ttaccgcaaa	1450

117

4

4

ttcaagaaac aactgcacgt atcattttta atggaaaaga tttaaatctg 1500
gtagaaaggc	ggatagcggc	ggttaatcct	agtgatccat	tagaaacgac	1550
taaaccggat	atgacattaa	aagaagccct	taaaatagca	tttggattta	1600
acgaaccgaa	tggaaactta	caatatcaag	ggaaagacat	aaccgaattt	1650
gattttaatt	tcgatcaaca	aacatctcaa	aatatcaaga	atcagttagc	1700
ggaattaaac	gcaactaaca	tatatactgt	attagataaa	atcaaattaa	1750
atgcaaaaat	gaatatttta	ataagagata	aacgttttca	ttatgataga	1800
aataacatag	cagttggggc	ggatgagtca	gtagttaagg	aggctcatag	1850
agaagtaatt	aattcgtcaa	cagagggatt	attgttaaat	attgataagg	1900
atataagaaa	aatattatca	ggttatattg	tagaaattga	agatactgaa	1950
gggcttaaag	aagttataaa	tgacagatat	gatatgttga	atatttctag	2000
tttacggcaa	gatggaaaaa	catttataga	ttttaaaaaa	tataatgata	2050
aattaccgtt	atatataagt	aatcccaatt	ataaggtaaa	tgtatatgct	2100
gttactaaag	aaaacactat	tattaatcct	agtgagaatg	gggatactag	2150
taccaacggg	atcaagaaaa	ttttaatctt	ttctaaaaaa	ggctatgaga	2200
taggataa				2208

<210> 23 <211> 736 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 23

Glu 1

Val

Lys

Gin Glu 5

Asn

Arg Leu Leu

Asn Glu 10

Ser

Glu

Ser

Ser

Ser

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Asp

Leu

Asn

15

20

25

Phe

Gin

Ala

Pro

Met

Val

Val

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Gly

Asp

30

35

40

Leu

Ser

Ile

Pro

Ser

Ser

Glu

Leu

Glu

Asn

Ile

Pro

Ser

Glu

45

50

55

Asn

Gin

Tyr

Phe

Gin

Ser

Ala

Ile

Trp

Ser

Gly

Phe

Ile

Lys

60

65

70

Val

Lys

Lys

Ser

Asp

Glu

Tyr

Thr

Phe

Ala

Thr

Ser

Ala

Asp

118 ·· · · • » · • « *

·» · ·

Asn

His

Val

Thr

Met

Trp

Val

Asp

Asp

Gin

Glu

Val

Ile

Asn

85

90

95

Lys

Ala

Ser

Asn

Ser

Asn

Lys

Ile

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly

Arg

100

105

110

Leu

Tyr

Gin

Ile

Lys

Ile

Gin

Tyr

Gin

Arg

Glu

Asn

Pro

Thr

115

120

125

Glu

Lys

Gly

Leu

Asp

Phe

Lys

Leu

Tyr

Trp

Thr

Asp

Ser

Gin

130

135

140

Asn

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Leu

Gin

Leu

Pro

145

150

Glu

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Ser

Asn

Ser

Arg

Lys

Lys

Arg

Ser

155

160

165

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Asp

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

170

175

180

Ile

Pro

Asp

Ser

Leu

Glu

Val

Glu

Gly

Tyr

Thr

Val

Asp

Val

185

190

195

Lys

Asn

Lys

Arg

Thr

Phe

Leu

Ser

Pro

Trp

Ile

Ser

Asn

Ile

200

205

210

His

Glu

Lys

Lys

Gly

Leu

Thr

Lys

Tyr

Lys

Ser

Ser

Pro

Glu

215

220

Lys

Trp

Ser

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Tyr

Ser

Asp

Phe

Glu

Lys

225

230

235

Val

Thr

Gly

Arg

Ile

Asp

Lys

Asn

Val

Ser

Pro

Glu

Ala

Arg

240

245

250

His

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Tyr

Pro

Ile

Val

His

Val

Asp

Met

255

260

265

Glu

Asn

Ile

Ile

Leu

Ser

Lys

Asn

Glu

Asp

Gin

Ser

Thr

Gin

270

275

280

Asn

Thr

Asp

Ser

Glu

Thr

Arg

Thr

Ile

Ser

Lys

Asn

Thr

Ser

285

290

Thr

Ser

Arg

Thr

His

Thr

Ser

Glu

Val

His

Gly

Asn

Ala

Glu

295

300

305

Val His Ala Ser Phe Phe Asp Ile Gly Gly Ser Val Ser Ala ··

119 •

· ·

310 Gly Phe

Ser Leu

Gly Leu

Arg Tyr

365

Pro Thr

380

Thr Ile

Pro Asn

Leu Asn

Asn Tyr

435

Arg Leu 450

Asn Phe

Trp Ser

Ile Ile

Ile Ala

505

Pro Asp 520

Phe Asn

Ile Thr

Ser

325

Ser

Asn

Val

Thr

Lys

395

Asn

Ala

Asn

Asp

Glu

465

Glu

Phe

Ala

Met

Glu

535

Glu

Asn Ser Asn

Leu Ala Gly 340

Thr Ala Asp 355

Asn Thr Gly 370

Ser Leu Val

Ala Lys Glu

Tyr Tyr Pro 410

Gin Asp Asp 425

Gin Phe Leu

440

Thr Asp Gin

Asn Gly Arg

Val Leu Pro

480

Asn Gly Lys 495

Val Asn Pro

510

Thr Leu Lys

Pro Asn Gly

Phe Asp Phe

315

Ser Ser Thr Val Ala

330

Glu Arg Thr Trp Ala 345

Thr Ala Arg Leu Asn 360

Thr Ala Pro Ile Tyr 375

Leu Gly Lys Asn Gin 385

Asn Gin Leu Ser Gin

400

Ser Lys Asn Leu Ala 415

Phe Ser Ser Thr Pro

430

Glu Leu Glu Lys Thr 445

Val Tyr Gly Asn Ile 455

Val Arg Val Asp Thr 470

Gin Ile Gin Glu Thr

485

Asp Leu Asn Leu Val 500

Ser Asp Pro Leu Glu 515

Glu Ala Leu Lys Ile 525

Asn Leu Gin Tyr Gin 540

Asn Phe Asp Gin Gin

320

Ile Asp His 335

Glu Thr Met

350

Ala Asn Ile

Asn Val Leu

Thr Leu Ala

390

Ile Leu Ala

405

Pro Ile Ala

420

Ile Thr Met

Lys Gin Leu

Ala Thr Tyr 460

Gly Ser Asn 475

Thr Ala Arg 490

Glu Arg Arg

Thr Thr Lys

Ala Phe Gly 530

Gly Lys Asp 545

Thr Ser Gin

Asn Ile

550

120

• « Ala

• ·* • · • * · • · • · • « 9 · Thr

• 9 • 0 • • Asn

• ·· • * • · • · ·· *♦· 560 Ile

Glu

555 Leu

Asn 570

Lys

Asn Gin 565

Leu

Ala

Tyr

Thr

Val

Leu

Asp

Lys

Ile

Lys

Leu

Asn

Ala

Lys

Met

Asn

575

580

585

Ile

Leu

Ile

Arg

Asp

Lys

Arg

Phe

His

Tyr

Asp

Arg

Asn

Asn

590

595

600

Ile

Ala

Val

Gly

Ala

Asp

Glu

Ser

Val

Val

Lys

Glu

Ala

His

605

610

615

Arg

Glu

Val

Ile

Asn

Ser

Ser

Thr

Glu

Gly

Leu

Leu

Leu

Asn

620

625

630

Ile

Asp

Lys

Asp

Ile

Arg

Lys

Ile

Leu

Ser

Gly

Tyr

Ile

Val

635

640

Glu

Ile

Glu

Asp

Thr

Glu

Gly

Leu

Lys

Glu

Val

Ile

Asn

Asp

645

650

655

Arg

Tyr

Asp

Met

Leu

Asn

Ile

Ser

Ser

Leu

Arg

Gin

Asp

Gly

660

665

670

Lys

Thr

Phe

Ile

Asp

Phe

Lys

Lys

Tyr

Asn

Asp

Lys

Leu

Pro

675

680

685

Leu

Tyr

Ile

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr

Lys

Val

Asn

Val

Tyr

Ala

690

695

700

Val

Thr

Lys

Glu

Asn

Thr

Ile

Ile

Asn

Pro

Ser

Glu

Asn

Gly

705

710

Asp

Thr

Ser

Thr

Asn

Gly

Ile

Lys

Lys

Ile

Leu

Ile

Phe

Ser

715

720

725

Lys

Lys

Gly

Tyr

Glu

Ile

Gly

Glx

730 735 <210> 24 <211> 599 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 24

121

Thr

Asp

Ser

Gin

Asn

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

1

5

10

Leu

Gin

Leu

Pro

Glu

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Ser

Asn

Ser

Arg

15

20

25

Lys

Lys

Arg

Ser

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Asp

Arg

30

35

40

Asp

Asn

Asp

Gly

Ile

Pro

Asp

Ser

Leu

Glu

Val

Glu

Gly

Tyr

45

50

55

Thr

Val

Asp

Val

Lys

Asn

Lys

Arg

Thr

Phe

Leu

Ser

Pro

Trp

60

65

70

Ile

Ser

Asn

Ile

His

Glu

Lys

Lys

Gly

Leu

Thr

Lys

Tyr

Lys

75

80

Ser

Ser

Pro

Glu

Lys

Trp

Ser

Thr

Ala

Ser

Asp

Pro

Tyr

Ser

85

90

95

Asp

Phe

Glu

Lys

Val

Thr

Gly

Arg

Ile

Asp

Lys

Asn

Val

Ser

100

105

110

Pro

Glu

Ala

Arg

His

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Tyr

Pro

Ile

Val

115

120

125

His

Val

Asp

Met

Glu

Asn

Ile

Ile

Leu

Ser

Lys

Asn

Glu

Asp

130

135

140

Gin

Ser

Thr

Gin

Asn

Thr

Asp

Ser

Gin

Thr

Arg

Thr

Ile

Ser

145

150

Lys

Asn

Thr

Ser

Thr

Ser

Arg

Thr

His

Thr

Ser

Glu

Val

His

155

160

165

Gly

Asn

Ala

Glu

Val

His

Ala

Ser

Phe

Phe

Asp

Ile

Gly

Gly

170

175

180

Ser

Val

Ser

Ala

Gly

Phe

Ser

Asn

Ser

Asn

Ser

Ser

Thr

Val

185

190

195

Ala

Ile

Asp

His

Ser

Leu

Ser

Leu

Ala

Gly

Glu

Arg

Thr

Trp

200

205

210

Ala

Glu

Thr

Met

Gly

Leu

Asn

Thr

Ala

Asp

Thr

Ala

Arg

Leu

215

220

Asn

Ala

Asn

Ile

Arg

Tyr

Val

Asn

Thr

Gly

Thr

Ala

Pro

Ile

225 230 235

122 ·· • · ♦

Tyr

Asn

Val

Leu

Pro

Thr

Thr

Ser

Leu

Val

Leu

Gly

Lys

Asn

240

245

250

Gin

Thr

Leu

Ala

Thr

Ile

Lys

Ala

Lys

Glu

Asn

Gin

Leu

Ser

255

260

265

Gin

Ile

Leu

Ala

Pro

Asn

Asn

Tyr

Tyr

Pro

Ser

Lys

Asn

Leu

270

275

280

Ala

Pro

Ile

Ala

Leu

Asn

Ala

Gin

Asp

Asp

Phe

Ser

Ser

Thr

285

290

Pro

Ile

Thr

Met

Asn

Tyr

Asn

Gin

Phe

Leu

Glu

Leu

Glu

Lys

295

300

305

Thr

Lys

Gin

Leu

Arg

Leu

Asp

Thr

Asp

Gin

Val

Tyr

Gly

Asn

310

315

320

Ile

Ala

Thr

Tyr

Asn

Phe

Glu

Asn

Gly

Arg

Val

Arg

Val

Asp

325

330

335

Thr

Gly

Ser

Asn

Trp

Ser

Glu

Val

Leu

Pro

Gin

Ile

Gin

Glu

340

345

350

Thr

Thr

Ala

Arg

Ile

Ile

Phe

Asn

Gly

Lys

Asp

Leu

Asn

Leu

355

360

Val

Glu

Arg

Arg

Ile

Ala

Ala

Val

Asn

Pro

Ser

Asp

Pro

Leu

365

370

375

Glu

Thr

Thr

Lys

Pro

Asp

Met

Thr

Leu

Lys

Glu

Ala

Leu

Lys

380

385

390

Ile

Ala

Phe

Gly

Phe

Asn

Glu

Pro

Asn

Gly

Asn

Leu

Gin

Tyr

395

400

405

Gin

Gly

Lys

Asp

Ile

Thr

Glu

Phe

Asp

Phe

Asn

Phe

Asp

Gin

410

415

420

Gin

Thr

Ser

Gin

Asn

Ile

Lys

Asn

Gin

Leu

Ala

Glu

Leu

Asn

425

430

Val

Thr

Asn

Ile

Tyr

Thr

Val

Leu

Asp

Lys

Ile

Lys

Leu

Asn

435

440

445

Ala

Lys

Met

Asn

Ile

Leu

Ile

Arg

Asp

Lys

Arg

Phe

His

Tyr

450

455

460

Asp

Arg

Asn

Asn

Ile

Ala

Val

Gly

Ala

Asp

Glu

Ser

Val

Val

475 ♦ ·

123 • · · · · ♦ ·

Lys Glu

Ala

His Arg Glu Val 480

Ile Asn 485

Ser

Ser Thr Glu Gly 490

Leu

Leu

Leu

Asn

Ile

Asp

Lys

Asp

Ile

Arg

Lys

Ile

Leu

Ser

495

500

Gly

Tyr

Ile

Val

Glu

Ile

Glu

Asp

Thr

Glu

Gly

Leu

Lys

Glu

505

510

515

Val

Ile

Asn

Asp

Arg

Tyr

Asp

Met

Leu

Asn

Ile

Ser

Ser

Leu

520

525

530

Arg

Gin

Asp

Gly

Lys

Thr

Phe

Ile

Asp

Phe

Lys

Lys

Tyr

Asn

535

540

545

Asp

Lys

Leu

Pro

Leu

Tyr

Ile

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr

Lys

Val

550

555

560

Asn

Val

Tyr

Ala

Val

Thr

Lys

Glu

Asn

Thr

Ile

Ile

Asn

Pro

565

570

Ser

Glu

Asn

Gly

Asp

Thr

Ser

Thr

Asn

Gly

Ile

Lys

Lys

Ile

575

580

585

Leu

Ile

Phe

Ser

Lys

Lys

Gly

Tyr

Glu

Ile

Gly

590 595 <210> 25 <211> 705 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 25

Glu

Leu

Asp

Gly

Met

Lys

Lys

Ile

Ile

Pro

Glu

Glu

Asn

Leu

1

5

10

Phe

Leu

Arg

Asp

Tyr

Ser

Asn

Ile

Glu

Lys

Asp

Asp

Pro

Phe

15

20

25

Ile

Pro

Asn

Asn

Asn

Phe

Phe

Asp

Pro

Lys

Leu

Met

Ser

Asp

30

35

40

Trp

Glu

Asp

Glu

Asp

Leu

Asp

Thr

Asp

Asn

Asp

Asn

Ile

Pro

45

50

55

Asp

Ser

Tyr

Glu

Arg

Asn

Gly

Tyr

Thr

Ile

Lys

Asp

Leu

Ile

124 • · > 9

9 «

9 9 9 · · ·· 9·9«

Ala Val

Lys Trp Glu Asp Ser 75

Phe Ala

Glu 80

Gin

Gly

Tyr

Lys

Lys

Tyr

Val

Ser

Asn

Tyr

Leu

Glu

Ser

Asn

Thr

Ala

Gly

Asp

85

90

95

Pro

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Glu

Lys

Ala

Ser

Gly

Ser

Phe

Asp

Lys

100

105

110

Ala

Ile

Lys

Thr

Glu

Ala

Arg

Asp

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Tyr

115

120

125

Pro

Ile

Val

Gly

Val

Gly

Met

Glu

Lys

Leu

Ile

Ile

Ser

Thr

130

135

140

Asn

Glu

His

Ala

Ser

Thr

Asp

Gin

Gly

Lys

Thr

Val

Ser

Arg

145

150

Ala

Thr

Thr

Asn

Ser

Lys

Thr

Glu

Ser

Asn

Thr

Ala

Gly

Val

155

160

165

Ser

Val

Asn

Val

Gly

Tyr

Gin

Asn

Gly

Phe

Thr

Ala

Asn

Val

170

175

180

Thr

Thr

Asn

Tyr

Ser

His

Thr

Thr

Asp

Asn

Ser

Thr

Ala

Val

185

190

195

Gin

Asp

Ser

Asn

Gly

Glu

Ser

Trp

Asn

Thr

Gly

Leu

Ser

Ile

200

205

210

Asn

Lys

Gly

Glu

Ser

Ala

Tyr

Ile

Asn

Ala

Asn

Val

Arg

Tyr

215

220

Tyr

Asn

Thr

Gly

Thr

Ala

Pro

Met

Tyr

Lys

Val

Thr

Pro

Thr

225

230

235

Thr

Asn

Leu

Val

Leu

Asp

Gly

Asp

Thr

Leu

Ser

Thr

Ile

Lys

240

245

250

Ala

Gin

Glu

Asn

Gin

Ile

Gly

Asn

Asn

Leu

Ser

Pro

Gly

Asp

255

260

265

Thr

Tyr

Pro

Lys

Lys

Gly

Leu

Ser

Pro

Leu

Ala

Leu

Asn

Thr

270

275

280

Met

Asp

Gin

Phe

Ser

Ser

Arg

Leu

Ile

Pro

Ile

Asn

Tyr

Asp

285 290

Gin Leu Lys Lys Leu Asp Ala Gly Lys Gin Ile Lys Leu Glu

125 *·

295 300 305

Thr Thr Gin Val 310

Ser Gly Asn Phe Gly Thr Lys Asn Ser

Ser

315

320

Gly

Gin

Ile

Val

Thr

Glu

Gly

Asn

Ser

Trp

Ser

Asp

Tyr

Ile

325

330

335

Ser

Gin

Ile

Asp

Ser

Ile

Ser

Ala

Ser

Ile

Ile

Leu

Asp

Thr

340

345

350

Glu

Asn

Glu

Ser

Tyr

Glu

Arg

Arg

Val

Thr

Ala

Lys

Asn

Leu

355

360

Gin

Asp

Pro

Glu

Asp

Lys

Thr

Pro

Glu

Leu

Thr

Ile

Gly

Glu

365

370

375

Ala

Ile

Glu

Lys

Ala

Phe

Gly

Ala

Thr

Lys

Lys

Asp

Gly

Leu

380

385

390

Leu

Tyr

Phe

Asn

Asp

Ile

Pro

Ile

Asp

Glu

Ser

Cys

Val

Glu

395

400

405

Leu

Ile

Phe

Asp

Asp

Asn

Thr

Ala

Asn

Lys

Ile

Lys

Asp

Ser

410

415

420

Leu

Lys

Thr

Leu

Ser

Asp

Lys

Lys

Ile

Tyr

Asn

Val

Lys

Leu

425

430

Glu

Arg

Gly

Met

Asn

Ile

Leu

Ile

Lys

Thr

Pro

Thr

Tyr

Phe

435

440

445

Thr

Asn

Phe

Asp

Asp

Tyr

Asn

Asn

Tyr

Pro

Ser

Thr

Trp

Ser

450

455

460

Asn

Val

Asn

Thr

Thr

Asn

Gin

Asp

Gly

Leu

Gin

Gly

Ser

Ala

465

470

475

Asn

Lys

Leu

Asn

Gly

Glu

Thr

Lys

Ile

Lys

Ile

Pro

Met

Ser

480

485

490

Glu

Leu

Lys

Pro

Tyr

Lys

Arg

Tyr

Val

Phe

Ser

Gly

Tyr

Ser

495

500

Lys

Asp

Pro

Leu

Thr

Ser

Asn

Ser

Ile

Ile

Val

Lys

Ile

Lys

505

510

515

Ala

Lys

Glu

Glu

Lys

Thr

Asp

Tyr

Leu

Val

Pro

Glu

Gin

Gly

520

525

530

Tyr Thr Lys Phe Ser Tyr Glu Phe Glu Thr Thr Glu Lys Asp

126 • ·

535

545 ·» * · • 4k ** • · · • · · • · ♦ • » · ·» ·*··

540

Ser

Ser

Asn

Ile 550

Glu

Ile

Thr Leu

Ile Gly 555

Ser

Gly

Thr

Thr 560

Tyr

Leu

Asp

Asn

Leu

Ser

Ile

Thr

Glu

Leu

Asn

Ser

Thr

Pro

565

570

Glu

Ile

Leu

Asp

Glu

Pro

Glu

Val

Lys

Ile

Pro

Thr

Asp

Gin

575

580

585

Glu

Ile

Met

Asp

Ala

His

Lys

Ile

Tyr

Phe

Ala

Asp

Leu

Asn

590

595

600

Phe

Asn

Pro

Ser

Thr

Gly

Asn

Thr

Tyr

Ile

Asn

Gly

Met

Tyr

605

610

615

Phe

Ala

Pro

Thr

Gin

Thr

Asn

Lys

Glu

Ala

Leu

Asp

Tyr

Ile

620

625

630

Gin

Lys

Tyr

Arg

Val

Glu

Ala

Thr

Leu

Gin

Tyr

Ser

Gly

Phe

635

640

Lys

Asp

Ile

Gly

Thr

Lys

Asp

Lys

Glu

Met

Arg

Asn

Tyr

Leu

645

650

655

Gly

Asp

Pro

Asn

Gin

Pro

Lys

Thr

Asn

Tyr

Val

Asn

Leu

Arg

660

665

670

Ser

Tyr

Phe

Thr

Gly

Gly

Glu

Asn

Ile

Met

Thr

Tyr

Lys

Lys

675

680

685

Leu

Arg

Ile

Tyr

Ala

Ile

Thr

Pro

Asp

Asp

Arg

Glu

Leu

Leu

690

695

700

Val

Leu

Ser

Val

Asp

705 <210> 26 <211> 706 <212> PRT <213> Clostridium perfringens <400> 26

Glu Leu Asn Gly Asn Lys Thr Val Ile Pro Glu Glu Asn Leu

127 ·· ·· • · ·

Phe

Phe

Arg

Asp

Tyr

Ser

Lys

Ile

Asp

Glu

Asn

Asp

Pro

Phe

15

20

25

Ile

Pro

Asn

Asn

Asn

Phe

Phe

Asp

Val

Arg

Phe

Phe

Ser

Ala

30

35

40

Ala

Trp

Glu

Asp

Glu

Asp

Leu

Asp

Thr

Asp

Asn

Asp

Asn

Ile

45

50

55

Pro

Asp

Ala

Tyr

Glu

Lys

Asn

Gly

Tyr

Thr

Ile

Lys

Asp

Ser

60

65

70

Ile

Ala

Val

Lys

Trp

Asn

Asp

Ser

Phe

Ala

Glu

Gin

Gly

Tyr

75

80

Lys

Lys

Tyr

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

Asn

Thr

Ala

Gly

85

90

95

Asp

Pro

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Gin

Lys

Ala

Ser

Gly

Ser

Ile

Asp

100

105

110

Lys

Ala

Ile

Lys

Leu

Glu

Ala

Arg

Asp

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

115

120

125

Tyr

Pro

Val

Val

Gly

Val

Gly

Met

Glu

Asn

Leu

Ile

Ile

Ser

130

135

140

Thr

Asn

Glu

His

Ala

Ser

Ser

Asp

Gin

Gly

Lys

Thr

Val

Ser

145

150

Arg

Ala

Thr

Thr

Asn

Ser

Lys

Thr

Asp

Ala

Asn

Thr

Val

Gly

155

160

165

Val

Ser

Ile

Ser

Ala

Gly

Tyr

Gin

Asn

Gly

Phe

Thr

Gly

Asn

170

175

180

Ile

Thr

Thr

Ser

Tyr

Ser

His

Thr

Thr

Asp

Asn

Ser

Thr

Ala

185

190

195

Val

Gin

Asp

Ser

Asn

Gly

Glu

Ser

Trp

Asn

Thr

Gly

Leu

Ser

200

205

210

Ile

Asn

Lys

Gly

Glu

Ser

Ala

Tyr

Ile

Asn

Ala

Asn

Val

Arg

215

220

Tyr

Tyr

Asn

Thr

Gly

Thr

Ala

Pro

Met

Tyr

Lys

Val

Thr

Pro

225

230

235

Thr

Thr

Asn

Leu

Val

Leu

Asp

Gly

Glu

Thr

Leu

Ala

Thr

Ile

240 245 250

128 «v ♦* • · · • · * • · · »·

I « • «

Lys Ala Gin	Asp	Asn	Gin	Ile Gly 260	Asn Asn	Leu	Ser	Pro 265	Asn
	255
Glu Thr	Tyr	Pro	Lys	Lys	Gly Leu	Ser Pro	Leu	Ala	Leu	Asn
		270				275				280
Thr Met	Asp	Gin	Phe	Asn	Ala Arg	Leu Ile	Pro	Ile	Asn	Tyr
			285			290
Asp Gin	Leu	Lys	Lys	Leu	Asp Ser	Gly Lys	Gin	Ile	Lys	Leu
295				300			305
Glu Thr	Thr	Gin	Val	Ser	Gly Asn	Tyr Gly	Thr	Lys	Asn	Ser
310					315			320
Gin Gly	Gin	Ile	Ile	Thr	Glu Gly	Asn Ser	Trp	Ser	Asn	Tyr
	325				330				335
Ile Ser	Gin	Ile	Asp	Ser	Val Ser	Ala Ser	Ile	Ile	Leu	Asp
		340				345				350
Thr Gly	Ser	Gin	Thr	Phe	Glu Arg	Arg Val	Ala	Ala	Lys	Glu
			355			360
Gin Gly	Asn	Pro	Glu	Asp	Lys Thr	Pro Glu	Ile	Thr	Ile	Gly
365				370			375
Glu Ala	Ile	Lys	Lys	Ala	Phe Ser	Ala Thr	Lys	Asn	Gly	Glu
380					385			390
Leu Leu	Tyr	Phe	Asn	Gly	Ile Pro	Ile Asp	Glu	Ser	Cys	Val
	395				400				405
Glu Leu	Ile	Phe	Asp	Asp	Asn Thr	Ser Glu	Ile	Ile	Lys	Glu
		410				415				420
Gin Leu	Lys	Tyr	Leu	Asp	Asp Lys	Lys Ile	Tyr	Asn	Val	Lys
			425			430
Leu Glu	Arg	Gly	Met	Asn	Ile Leu	Ile Lys	Val	Pro	Ser	Tyr
435				440			445
Phe Thr	Asn	Phe	Asp	Glu	Tyr Asn	Asn Phe	Pro	Ala	Ser	Trp
450					455			460
Ser Asn	Ile	Asp	Thr	Lys	Asn Gin	Asp Gly	Leu	Gin	Ser	Val
	465				470				475
Ala Asn	Lys	Leu	Ser	Gly	Glu Thr	Lys Ile	Ile	Ile	Pro	Met

480 485 490

129

Ser	Lys	Leu Lys	Pro Tyr 495	Lys	Arg	Tyr	Val 500	Phe Ser Gly Tyr
Ser	Lys	Asp Pro	Ser Thr	Ser	Asn	Ser	Ile	Thr Val Asn Ile
505			510					515
Lys	Ser	Lys Glu	Gin Lys	Thr	Asp	Tyr	Leu	Val Pro Glu Lys
	520			525			530
Asp	Tyr	Thr Lys	Phe Ser	Tyr	Glu	Phe	Glu	Thr Thr Gly Lys
		535			540			545
Asp	Ser	Ser Asp	Ile Glu	Ile	Thr	Leu	Thr	Ser Ser Gly Val
		550				555		560
Ile	Phe	Leu Asp	Asn Leu	Ser	Ile	Thr	Glu	Leu Asn Ser Thr
			565				570
Pro	Glu	Ile Leu	Lys Glu	Pro	Glu	Ile	Lys	Val Pro Ser Asp
575			580				585
Gin	Glu	Ile Leu	Asp Ala	His	Asn	Lys	Tyr	Tyr Ala Asp Ile
	590			595				600
Lys	Leu	Asp Thr	Asn Thr	Gly	Asn	Thr	Tyr	Ile Asp Gly Ile
		605			610			615
Tyr	Phe	Glu Pro	Thr Gin	Thr	Asn	Lys	Glu	Ala Leu Asp Tyr
		620				625		630
Ile	Gin	Lys Tyr	Arg Val	Glu	Ala	Thr	Leu	Gin Tyr Ser Gly
			635				640
Phe	Lys	Asp Ile	Gly Thr	Lys	Asp	Lys	Glu	Ile Arg Asn Tyr
645			650					655
Leu	Gly	Asp Gin	Asn Gin	Pro	Lys	Thr	Asn	Tyr Ile Asn Phe
	660			665				670
Arg	Ser	Tyr Phe	Thr Ser	Gly	Glu	Asn	Val	Met Thr Tyr Lys
		675			680			685
Lys	Leu	Arg Ile	Tyr Ala	Val	Thr	Pro	Asp	Asn Arg Glu Leu
		690				695		700
Leu	Val	Leu Ser	Val Asn

705 <210> 27

130 t ·· ·· « » • ·· • · · • · ·

Ol *#* • 99 ·· • fc Φ i · • · · • « » · • « * *·· ···· ·* ♦

•

9999 <211> 712 <212> PRT <213> Clostridium spiroforme <400> 27

Glu

Leu

Asn Gly Asp Lys Thr Leu Ile

Pro

Glu

Lys

Asn

Leu

1

5

10

Phe

Leu

Arg

Asp

Tyr

Ser

Lys

Ile

Asp

Glu

Asn

Asp

Pro

Phe

15

20

25

Ile

Pro

Lys

Asp

Asn

Phe

Phe

Asp

Leu

Lys

Leu

Lys

Ser

Arg

30

35

40

Ser

Ala

Arg

Leu

Ala

Ser

Gly

Trp

Gly

Asp

Glu

Asp

Leu

Asp

45

50

55

Thr

Asp

Asn

Asp

Asn

Ile

Pro

Asp

Ala

Tyr

Glu

Lys

Asn

Gly

60

65

70

Tyr

Thr

Ile

Lys

Asp

Ser

Ile

Ala

Val

Lys

Trp

Glu

Asp

Ser

75

80

Phe

Ala

Gin

Gin

Gly

Tyr

Lys

Lys

Tyr

Leu

Ser

Ser

Tyr

Leu

85

90

95

Glu

Ser

Asn

Thr

Ala

Gly

Asp

Pro

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Gin

Lys

100

105

110

Ala

Ser

Gly

Ser

Phe

Asp

Lys

Ala

Ile

Lys

Ala

Glu

Ala

Arg

115

120

125

Asp

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Tyr

Pro

Val

Val

Gly

Val

Gly

Met

130

135

140

Glu

Lys

Leu

Ile

Ile

Ser

Thr

Asn

Glu

His

Ala

Ser

Thr

Asp

145

150

Gin

Gly

Lys

Thr

Val

Ser

Arg

Asn

Thr

Thr

Asn

Ser

Lys

Thr

155

160

165

Asp

Ala

Asn

Thr

Ala

Gly

Val

Ala

Ile

Asn

Ile

Ala

Tyr

Gin

170

175

180

Asn

Gly

Phe

Thr

Gly

Ser

Ile

Thr

Thr

Asn

Tyr

Ser

His

Thr

185

190

195

Thr

Glu

Asn

Ser

Thr

Ala

Val

Gin

Asn

Ser

Asn

Gly

Glu

Ser

131 • ·

200 205 210

Trp Asn Thr Ser Leu Ser	Ile Asn	Lys	Gly Glu 220	Ser	Ala	Tyr
	215
Ile Asn	Ala Asn Val Arg	Tyr Tyr	Asn	Thr Gly	Thr	Ala	Pro
225	230			235
Met Tyr	Lys Val Thr Pro	Thr Thr	Asn	Leu Val	Leu	Asp	Gly
240		245			250
Asp Thr	Leu Thr Thr Ile	Lys Ala	Gin	Asp Asn	Gin	Ile	Gly
	255	260				265
Asn Asn	Leu Ser Pro Asn	Glu Thr	Tyr	Pro Lys	Lys	Gly	Leu
	270		275				280
Ser Pro	Leu Ala Leu Asn	Thr Met	Asp	Gin Phe	Ser	Ser	Arg
	285			290
Leu Ile	Pro Ile Asn Tyr	Asp Gin	Leu	Lys Lys	Leu	Asp	Ala
295	300			305
Gly Lys	Gin Ile Lys Leu	Glu Thr	Thr	Gin Val	Ser	Gly	Asn
310		315			320
Tyr Gly	Ile Lys Asn Ser	Gin Gly	Gin	Ile Ile	Thr	Glu	Gly
	325	330				335
Asn Ser	Trp Ser Asp Tyr	Ile Ser	Gin	Ile Asp	Ser	Leu	Ser
	340		345				350
Ala Ser	Ile Ile Leu Asp	Thr Gly	Ser	Asp Val	Phe	Glu	Arg
	355			360
Arg Val	Thr Ala Lys Asp	Ser Ser	Asn	Pro Glu	Asp	Lys	Thr
365	370			375
Pro Val	Leu Thr Ile Gly	Glu Ala	Ile	Glu Lys	Ala	Phe	Gly
380		385			390
Ala Thr	Lys Asn Gly Glu	Ile Leu	Tyr	Phe Asn	Gly	Met	Pro
	395	400				405
Ile Asp	Glu Ser Cys Val	Glu Leu	Ile	Phe Asp	Gly	Asn	Thr
	410		415				420
Ala Asn	Leu Ile Lys Glu	Arg Leu	Asn	Ala Leu	Asn	Asp	Lys
	425			430
Lys Ile	Tyr Asn Val Gin	Leu Glu	Arg	Gly Met	Lys	Ile	Leu

132

435 440 445

Ile Lys	Thr Ser	Thr Tyr	Phe Asn Asn Phe Asp 455	Gly 460	Tyr	Asn
	450
Asn	Phe	Pro Ser	Ser Trp	Ser Asn Val Asp Ser	Asn	Asn	Gin
		465		470		475
Asp	Gly	Leu Gin	Asn Ala	Ala Asn Lys Leu Ser	Gly	Glu	Thr
		480		485			490
Lys	Ile	Val Ile	Pro Met	Ser Lys Leu Asn Pro	Tyr	Lys	Arg
			495	500
Tyr	Val	Phe Ser	Gly Tyr	Leu Lys Asn Ser Ser	Thr	Ser	Asn
505			510	515
Pro	Ile	Thr Val	Asn Ile	Lys Ala Lys Glu Gin	Lys	Thr	Tyr
	520			525	530
Asn	Leu	Val Ser	Glu Asn	Asp Tyr Lys Lys Phe	Ser	Tyr	Glu
		535		540		545
Phe	Glu	Thr Ile	Gly Arg	Asp Ala Ser Asn Ile	Glu	Ile	Thr
		550		555			560
Leu	Thr	Ser Ser	Gly Thr	Ile Phe Leu Asp Asn	Leu	Ser	Ile
			565	570
Thr	Glu	Leu Asn	Ser Thr	Pro Glu Ile Leu Lys	Glu	Pro	Asp
575			580	585
Ile	Lys	Val Pro	Ser Asp	Gin Glu Ile Ile Asp	Ala	His	Lys
	590			595	600
Lys	Tyr	Tyr Ala	Asp Leu	Ser Phe Asn Gin Ser	Thr	Ala	Asn
		605		610		615
Tyr	Tyr	Leu Asp	Gly Leu	Tyr Phe Glu Pro Thr	Gin	Thr	Asn
		620		625			630
Lys	Glu	Val Leu	Asp Tyr	Ile Gin Lys Tyr Lys	Val	Glu	Ala
			635	640
Thr	Leu	Glu Tyr	Ser Gly	Phe Lys Asp Ile Gly	Thr	Lys	Asp
645			650	655
Lys	Glu	Leu Arg	Asn Tyr	Thr Gly Asp Ser Asn	Gin	Pro	Lys
	660			665	670
Thr	Asn	Tyr Val	Asn Phe	Arg Ser Tyr Phe Thr	Ser	Gly	Glu

133 • · · ·

675

680

685

Asn

Val

Met

Pro

Tyr

Lys

Lys

Leu

Arg

Ile

Tyr

Ala

Ile

Thr

690

695

700

Pro

Glu

Asn

Lys

Glu

Leu

Leu

Val

Leu

Ser

Ile

Asn

705 710 <210> 28 <211> 582 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 28

Glu

Thr

Ser

Asp

Ile

Ile

Lys

Glu

Ile

Ile

Pro

Ser

Glu

Val

1

5

10

Leu

Leu

Lys

Pro

Asn

Tyr

Ser

Asn

Thr

Asn

Glu

Lys

Ser

Lys

15

20

25

Phe

Ile

Pro

Asn

Asn

Thr

Leu

Phe

Ser

Asn

Ala

Lys

Leu

Lys

30

35

40

Ala

Asn

Ala

Asn

Arg

Asp

Thr

Asp

Arg

Asp

Gly

Ile

Pro

Asp

45

50

55

Glu

Trp

Glu

Ile

Asn

Gly

Tyr

Thr

Val

Met

Asn

Gin

Lys

Ala

60

65

70

Val

Ala

Trp

Asp

Asp

Lys

Phe

Ala

Ala

Asn

Gly

Tyr

Lys

Lys

75

80

Tyr

Val

Ser

Asn

Pro

Phe

Lys

Pro

Cys

Thr

Ala

Asn

Asp

Pro

85

90

95

Tyr

Thr

Asp

Phe

Glu

Lys

Val

Ser

Gly

Gin

Ile

Asp

Pro

Ser

100

105

110

Val

Ser

Met

Val

Ala

Arg

Asp

Pro

Met

Ile

Ser

Ala

Tyr

Pro

115

120

125

Ile

Val

Gly

Val

Gin

Met

Glu

Arg

Leu

Val

Val

Ser

Lys

Ser

130

135

140

Glu

Thr

Ile

Thr

Gly

Asp

Ser

Thr

Lys

Ser

Met

Ser

Lys

Ser

145

150 • · ·

134

Thr Ser His Ser Ser Thr Asn Ile Asn Thr Val Gly Ala Glu

155 160 165

Val Ser Gly Ser Leu Gin Leu Ala Gly Gly Ile Phe Pro Val

170 175 180

Phe Ser Met Ser Ala Ser Ala Asn Tyr Ser His Thr Trp Gin

185 190 195

Asn Thr Ser Thr Val Asp Asp Thr Thr Gly Glu Ser Phe Ser

200 205 210

Gin Gly Leu Ser Ile Asn Thr Gly Glu Ser Ala Tyr Ile Asn

215 220

Pro Asn Ile Arg Tyr Tyr Asn Thr Gly Thr Ala Pro Val Tyr

225 230 235

Asn Val Thr Pro Thr Thr Thr Ile Val Ile Asp Lys Gin Ser

240 245 250

Val Ala Thr Ile Lys Gly Gin Glu Ser Leu Ile Gly Asp Tyr

255 260 265

Leu Asn Pro Gly Gly Thr Tyr Pro Ile Ile Gly Glu Pro Pro

270 275 280

Met Ala Leu Asn Thr Met Asp Gin Phe Ser Ser Arg Leu Ile

285 290

Pro Ile Asn Tyr Asn Gin Leu Lys Ser Ile Asp Asn Gly Gly 295 300 305

Thr

Val 310

Met

Leu

Ser

Thr Ser Gin Phe Thr Gly Asn Phe

Ala

315

320

Lys

Tyr

Asn

Ser

Asn

Gly

Asn

Leu

Val

Thr

Asp

Gly

Asn

Asn

325

330

335

Trp

Gly

Pro

Tyr

Leu

Gly

Thr

Ile

Lys

Ser

Thr

Thr

Ala

Ser

340

345

350

Leu

Thr

Leu

Ser

Phe

Ser

Gly

Gin

Thr

Thr

Gin

Val

Ala

Val

355

360

Val

Ala

Pro

Asn

Phe

Ser

Asp

Pro

Glu

Asp

Lys

Thr

Pro

Lys

365

370

375

Leu

Thr

Leu

Glu

Gin

Ala

Leu

Val

Lys

Ala

Phe

Ala

Leu

Glu

380

385

390

• · • ·

135

Lys	Lys	Asn Gly Lys Phe Tyr Phe His	Gly	Leu	Glu	Ile 405	Ser
395	400
Lys	Asn	Glu	Lys Ile Gin Val Phe Leu	Asp	Ser	Asn	Thr	Asn
			410 415					420
Asn	Asp	Phe	Glu Asn Gin Leu Lys Asn	Thr	Ala	Asp	Lys	Asp
			425	430
Ile	Met	His	Cys Ile Ile Lys Arg Asn	Met	Asn	Ile	Leu	Val
435			440		445
Lys	Val	Ile	Thr Phe Lys Glu Asn Ile	Ser	Ser	Ile	Asn	Ile
	450		455			460
Ile	Asn	Asp	Thr Asn Phe Gly Val Gin	Ser	Met	Thr	Gly	Leu
		465	470				475
Ser	Asn	Arg	Ser Lys Gly Gin Asp Gly	Ile	Tyr	Arg	Ala	Ala
			480 485					490
Thr	Thr	Ala	Phe Ser Phe Lys Ser Lys	Glu	Leu	Lys	Tyr	Pro
			495	500
Glu	Gly	Arg	Tyr Arg Met Arg Phe Val	Ile	Gin	Ser	Tyr	Glu
505			510		515
Pro	Phe	Thr	Cys Asn Phe Lys Leu Phe	Asn	Asn	Leu	Ile	Tyr
	520		525			530
Ser	Ser	Ser	Phe Asp Lys Gly Tyr Tyr	Asp	Glu	Phe	Phe	Tyr
		535	540				545
Phe	Tyr	Tyr	Asn Gly Ser Lys Ser Phe	Phe	Asn	Ile	Ser	Cys
			550 555					560
Asp	Ile	Ile	Asn Ser Ile Asn Arg Leu	Ser	Gly	Val	Phe	Leu
			565	570
Ile	Glu	Leu	Asp Lys Leu Ile Ile

575 580 <210> 29 <211> 708 <212> PRT <213> Bacillus cereus • ·

136 • · · · • · · · · • · · ·· ·· ····

<400> 29

Ile

Asp

Ser

Gin

Asn

Gin

Pro

Gin

Gin

Val

Gin

Gin

Asp

Glu

1

5

10

Leu

Arg

Asn

Pro

Glu

Phe

Asn

Lys

Lys

Glu

Ser

Gin

Glu

Phe

15

20

25

Leu

Ala

Lys

Pro

Ser

Lys

Ile

Asn

Leu

Phe

Thr

Gin

Gin

Met

30

35

40

Lys

Arg

Glu

Ile

Asp

Glu

Asp

Thr

Asp

Thr

Asp

Gly

Asp

Ser

45

50

55

Ile

Pro

Asp

Leu

Trp

Glu

Glu

Asn

Gly

Tyr

Thr

Ile

Gin

Asn

60

65

70

Arg

Ile

Ala

Val

Lys

Trp

Asp

Asp

Ser

Leu

Ala

Ser

Lys

Gly

75

80

Tyr

Thr

Lys

Phe

Val

Ser

Asn

Pro

Leu

Glu

Ser

His

Thr

Val

85

90

95

Gly

Asp

Pro

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Glu

Lys

Ala

Ala

Arg

Asp

Leu

100

105

110

Asp

Leu

Ser

Asn

Ala

Lys

Glu

Thr

Phe

Asn

Pro

Leu

Val

Ala

115

120

125

Ala

Phe

Pro

Ser

Val

Asn

Val

Ser

Met

Glu

Lys

Val

Ile

Leu

130

135

140

Ser

Pro

Asn

Glu

Asn

Leu

Ser

Asn

Ser

Val

Glu

Ser

His

Ser

145

150

Ser

Thr

Asn

Trp

Ser

Tyr

Thr

Asn

Thr

Glu

Gly

Ala

Ser

Val

155

160

165

Glu

Ala

Gly

Ile

Gly

Pro

Lys

Gly

Ile

Ser

Phe

Gly

Val

Ser

170

175

180

Val

Asn

Tyr

Gin

His

Ser

Glu

Thr

Val

Ala

Gin

Glu

Trp

Gly

185

190

195

Thr

Ser

Thr

Gly

Asn

Thr

Ser

Gin

Phe

Asn

Thr

Ala

Ser

Ala

200

205

210

Gly

Tyr

Leu

Asn

Ala

Asn

Val

Arg

Tyr

Asn

Asn

Val

Gly

Thr

215

220

Gly

Ala

Ile

Tyr

Asp

Val

Lys

Pro

Thr

Thr

Ser

Phe

Val

Leu

137 • ·

225

230

235

Asn

Asn

Asp

Thr

Ile

Ala

Thr

Ile

Thr

Ala

Lys

Ser

Asn

Ser

240

245

250

Thr

Ala

Leu

Asn

Ile

Ser

Pro

Gly

Glu

Ser

Tyr

Pro

Lys

Lys

255

260

265

Gly

Gin

Asn

Gly

Ile

Ala

Ile

Thr

Ser

Met

Asp

Asp

Phe

Asn

270

275

280

Ser

His

Pro

Ile

Thr

Leu

Asn

Lys

Lys

Gin

Val

Asp

Asn

Leu

285

290

Leu

Asn

Asn

Lys

Pro

Met

Met

Leu

Glu

Thr

Asn

Gin

Thr

Asp

295

300

305

Gly

Val

Tyr

Lys

Ile

Lys

Asp

Thr

His

Gly

Asn

Ile

Val

Thr

310

315

320

Gly

Gly

Glu

Trp

Asn

Gly

Val

Ile

Gin

Gin

Ile

Lys

Ala

Lys

325

330

335

Thr

Ala

Ser

Ile

Ile

Val

Asp

Asp

Gly

Glu

Arg

Val

Ala

Glu

340

345

350

Lys

Arg

Val

Ala

Ala

Lys

Asp

Tyr

Glu

Asn

Pro

Glu

Asp

Lys

355

360

Thr

Pro

Ser

Leu

Thr

Leu

Lys

Asp

Ala

Leu

Lys

Leu

Ser

Tyr

365

370

375

Pro

Asp

Glu

Ile

Lys

Glu

Ile

Glu

Gly

Leu

Leu

Tyr

Tyr

Lys

380

385

390

Asn

Lys

Pro

Ile

Tyr

Glu

Ser

Ser

Val

Met

Thr

Tyr

Leu

Asp

395

400

405

Glu

Asn

Thr

Ala

Lys

Glu

Val

Thr

Lys

Gin

Leu

Asn

Asp

Thr

410

415

420

Thr

Gly

Lys

Phe

Lys

Asp

Val

Ser

His

Leu

Tyr

Asp

Val

Lys

425

430

Leu

Thr

Pro

Lys

Met

Asn

Val

Thr

Ile

Lys

Leu

Ser

Ile

Leu

435

440

445

Tyr

Asp

Asn

Ala

Glu

Ser

Asn

Asp

Asn

Ser

Ile

Gly

Lys

Trp

450

455

460

Thr

Asn

Thr

Asn

Ile

Val

Ser

Gly

Gly

Asn

Asn

Gly

Lys

Lys

138

465 470 475

Gin Tyr Ser Ser	Asn	Asn Pro Asp Ala Asn Leu Thr Leu Asn
	480	485	490
Thr Asp Ala	Gin	Glu	Lys Leu Asn Lys Asn Arg Asp Tyr	Tyr
		495 500
Ile Ser Leu	Tyr	Met	Lys Ser Glu Lys Asn Thr Gin Cys	Glu
505			510 515
Ile Thr Ile	Asp	Gly	Glu Ile Tyr Pro Ile Thr Thr Lys	Thr
520			525 530
Val Asn Val	Asn	Lys	Asp Asn Tyr Lys Arg Leu Asp Ile	Ile
535			540 545
Ala His Asn	Ile	Lys	Ser Asn Pro Ile Ser Ser Leu His	Ile
	550		555	560
Lys Thr Asn	Asp	Glu	Ile Thr Leu Phe Trp Asp Asp Ile	Ser
		565	570
Ile Thr Asp	Val	Ala	Ser Ile Lys Pro Glu Asn Leu Thr	Asp
575			580 585
Ser Glu Ile	Lys	Gin	Ile Tyr Ser Arg Tyr Gly Ile Lys	Leu
590			595 600
Glu Asp Gly	Ile	Leu	Ile Asp Lys Lys Gly Gly Ile His	Tyr
605			610 615
Gly Glu Phe	Ile	Asn	Glu Ala Ser Phe Asn Ile Glu Pro	Leu
	620		625	630
Gin Asn Tyr	Val	Thr	Lys Tyr Glu Val Thr Tyr Ser Ser	Glu
		635	640
Leu Gly Pro	Asn	Val	Ser Asp Thr Leu Glu Ser Asp Lys	i Ile
645			650 655
Tyr Lys Asp	Gly	Thr	Ile Lys Phe Asp Phe Thr Lys Tyr	Ser
660			665 670
Lys Asn Glu	Gin	Gly	Leu Phe Tyr Asp Ser Gly Leu Asn	Trp
675			680 685
Asp Phe Lys	Ile	Asn	Ala Ile Thr Tyr Asp Gly Lys Glu	Met
	690		695	700
Asn Val Phe	His	Arg	Tyr Asn Lys

139

705 <210> 30 <211> 735 <212> PRT <213> Bacillus anthracis <400> 30

Glu

Val

Lys

Gin

Glu

Asn

Arg

Leu

Leu

Asn

Glu

Ser

Glu

Ser

1

5

10

Ser

Ser

Gin

Gly

Leu

Leu

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Asp

Leu

Asn

15

20

25

Phe

Gin

Ala

Pro

Met

Val

Val

Thr

Ser

Ser

Thr

Thr

Gly

Asp

30

35

40

Leu

Ser

Ile

Pro

Ser

Ser

Glu

Leu

Glu

Asn

Ile

Pro

Ser

Glu

45

50

55

Asn

Gin

Tyr

Phe

Gin

Ser

Ala

Ile

Trp

Ser

Gly

Phe

Ile

Lys

60

65

70

Val

Lys

Lys

Ser

Asp

Glu

Tyr

Thr

Phe

Ala

Thr

Ser

Ala

Asp

75

80

Asn

His

Val

Thr

Met

Trp

Val

Asp

Asp

Gin

Glu

Val

Ile

Asn

85

90

95

Lys

Ala

Ser

Asn

Ser

Asn

Lys

Ile

Arg

Leu

Glu

Lys

Gly

Arg

100

105

110

Leu

Tyr

Gin

Ile

Lys

Ile

Gin

Tyr

Gin

Arg

Glu

Asn

Pro

Thr

115

120

125

Glu

Lys

Gly

Leu

Asp

Phe

Lys

Leu

Tyr

Trp

Thr

Asp

Ser

Gin

130

135

140

Asn

Lys

Lys

Glu

Val

Ile

Ser

Ser

Asp

Asn

Leu

Gin

Leu

Pro

145

150

Glu

Leu

Lys

Gin

Lys

Ser

Ser

Asn

Ser

Arg

Lys

Lys

Arg

Ser

155

160

165

Thr

Ser

Ala

Gly

Pro

Thr

Val

Pro

Asp

Arg

Asp

Asn

Asp

Gly

170 175 180 « ·

140

Ile Pro Asp	Ser Leu	Glu Val Glu Gly Tyr 190	Thr	Val	Asp 195	Val
	185
Lys Asn	Lys	Arg Thr	Phe Leu Ser Pro Trp	Ile	Ser	Asn	Ile
		200	205				210
His Glu	Lys	Lys Gly	Leu Thr Lys Tyr Lys	Ser	Ser	Pro	Glu
		215	220
Lys Trp	Ser	Thr Ala	Ser Asp Pro Tyr Ser	Asp	Phe	Glu	Lys
225			230	235
Val Thr	Gly	Arg Ile	Asp Lys Asn Val Ser	Pro	Glu	Ala	Arg
240			245		250
His Pro	Leu	Val Ala	Ala Tyr Pro Ile Val	His	Val	Asp	Met
	255		260			265
Glu Asn	Ile	Ile Leu	Ser Lys Asn Glu Asp	Gin	Ser	Thr	Gin
		270	275				280
Asn Thr	Asp	Ser Gin	Thr Arg Thr Ile Ser	Lys	Asn	Thr	Ser
		285	290
Thr Ser	Arg	Thr His	Thr Ser Glu Val His	Gly	Asn	Ala	Glu
295			300	305
Val His	Ala	Ser Phe	Phe Asp Ile Gly Gly	Ser	Val	Ser	Ala
310			315		320
Gly Phe	Ser	Asn Ser	Asn Ser Ser Thr Val	Ala	Ile	Asp	His
	325		330			335
Ser Leu	Ser	Leu Ala	Gly Glu Arg Thr Trp	Ala	Glu	Thr	Met
		340	345				350
Gly Leu	Asn	Thr Ala	Asp Thr Ala Arg Leu	Asn	Ala	Asn	Ile
		355	360
Arg Tyr	Val	Asn Thr	Gly Thr Ala Pro Ile	Tyr	Asn	Val	Leu

365 370 375

Pro Thr Thr Ser Leu Val Leu Gly Lys Asn Gin Thr Leu Ala 380 385 390

Thr Ile Lys Ala Lys Glu Asn Gin Leu Ser Gin Ile Leu Ala 395 400 405

Pro Asn Asn Tyr Tyr Pro Ser Lys Asn Leu Ala Pro Ile Ala 410 415 420

141 • · • ·· φ· ·· ♦· • « · · · • · · · • · · · · • · · ♦ ·«·· ·♦ ····

Leu Asn Ala Gin	Asp Asp Phe Ser Ser 425	Thr Pro 430	Ile	Thr	Met
Asn Tyr Asn Gin	Phe Leu Glu Leu Glu	Lys Thr	Lys	Gin	Leu
435	440	445
Arg Leu Asp Thr	Asp Gin Val Tyr Gly	Asn Ile	Ala	Thr	Tyr
450	455		460
Asn Phe Glu Asn	Gly Arg Val Arg Val	Asp Thr	Gly	Ser	Asn
465	470			475
Trp Ser Glu Val	Leu Pro Gin Ile Gin	Glu Thr	Thr	Ala	Arg
480	485				490
Ile Ile Phe Asn	Gly Lys Asp Leu Asn	Leu Val	Glu	Arg	Arg
	495	500
Ile Ala Ala Val	Asn Pro Ser Asp Pro	Leu Glu	Thr	Thr	Lys
505	510	515
Pro Asp Met Thr	Leu Lys Glu Ala Leu	Lys Ile	Ala	Phe	Gly
520	525		530
Phe Asn Glu Pro	Asn Gly Asn Leu Gin	Tyr Gin	Gly	Lys	Asp
535	540			545
Ile Thr Glu Phe	Asp Phe Asn Phe Asp	Gin Gin	Thr	Ser	Gin
550	555				560
Asn Ile Lys Asn	Gin Leu Ala Glu Leu	Asn Val	Thr	Asn	Ile
	565	570
Tyr Thr Val Leu	Asp Lys Ile Lys Leu	Asn Ala	Lys	Met	Asn
575	580	585
Ile Leu Ile Arg	Asp Lys Arg Phe His	Tyr Asp	Arg	Asn	Asn
590	595		600
Ile Ala Val Gly	Ala Asp Glu Ser Val	Val Lys	Glu	Ala	His
605	610			615
Arg Glu Val Ile	Asn Ser Ser Thr Glu	Gly Leu	Leu	Leu	Asn
620	625				630
Ile Asp Lys Asp	Ile Arg Lys Ile Leu	Ser Gly	Tyr	Ile	Val
	635	640
Glu Ile Glu Asp	Thr Glu Gly Leu Lys	Glu Val	Ile	Asn	Asp

645 650 655

142

Arg Tyr 660

Asp Met

Leu Asn

Ile Ser Ser Leu Arg Gin Asp

Gly

665

670

Lys

Thr

Phe

Ile

Asp

Phe

Lys

Lys

Tyr

Asn

Asp

Lys

Leu

Pro

675

680

685

Leu

Tyr

Ile

Ser

Asn

Pro

Asn

Tyr

Lys

Val

Asn

Val

Tyr

Ala

690

695

700

Val

Thr

Lys

Glu

Asn

Thr

Ile

Ile

Asn

Pro

Ser

Glu

Asn

Gly

705

710

Asp

Thr

Ser

Thr

Asn

Gly

Ile

Lys

Lys

Ile

Leu

Ile

Phe

Ser

715

720

725

Lys

Lys

Gly

Tyr

Glu

Ile

Gly

730 735 <210> 31 <211> 876 <212> PRT <213> Clostridium difficile <400> 31

Met

Lys

Ile

Gin

Met

Arg

Asn

Lys

Lys

Val

Leu

Ser

Phe

Leu

1

5

10

Thr

Leu

Thr

Ala

Ile

Val

Ser

Gin

Ala

Leu

Val

Tyr

Pro

Val

15

20

25

Tyr

Ala

Gin

Thr

Ser

Thr

Ser

Asn

His

Ser

Asn

Lys

Lys

Lys

30

35

40

Glu

Ile

Val

Asn

Glu

Asp

Ile

Leu

Pro

Asn

Asn

Gly

Leu

Met

45

50

55

Gly

Tyr

Tyr

Phe

Ser

Asp

Glu

His

Phe

Lys

Asp

Leu

Lys

Leu

60

65

70

Met

Ala

Pro

Ile

Lys

Asp

Gly

Asn

Leu

Lys

Phe

Glu

Glu

Lys

75

80

Lys

Val

Asp

Lys

Leu

Leu

Asp

Lys

Asp

Lys

Ser

Asp

Val

Lys

85

90

95

Ser

Ile

Arg

Trp

Thr

Gly

Arg

Ile

Ile

Pro

Ser

Lys

Asp

Gly

143 • ·

100

105

110

Glu

Tyr

Thr

Leu

Ser

Thr

Asp

Arg

Asp Asp

Val

Leu

Met

Gin

115

120

125

Val

Asn

Thr

Glu

Ser

Thr

Ile

Ser

Asn

Thr

Leu

Lys

Val

Asn

130

135

140

Met

Lys

Lys

Gly

Lys

Glu

Tyr

Lys

Val

Arg

Ile

Glu

Leu

Gin

145

150

Asp

Lys

Asn

Leu

Gly

Ser

Ile

Asp

Asn

Leu

Ser

Ser

Pro

Asn

155

160

165

Leu

Tyr

Trp

Glu

Leu

Asp

Gly

Met

Lys

Lys

Ile

Ile

Pro

Glu

170

175

180

Glu

Asn

Leu

Phe

Leu

Arg

Asp

Tyr

Ser

Asn

Ile

Glu

Lys

Asp

185

190

195

Asp

Pro

Phe

Ile

Pro

Asn

Asn

Asn

Phe

Phe

Asp

Pro

Lys

Leu

200

205

210

Met

Ser

Asp

Trp

Glu

Asp

Glu

Asp

Leu

Asp

Thr

Asp

Asn

Asp

215

220

Asn

Ile

Pro

Asp

Ser

Tyr

Glu

Arg

Asn

Gly

Tyr

Thr

Ile

Lys

225

230

235

Asp

Leu

Ile

Ala

Val

Lys

Trp

Glu

Asp

Ser

Phe

Ala

Glu

Gin

240

245

250

Gly

Tyr

Lys

Lys

Tyr

Val

Ser

Asn

Tyr

Leu

Glu

Ser

Asn

Thr

255

260

265

Ala

Gly

Asp

Pro

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Glu

Lys

Ala

Ser

Gly

Ser

270

275

280

Phe

Asp

Lys

Ala

Ile

Lys

Thr

Glu

Ala

Arg

Asp

Pro

Leu

Val

285

290

Ala

Ala

Tyr

Pro

Ile

Val

Gly

Val

Gly

Met

Glu

Lys

Leu

Ile

295

300

305

Ile

Ser

Thr

Asn

Glu

His

Ala

Ser

Thr

Asp

Gin

Gly

Lys

Thr

310

315

320

Val

Ser

Arg

Ala

Thr

Thr

Asn

Ser

Lys

Thr

Glu

Ser

Asn

Thr

325

330

335

Ala Gly Val Ser Val Asn Val Gly Tyr Gin Asn Gly Phe Thr

144

340 345 350

Ala Asn Val

Thr

Thr Asn Tyr 355

Ser

His

Thr Thr Asp Asn Ser 360

Thr

Ala

Val

Gin

Asp

Ser

Asn

Gly

Glu

Ser

Trp

Asn

Thr

Gly

365

370

375

Leu

Ser

Ile

Asn

Lys

Gly

Glu

Ser

Ala

Tyr

Ile

Asn

Ala

Asn

380

385

390

Val

Arg

Tyr

Tyr

Asn

Thr

Gly

Thr

Ala

Pro

Met

Tyr

Lys

Val

395

400

405

Thr

Pro

Thr

Thr

Asn

Leu

Val

Leu

Asp

Gly

Asp

Thr

Leu

Ser

410

415

420

Thr

Ile

Lys

Ala

Gin

Glu

Asn

Gin

Ile

Gly

Asn

Asn

Leu

Ser

425

430

Pro

Gly

Asp

Thr

Tyr

Pro

Lys

Lys

Giy

Leu

Ser

Pro

Leu

Ala

435

440

445

Leu

Asn

Thr

Met

Asp

Gin

Phe

Ser

Ser

Arg

Leu

Ile

Pro

Ile

450

455

460

Asn

Tyr

Asp

Gin

Leu

Lys

Lys

Leu

Asp

Ala

Gly

Lys

Gin

Ile

465

470

475

Lys

Leu

Glu

Thr

Thr

Gin

Val

Ser

Gly

Asn

Phe

Gly

Thr

Lys

480

485

490

Asn

Ser

Ser

Gly

Gin

Ile

Val

Thr

Glu

Gly

Asn

Ser

Trp

Ser

495

500

Asp

Tyr

Ile

Ser

Gin

Ile

Asp

Ser

Ile

Ser

Ala

Ser

Ile

Ile

505

510

515

Leu

Asp

Thr

Glu

Asn

Glu

Ser

Tyr

Glu

Arg

Arg

Val

Thr

Ala

520

525

530

Lys

Asn

Leu

Gin

Asp

Pro

Glu

Asp

Lys

Thr

Pro

Glu

Leu

Thr

535

540

545

Ile

Gly

Glu

Ala

Ile

Glu

Lys

Ala

Phe

Gly

Ala

Thr

Lys

Lys

550

555

560

Asp

Gly

Leu

Leu

Tyr

Phe

Asn

Asp

Ile

Pro

Ile

Asp

Glu

Ser

565

570

Cys Val Glu Leu Ile Phe Asp Asp Asn Thr Ala Asn Lys Ile

145

575

580

585

Lys

Asp

Ser

Leu

Lys

Thr

Leu

Ser

Asp

Lys

Lys

Ile

Tyr

Asn

590

595

600

Val

Lys

Leu

Glu

Arg

Gly

Met

Asn

Ile

Leu

Ile

Lys

Thr

Pro

605

610

615

Thr

Tyr

Phe

Thr

Asn

Phe

Asp

Asp

Tyr

Asn

Asn

Tyr

Pro

Ser

620

625

630

Thr

Trp

Ser

Asn

Val

Asn

Thr

Thr

Asn

Gin

Asp

Gly

Leu

Gin

635

640

Gly

Ser

Ala

Asn

Lys

Leu

Asn

Gly

Glu

Thr

Lys

Ile

Lys

Ile

645

650

655

Pro

Met

Ser

Glu

Leu

Lys

Pro

Tyr

Lys

Arg

Tyr

Val

Phe

Ser

660

665

670

Gly

Tyr

Ser

Lys

Asp

Pro

Leu

Thr

Ser

Asn

Ser

Ile

Ile

Val

675

680

685

Lys

Ile

Lys

Ala

Lys

Glu

Glu

Lys

Thr

Asp

Tyr

Leu

Val

Pro

690

695

700

Glu

Gin

Gly

Tyr

Thr

Lys

Phe

Ser

Tyr

Glu

Phe

Glu

Thr

Thr

705

710

Glu

Lys

Asp

Ser

Ser

Asn

Ile

Glu

Ile

Thr

Leu

Ile

Gly

Ser

715

720

725

Gly

Thr

Thr

Tyr

Leu

Asp

Asn

Leu

Ser

Ile

Thr

Glu

Leu

Asn

730

735

740

Ser

Thr

Pro

Glu

Ile

Leu

Asp

Glu

Pro

Glu

Val

Lys

Ile

Pro

745

750

755

Thr

Asp

Gin

Glu

Ile

Met

Asp

Ala

His

Lys

Ile

Tyr

Phe

Ala

760

765

770

Asp

Leu

Asn

Phe

Asn

Pro

Ser

Thr

Gly

Asn

Thr

Tyr

Ile

Asn

775 780

Gly Met Tyr Phe Ala Pro Thr Gin Thr Asn Lys Glu Ala Leu

785 790 795

Asp Tyr Ile Gin Lys Tyr Arg Val Glu Ala Thr Leu Gin Tyr

800 805 810

Ser Gly Phe Lys Asp Ile Gly Thr Lys Asp Lys Glu Met Arg

146

815

820

825

Asn

Tyr

Leu

Gly

Asp

Pro

Asn

Gin

Pro

Lys

Thr

Asn

Tyr

Val

830

835

840

Asn

Leu

Arg

Ser

Tyr

Phe

Thr

Gly

Gly

Glu

Asn

Ile

Met

Thr

845

850

Tyr

Lys

Lys

Leu

Arg

Ile

Tyr

Ala

Ile

Thr

Pro

Asp

Asp

Arg

855

860

865

Glu

Leu

Leu

Val

Leu

Ser

Val

Asp

870

875

<210> 32 <211> 875 <212> PRT <213> Clostridium perfringens

<400> 32

Met

Asn

Ile

Gin

Ile

Lys

Asn

Val

Phe

Ser

Phe

Leu

Thr

Leu

1

5

10

Thr

Ala

Met

Ile

Ser

Gin

Thr

Leu

Ser

Tyr

Asn

Val

Tyr

Ala

15

20

25

Gin

Thr

Thr

Thr

Gin

Asn

Asp

Thr

Asn

Gin

Lys

Glu

Glu

Ile

30

35

40

Thr

Asn

Glu

Asn

Thr

Leu

Ser

Ser

Asn

Gly

Leu

Met

Gly

Tyr

45

50

55

Tyr

Phe

Ala

Asp

Glu

His

Phe

Lys

Asp

Leu

Glu

Leu

Met

Ala

60

65

70

Pro

Ile

Lys

Asn

Gly

Asp

Leu

Lys

Phe

Glu

Glu

Lys

Lys

Val

75

80

Asp

Lys

Leu

Leu

Thr

Glu

Asp

Asn

Ser

Ser

Ile

Lys

Ser

Ile

85

90

95

Arg

Trp

Thr

Gly

Arg

Ile

Ile

Pro

Ser

Glu

Asp

Gly

Glu

Tyr

100

105

110

Ile

Leu

Ser

Thr

Asp

Arg

Asn Asp

Val

Leu

Met

Gin

Ile

Asn

115 120

125

147 ♦ · · 4 4 >·<···· 4 · · · * 4

Ala

Lys Gly Asp 130

Ile Ala Lys Thr Leu Lys Val Asn Met 135

Lys 140

Lys

Gly

Gin

Ala

Tyr

Asn

Ile

Arg

Ile

Glu

Ile

Gin

Asp

Lys

145

150

Asn

Leu

Gly

Ser

Ile

Asp

Asn

Leu

Ser

Val

Pro

Lys

Leu

Tyr

155

160

165

Trp

Glu

Leu

Asn

Gly

Asn

Lys

Thr

Val

Ile

Pro

Glu

Glu

Asn

170

175

180

Leu

Phe

Phe

Arg

Asp

Tyr

Ser

Lys

Ile

Asp

Glu

Asn

Asp

Pro

185

190

195

Phe

Ile

Pro

Asn

Asn

Asn

Phe

Phe

Asp

Val

Arg

Phe

Phe

Ser

200

205

210

Ala

Ala

Trp

Glu

Asp

Glu

Asp

Leu

Asp

Thr

Asp

Asn

Asp

Asn

215

220

Ile

Pro

Asp

Ala

Tyr

Glu

Lys

Asn

Gly

Tyr

Thr

Ile

Lys

Asp

225

230

235

Ser

Ile

Ala

Val

Lys

Trp

Asn

Asp

Ser

Phe

Ala

Glu

Gin

Gly

240

245

250

Tyr

Lys

Lys

Tyr

Val

Ser

Ser

Tyr

Leu

Glu

Ser

Asn

Thr

Ala

255

260

265

Gly

Asp

Pro

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Gin

Lys

Ala

Ser

Gly

Ser

Ile

270

275

280

Asp

Lys

Ala

Ile

Lys

Leu

Glu

Ala

Arg

Asp

Pro

Leu

Val

Ala

285

290

Ala

Tyr

Pro

Val

Val

Gly

Val

Gly

Met

Glu

Asn

Leu

Ile

Ile

295

300

305

Ser

Thr

Asn

Glu

His

Ala

Ser

Ser

Asp

Gin

Gly

Lys

Thr

Val

310

315

320

Ser

Arg

Ala

Thr

Thr

Asn

Ser

Lys

Thr

Asp

Ala

Asn

Thr

Val

325

330

335

Gly

Val

Ser

Ile

Ser

Ala

Gly

Tyr

Gin

Asn

Gly

Phe

Thr

Gly

340

345

350

Asn

Ile

Thr

Thr

Ser

Tyr

Ser

His

Thr

Thr

Asp

Asn

Ser

Thr

355 360

148

Ala	Val	Gin	Asp	Ser Asn Gly Glu	Ser Trp Asn Thr Gly Leu
365				370	375
Ser	Ile	Asn	Lys	Gly Glu Ser Ala	Tyr Ile Asn Ala Asn Val
	380			385	390
Arg	Tyr	Tyr	Asn	Thr Gly Thr Ala	Pro Met Tyr Lys Val Thr
		395		40C	) 405
Pro	Thr	Thr	Asn	Leu Val Leu Asp	Gly Glu Thr Leu Ala Thr
			410		415 420
Ile	Lys	Ala	Gin	Asp Asn Gin Ile	Gly Asn Asn Leu Ser Pro
				425	430
Asn	Glu	Thr	Tyr	Pro Lys Lys Gly	Leu Ser Pro Leu Ala Leu
435				440	445
Asn	Thr	Met	Asp	Gin Phe Asn Ala	Arg Leu Ile Pro Ile Asn
	450			455	460
Tyr	Asp	Gin	Leu	Lys Lys Leu Asp	Ser Gly Lys Gin Ile Lys
		465		470	475
Leu	Glu	Thr	Thr	Gin Val Ser Gly	Asn Tyr Gly Thr Lys Asn
			480		485 490
Ser	Gin	Gly	Gin	Ile Ile Thr Glu	Gly Asn Ser Trp Ser Asn
				495	500
Tyr	Ile	Ser	Gin	Ile Asp Ser Val	Ser Ala Ser Ile Ile Leu
505				510	515
Asp	Thr	Gly	Ser	Gin Thr Phe Glu	Arg Arg Val Ala Ala Lys
	520			525	530
Glu	Gin	Giy	Asn	Pro Glu Asp Lys	Thr Pro Glu Ile Thr Ile
		535		540	545
Gly	Glu	Ala	Ile	Lys Lys Ala Phe	Ser Ala Thr Lys Asn Gly
			550		555 560
Glu	Leu	Leu	Tyr	Phe Asn Gly Ile	Pro Ile Asp Glu Ser Cys
				565	570
Val	Glu	Leu	Ile	Phe Asp Asp Asn	Thr Ser Glu Ile Ile Lys
575				580	585
Glu	Gin	Leu	Lys	Tyr Leu Asp Asp	Lys Lys Ile Tyr Asn Val

590 595 600

149

Lys	Leu	Glu 605	Arg	Gly	Met	Asn Ile Leu 610	Ile	Lys	Val	Pro Ser 615
Tyr	Phe	Thr	Asn	Phe	Asp	Glu Tyr Asn	Asn	Phe	Pro	Ala Ser
			620			625			630
Trp	Ser	Asn	Ile	Asp	Thr	Lys Asn Gin	Asp	Gly	Leu	Gin Ser
				635		640
Val	Ala	Asn	Lys	Leu	Ser	Gly Glu Thr	Lys	Ile	Ile	Ile Pro
645					650			655
Met	Ser	Lys	Leu	Lys	Pro	Tyr Lys Arg	Tyr	Val	Phe	Ser Gly
	660					665			670
Tyr	Ser	Lys	Asp	Pro	Ser	Thr Ser Asn	Ser	Ile	Thr	Val Asn
		675				680				685
Ile	Lys	Ser	Lys	Glu	Gin	Lys Thr Asp	Tyr	Leu	Val	Pro Glu
			690			695				700
Lys	Asp	Tyr	Thr	Lys	Phe	Ser Tyr Glu	Phe	Glu	Thr	Thr Gly
				705			710
Lys	Asp	Ser	Ser	Asp	Ile	Glu Ile Thr	Leu	Thr	Ser	Ser Gly
715					720			725
Val	Ile	Phe	Leu	Asp	Asn	Leu Ser Ile	Thr	Glu	Leu	Asn Ser
	730					735			740
Thr	Pro	Glu	Ile	Leu	Lys	Glu Pro Glu	Ile	Lys	Val	Pro Ser
		745				750				755
Asp	Gin	Glu	Ile	Leu	Asp	Ala His Asn	Lys	Tyr	Tyr	Ala Asp
			760			765				770
Ile	Lys	Leu	Asp	Thr	Asn	Thr Gly Asn	Thr	Tyr	Ile	Asp Gly
				775			780
Ile	Tyr	Phe	Glu	Pro	Thr	Gin Thr Asn	Lys	Glu	Ala	Leu Asp
785					790			795
Tyr	Ile	Gin	Lys	Tyr	Arg	Val Glu Ala	Thr	Leu	Gin	Tyr Ser
	800					805			810
Gly	Phe	Lys	Asp	Ile	Gly	Thr Lys Asp	Lys	Glu	Ile	Arg Asn
		815				820				825
Tyr	Leu	Gly	Asp	Gin	Asn	Gin Pro Lys	Thr	Asn	Tyr	Ile Asn

830 835

840

150 ·* * · ** • « « • · · • · · • · · ·· ···· • * » · k «

Λ9

Phe Arg Ser

Tyr

Phe Thr Ser Gly Glu Asn Val

Met Thr

Tyr

845

850

Lys

Lys

Leu

Arg

Ile

Tyr

Ala Val

Thr

Pro

Asp

Asn

Arg

Glu

855

860

865

Leu

Leu

Val

Leu

Ser

Val

Asn

870

875

<210> 33 <211> 879 <212> PRT <213> Clostridium spiroforme <400> 33

Met

Lys

Asn

Lys

Lys

Ile

Leu

Gly

Leu

Leu

Thr

Cys

Thr

Val

1

5

10

Leu

Val

Gly

Gin

Met

Met

Thr

Tyr

Pro

Val

Tyr

Ala

Lys

Thr

15

20

25

Ile

Thr

Gin

Asn

Tyr

Asp

Asn

Gin

Glu

Val

Glu

Thr

Thr

Asn

30

35

40

Glu

Lys

Thr

Val

Ser

Ser

Asn

Gly

Leu

Met

Gly

Tyr

Tyr

Phe

45

50

55

Ala

Asp

Glu

His

Phe

Lys

Asp

Leu

Glu

Leu

Met

Ala

Pro

Val

60

65

70

Lys

Asn

Gly

Glu

Leu

Lys

Phe

Glu

Lys

Asn

Lys

Val

Glu

Lys

75

80

Leu

Leu

Thr

Glu

Glu

Lys

Thr

Asn

Ile

Lys

Ser

Ile

Arg

Trp

85

90

95

Thr

Gly

Arg

Ile

Ile

Pro

Ser

Lys

Asp

Gly

Glu

Tyr

Thr

Leu

100

105

110

Ser

Thr

Asp

Lys

Asp

Asn

Val

Leu

Met

Gin

Ile

Asn

Ala

Glu

115

120

125

Gly

Glu

Ile

Ala

Asn

Thr

Leu

Lys

Val

Asn

Met

Ile

Lys

Gly

130

135

140

Gin

Glu

Tyr

Ser

Ile

Arg

Ile

Glu

Ile

Gin

Asp

Lys

Asp

Ile

151 ·· * · ♦· • a *♦ *9 · « ; · ; ·· ··· 9«· v» r·* »ο·* ·· ♦ ···

145 150

Gly

Tyr

Val

Asp

Asp

Leu

Ser

Ser

Pro

Lys

Leu

Tyr

Trp

Glu

155

160

165

Leu

Asn

Gly

Asp

Lys

Thr

Leu

Ile

Pro

Glu

Lys

Asn

Leu

Phe

170

175

180

Leu

Arg

Asp

Tyr

Ser

Lys

Ile

Asp

Glu

Asn

Asp

Pro

Phe

Ile

185

190

195

Pro

Lys

Asp

Asn

Phe

Phe

Asp

Leu

Lys

Leu

Lys

Ser

Arg

Ser

200

205

210

Ala

Arg

Leu

Ala

Ser

Gly

Trp

Gly

Asp

Glu

Asp

Leu

Asp

Thr

215

220

Asp

Asn

Asp

Asn

Ile

Pro

Asp

Ala

Tyr

Glu

Lys

Asn

Gly

Tyr

225

230

235

Thr

Ile

Lys

Asp

Ser

Ile

Ala

Val

Lys

Trp

Glu

Asp

Ser

Phe

240

245

250

Ala

Gin

Gin

Gly

Tyr

Lys

Lys

Tyr

Leu

Ser

Ser

Tyr

Leu

Glu

255

260

265

Ser

Asn

Thr

Ala

Gly

Asp

Pro

Tyr

Thr

Asp

Tyr

Gin

Lys

Ala

270

275

280

Ser

Gly

Ser

Phe

Asp

Lys

Ala

Ile

Lys

Ala

Glu

Ala

Arg

Asp

285

290

Pro

Leu

Val

Ala

Ala

Tyr

Pro

Val

Val

Gly

Val

Gly

Met

Glu

295

300

305

Lys

Leu

Ile

Ile

Ser

Thr

Asn

Glu

His

Ala

Ser

Thr

Asp

Gin

310

315

320

Gly

Lys

Thr

Val

Ser

Arg

Asn

Thr

Thr

Asn

Ser

Lys

Thr

Asp

325

330

335

Ala

Asn

Thr

Ala

Gly

Val

Ala

Ile

Asn

Ile

Ala

Tyr

Gin

Asn

340

345

350

Gly

Phe

Thr

Gly

Ser

Ile

Thr

Thr

Asn

Tyr

Ser

His

Thr

Thr

355

360

Glu

Asn

Ser

Thr

Ala

Val

Gin

Asn

Ser

Asn

Gly

Glu

Ser

Trp

365

370

375

Asn Thr Ser Leu Ser Ile Asn Lys Gly Glu Ser Ala Tyr Ile

152 ·· ···· · · · ·· · · · · • · · · ····

380	385	390
Asn Ala Asn	Val Arg Tyr Tyr Asn	Thr Gly Thr Ala Pro Met
395	400 405
Tyr Lys Val	Thr Pro Thr Thr Asn	Leu Val Leu Asp Gly Asp
	410	415 420
Thr Leu Thr	Thr Ile Lys Ala Gin	Asp Asn Gin Ile Gly Asn
	425	430
Asn Leu Ser	Pro Asn Glu Thr Tyr	Pro Lys Lys Gly Leu Ser
435	440	445
Pro Leu Ala	Leu Asn Thr Met Asp	Gin Phe Ser Ser Arg Leu
450	455	460
Ile Pro Ile	Asn Tyr Asp Gin Leu	Lys Lys Leu Asp Ala Gly
465	470	475
Lys Gin Ile	Lys Leu Glu Thr Thr	Gin Val Ser Gly Asn Tyr
	480	485 490
Gly Ile Lys	Asn Ser Gin Gly Gin	Ile Ile Thr Glu Gly Asn
	495	500
Ser Trp Ser	Asp Tyr Ile Ser Gin	Ile Asp Ser Leu Ser Ala
505	510	515
Ser Ile Ile	Leu Asp Thr Gly Ser	Asp Val Phe Glu Arg Arg
520	525	530
Val Thr Ala	Lys Asp Ser Ser Asn	Pro Glu Asp Lys Thr Pro
535	540	545
Val Leu Thr	Ile Gly Glu Ala Ile	Glu Lys Ala Phe Gly Ala
	550	555 560
Thr Lys Asn	Gly Glu Ile Leu Tyr	Phe Asn Gly Met Pro Ile
	565	570
Asp Glu Ser	Cys Val Glu Leu Ile	Phe Asp Gly Asn Thr Ala
575	580	585
Asn Leu Ile	Lys Glu Arg Leu Asn	Ala Leu Asn Asp Lys Lys
590	595	600
Ile Tyr Asn	Val Gin Leu Glu Arg	Gly Met Lys Ile Leu Ile
605	610	615
Lys Thr Ser	Thr Tyr Phe Asn Asn	Phe Asp Gly Tyr Asn Asn

153

620 625 630

Phe	Pro Ser	Ser Trp Ser 635	Asn Val	Asp	Ser Asn 640	Asn	Gin	Asp
Gly	Leu Gin	Asn Ala Ala	Asn Lys	Leu	Ser Gly	Glu	Thr	Lys
645		650			655
Ile	Val Ile	Pro Met Ser	Lys Leu	Asn	Pro Tyr	Lys	Arg	Tyr
	660		665			670
Val	Phe Ser	Gly Tyr Leu	Lys Asn	Ser	Ser Thr	Ser	Asn	Pro
	675		680				685
Ile	Thr Val	Asn Ile Lys	Ala Lys	Glu	Gin Lys	Thr	Tyr	Asn
		690		695				700
Leu	Val Ser	Glu Asn Asp	Tyr Lys	Lys	Phe Ser	Tyr	Glu	Phe
		705			710
Glu	Thr Ile	Gly Arg Asp	Ala Ser	Asn	Ile Glu	Ile	Thr	Leu
715		720			725
Thr	Ser Ser	Gly Thr Ile	Phe Leu	Asp	Asn Leu	Ser	Ile	Thr
	730		735			740
Glu	Leu Asn	Ser Thr Pro	Glu Ile	Leu	Lys Glu	Pro	Asp	Ile
	745		750				755
Lys	Val Pro	Ser Asp Gin	Glu Ile	Ile	Asp Ala	His	Lys	Lys
		760		765				770
Tyr	Tyr Ala	Asp Leu Ser	Phe Asn	Gin	Ser Thr	Ala	Asn	Tyr
		775			780
Tyr	Leu Asp	Gly Leu Tyr	Phe Glu	Pro	Thr Gin	Thr	Asn	Lys
785		790			795
Glu	Val Leu	Asp Tyr Ile	Gin Lys	Tyr	Lys Val	Glu	Ala	Thr
	800		805			810
Leu	Glu Tyr	Ser Gly Phe	Lys Asp	Ile	Gly Thr	Lys	Asp	Lys
	815		820				825
Glu	Leu Arg	Asn Tyr Thr	Gly Asp	Ser	Asn Gin	Pro	Lys	Thr
		830		835				840
Asn	Tyr Val	Asn Phe Arg	Ser Tyr	Phe	Thr Ser	Gly	Glu	Asn
		845			850
Val	Met Pro	Tyr Lys Lys	Leu Arg	Ile	Tyr Ala	Ile	Thr	Pro

154 • ·

855 860 865

Glu Asn Lys Glu Leu Leu Val Leu Ser Ile Asn

870 875 <210> 34 <211> 721 <212> PRT <213> Clostridium botulinum <400> 34

Met 1

Leu Val

Ser

Lys 5

Phe

Glu

Asn

Ser Val 10

Lys Asn Ser

Asn

Lys

Asn

Tyr

Phe

Thr

Ile

Asn

Gly

Leu

Met

Gly

Tyr

Tyr

Phe

15

20

25

Glu

Asn

Asp

Phe

Phe

Asn

Leu

Asn

Ile

Ile

Ser

Pro

Thr

Leu

30

35

40

Asp

Gly

Asn

Leu

Thr

Phe

Ser

Lys

Glu

Asp

Ile

Asn

Ser

Ile

45

50

55

Leu

Gly

Asn

Lys

Ile

Ile

Lys

Ser

Ala

Arg

Trp

Ile

Gly

Leu

60

65

70

Ile

Lys

Pro

Ser

Ile

Thr

Gly

Glu

Tyr

Ile

Leu

Ser

Thr

Asn

75

80

Ser

Pro

Asn

Cys

Arg

Val

Glu

Leu

Asn

Gly

Glu

Ile

Phe

Asn

85

90

95

Leu

Ser

Leu

Asn

Thr

Ser

Asn

Thr

Val

Asn

Leu

Ile

Gin

Gly

100

105

110

Asn

Val

Tyr

Asp

Ile

Arg

Ile

Glu

Gin

Leu

Met

Ser

Glu

Asn

115

120

125

Gin

Leu

Leu

Lys

Asn

Tyr

Glu

Gly

Ile

Lys

Leu

Tyr

Trp

Glu

130

135

140

Thr

Ser

Asp

Ile

Ile

Lys

Glu

Ile

Ile

Pro

Ser

Glu

Val

Leu

145

150

Leu

Lys

Pro

Asn

Tyr

Ser

Asn

Thr

Asn

Glu

Lys

Ser

Lys

Phe

155

160

165

155

Ile Pro Asn 170

Asn

Thr Leu Phe Ser Asn 175

Ala

Lys

Leu 180

Lys

Ala

Asn

Ala

Asn

Arg

Asp

Thr

Asp

Arg

Asp

Gly

Ile

Pro

Asp

Glu

185

190

195

Trp

Glu

Ile

Asn

Gly

Tyr

Thr

Val

Met

Asn

Gin

Lys

Ala

Val

200

205

210

Ala

Trp

Asp

Asp

Lys

Phe

Ala

Ala

Asn

Gly

Tyr

Lys

Lys

Tyr

215

220

Val

Ser

Asn

Pro

Phe

Lys

Pro

Cys

Thr

Ala

Asn

Asp

Pro

Tyr

225

230

235

Thr

Asp

Phe

Glu

Lys

Val

Ser

Gly

Gin

Ile

Asp

Pro

Ser

Val

240

245

250

Ser

Met

Val

Ala

Arg

Asp

Pro

Met

Ile

Ser

Ala

Tyr

Pro

Ile

255

260

265

Val

Gly

Val

Gin

Met

Glu

Arg

Leu

Val

Val

Ser

Lys

Ser

Glu

270

275

280

Thr

Ile

Thr

Gly

Asp

Ser

Thr

Lys

Ser

Met

Ser

Lys

Ser

Thr

285

290

Ser

His

Ser

Ser

Thr

Asn

Ile

Asn

Thr

Val

Gly

Ala

Glu

Val

295

300

305

Ser

Gly

Ser

Leu

Gin

Leu

Ala

Gly

Gly

Ile

Phe

Pro

Val

Phe

310

315

320

Ser

Met

Ser

Ala

Ser

Ala

Asn

Tyr

Ser

His

Thr

Trp

Gin

Asn

325

330

335

Thr

Ser

Thr

Val

Asp

Asp

Thr

Thr

Gly

Glu

Ser

Phe

Ser

Gin

340

345

350

Gly

Leu

Ser

Ile

Asn

Thr

Gly

Glu

Ser

Ala

Tyr

Ile

Asn

Pro

355

360

Asn

Ile

Arg

Tyr

Tyr

Asn

Thr

Gly

Thr

Ala

Pro

Val

Tyr

Asn

365 370 375

Val Thr Pro Thr Thr Thr Ile Val Ile Asp Lys Gin Ser Val 380 385 390

Ala Thr Ile Lys Gly Gin Glu Ser Leu Ile Gly Asp Tyr Leu 395 400 405

156

Asn Pro	Gly	Gly Thr 410	Tyr	Pro	Ile	Ile Gly Glu Pro Pro 415	Met 420
Ala Leu	Asn	Thr Met	Asp	Gin	Phe	Ser Ser Arg Leu Ile	Pro
		425				430
Ile Asn	Tyr	Asn Gin	Leu	Lys	Ser	Ile Asp Asn Gly Gly	Thr
435			440			445
Val Met	Leu	Ser Thr	Ser	Gin	Phe	Thr Gly Asn Phe Ala	Lys
450				455	460
Tyr Asn	Ser	Asn Gly	Asn	Leu	Val	Thr Asp Gly Asn Asn	Trp
	465				470	475
Gly Pro	Tyr	Leu Gly	Thr	Ile	Lys	Ser Thr Thr Ala Ser	Leu
		480				485	490
Thr Leu	Ser	Phe Ser	Gly	Gin	Thr	Thr Gin Val Ala Val	Val
		495			500
Ala Pro	Asn	Phe Ser	Asp	Pro	Glu	Asp Lys Thr Pro Lys	Leu
505			510			515
Thr Leu	Glu	Gin Ala	Leu	Val	Lys	Ala Phe Ala Leu Glu	Lys
520				525		530
Lys Asn	Gly	Lys Phe	Tyr	Phe	His	Gly Leu Glu Ile Ser	Lys
	535				540	545
Asn Glu	Lys	Ile Gin	Val	Phe	Leu	Asp Ser Asn Thr Asn	Asn
		550				555	560
Asp Phe	Glu	Asn Gin	Leu	Lys	Asn	Thr Ala Asp Lys Asp	Ile
		565				570
Met His	Cys	Ile Ile	Lys	Arg	Asn	Met Asn Ile Leu Val	Lys
575			580			585
Val Ile	Thr	Phe Lys	Glu	Asn	Ile	Ser Ser Ile Asn Ile	Ile
590				595		600
Asn Asp	Thr	Asn Phe	Gly	Val	Gin	Ser Met Thr Gly Leu	Ser
	605			610	615
Asn Arg	Ser	Lys Gly	Gin	Asp	Gly	Ile Tyr Arg Ala Ala	Thr
		620				625	630
Thr Ala	Phe	Ser Phe	Lys	Ser	Lys	Glu Leu Lys Tyr Pro	Glu

635 640

157 • 44 ·· ·· • · 4 4 · · 4

4 4 4

Gly Arg Tyr Arg Met Arg Phe Val

645 650

Phe Thr Cys Asn Phe Lys Leu Phe

660 665

Ser Ser Phe Asp Lys Gly Tyr Tyr

675 680

Tyr Tyr Asn Gly Ser Lys Ser Phe

690

Ile Ile Asn Ser Ile Asn Arg Leu 705

Glu Leu Asp Lys Leu Ile Ile 715 720 <210> 35 <211> 1338 <212> PRT <213> Bacillus cereus <400> 35

Met Lys Arg Met Glu Gly Lys Leu 1 5

Leu Gin Val Val Thr Lys Thr Val 15 20

Ser Ile Ser Leu Leu Asn Asn Glu

35

Leu Asn Ile Asn Ser Gin Ser Lys

50

Leu Lys Ile Thr Asp Lys Val Glu

Glu Lys Ala Lys Glu Trp Gly Lys 75

Lys Leu Thr Ala Thr Glu Lys Gly 85

444 44 444

444 44 444 4444 4* 4444

Ile Gin Ser Tyr Glu Pro 655

Asn Asn Leu Ile Tyr Ser 670

Asp Glu Phe Phe Tyr Phe 685

Phe Asn Ile Ser Cys Asp

695 700

Ser Gly Val Phe Leu Ile 710

Phe Met Val Ser Lys Lys 10

Leu Leu Ser Thr Val Phe

Val Ile Lys Ala Glu Gin 40

Tyr Thr Asn Leu Gin Asn 55

Asp Phe Lys Glu Asp Lys

70

Glu Lys Glu Lys Glu Trp 80

Lys Met Asn Asn Phe Leu

158

Asp Asn 100	Lys Asn Asp	Ile	Lys Thr Asn Tyr Lys 105	Glu 110	Ile	Thr
Phe Ser	Ile Ala Gly	Ser	Phe Glu Asp Glu Ile	Lys	Asp	Leu
	115		120		125
Lys Glu	Ile Asp Lys	Met	Phe Asp Lys Thr Asn	Leu	Ser	Asn
	130		135			140
Ser Ile	Ile Thr Tyr	Lys	Asn Val Glu Pro Thr	Thr	Ile	Gly
	145		150
Phe Asn	Lys Ser Leu	Thr	Glu Gly Asn Thr Ile	Asn	Ser	Asp
155		160	165
Ala Met	Ala Gin Phe	Lys	Glu Gin Phe Leu Asp	Arg	Asp	Ile
170			175	180
Lys Phe	Asp Ser Tyr	Leu	Asp Thr His Leu Thr	Ala	Gin	Gin
	185		190		195
Val Ser	Ser Lys Glu	Arg	Val Ile Leu Lys Val	Thr	Val	Pro
	200		205			210
Ser Gly	Lys Gly Ser	Thr	Thr Pro Thr Lys Ala	Gly	Val	Ile
	215		220
Leu Asn	Asn Ser Glu	Tyr	Lys Met Leu Ile Asp	Asn	Gly	Tyr
225		230	235
Met Val	His Val Asp	Lys	Val Ser Lys Val Val	Lys	Lys	Gly
240			245	250
Val Glu	Cys Leu Gin	Ile	Glu Gly Thr Leu Lys	Lys	Ser	Leu
	255		260		265
Asp Phe	Lys Asn Asp	Ile	Asn Ala Glu Ala His	Ser	Trp	Gly
	270		275			280
Met Lys	Asn Tyr Glu	Glu	Trp Ala Lys Asp Leu	Thr	Asp	Ser
	285		290
Gin Arg	Glu Ala Leu	Asp	Gly Tyr Ala Arg Gin	Asp	Tyr	Lys

295 300 305

Glu Ile Asn Asn Tyr Leu Arg Asn Gin Gly Gly Ser Gly Asn 310 315 320

Glu Lys Leu Asp Ala Gin Ile Lys Asn Ile Ser Asp Ala Leu 325 330 335

159 ··· · · · · * • ·· · · • · · · · · • · · · ·

Gly	Lys	Lys	Pro Ile 340	Pro	Glu Asn Ile Thr Val 345	Tyr	Arg	Trp 350
Cys	Gly	Met	Pro Glu	Phe	Gly Tyr Gin Ile Ser	Asp	Pro	Leu
			355		360
Pro	Ser	Leu	Lys Asp	Phe	Glu Glu Gin Phe Leu	Asn	Thr	Ile
365				370	375
Lys	Glu	Asp	Lys Gly	Tyr	Met Ser Thr Ser Leu	Ser	Ser	Glu
	380				385	390
Arg	Leu	Ala	Ala Phe	Gly	Ser Arg Lys Ile Ile	Leu	Arg	Leu
		395			400		405
Gin	Val	Pro	Lys Gly	Ser	Thr Gly Ala Tyr Leu	Ser	Ala	Ile
			410		415			420
Gly	Gly	Phe	Ala Ser	Glu	Lys Glu Ile Leu Leu	Asp	Lys	Asp
			425		430
Ser	Lys	Tyr	His Ile	Asp	Lys Val Thr Glu Val	Ile	Ile	Lys
435				440	445
Gly	Val	Lys	Arg Tyr	Val	Val Asp Ala Thr Leu	Leu	Thr	Asn
	450				455	460
Ser	Arg	Gly	Pro Ser	Thr	Pro Pro Thr Pro Ser	Pro	Ser	Thr
		465			470		475
Pro	Pro	Thr	Pro Ser	Asp	Ile Gly Ser Thr Met	Lys	Thr	Asn
			480		485			490
Gin	Ile	Ser	Thr Thr	Gin	Lys Asn Gin Gin Lys	Glu	Met	Asp
			495		500
Arg	Lys	Gly	Leu Leu	Gly	Tyr Tyr Phe Lys Gly	Lys	Asp	Phe
505				510	515
Ser	Asn	Leu	Thr Met	Phe	Ala Pro Thr Arg Asp	Ser	Thr	Leu
	520				525	530
Ile	Tyr	Asp	Gin Gin	Thr	Ala Asn Lys Leu Leu	Asp	Lys	Lys
		535			540		545
Gin	Gin	Glu	Tyr Gin	Ser	Ile Arg Trp Ile Gly	Leu	Ile	Gin
			550		555			560
Ser	Lys	Glu	Thr Gly	Asp	Phe Thr Phe Asn Leu	Ser	Glu	Asp

565

570

160 •· · ·· ·· ·· • · · · · · ♦ ♦· · ·· ♦ · · · • · · ·· · · · ··· ·· ··· ···· ·· ····

Glu

Gin

Ala

Ile

Ile

Glu

Ile

Asn

Gly

Lys

Ile

Ile

Ser

Asn

575

580

585

Lys

Gly

Lys

Glu

Lys

Gin

Val

Val

His

Leu

Glu

Lys

Gly

Lys

590 595 600

Leu	Val	Pro 605	Ile	Lys	Ile Glu Tyr 610	Gin Ser Asp Thr Lys 615	Phe
Asn	Ile	Asp	Ser	Lys	Thr Phe Lys	Glu Leu Lys Leu Phe	Lys
			620			625	630
Ile	Asp	Ser	Gin	Asn	Gin Pro Gin	Gin Val Gin Gin Asp	Glu
				635	640
Leu	Arg	Asn	Pro	Glu	Phe Asn Lys	Lys Glu Ser Gin Glu	Phe
645					650	655
Leu	Ala	Lys	Pro	Ser	Lys Ile Asn	Leu Phe Thr Gin Gin	Met
	660				665	670
Lys	Arg	Glu	Ile	Asp	Glu Asp Thr	Asp Thr Asp Gly Asp	Ser
		675			680	685
Ile	Pro	Asp	Leu	Trp	Glu Glu Asn	Gly Tyr Thr Ile Gin	Asn
			690			695	700
Arg	Ile	Ala	Val	Lys	Trp Asp Asp	Ser Leu Ala Ser Lys	Gly
				705		710
Tyr	Thr	Lys	Phe	Val	Ser Asn Pro	Leu Glu Ser His Thr	Val
715					720	725
Gly	Asp	Pro	Tyr	Thr	Asp Tyr Glu	Lys Ala Ala Arg Asp	Leu
	730				735	740
Asp	Leu	Ser	Asn	Ala	Lys Glu Thr	Phe Asn Pro Leu Val	Ala
		745			750	755
Ala	Phe	Pro	Ser	Val	Asn Val Ser	Met Glu Lys Val Ile	Leu
			760			765	770
Ser	Pro	Asn	Glu	Asn	Leu Ser Asn	Ser Val Glu Ser His	Ser
				775		780
Ser	Thr	Asn	Trp	Ser	Tyr Thr Asn	Thr Glu Gly Ala Ser	Val
785					790	795
Glu	Ala	Gly	Ile	Gly	Pro Lys Gly	Ile Ser Phe Gly Val	Ser
	800				805	810

161

Val Asn Tyr	Gin	His	Ser	Glu	Thr Val Ala Gin 820	Glu	Trp 825	Gly
	815
Thr Ser	Thr	Gly	Asn	Thr	Ser	Gin Phe Asn Thr	Ala	Ser	Ala
		830				835			840
Gly Tyr	Leu	Asn	Ala	Asn	Val	Arg Tyr Asn Asn	Val	Gly	Thr
			845			850
Gly Ala	Ile	Tyr	Asp	Val	Lys	Pro Thr Thr Ser	Phe	Val	Leu
855				860		865
Asn Asn	Asp	Thr	Ile	Ala	Thr	Ile Thr Ala Lys	Ser	Asn	Ser
870					875	880
Thr Ala	Leu	Asn	Ile	Ser	Pro	Gly Glu Ser Tyr	Pro	Lys	Lys
	885					890		895
Gly Gin	Asn	Gly	Ile	Ala	Ile	Thr Ser Met Asp	Asp	Phe	Asn
		900				905			910
Ser His	Pro	Ile	Thr	Leu	Asn	Lys Lys Gin Val	Asp	Asn	Leu
			915			920
Leu Asn	Asn	Lys	Pro	Met	Met	Leu Glu Thr Asn	Gin	Thr	Asp
925				930		935
Gly Val	Tyr	Lys	Ile	Lys	Asp	Thr His Gly Asn	Ile	Val	Thr
940					945		950
Gly Gly	Glu	Trp	Asn	Gly	Val	Ile Gin Gin Ile	Lys	Ala	Lys
	955					960		965
Thr Ala	Ser	Ile	Ile	Val	Asp	Asp Gly Glu Arg	Val	Ala	Glu
		970				975			980
Lys Arg	Val	Ala	Ala	Lys	Asp	Tyr Glu Asn Pro	Glu	Asp	Lys
			985			990
Thr Pro	Ser	Leu	Thr	Leu	Lys	Asp Ala Leu Lys	Leu	Ser	Tyr
995				1000		1005
Pro Asp	Glu	Ile	Lys	Glu	Ile	Glu Gly Leu Leu	Tyr	Tyr	Lys
1010				1015		1020
Asn Lys	Pro	Ile	Tyr	Glu	Ser	Ser Val Met Thr	Tyr	Leu	Asp
	1025				1030		1035
Glu Asn	Thr	Ala	Lys	Glu	Val	Thr Lys Gin Leu	Asn Asp	Thr

1040 1045 1050

162 ·· ·· ·· • · ···· » »♦ ·« · · ♦ · • · * ♦ »♦♦·· • · · · · · · ·· ··· ··<· ·♦ ···

Thr Gly	Lys	Phe Lys Asp 1055	Val	Ser	His	Leu Tyr Asp Val 1060	Lys
Leu Thr	Pro	Lys Met Asn	Val	Thr	Ile	Lys Leu Ser Ile	Leu
1065		1070			1075
Tyr Asp	Asn	Ala Glu Ser	Asn	Asp	Asn	Ser Ile Gly Lys	Trp
1080		1085		1090
Thr Asn	Thr	Asn Ile Val	Ser	Gly	Gly	Asn Asn Gly Lys	Lys
	1095		1100	1105
Gin Tyr	Ser	Ser Asn Asn	Pro	Asp	Ala	Asn Leu Thr Leu	Asn
		1110			1115		1120
Thr Asp	Ala	Gin Glu Lys	Leu	Asn	Lys	Asn Arg Asp Tyr	Tyr
		1125				1130
Ile Ser	Leu	Tyr Met Lys	Ser	Glu	Lys	Asn Thr Gin Cys	Glu
1135		1140			1145
Ile Thr	Ile	Asp Gly Glu	Ile	Tyr	Pro	Ile Thr Thr Lys	Thr
1150		1155			1160
Val Asn	Val	Asn Lys Asp	Asn	Tyr	Lys	Arg Leu Asp Ile	Ile
	1165		1170		1175
Ala His	Asn	Ile Lys Ser	Asn	Pro	Ile	Ser Ser Leu His	Ile
		1180			1185	1190
Lys Thr	Asn	Asp Glu Ile	Thr	Leu	Phe	Trp Asp Asp Ile	Ser
		1195				1200
Ile Thr	Asp	Val Ala Ser	Ile	Lys	Pro	Glu Asn Leu Thr	Asp
1205		1210				1215
Ser Glu	Ile	Lys Gin Ile	Tyr	Ser	Arg	Tyr Gly Ile Lys	Leu
1220		1225			1230
Glu Asp	Gly	Ile Leu Ile	Asp	Lys	Lys	Gly Gly Ile His	Tyr
	1235		1240		1245
Gly Glu	Phe	Ile Asn Glu	Ala	Ser	Phe	Asn Ile Glu Pro	Leu
		1250		1255		1260
Gin Asn	Tyr	Val Thr Lys	Tyr	Glu	Val	Thr Tyr Ser Ser	Glu
		1265				1270
Leu Gly	Pro	Asn Val Ser	Asp	Thr	Leu	Glu Ser Asp Lys	Ile

1275

1280

1285

163

• ♦

·· • » • ·

Tyr Lys Asp

Gly

Thr Ile Lys Phe Asp Phe Thr Lys Tyr Ser

1290

1295

1300

Lys

Asn

Glu

Gin

Gly

Leu

Phe

Tyr

Asp

Ser

Gly

Leu

Asn

Trp

1305

1310

1315

Asp

Phe

Lys

Ile

Asn

Ala

Ile

Thr

Tyr

Asp

Gly

Lys

Glu

Met

1320

1325

133

Asn

Val

Phe

His

Arg

Tyr

Asn

Lys

1335

164

3>V UtV0 00 »00 «0 ··

0 0 0 «00 · · 00

00 « 0 0 0 0

0 0 « 000 0 « 000 «0 000

000 00 000 000· 0« 00«0

Claims (27)

1. PATENTOVÉ

   NÁROKY

   1. Skupina B z binárního, pór tvořícího toxinu A-B, přičemž tato skupina obsahuje mutaci, která inhibuje její schopnost tvořit pór, přičemž tato mutace není vynechání aminokyselin 302 až 325 ochranného antigenu antraxu - sekvence id. č. 12.
2. 2. Skupina B podle nároku 1, kdy tato skupina B je ochranný antigen antraxu.
3. 3. Skupina B podle nároku 1, kdy tato skupina B postrádá schopnost tvorby póru.
4. 4. Skupina B podle nároku 1, která má aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň z 80 % stejná jako sekvence id. č. 21, a obsahuje změnu vybranou ze skupiny sestávající z:

   a) K397A,

   b) K397D,

   c) K397C,

   d) K397Q,

   e) D425A,

   f) D425N,

   g) D425E,

   h) D425K,

   i) F427A,

   j) K397 + D425K dvojité mutace,

   k) K3 95D + K397D + D425K + D426K čtyřnásobné mutace, 1) K3 97D + D425K + F427A trojité mutace, m) F427A + AD2L2 dvojité mutace, n) K397D + F427A + ŮD2L2 trojité mutace, o) K397D + D425K + F427A + ŮD2L2 čtyřnásobné mutace, p) F427D a

   q) F427K.

   165
5. 5. Očkovací prostředek, vyznačující se tím, že obsahuje skupinu B z binárního, pór tvořícího toxinu A-B nebo její fragment ve farmaceuticky přijatelném nosiči, přičemž skupina B obsahuje mutaci, která inhibuje její schopnost tvořit pór.
6. 6. Očkovací vyznačuj ící antigen antraxu.
7. 7. Očkovací vyznačuj ící prostředek podle nároku 5, se t í m, že skupina B je ochranný prostředek podle nároku 5, se tím, že skupina B je deaktivována chemickými nebo fyzikálními prostředky.
8. 8. Způsob prevence bakteriální infekce u savce, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání očkovací látky obsahující skupinu B z binárního, pór tvořícího toxinu A-B nebo její fragment ve farmaceuticky přijatelném nosiči, přičemž skupina B obsahuje mutaci, která inhibuje její schopnost tvořit pór, savci.
9. 9. Způsob léčení bakteriální infekce u savce, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání očkovací látky obsahující skupinu B z binárního, pór tvořícího toxinu A-B nebo její fragment ve farmaceuticky přijatelném nosiči, přičemž skupina B obsahuje mutaci, která inhibuje její schopnost tvořit pór, savci.
10. 10. Způsob podle nároku 8 nebo 9, vyznačující se t í m, že se tato očkovací látka podává s adjuvans.
11. 11. Mutantní skupina B z binárního, pór tvořícího toxinu A-B, kdy tato mutantní skupina B obsahuje mutaci, která

    166

    4· • » inhibuje její schopnost tvořit pór, a tato mutantní skupina B inhibuje schopnost tvořit pór u skupiny B přirozeného typu tohoto toxinu.
12. 12. Mutantní skupina B podle nároku 11, kdy tato mutantní skupina B je ochranný antigen antraxu.
13. 13. Mutantní skupina B podle nároku 12, která má schopnost vázat letální faktor nebo edémový faktor.
14. 14. Mutantní skupina B podle nároku 11, která má schopnost soutěžit se skupinou B přirozeného typu o vazbu k receptoru na povrchu savčí buňky.
15. 15. Mutantní skupina B podle nároku 11, která má schopnost vázat skupinu B přirozeného typu.
16. 16. Mutantní skupina B podle nároku 11, která má schopnost oligomerizovat se skupinou B přirozeného typu tak, že vznikne komplex, který má sníženou schopnost tvořit pór.
17. 17. Mutantní skupina B podle nároku 16, kdy tento komplex postrádá schopnost tvořit pór.
18. 18. Mutantní skupina B podle nároku 11, která má aminokyselinovou sekvenci, která je alespoň z 80 % stejná jako sekvence id. č. 21, a obsahuje změnu vybranou ze skupiny sestávající z:

    a) K397D + D425K dvojité mutace,

    b) AD2L2,

    c) K395D + K397D + D425K + D426K čtyřnásobné mutace,

    d) D425K,

    e) F427A,

    f) K397D + D425K + F427A trojité mutace, • ·

    16Ί ·· ···· · · · ·· · · · · · ··· * · · · · · • · · 9 · · · ··· ·· ··♦··«« ·♦ ··♦·

    g) F427A + AD2L2 dvojité mutace,

    h) K397D + F427A + ÁD2L2 trojité mutace,

    i) K397D + D425K + F427A + AD2L2 čtyřnásobné mutace,

    j) F427D a

    k) F427K.
19. 19. Mutantní skupina B podle nároku 11 obsahující vynechání alespoň 5 aminokyselin ze smyčky D2L2.
20. 20. Způsob prevence bakteriální infekce u savce, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání mutantní skupiny B z binárního, pór tvořícího toxinu A-B nebo jejího fragmentu, přičemž skupina B obsahuje mutaci, která inhibuje její schopnost tvořit pór, a tato mutantní skupina B inhibuje schopnost tvořit pór u skupiny B přirozeného typu tohoto toxinu, savci.
21. 21. Způsob léčení bakteriální infekce u savce, vyznačující se tím, že zahrnuje podávání mutantní skupiny B z binárního, pór tvořícího toxinu A-B nebo jejího fragmentu, přičemž skupina B obsahuje mutaci, která inhibuje její schopnost tvořit pór, a tato mutantní skupina B inhibuje schopnost tvořit pór u skupiny B přirozeného typu tohoto toxinu, savci.
22. 22. Způsob podle nároku 8, 9, 20 nebo 21, ve kterém skupina B nebo mutantní skupina B je ochranný antigen antraxu a bakteriální infekce je infekce antraxem.
23. 23. Způsob podle nároku 8, 9, 20 nebo 21, který dále zahrnuje podávání protilátky, která váže skupinu B přirozeného typu, savci.

    168 • »* w *· ·· ·* ·· t · ·« · · · · · • ·· » · · · · • · · · · ···· · ··· »· e < · »*· ·· *·· ···· ·* ♦···
24. 24. Způsob podle nároku 8, 9, 20 nebo 21, ve kterém savec je člověk.
25. 25. Způsob podle nároku 24, ve kterém byl savec vystaven sporám B. anthracis.
26. 26. Čištěná protilátka, která specificky váže skupinu B přirozeného typu z binárního, pór tvořícího toxinu A-B s vyšší afinitou než mutantní skupina B tohoto toxinu, přičemž tato mutantní skupina B obsahuje mutaci, která inhibuje její schopnost tvorby póru.
27. 27. Protilátka podle nároku 26, ve které tato mutantní skupina B inhibuje schopnost tvorby póru u skupiny B přirozeného typu tohoto toxinu.