CZ200197A3 - Antioxidační a antiproliferační přípravek obsahující karnitin a karotenoid - Google Patents

Abstract

Je popsán přípravek obsahující jako charakteristické účinné složky propionyl-L-kamitin a alespoň jeden karotenoid, typicky lykopen extrahovaný z rajských jablíček, k prevenci a/nebo terapeutickému působení na různé změny a patologické stavy vyvolané volnými radikály a lipoperoxidačnímjevem, Tento přípravek může mít formu doplňkové výživy, podpůrné výživy nebo může být použit jako skutečné léčivo.

Description

Antioxidační a antiproliferační přípravek obsahující karnitin a karotenoid

Oblast techniky

Předložený vynález se týká přípravku k prevenci a/nebo léčbě onemocnění vzniklého přítomností volných radikálů pocházejících ze znečištěného prostředí a lipoperoxidačního jevu atherosklerotického, vaskulárního, kardiálního nebo cerebrálního druhu; proliferujících změn tkání včetně prostatických, děložních, prsních či střevních tkání; změn vízu a sítnice včetně katarakty a makulární degenerace sítnice.

Dosavadní stav techniky

Karotenoidy jsou skupina rostlinných pigmentů s dlouhým řetězcem terpenické povahy (tetraterpeny) obsahující až 40 uhlíkových atomů s konjugovaným systémem dvojných vazeb. Karotenoidy jsou přítomny ve většině rostlin, v chloroplastech a v těch plastidech, které jsou v těch oblastech rostliny, kde není přítomen chlorofyl (některé kořeny a mnoho květin a ovoce, jako například rajská jablíčka, ve kterých se zvyšuje během zrání); nacházejí se také v modrých řasách, v některých fotosyntetických bakteriích a některých houbách. Karotenoidy hrají doplňkovou úlohu k chlorofylu při fotosyntéze absorbcí některých částí světelného spektra a převodu energie do samotného chlorofylu.

I když se v rostlinné říši nachází více jak šest set karotenoidů, jen čtyřicet z nich se objevuje v lidské potravě, pouze čtrnáct z nich je absorbováno střevy a zbývající jsou neabsorbovatelné epoxydy. Nejběžnějším z těchto čtrnácti jsou lykopen, a-karoten, β-karoten, lutein zeaxantin a β-kryptoxantiny.

Lykopen má jedenáct lineárně konjugovaných dvojných vazeb (zatímco β-karoten jich má devět) a je karotenoidem s nejdelším řetězcem s lineárně konjugovanými dvojnými vazbami.

Nárokuje se také vztah mezi těmito zvláštními strukturami a jejich vyšší sílou jako ·· · · ·· · · · · ·· • · · · · · ··· • ····· · ··· · antioxidačních látek.

I když existují metabolické interakce mezi lykopenem a β-karotenem, lykopen se sám nemůže transformovat do řetězce β-karotenu, který je charakterizován trimethylcyklohexanylovým kruhem na obou stranách uhlíkového řetězce.

β-karoten na druhé straně je schopen transformovat se sám redukcí řetězce na trans-retinol a kyselinu retinovou a působit jako provitamin A.

Tyto sloučeniny jsou charakterizovány významnou antioxidační silou, avšak lykopen je mezi nimi tou látkou, která má největší schopnost blokovat jednoatomový kyslík, a tato schopnost je například dvakrát větší než u β-karotenu.

Lykopen je tělem absorbován, zvláště v přítomnosti tuků a nalézá se v krvi a tkáních ve dvou izomerních formách: jako cis- a trans-lykopen.

Podobně jako všechny karotenoidy nemůže být lykopen syntetizován tělem, ale musí být přijímán potravou.

Je mnoho potravin obsahujících karotenoidy, včetně papají, červených grepů, špenátu, meruněk, mléka a vajec, ale nade vším jsou rajská jablíčka obsahující největší množství lykopenu.

Vedle této významné antioxidační schopnosti je soustředěn zájem o lykopen pro jeho výsledky uváděné v epidemiologických studiích, které ukazují, že karotenoidy s účinkem provitaminu A jako je β-karoten, mohou samy mít na některé formy nádorů ochranný účinek, aniž by se transformovaly na retinol. Mnoho perspektivních i retrospektivních výzkumných prací odhalilo i opačný vztah mezi spotřebou zeleniny a ovoce bohatých na karoten nebo vysoké koncentrace karotenu v plasmě a rizikem nádorů, zvláště plicních nádorů. Tyto výsledky byly připisovány karotenoidům pouze jako prekurzoru vitaminu A. Přesto poslední klinické zkoušky ukázaly, že braní samotného β-karotenu v potravě nemá žádnou • · · · • ·

- 3 výhodu vzhledem k riziku nádorů v porovnání s populací, jejichž strava je tohoto vitaminu prostá.

Stejné negativní výsledky byly získány u skupiny kuřáků nebo jedinců s rizikem asbestozy. Pečlivější zpracování těchto údajů ukazuje na to, že jiné karotenoidy než β-karoten mohou přispívat k dosažení ochranného účinku těmito zkouškami, zjištěného.

Co zvláště charakterizuje lykopen a v co se věří, že v tom spočívá jeho vynikající biologický účinek, že je schopen působit na tělo, je síla antioxidačního účinku nejpravděpodobněji proti jednoatomovému kyslíku, který je jedním z nejreaktivnějších látek při tvorbě volných radikálů. Vedle tohoto účinku proti jednoatomovému kyslíku je lykopen také extrémně aktivní při ochraně buněk a tkání proti dalším reaktivním formám kyslíku, jako je peroxid vodíku a oxid dusnatý.

Mezi tyto zvláštní účinky lykopenu, které jej řadí do popředí před jiné přírodní antioxidanty, lze zvláště počítat prospěšné účinky zlepšující zdraví, a ty řadí lykopen mezi výživu schopnou uplatnit se.

Skutečně bylo zjištěno, že jedinci postižení myokardiálním infarktem, rovněž tak jako ti, kteří jsou vysokým obsahem cholesterolu nebo triglyceridů v krvi rizikoví, mají oproti kontrolní skupině velmi nízkou koncentraci β-karotenu v krvi a zvláště lykopenu. Že to může mít vztah k antilipoperoxidačnímu účinku vyvolávanému lykopenem vychází též z výzkumu dokazujícího, že lykopen je přítomen v LDL a může chránit před jeho oxidací.

Bylo potvrzeno, že antilipoperoxidativní účinek lykopenu je také významným pro βa. α-karoten, pokud se měřilo na buněčných kulturách (C3H/10T1/2), kde chrání jejich neoplastickou transformaci. Antilipoperoxidativní účinek lykopenu také vysvětluje jeho schopnost chránit před atherosklerotickým a vaskulárním poškozením a také v součinosti s inhibici IGD a vazebnou nitrobuněčnou

- 4 komunikací zlepšovat účinnost působení na proliferaci nádorových buněk.

Lykopen je v inhibici spontánního vývoje nádorů prsních žláz u krys a při růstu leukemických buněk (H1-60 promyelocytická leukemická buněčná linie) rovněž tak jako krysího gliomu buněk C-6 in vitro nebo neoplastické tranfrormaci vyvolané chemickými látkami nejúčinnějším karotenoidem.

Epidemiologické studie prokázaly převrácený vztah mezi příjmem lykopenu ve stravě a riziku vývoje nádoru prostaty natolik, že je možné jej považovat za prostředek působící proti tomuto onemocnění. Totéž platí pro riziko nádorů prsu a plic.

Jiným onemocněním, u kterého může lykopen, podobně jako lutein a zeaxantin vykonávat preventivní účinek je makulární degenerace sítnice (AMD) způsobená stářím.

L-karnitin a jeho alkanoyl deriváty jsou dobře známy pro jejich důležitou úlohu, kterou hrají v metabolismu, zvláště co se týká oxidace při jejich využívání při βodbourávání mastných kyselin.

L-karnitin, a to ať už je přijímán s potravou, či syntetizován tělem, je krví koncentrován v orgánech, které jsou metabolicky nejaktivnější ve využívání mastných kyselin, jako je kosterní svalstvo a srdce.

Nedostatek L-karnitinu může vést k myopatiím, zatímco orální podávání zlepšuje klinický stav takových myopatií. Při mitochondriální oxidaci glukózy má L-karnitin také důležitou funkci při vytváření energie s tím výsledkem, že v kardiální a svalové oblasti je odpovídající hladina L-karnitinu pro normální energetický metabolismus nezbytná.

Jeho podávání zlepšuje odolnost ke stresu u těch jedinců, kteří trpí koronární nedostatečností, rovněž tak jako samotným průtokem krve srdcem a klinicky ovlivňuje kardiální dekompenzaci.

Dalšími biologickými vlastnostmi L-karnitinu a jeho derivátů, zvláště propionyl-Lkarnitinu jsou jeho schopnost stabilizovat buněčné membrány a chránit je proti lézím vyvolaným oxidačními procesy.

Podstata vynálezu

Nyní bylo překvapivě zjištěno, že přípravek obsahující charakteristické složky v kombinaci:

(a) propionyl-L-karnitin nebo jeho farmakologicky přijatelná sůl; a (b) karotenoid volený ze skupiny sestávající z lykopenu, cc-karotenu, β-karotenu, zeaxantinu, kryptoxantinu, luteinu nebo jejich směsí je extrémně účinný při prevenci a/nebo poškození vyvolaném přítomností volných radikálů pocházejících ze znečištěného prostředí a lipoperoxidačního jevu atherosklerotického, vaskulárního, kardiálního a cerebrálního původu; proliferačních abnormalit tkání včetně tkání prostaty, dělohy, prsů a střev; a poruch vízu a sítnice včetně zákalů a makulární degenerace sítnice, a to jako výsledek silného synergického účinku působeného těmito složkami.

Také bylo zjištěno, že složka (a) může případně obsahovat „karnitin“ vybíraný ze skupiny sestávající z L-karnitinu, acetyl-L-karnitinu, valeryl-L-karnítinu a isovalerylL-karnitinu nebo jejich farmakologicky přijatelných solí nebo jejich směsí, a že složka (b) může sestávat z extraktu rostlinného původu tuto látku obsahující, jako je například extrakt z rajského jablíčka (Lycopersicon esculentum, odrůdy Solanaceae).

Hmotnostní poměr (a): (b) se pohybuje od 1 : 0,1 do 1 : 10.

Přípravek může mít formu a využití jako doplňková výživa nebo skutečné léčivo v • · · · tt 9 9 9 9 · · • 9 · 9 »9 9 4 9 9

4 4 4 4 9 4 4 4 · 4 4

9 9494 494 ···· 99 99 44 49 449 závislosti na tom, zda jde o podpůrné či preventivní působení, nebo přísně terapeutické působení, pro které je přípravek určen a je používán a závisející na příslušném jedinci, který ho používá.

Toxikologické zkoušky

Jak karnitin, tak jeho deriváty a lykopen a další karotenoidy jako je lutein, zeaxantin a kryptoxantin, rovněž tak jako β-karoten mají nízkou toxicitu a jsou dobře tolerovány, zvláště pokud se podávají orálně.

Tyto vynikající charakteristiky byly potvrzeny zkouškami, které byly provedeny při podávání vysokých dávek jak L-karnitinu (1 g.kg'¹), tak propionyl-L- karnitinu (1 g.kg'¹), či L-karnitinu (250 mg.kg'¹) s propionyl-L-karnitinem (250 mg.kg'¹), acetyl-L-karnitinem (250 mg.kg'¹), isovaleryl-L-karnitinem (250 mg.kg'¹), a také podáváním 50 mg.kg'¹ lykopenu nebo 1 g.kg'¹ přírodního rajského extraktu obsahujícího 5 % lykopenu krysám.

Také kombinace 1 g.kg'¹ propionyl-L-karnitinu a 50 mg.kg'¹ lykopenu podávaná krysám orálně potvrdila dobrou toleranci a nezpůsobila žádnou mortalitu takto chovaných zvířat.

To samé platí pro výsledky získané při podávání karnitinové směsi (250 mg.kg'¹ Lkarnitinu s 250 mg.kg'¹ acetyl-L-karnitinu, 250 mg.kg'¹ propionyl-L-karnitinu a 250 mg.kg¹ isovaleryl-L-karnitinu) v kombinaci s lykopenem v dávce 50 mg.kg '¹. Podobné vynikající výsledky byly získány při denním podávání jak propionyl-Lkarnitinu (500 mg.kg' ) nebo směsi různých karnitinů (150 mg.kg' L-karnitinu s 150 mg.kg'¹ acetyl-L-karnitinu, 150 mg.kg'¹ propionyl-L-karnitinu a 150 mg.kg'¹ isovaleryl-L-karnitinu) v kombinaci s lykopenem v dávce 25 mg.kg'¹ krysám po prodlouženou dobu (30 dnů).

Na konci třicátého dne nevykazovaly takto chované krysy žádnou mortalitu ani známky toxicity. Chemicko fyzikální zkoušky, počet červených krvinek a počet • · «· · · 9 · · · ·· • ••9 99 9 9 9 9 • 999 999 9999

9 9 9 9 9 9 9 bílých krvinek byly u takto chovaných zvířat normální, rovněž tak jako výsledky histologických prověřování hlavních orgánů na konci pokusu.

Zkoušky na izolovaných jaterních buňkách intoxikovaných chloridem uhličitým

K hodnocení antioxidačních a ochranných účinků proti působení volných radikálů vyvolaných přípravkem podle vynálezu zde popsaného byl zkoumán účinek intoxikace vyvolané chloridem uhličitým na hodnocené izolované jaterní buněčné kultury.

Je dobře známo, že chlorid uhličitý (CCI₄) vyvolává lipoperoxidaci buněčných membrán, což může vést k nekrozám buněk.

Tyto zkoušky provedené na kulturách krysích jaterních buněk ukazují, že lipoperoxidativní a toxický účinek CCI₄ týkající se uvolňování volných radikálů je možno omezit přítomností karnitinové směsi (100 mg.l'¹) v kultuře obsahující Lkarnitin, acetyl-L-karnitin, propionyl-L-karnitin a isovaleryl-L-karnitin ve vzájemném hmotnostním poměru 1 :1 nebo propionyl-L-karnitinu (100 mg.l'¹), zvláště pokud se zkombinuje s lykopenem (20 mg.l'¹) nebo rajským extraktem obsahujícím 5 % lykopenu.

Za účelem provedení těchto zkoušek byly jaterní buňky odebrané z krysích jater izolovány metodou popsanou Seglenem (Seglen, F. O.: Meth. Cell. Biol. Chem., 264,4747, 1989).

Leze vyvolané CCI₄ na buněčných membránách a ochranný účinek vyvolaný karnitinovou směsí nebo propionyl-L-karnitinem nebo lykopenem, rovněž tak jako jejich kombinací byl vyhodnocen sledováním jak alanínaminotransferázy (AlaAT), tak aspartátaminotransferázy (aspaAT) v supernatantové tekutině buněčných kultur (Beckman 700-Encore 2 Auto-biochemistry Assay System).

K vyhodnocení ochranného účinku působícího proti lipoperodidačnímu účinku • · * 0 0 » «000 0· 0 • 00« 00 « 000« 000 00 0 00 0

000 00 0 000 0 0

0 0000 000 0000 00 00 00 00 «00

CCI4, se měří obsah malonylaldehydu metodou používající kyselinu thiobarbiturovou (Ohkawa, H.: Anal. Biochem., 95, 351, 1979).

Cytologie jaterních buněk na konci pokusu byla zkoumána po fixaci ve formalinu nebo glutaraldehydu a to jak světelným, tak elektronovým mikroskopem. Z prozkoumání výsledků těchto zkoušek vychází, že zde je překvapující stupeň synergismu v ochraně jaterních buněk proti lézím membrány a proti lipoperoxidaci vyvolané CCI₄, a to jak mezi karnitinovou směsí a lykopenem, tak mezi propionylL-karnitinem a lykopenem.

Tento synergismus mezi karnitiny, zvláště mezi propionyl-L-karnitinem a lykopenem je také zřejmý z měření malonylaldehydu, který je markérem lipoperoxidačního účinku.

Cytologické prověřování jaterních buněk potvrzuje omezení počtu nekrotických buněk po působení propionyl-L-karnitinem a lykopenem; ultrastrukturní zkoumání zvláště však tam, kde buňky v kontrolní skupině (CCI4) vykazovaly hemochromní abnormality, nesouměrné membrány jader, zmizelé mitochondriální kresty v mitochondriu a snížený počet ribozomů, měly ty buňky, které byly vystaveny nejen CCI4, ale i karnitinu a lykopenu, neočekávaně neporušené buněčné membrány a jádra a pravidelné heterochromatiny, rovněž tak jako pravidelné mitochondrie a počet ribozomů.

Normalizace cytologického vzhledu byla překvapivě markantní u jaterních buněk vystavených kombinovanému účinku karnitinové směsi a lykopenu, zatímco účinek samotných jednotlivých sloučenin, ne jejich kombinace, byl nevýrazný, čímž se demonstroval synergismus mezi karnitiny a lykopenem.

Tabulka 1

Koncentrace alaninaminotransferazy (AlaAT nmol.min'¹) v supernatantu kultur jaterních buněk vystavených CCI₄ (kontrolní) a vystavených samotné karnitinové • · · · » · · 1 φ· ··

- 9 směsi nebo propionyl-L-karnitinu nebo přírodnímu rajskému karotenoidovému extraktu nebo lykopenu, nebo jejich různým kombinacím (C = karnitinová směs; P = propionyl-L-karnitin; TE = přírodní rajský extrakt; L = lykopen).

Čas v hodinách	4	8	16
kontrolní	24,6±2,1	26,8±2,3	30,5+4,5
C	20,6±3,2	21,9±3,3	26,4±2,8
P	19,4±2,1	23,3±3,1	25,7±3,7
TE	22,3±1,8	24,3±2,7	24,7±2,9
L	22,1±2,1	20,6±2,4	23,6±2,1
C + TE	11,9±1,9	8,6±1,1	5,1±1,7
C + L	12,2±1,8	10,5±1,5	5,4±1,9
P + L	11,5±2,1	9,9±2,4	6,2±1,5

·· ·· · · · * · · ·· • « · · · · · · • ··· · · · · · · · · • · · · · · · · ♦ ·«·« ·· «· ·· ·· ··»

Tabulka 2

Koncentrace aspartátaminotransferázy (AspaAT nmol.min'¹) v supernatantu jaterních buněčných kultur vystavených CCI₄ (kontrolní) a karnitinové směsi nebo propionyl-L-karnitinu nebo přírodnímu karotenoidovému extraktu z rajských jablíček nebo samotnému lykopenu nebo jejich různým kombinacím (C = karnitinová směs; P = propionyl-L-karnitín; TE = přírodní extrakt z rajských jablíček; L = lykopen).

čas v hodinách	4	8	16
kontrolní	8,5±0,6	10,9±1,1	12,1±1,5
C	8,1±0,9	9,9±0,8	9,8±1,1
P	8,9±0,9	9,2±1,2	9,1±1,7
TE	8,2±0,8	9,1±0,9	9,0±1,2
L	8,8±1,8	8,9±0,9	9,0±1,2
C + TE	5,4±0,7	3,2±0,9	3,0±0,5
C + L	5,6±1,1	3,1±0,8	3,5±1,2
P + L	5,5±0,9	3,5±1,2	3,2±0,8

Zkoušky s pokusně vyvolaným kataraktem

I když mezi se faktory, které jsou zodpovědné za oční katarakty vyskytují odkazy nejen na oslabený glukozový metabolismus, ale také na volné radikály a lipoperoxidaci, z pohledu patogenní důležitosti a společně s dysfunkcí přívodu krve do sítnice, jsme pokusně u krys vyvolali oční katarakta výživou bohatou na galaktozu metodou popsanou Gabbayem (Gabbay, K. Η.: N. Engl. J. Med., 288, 821, 1973).

Přibližně po osmi dnech pokusu vznikl krysám zákal čočky, který byl podle stupně závažnosti hodnocen stoupající hodnotou jako stav I, II a III podle metody popsané Sippelem (Sippel, T. O.: Invest, Ophtalmol., 5, 568, 1966). Výsledky získané v těchto zkouškách ukázaly, že osmidenní podávání karnitinové směsi (400 mg.kg'¹ orálně v kombinaci s L-karnitinem, acetyl-L-kamitinem, propionyl-Lkarnitinem a isovaleryl-L-karnitinem v ideálním vzájemném hmotnostním poměru) nebo propionyl-L-karnitinu (400 mg.kg'¹) nebo lykopenu (5 mg.kg'¹) nebo přírodního extraktu z rajských jablíček obsahující 5 % lykopenu (100 mg.kg'¹) nebo těchtoproduktů v kombinaci omezilo závažnost očních lézí vyvolaných galaktozou. Výskyt zakalování čoček byl však téměř zcela inhibován, pokud se v • · · · » · • · ·· • · f · · • ··· · · · ♦ · · · * • ·#···«·» ···· «· ·· »· ···

- 11 předcházejícím devítidenním období pokusně chovaným krysám, kterým se podávala galaktoza, podávala také kombinace karnitinové směsi a lykopenu nebo propionyl-L-karnitinu a lykopenu.

Tabulka 3

Zkoušky inhibice zakalování čoček galaktosemických krys, kterým se podávala karntinová směs, propionyl-L-karnitin, přírodní rajský karotenoidový extrakt a lykopen, nebo jejich různé kombinace (skupiny po 20 krysách).

látka (mg.kg^-1)

Stupeň zakalení očních čoček (počet zkoumaných čoček) kontrolní 0 karnitinová směs (400 mg.kg’¹) 0 propionyl-L-karnitin (400 mg.kg'¹) 0 přírodní rajský karotenoidový extrakt(100 mg.kg'¹) 8 lykopen (5 mg.kg'¹) 6 karnitinová směs (400 mg.kg'¹) + přírodní rajský 12 karotenoidový extrakt (100 mg.kg'¹) karnitinová směs (400 mg.kg~¹)+lykopen (5 mg.kg'¹) 12 propionyl-L-karnitin (400 mg.kg'¹) + přírodní 14 rajský karotenoidový extrakt (100 mg.kg'¹) propionyl-L-karnitin (400 mg.kg'¹) + lykopen (5 mg.kg'¹) 15

8 4 8

III

Pokusné atherosklerotické zkoušky na králících

U těchto zkoušek byl vyhodnocován účinek samotné karnitinové směsi, propionylL-karnitinu, lykopenu a přírodního rajského extraktu obsahujícího 5 % lykopenu nebo jejich různých kombinací na králících s pokusně vyvolanou atherosklerozou.

Pro tyto zkoušky byli použiti novozélandští králíci o střední hmotnosti 2,9 kg, kteří • ♦ · · · · • · · ·· ·♦ • · · ♦ 9 9 · · • · · · ♦ · » ··· * 9 ·♦···»·· ···« ·· 99 99 99 ···

- 12 dostávali po dobu 30 po sobě následujících dnů normalizovanou potravu, do které bylo přidáno 0,5 % hmotn. cholesterolu. Každý den dostala stejná zvířata se svou potravou obohacenou o cholesterol dávku odpovídající 400 mg.kg'¹ karnitinové směsi (kombinace L-karnitinu, acetyl-L-karnitinu, propionyl-L-karnitinu a isovalerylL-karnitinu ve stejném vzájemném hmotnostním poměru), nebo 400 mg.kg'¹ propionyl-L-karnitinu, nebo 5 mg.kg'¹ lykopenu nebo 100 mg.kg'¹ přírodního rajského extraktu obsahujícího 5 % lykopenu, nebo stejné látky v různých kombinacích. Na konci třicátého dne působení byly odebrány z centrální arterie ucha každého zvířete vzorky krve a použity ke stanovení přítomných lipoproteinů Hatchovou metodou (Hatch, F. T.:Adv. Lipid Res., 6, 1, 1968).

Potom byla zvířata utracena a odebrána jim játra ke stanovení cholesterolu a triglyceridů podle Dehoffovy a Levyho metody (Dehoff, J. L.: Clin. Chem., 24, 433, 1978; Levý, A.: Advances in Automated Analysis (Technicon Corp.), 497, Thurman, Miami, 1972). K hodnocení přítomnosti atherosklerotických lézí podle Klurfeldovy metody (Klurfeld, D. M.: J. Med., 10, 35, 1979) bodovací stupnicí podle závažnosti od I do IV byly také izolovány a použity aorta a srdce.

Výsledky těchto zkoušek ukazují, že jak karnitiny, tak v menší míře lykopen vykazují ochranný účinek proti zvyšování koncentrace cholesterolu a triglyceridů u králíků vyvolané hyperlipidovou výživou, avšak pouze při jejich kombinovaném použití bylo dosaženo prakticky k úplné ochrany.

U zvířat, kterým byla podávána kombinace karnitinů a lykopenu se ve skutečnosti projevil takový stupeň ochrany, kterého nebylo možno dosáhnout spojením účinků jednotlivých látek podávaných samostatně. Výsledky těchto zkoušek také ukazují markantní synergický účinek vyvolaný přípravkem podle vynálezu zde popsaného.

Tabulka 4

Zkoušky u hypercholesterolemických králíků φφ φφφφ ♦ φ φφ φφ • φ φ φ φ φ φ φ φφφ φ φ φφφφ φφ φ φ φ φφφ φφφ φ φ φ φ φ φ φφ φφ

- 13 Koncentrace lipoproteinů v plazmě

HC	VLDL (mg.dl'1) 1119±295	LDL (mg.dl'1) 485±19,9	HDL (mg.dl'1) 23,1±6,5
CM	755±10,9	306±15,5	28,5±5,5
TE	880±105	295±20,7	30,1±4,2
P	805±95	280+22,5	29,5±6,2
L	715±80	260±28,5	29,3±5,5
CM + TE	280±45	155±16,5	35,5±3,9
CM + L	240±25	96±9,4	31,2±2,9
P + TE	250±30	105±15,5	36,9±3,5
P + L	220±20	90±10,5	32,1±3,1

HC = hypercholesterolemická kontrola CM = karnitinová směs TE = přírodní rajský karotenoidový extrakt P = propionyl-L-karnitin L = lykopen

Tabulka 5

Zkoušky u hypercholesterolemických králíků koncentrace celkového cholesterolu a triglyceridů v játrech

HC	celkový cholesterol (mg.dl'1) 1885±315	triglyceridy (mg.g'1) 180±15,5
CM	1420±205	155±12,7
TE	1475±195	139±11,5
P	1250±145	142±12,8
L	1200±180	135+13,8
CM + TE	985±85	115±11,6
CM + L	780±98	105±11,6
P + TE	750±64	110±10,7
P + L	655±90	90±8,5

HC = hypercholesterolemická kontrola CM = karnitinová směs TE = přírodní rajský karotenoidový extrakt P = propionyl-L-karnitin L = lykopen

9·««

9 99

99 9 9 9 · 9 999

994 99 « 99 9

999 999 9999 9

9 «99· 999

9999 99 99 99 99 99«

- 14 Zkoušky antoproliferativního účinku s vyhodnocením účinku ornitindekarboxylázy

Jak je známo, podobně jako forbolmyristáty, také teleocidin podávaný krysám subkutálně způsobuje proliferující abnormality na kůži zvířat na které se takto působí, což může vést i k vytváření keratotických jevů typu podobného nádorům.

Proliferativní abnormality jsou doprovázeny zvýšením koncentrace enzymu ornitindekarboxylázy a tak jako u všech případů patologické proliferující aktivace obecně, je zvyšování účinků ornitindekarboxylázy úměrné závažnosti vyvolaných lézí. V těchto zkouškách byl teleocidin rozpuštěn ve 0,2 cm³ vody a injikován do odchlupených hřbetů myší v dávce 5 μg na jednu myš. Sedm dní před tímto zákrokem obdržela zkoušená zvířata orálně dávku jak samotné karnitinové směsi (400 mg.kg'¹) sestávající z kombinace L-karnitinu, acetyl-L-karnitinu, propionyl-Lkarnitinu a isovaleryl-L-karnitinu ve stejném vzájemném hmotnostním poměru, tak samotný propionyl-L-karnitin (400 mg.kg'¹), či samotný přírodní karotenoidový extrakt (100 mg.kg'¹ obsahující 5 % lykopenu), či samotný lykopen (5 mg.kg'¹), nebo kombinaci karnitinové směsi s lykopenem nebo extrakt obsahující lykopen, nebo propionyl-L-karnitin s lykopenem nebo extraktem obsahujícím lykopen. V jiném souboru zkoušek byly tyto látky aplikovány na kůži myší půl hodiny před injikováním teleocidinu po vhodné dispergaci těchto látek nejprve v dimethylsulfoxidu a potom v lanolinu až k dosažení koncentrace 200 mg.cm'³ karnitinové směsi, nebo koncentrace 200 mg.cm'³ karotenoidového extraktu obsahujícího 5 % lykopenu, nebo koncentrace 5 mg.cm'³ lykopenu.

Různé preparáty byly aplikovány v dávkách po 0,3 cm³ na tu oblast kůže, kam byl injikovám teleocidin a injikované místo bylo chráněno zakrytím obvazem.

Za účelem vyhodnocení ornitindekarboxylázy v té části kůže, do které byl injikován teleocidin, byla pět hodin po injikování použita metoda popsaná O’Brienem a Nakadatem (O’Brien, T. G.: Cancer Res., 35, 1662 1975; Nakadate, T.: Cancer Res., 42, 2841, 1982). Koncentrace proteinu v epidermálním extraktu byla měřena za použití Lowryho metody (Lowry, O. H.: J. Biol. Chem., 193, 265, 1951).

• · ·· · · · · · · · · » · φ ♦ · · » ··· ♦ ··· ♦ · · ♦ · · 9 · · · · 9 9 9

9999 *· ♦· ·· 99 9

Výsledky těchto zkoušek ukazují, že jak karnitinová směs, tak karotenoidy v přírodním rajském extraktu, rovněž tak jako propionyl-L-karnitin samotný a samotný lykopen vykazují pouze malý ochranný účinek proti proliferujícímu jevu a proti zvýšení účinků ornitindekarboxylázy, avšak naproti tomu se prokazuje překvapivě velký ochranný účinek, pokud se tyto látky použijí v kombinaci, čímž se ukázal neočekávaný a překvapující synergický účinek.

Tabulka 6

Účinky ornitindekarboxylázy látka účinky ornitindekarboxylázy (nmol CO2.60 min'¹, mg'¹ proteinu)

	orální podávání	kožní aplikace
kontrolní	0,05±0,002	0,03±0,001
teleocidin	2,4±,0,3	2,6±0,2
karnitinová směs	1,92±0,4	1,75±0,3
propionyl-L-karnitin	1,90±0,2	1,60±0,1
přírodní rajský extrakt	1,85±0,3	1,80±0,2
lykopen	1,70±0,1	1,65±0,1
karnitinová směs + přírodní rajský extrakt	0,35±0,005	0,40±0,06
karnitinová směs + lykopen	0,30±0,03	0,45±0,05
propionyl-L-karnitin + přírodní rajský	0,36+0,06	0,30±0,04
extrakt
propionyl-L-karnitin + lykopen	0,33±0,05	0,31±0,03

Příklady provedení

Ilustrativní, avšak nikterak neomezující příklady přípravků podle vynálezu jsou uvedeny níže.

1) karnitinová směs 500 mg (L-karnitin 125 mg, acetyl-L-karnitin 125 mg, propionyl-Lkarnitin 125 mg, isovaleryl-L-karnitin 125 mg) ·· ·· ·♦··«· 4 4 4 4 4 4 · • 444 944 4

4 4 4 4 4

4444 44 44 44

přírodní rajský extrakt (deklarováno 5 % lykopenu)	100 mg
2) karnitinová směs	300 mg
(L-karnitin 75 mg, acetyl-L-karnitin 75 mg, propionyl-L-
karnitin 75 mg, isovaleryl-L-karnitin 75 mg)
přírodní rajský extrakt (deklarováno 5 % lykopenu)	50 mg
3) propionyl-L-karnitin	500 mg
přírodní rajský extrakt (deklarováno 5 % lykopenu)	100 mg
4) propionyl-L-karnitin	250 mg
přírodní rajský extrakt (deklarováno 5 % lykopenu)	50 mg
5) propionyl-L-karnitin	500 mg
Lykopen	5 mg
6) propionyl-L-karnitin	250 mg
Lykopen	2,5 mg
7) karnitinová směs	300 mg
(L-karnitin 75 mg, acetyl-L-karnitin 75 mg, propionyl-L-
karnitin 75 mg, isovaleryl-L-karnitin 75 mg)
Lykopen	5 mg
8) karnitinová směs	300 mg
(L-karnitin 75 mg, acetyl-L-karnitin 75 mg, propionyl-L-
karnitin 75 mg, isovaleryl-L-karnitin 75 mg)
lykopen	2,5 mg
9) karnitinová směs	300 mg
(L-karnitin 75 mg, acetyl-L-karnitin 75 mg, propionyl-L-
karnitin 75 mg, isovaleryl-L-karnitin 75 mg)
karotenoidový komplex (přírodní extrakt z rajských jablíček,	300 mg

rudých grepů, karotky, pomerančového květu)

10)	propionyl-L-karnitin lykopen β-karoten a-karoten lutein zeaxantin	400 mg 2,5 mg 5 mg 2 mg 5 mg 1 mg
11)	propionyl-L-karnitin lykopen trpasličí vějířová palma (Serenoa repens)	350 mg 5 mg 50 mg

99 9« 99 9999 99 9

9999 99 9 9999

999 99 9 99 9

999 999 9999 9

9 9999 999

9999 99 99 99 99 999 extrakt z Pygeum africanum 50 mg

12) karnitinová směs 300mg (L-karnitin 75 mg, acetyl-L-karnitin 75 mg, propionyl-Lkarnitin 75 mg, isovaleryl-L-karnitin 75 mg) přírodní rajský extrakt (deklarováno 5 % lykopenu) 100 mg extrakt z trpasličí vějířové palmy (Serenoa repens) 50 mg extrakt z Pygeum africanum 50 mg extrakt z květu kaktusu (Opuntia ficus indica) 50 mg glycinát zinečnatý 50 mg selen (1-seleniummethionát) 50 pg vitamin E 10 mg koenzym Q-io 10 mg

13) karnitinová směs 400 mg (L-karnitin 100 mg, acetyl-L-karnitin 100 mg, propionyl-Lkarnitin 100 mg, isovaleryl-L-karnitin 100 mg) přírodní rajský extrakt (deklarováno 5 % lykopenu) 100 mg anthocyaniny extrahované z klikvy 50 mg polyfenoly extrahované z grepů 10 mg vitamin E 10 mg selen methionát 50 pg

14) propionil-L-karnitin 300 mg β-karoten 5 mg lykopen 5 mg lutein 3 mg katechin 5 mg kyselina lipoová 5 mg koenzym Q10 10 mg vitaminC 100 mg vitamin PP 25 mg vitanin B₆ 25 mg vitamin B₁₂ 250 pg taurin 100 mg

Farmakologicky přijatelnou solí L-karnitinu nebo alkanoyl-L-karnitinu je míněna jakákoliv sůl těchto aktivních složek s kyselinou, která nedává vznikat nežádoucím toxickým nebo vedlejším účinkům. Tyto kyseliny jsou odborníkům ve farmacii dobře známy.

Příklady vhodných solí, které však nikterak neomezují jejich rozsah jsou: chlorid, bromid, jodid, aspartát, kyselý aspartát, citrát, kyselý citrát, vínan, fosforečnan, kyselý fosforečnan, fumarát, kyselý fumarát, glycerofosfát, glukofosfát, mléčnan, • « · · * ·

99

9 9 9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 9

999 999 9999 9

9 9 9 9 9 9 9 9

9999 99 99 99 99 999

- 18 maleát, kyselý maleát, orotát, šťavelan, kyselý šťavelan, síran, kyselý síran, trichloracetát, trifluoracetát a methansulfonat.

Seznam farmakologicky přijatelných solí schválených FDA je uveden v Int. J. of Pharm., 33, 201 - 217, 1986; tato poslední publikace je sem vložena jako odkaz.

Přípravek podle vynálezu může také obsahovat vitaminy, koenzymy, minerální látky a antioxidanty.

K výrobě přípravků s ohledem na specifickou cestu jejich podávání lze použít příslušné excipienty, které jsou farmaceutickým a potravinářským odborníkům známy.

• · 9· · · · · ·« · · • « 9 · 9 9 9 9 9 · • 999 9 9 · · · 9 · 9 • 9·······

9999 99 99 99 99 999

Claims (13)

1. Patentové nároky

   1. Antioxidační a antiproliferační přípravek vyznačující se tím, že obsahuje:

   (a) propionyl-L-karnitin nebo jeho farmakologicky přijatelnou sůl; a (b) karotenoid
2. 2. Přípravek podle nároku 1 vyznačující se tím, že složka (a) dále obsahuje „karnitin“ vybíraný ze skupiny sestávající z L-karnitinu, acetyl-L-karnitinu, valeryl-L-karnitinu, isovaleryl-L-karnitinu nebo jejich farmakologicky přijatelných solí nebo jejich směsí.
3. 3. Přípravek podle nároku 1 nebo 2 vyznačující se tím, že karotenoid se vybírá ze skupiny sestávající z lykopenu, a-karotenu, β-karotenu, zeaxantinu, kryptoxantinu, luteinu nebo jejich směsi.
4. 4. Přípravek podle nároku 1 až 3 vyznačující se tím, že hmotnostní poměr (a): (b) se pohybuje od 1 : 0,1 do 1 : 10.
5. 5. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že

   I složka (b) je ve formě rostlinných extraktů, které tuto složku obsahují.
6. 6. Přípravek podle nároku 5 vyznačující se tím, že jmenovaným rostlinným extraktem je extrakt z rajského jablíčka (Lycopersicon esculentum).
7. 7. Přípravek podle nároku 6 vyznačující se tím, že extrakt z rajského jablíčka obsahuje od 2 do 20 % hmotn. lykopenu.
8. 8. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že farmakologicky přijatelná sůl L-karnitinu nebo alkanoyl-L-karnitinu se vybírá ze skupiny obsahující: chlorid, bromid, jodid, aspartát, kyselý aspartát, citrát, kyselý citrát, vínan, fosforečnan, kyselý fosforečnan, fumarát, kyselý fumarát, glycerofosfát, glukofosfát, mléčnan, maleát, kyselý maleát, orotát, kyselý

   44 4444

   44 44

   4 4 4 4 «4 4

   4 44«

   4 4

   4444 44

   - 20 šťavelan, síran, kyselý síran, trichloracetát, trifluoracetát a methansulfonát.
9. 9. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že dále obsahuje vitaminy, koenzymy, minerální látky a antioxidanty.
10. 10. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že je ve formě doplňkové výživy pro orální podávání.
11. 11. Přípravek podle kteréhokoliv z předcházejících nároků vyznačující se tím, že je ve formě léčiva pro orální, parenterální, rektální, transdermální nebo oční podávání.
12. 12. Doplňková výživa podle nároku 10 k prevenci onemocnění způsobených přítomností volných radikálů pocházejících ze znečištěného prostředí a lipoperoxidačním jevem atherosklerotického, vaskulárního, kardiálního nebo cerebrálního druhu; proliferativních změn tkání jako jsou tkáně prostaty, dělohy, prsu nebo střeva; změn vízu a sítnice zahrnující katarakta a makulární degeneraci sítnice.
13. 13. Léčivo podle nároku 11 k terapeutické léčbě onemocnění způsobených přítomností volných radikálů pocházejících ze znečištěného prostředí a lipoperoxidačním jevem atherosklerotického, vaskulárního, kardiálního nebo cerebrálního druhu; proliferativních změn tkání jako jsou tkáně prostaty, dělohy, prsu nebo střeva; změn vízu a sítnice zahrnující katarakta a makulární degeneraci sítnice.