CZ2001531A3 - Chemické syntézy exochelinů - Google Patents

Abstract

Způsob syntézy sloučenin vážících železo s vysokou afinitou, které jsou známé jako exocheliny, a přesněji syntézy exochelinů a modifikací těchto nově syntetizovaných sloučenin za účelem změny jejich fyziologických vlastností, včetně použití těchto nově syntetizovaných sloučenin pro diagnostiku a léčbu onemocnění u savců, a to infarktu myokardu a nádorových onemocnění.

Description

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká dosud nepopsaného způsobu pro syntézu sloučenin vážících železo s vysokou afinitou, které jsou známé jako exocheliny, a přesněji syntézy exochelinů a modifikací těchto nově syntetizovaných sloučenin za účelem změny jejich fyziologických vlastností, včetně použití těchto nově syntetizovaných sloučenin pro diagnostiku a léčbu onemocnění u savců.

Dosavadní stav techniky

US patent č. 08/383180, US patent č. 5721209, US patent č. 08/796791, US patent 5786326, US patent č. 08/882122 a US patent č. 08/960714 (všechny Horwitz et al.), které všechny náleží nebo které jsou uděleny stejným zmocněncům jako předkládaný vynález, popisují, že exocheliny mají jedinečné fyziologicky výhodné vlastnosti. Například, při akutním infarktu myokardu je srdeční tkáň poškozena dvěma postupnými ději, hypoxií v ischemické fázi a oxidačním poškozením v reperfusní fázi. Myokard poškozený v ischemické fázi může být zachráněn obnovením průtoku krve v ischemické oblasti. Nicméně, reperfuse může vést k poškození reperfundované tkáně v důsledku zánětlivé odpovědi způsobené migrací leukocytů do tkáně a produkcí reaktivních typů kyslíku. Jedním z nejreaktivnějších typů kyslíku je hydroxylový radikál (-OH), který je tvořen za přítomnosti železa a který často způsobuje smrt buňky nebo oxidační poškození tkáně.

Prevence tvorby (-OH) brání letálnímu poškození buněk několika mechanismy. Je dobře známo, že tvorba (-OH) je ¹ A

Chemická syntéza exochelinu

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká dosud nepopsaného způsobu pro syntézu sloučenin vážících železo s vysokou afinitou, které jsou známé jako exocheliny, a přesněji syntézy exochelinu a modifikací těchto nově syntetizovaných sloučenin za účelem změny jejich fyziologických vlastností, včetně použití těchto nově syntetizovaných sloučenin pro diagnostiku a Léčbu onemocnění u savců.

Dosavadní stav techniky

US patent č. 08/383180, US patent č. 5721209, US patent č. 08/796791, US patent 5786326, US patent č. 08/882122 a US patent č. 08/960714 (všechny Horwitz et al.), které všechny náleží nebo které jsou uděleny stejným zmocněncům jako předkládaný vynález, popisují, že exocheliny mají jedinečné fyziologicky výhodné vlastnosti. Například, při akutním infarktu myokardu je srdeční tkáň poškozena dvěma postupnými ději, hypoxií v ischemické fázi a oxidačním poškozením v reperfusní fázi. Myokard poškozený v ischemické fázi může být zachráněn obnovením průtoku krve v ischemické oblasti. Nicméně, reperfuse může vést k poškození reperfundované tkáně v důsledku zánětlivé odpovědi způsobené migrací leukocytů do tkáně a produkcí reaktivních typů kyslíku. Jedním z nejreaktivnějších typů kyslíku je hydroxylový radikál· (-OH), který je tvořen za přítomnosti železa a který často způsobuje smrt buňky nebo oxidační poškození tkáně.

Prevence tvorby (-OH) brání ietálnímu poškození buněk několika mechanismy. Je dobře známo, že tvorba (-OH) je závislá na přítomnosti volného železa a že chelátory železa brání reperfusnímu poškození. Například, chelátor železa deferoxamin, je-li podán před reperfusí, brání poškození a snižuje velikost infarktu myokardu při oklusi koronární arterie a reperfusi. Nicméně, reperfusní poškození vzniká rychle po obnovení průtoku krve ischemickým myokardem.

Tvorba (-0H) radikálu závisí na přítomnosti volného železa a chelátory kovů mohou vychytávat volné železo a tak mohou způsobovat nedostatek železa pro katalýzu tvorby hydroxylového radikálu. Nicméně, v oboru známá činidla vytvářející cheláty nebráni produkci (-0H) Fentonovou reakcí (tj. EDTA), nebo pronikají do buněk příliš pomalu (tj. desferoxamin).

V důsledku toho není dostatečné množství činidla vytvářejícího cheláty přítomno dostatečně rychle pro to, aby mohlo dojít ke tvorbě chelátů s železem bránící tvorbě (-0H) a tak zabránění poškození buněk a jejich destrukci.

Bylo prokázáno, že desferrioxamin je účinný, pokud je podán před vznikem infarktu myokardu, ale je neúčinný, je-li podán při nebo po obnovení perfuse. Podobné poškození srdeční tkáně může vzniknout při srdečních by-passech, například během operacích na srdci nebo na jiných orgánech, když je do nich snížen přísun okysličené krve v důsledku chirurgického zákroku nebo poranění. Proto jsou chelátory vychytávající železo potřebné pro prevenci oxidačního poškození tkáně.

Před Horwitzovými objevy byly sloučeniny označované jako exocheliny stručně popsány, a jejich obecnou funkci při růstu mykobakterií popsali Máchám, Ratledge a Barclay z University of Hulí ve Velké Británii (Máchám, L.P., Ratledge, C. a Nocton, J.C., Extracelular Iron Acquisition by Mycobacteria: Role of the Exochelins a Evidence against the Participation of • ·

Mycobactin”, Infection a Immunity, Dec. 1975, str. 1242-1251, svazek 12, č. 6; Barclay, R. a Ratledge, C., Mycobactins a Exochelins of Mycobacterium tuberculosis, M. bovis, M. africanum a Other Related Species”, Journal of General Microbiology, 1988, str. 134, 771-776; Máchám, L.P. a Ratledge, C., Journal of General Microbiology, 1975, str. 89: 379-382) .

Máchám identifikoval existenci substance přítomné v extracelulární kapalině, kterou označil jako 'exochelin'. Máchám dále popsal materiály, které označil jako exocheliny, jako sloučeniny rozpustné ve vodě a chloroformu mající schopnost chelatovat volné železo. Máchám et al. neizolovali ani nepřečistili sloučeniny, pouze je charakterizovali jako penta- nebo hexapeptidy, s molekulovou hmotností v rozmezí 750 až 800, mimo jiné.

Podle Machamovi práce mají jeho exocheliny podobnost s mykobaktinem - který je přítomen v buněčné stěně a je přenašečem železa do nitra buňky. Nicméně, oproti mykobaktinu, lipofílní, ve vodě nerozpustné molekule, která není schopna difundovat do a asimilovat volné železo z extracelulárního prostředí, provádějí exocheliny při fyziologickém pH sekvestraci železa z jiných sloučenin přenášejících železo v séru. Máchám et al. také popsali, že - podle bakteriálního zdroje sloučenin - tato molekula může také obsahovat kyselinu salicylovou nebo β-alanin.

Barclay et al. (ibid.) také popsali produkci sloučenin označovaných jako exocheliny z 22 různých kmenů M. tuberculosis a příbuzných kmenů. Nicméně, u žádné z nich nebyla stanovena specifická struktura těchto sloučenin, ani nebylo navrženo žádné použití těchto sloučenin jiné než je jejich vlastní funkce přenašeče železa na mykobaktin ve stěně buněk.

Závěrem, Máchám et al. zjistili, že po sekvestraci železa z - například - ferritinu nebo transferrinu (a podobných sloučenin přenášejících železo přítomných v séru), prezentuje jím objevená sloučenina železo ve formě, ze které může být přeneseno na mykobaktin, zatímco Barclay et al. popisují produkci sloučeniny ze známých mykobakteriálních kmenů, bez přesného stanovení její struktury.

Úplnou syntézu příbuzné sloučeniny, mykobaktinu S2, popsali Maurer a Miller v 1983 (MAUER, P.J. a MILLER, M.J. Total Synthesis of a Mycobactin: Mycobactin S2, 1983, J. Am. Chem. Soc., str. 240-245, svazek 105). Mauer et al. úspěšně připravili 29 mg mykobaktinu pomocí komplexní, mnoha stupňové syntézy. Mykobaktin S2 je, nicméně, významně odlišný od cílové molekuly syntézy podle předkládaného vynálezu. Syntéza exochelinu také nebyla doposud popsána.

Následující odkazy uvádějí fakta související se syntézou podle předkládaného vynálezu:

MAUER,P.J. a MILLER, M.J., 1982, J. Am. Chem. Soc., 104, 3096; FARKAS, L. et al. , 1967, Tetrahedron, 23, 741;

SCHNIEPP.L.E. a GELLER, H.H., 1946, J.Am. Chem. Soc., 68,

1646;

GAUDRY, R., 1948, Can. J. Res. Séct. B. 26, 387;

DREYFUSS, P., 1974, J. Med. Chem., 17(2), 252;

BERLINGUET, L. a GAUDRY, R., 1952, J. Biol. Chem., 198, 765; BODANSZKY, M., et al., 1978, J. Med. Chem.. 21(10), 1030; MAURER, P. J. a MILLER, M.J., 1981, J. Org. Chem. Soc..

46(13), 2835;

BIRNBAUM, S.M., LEVINTOW, L. KINGSLEY, R.B. a GREENSTEIN, • · · · · · • · · · • · · « · 9 · • · · · · · · ♦· · 9 9 99 9 9

J.P., 1952, J. Biol. Chem., 194, 455;

COREY, E.J. a VANKATESWARLU, A., 1972, J. Am. Chem. Soc., 94, 6190;

SIEBER, P., 1977, Helv. Chim. Acta, 60, 2711 (b) ;

GERLACH, H., 1977, Helv .Chim. Acta, 60, 3039;

MITSUNOBU, 0,, 1981, Svnthesis, 1981, 1,

Horwitz, et al. objevili v současnosti přijímanou strukturu exochelinů a patentovali použití exochelinů jako nových sloučenin chelatujících železo pro inhibici železem zprostředkovaného oxidačního poškození vyskytujícího se při reperfusi, a pro použití v jiných stavech s poškozením tkání hydroxylovýmí radikály, jako je nádorový růst, arteriosklerosa, ochrana orgánů a okluze cév po angioplastice.

Také syntéza podobných sloučenin jasně ukazuje na jejich potřebu v lékařství, včetně potřeby syntetických verzí takových významných a potřebných sloučenin. Viz, například,

Hu, J., a Miller M.J., Total Synthesis of mycobactin S, a Siderophore and Growth Promotér of Mycobacterium smegmatis, and Determination of its growth Inhibitory Activity against Mycobacterium tuberculosis, 1997, str. 3462-3468, J. Chem. Soc. 119, Nicméně, komplikace doprovázející syntézu takových sloučenin vyžadují modifikace známých postupů a různé stereochemické překážky brání syntetické přípravě exochelinů.

Po určení chelatace železa jako způsobu pro prevenci oxidačního poškození živých tkání bylo navrženo mnoho potenciálních použití exochelinů a příbuzných sloučenin. Jako činidlo vychytávající železo ve fyziologickém systému, které je schopné odebírat železo z proteinů přenášejících železo, brání exocheliny účinně destrukci buněk po narušení průtoku krve. Podobně, chelatace jiných kovů může regulovat • · 9 99 9 9 · 9 9·· 9 9 • · 9 * · ·«·

9 9 9 9 9« 9 99

9999 9999 koncentrace těchto kovů v různých terapeutických aplikacích, včetně dodání různých významných kovů do těla nebo cílené podání léků navázaných na exocheliny do orgánů poškozených onemocněním, nebo v jiných použitích jako transportního systému.

Dřívější práce Horwitze et al. vedla k zisku přečištěných exochelinů a prokázala jejich použitelnost jako činidel vychytávajících volné železo a prokázala jejich účinnost v prevenci poškození tkáně hydroxylovými radikály. Přesněji, Horwitz et al. přečistili exocheliny z M. tuberculosis a prokázali, že účinně odebírají železo z transferinu, laktoferinu a ferritinu při fyziologickém pH, bez přenosu jakýchkoliv infekčních rysů tuberkulosních bakterií. Horwitz et al. také poprvé ukázali, že tyto exocheliny blokují tvorbu hydroxylových radikálů Fentonovou reakcí a že jsou, podle reakce srdečních myocytů, účinné pro prevenci reperfusního poškození po infarktu myokardu nebo cévním poškození jiných tkání, když jsou podány po nástupu ataky, do několika hodin po jejím vzniku.

Dále Horwitz et al. při hodnocení chemické struktury exochelinů zjistili, že dřívější práce nedefinují skutečnou strukturu a pouze charakterizují exocheliny jako peptidy. Tyto neúspěšné pokusy o identifikaci skutečné struktury exochelinové rodiny patrně odradily odborníky od provedení jejich syntézy. Podle širokého rozmezí molekulových hmotností, které exocheliny mají, objevili Horwitz et al., že do skupiny patří několik typů sloučenin s rozdílnými molekulovými hmotnostmi. Exocheliny nemohou být považovány za peptidy; obsahují tři aminokyseliny a jiné strukturální skupiny (kyselinu salicylovou, dikarboxylové kyseliny nebo monoesterové analogy a hydroxykarboxylové kyseliny) tvořené • · · · ·· ·· ·«· ·· • · » «· · · · · ····· » 9 · ·« • · ··«· β · · * «· · · · · « « · « « · amidovou (-NH-CO-), hydroxamatovou (-ΝΗ(OH)-C0-) a esterovou kondenzací (-C0-0).

Podobně, v současně projednávané US přihlášce č. 08/882122 je uvedeno, že snížení hladiny železa ovlivňuje nádorové buňky a toto snížení železa lze dosáhnout pomocí exochelinů.

Vzhledem k velmi vysoké afinitě pro železo a rozpustnosti v lipidech mohou exocheliny získané z Mycobacterium tuberculosis snadno vstupovat do buněk. Syntetické činidlo chelatující železo, jako jsou exocheliny z biologického zdroje, může být užitečné při diagnostice nádorů, léčbě a vyhledávání nádorů, stejně jako při jiných fyziologických problémech.

Existuje tedy potřeba vylepšeného syntetického činidla nebo sloučeniny účinné pro rychlou chelataci kovů, pro léčbu infarktu myokardu, nádorů a jiných stavů ovlivněných přítomností volných kovů, nebo pro chránění tkáně, která může být poškozena hydroxylovým radikálem nebo jinými mechanismy způsobujícími smrt a destrukci buňky.

Podstata vynálezu

Předmětem předkládaného vynálezu je způsob syntetické přípravy exochelinů, který překonává nevýhody dřívějších způsobů. Dalším předmětem vynálezu je syntéza sloučeniny, která se chová, ve všech ohledech, jako přirozený materiál, který izolovali Horwitz et al.

Dalším předmětem vynálezu je způsob přípravy syntetického desferri-exochelinu 772SM(R) nebo (S), který rychle chelatuje trojmocné železo v roztoku.

Dalším předmětem vynálezu je způsob chemické syntézy ·· 9··· · ί « · « • 9 desferri-exocheiinu 772SM(R) nebo (S), který rychle váže železo, společně s jinými kovy.

Dalším předmětem vynálezu je synteticky připravená exochelinová sloučenina, která eluuje při HPLC s reverzní fází (na fenylové koloně) při stejné koncentraci acetonitrilu jako přirozená molekula.

Ještě dalším, předmětem vynálezu je zjednodušený způsob pro přípravu syntetických exochelinů v průmyslovém rozsahu pro použití v prevenci oxidačního poškození živých tkání.

Stručně řečeno, vynález poskytuje způsob syntézy exochelinů 772SM(R), nové molekuly obsahující sedmičlenný uhlíkový řetězec zakončený methylesterem navázaným na acyklický hydroxamat, se čtyřmi stereogenními centry, včetně tří Sisoforem a R-konfigurace na B-podjednotce.

Způsob syntézy exochelinů 772SM(R) podle předkládaného vynálezu zahrnuje stupeň reakce kyseliny pimelové, dimethylpimelaru, kyseliny chlorovodíkové, methanolu a di-n-butyletheru, za vzniku methylhydrogenpimelatu, a potom smísení methylhydrogenpimelatu s thionylchloridem a dimethylformamídem za vzniku methylpimeloylchloridu, který se uskladní pro další reakce. Tato sloučenina se potom přidá do suspenze O-benzylhydroxylaminhydrochloridu a triethylaminu v CH2CI2 za vzniku O-benzylmethylpimeiylhydroxamatu. Do roztoku (L)-6-hydroxynorleucinu a triethylaminu ve směsi tetrahydrofuranu (THF)- vody se přidá roztok di-terc-butyldikarbonatu v 1HF. Vodná vrstva se potom okyselí na pH 3 kyselinou citrónovou a extrahuje se EtOAc. Organická vrstva se suší a přečistí se za zisku (L)-N-Boc-6-hydroxynorleucinu.

(L)-N-Boc-6-hydroxynorieucin reaguje s allylbromidem za zisku • · · · • · · · • · • · · * · # · ·· *· · allylesteru (L)-N-Boc-6-hydroxynorleucinu. Do allylesteru (L)-N-Boc-6-hydroxynorleucinu a bromidu uhličitého v bezvodém CH2CI2 se přidá trifenylfosfin za zisku viskózního oleje, který se potom přidá do EtOAc/hexanu a získá se allylester (L)-NBoc-6-bromnorleucinu. Připraví se směs allylesteru (L)-N-Boc-6-bromnorleucinu, O-benzylmethylpimelylhydroxamatu, jodídu draselného (ΚΙΊ a uhličitanu draselného v bezvodém acetonu a získá se allylester (L)-N⁶-methylpimelyl-N⁶-(benzyloxy)-N²-Boc-lysinu. K allylesteru (L)-N^S-methylpimelyl-N⁶-(benzyloxy)-N²Boc-lysinu se přidá kyselina trifluoroctová a vznikne pevný meziprodukt, kcerý se přidá k (L)-N-(2-(benzyloxy)benzoyl)šeřinu a 2-ethoxy-l-ethoxykarbonyl-l,2-dihydrochinolinu, za vzniku světle hnědého viskózního oleje, kterým je allylester (L) -N⁶-methylpimelyl-N⁶- (benzyloxy) -N²- ( (L) -N- (2- (benzyloxy) benzoyl)serin)-lysinu. Thionylchlorid se postupně přidává do chladného (lázeň -30 °C) roztoku lysinového allylesteru v bezvodém tetrahydrofuran u(THF) a zlatavě zabarvený olej se potom přečistí za zisku světle hnědého viskózního oleje, kterým je allylester (L)-N⁶-methylpimelyl-N⁶- (benzyloxy)-N²-((S)-2-(2-benzyloxy)fenyl)-2-oxazolin-4-karbonyl)-lysinu. Do roztoku oxazolin-lysinového allylesteru v bezvodém CH2C12 se přidá morfolin a tetrakis(trifenylfosfin)palladium, za zisku kyseliny. Do roztoku kyseliny a (L)-N^a-((S)-3-hydroxybutyryl)-α-amino-N-(benzyloxy)kaprolaktamu v bezvodém THF se postupně přidává diethylazodíkarboxylát. Materiál se izoluje a smísí se s MeOH, palladiem a vodíkem. Směs se přefiltruje a rozpouštědlo se potom odstraní za redukovaného tlaku a odpaří se současně s CH2CI2 za zisku špinavě bílého vločkovitého materiálu, kterým je podle NMR analýzy exochelin 772SM(R) vzorce la.

Výše uvedené a další předměty, výhody a rysy vynálezu budou zjevné z následujícího popisu, obrázků, tabulek a vzorců, z «· ··· · · ·· ·· ··· popisu provedení způsobů syntézy podle předkládaného vynálezu, ve kterých je použito běžných termínů, které představují běžné chemické skupiny a funkční skupiny.

Popis obrázků na připojených výkresech

Charakteristiky, aspekty a výhody předkládaného vynálezu budou srozumitelnější po prostudování následujícího popisu, připojených patentových nároků a připojených výkresů, kde:

Obr. 1 ukazuje cílovou molekulu exochelinu 772SM v R a S konfiguraci;

Obr. Ib ukazuje mykobaktin S2, který je uveden pro srovnání;

Obr. lc ukazuje cílovou molekulu podle obr. la rozdělenou do funkčních částí označených jako části A-F, za účelem popisu různých mechanismů dále vysvětlených na schématech I-VII, dále ;

Obr. 2 ukazuje první část chemické syntézy ve způsobu syntézy podle předkládaného vynálezu;

Obr. 3 ukazuje druhou část chemické syntézy ve způsobu syntézy podle předkládaného vynálezu;

Obr. 4 uvádí alternativní reaktanty pro provedení části způsobu syntézy podle předkládaného vynálezu;

Obr. 5 ukazuje chemické reakce po třetí části chemické syntézy ve způsobu syntézy podle předkládaného vynálezu;

Obr. 6 ukazuje poslední stupeň chemické syntézy ve způsobu

II syntézy podle předkládaného vynálezu.

Podrobný popis vynálezu

Předkladatelé vynálezu zjistili, jak je popsáno ve výše uvedených současně projednávaných US patentech, že exocheliny blokují nebo významně redukují oxidativní poškození tkáně vznikající při katalýze tkáně zprostředkované železem a působením volných radikálů, jako jsou hydroxylové radikály. Konkrétně, bylo prokázáno, že takové procesy se účastní reperfusního poškození, arteriosklerosy, katarakty, nádorů a jiných degenerativních poškození živých tkání.

Dále bylo prokázáno, že exocheliny účinně brání - nebo alespoň zpomalují - reperfusní poškození, když jsou podány na počátku nebo současně s reperfusi, významně snižují nebo brání blokádě arterií po angioplastice a snižují poškození normálních tkání chemoterapií používanou při léčně nádorů. Kromě toho předkladatelé vynálezu již dříve popsali, že exocheliny zahrnují mnohem širší skupinu materiálů majících různou chemickou strukturu, než původně předpokládali Máchám et al. a Barclay et al.

Nyní je známo, že exocheliny chelatují různé kovy a že když jsou správně modifikovány, tak mohou být použity pro léčbu různých onemocnění, pro ovlivnění nádorových buněk (mimo jiné) a mohou být pcužity také při diagnostice a sledování onemocnění. Například neuroblastomové buňky mohou být negativně ovlivněny odstraněním železa pomocí desferrioxiamanu, s poškozením zdravých tkání. Podobně chemoterapie, jako je například chemoterapie při leukémii, často způsobuje nadměrný přísun železa (například v důsledku transfusí) a rylo prokázáno, že exocheliny mohou být použity • · • · » · ««··« ·· · · · · · pro léčbu tohoto stavu.

Obr. la ukazuje cílovou molekulu exochelin 772SM(R) ve srovnání s mykobaktinem S2 (obr. lb). Ačkoliv má tato molekula podobnou strukturu jako mykobaktin S2, jsou přítomné významné rozdíly. Exochelin 772SM(R) je tvořen šesti-uhlíkovým řetězcem zakončeným methylesterem navázaným na acyklický hydroxamat (podjednotka F, obr. lc), zatímco mykobaktin S2 obsahuje v příslušné pozici pouze methylovou skupinu. Další strukturální odlišností je stereochemický charakter. Každá sloučenina obsahuje čtyři stereogenní centra a v případě mykobaktinu S2 jsou všechna tato centra v S-konfiguraci. Exochelin 772SM(R) má však na podjednotce B R-konfiguraci. Tři zbývající centra jsou také v S-konfiguraci, analogicky s mykobaktinem S2, Tyto odlišnosti vyžadují, aby byly pro syntézu cílové molekuly provedeny vhodné modifikace zavedených postupů.

Prvním cílem způsobu syntézy podle předkládaného vynálezu byla příprava E/D podjednotek exochelinu 772SM(R) (obr. lc (zejména blokový diagram funkčních jednotek cílové molekuly označených A-F)).

Syntéza 772SM(R) (la) a 772SM(S) (lb)

Obecný postup

Syntézy 772SM(R) a 772SM(S) jsou v některých ohledech podobné publikované syntéze mykobaktinu S2, což je důsledkem jejich podobné struktury. Rozdíl mezi diastereomery 772SM je v označeném chirálním centru. Konvergentní postup byl použit pro úplnou syntézu vyžadující 22 syntetických transformací.

Exochelin obsahuje kyselinu (jednotky CDEF) a kaprolaktam • · • · · · π .......

·«··· ««·· (jednotky AB) navázané esterovou vazbou.

Mitsunobuova reakce se použije pro vazbu jednotek CDEF s jednotkami AB, které byly připraveny způsobem uvedeným v literatuře z L-6-hydroxynorleucinu. Připravený kaprolaktam se naváže na kyselinu (S) -(+)-hydroxymáselnou za vzniku jednotky AB.

Příprava kyseliny vyžaduje osm stupňů syntézy v lineární sekvenci začínající kopulační reakcí L-6-hydroxynorleucinu s derivátem lysinu, jako je amin bez benzyloxykarbonylové skupiny (Boc) , se serinovým derivátem za použití kopulačního činidla 2-ethoxy-l-ethoxykarbonyl-l,2-dihydrochinolinu (EEDQ). Selektivní odstranění allylesteru za přítomnosti methylesteru umožní přípravu monokyseliny (Friedrich-Bochnitschek, S., Waldmann, H., Kunz, H., J. Org. Chem 1989, 54: 751).

Serinový derivát se připraví z kyseliny salicylové a Lserinu ve čtyřech stupních syntézy podle publikované metody (Maurer, P.J., Miller, M.J., J. Tím. Chem. Soc. 1983, 105: 240; (Maurer, P.J., Miller, M.J., J. Am. Chem. Soc. 1982, 104:

3096). Chráněná kyselina hydroxamová, použitá pro přípravu jednotky F, se připraví ve třech stupních syntézy z kyseliny pimelové (Swann, S. Jr., Oehler, R., Buswell, R.J., Org. Syntheses, Coli. Vol. II 1943, 276; Cason, J. Org. Syntheses. Coli. Vol. III 1955, 169).

Syntéza S formy je stejná jako syntéza R formy s tou výjimkou, že pro přípravu jednotky AB se použije kyselina (R) - (-)-hydroxymáselná.

Podrobný popis přípravy ··· ·· · · · · • ·

Požadovaný exochelin se připraví způsobem podle obr. 2-5,

A. Methylhydrogenpimelat (7). Směs kyseliny pimelové (15) (75,1 g, 0,47 mol), dimethylpimelatu (50,1 g, 0,27 mol), kyseliny chlorovodíkové (8 ml, 0,1 mol), methanolu (25 ml,

0,62 mol) a di-n-butyletheru (20 ml)se zahřívá (olejová lázeň: 100-110°C) pod atmosférou N₂ přes noc. Po ochlazení na teplotu okolí se přidá EtOAc (200 ml)a směs se promyje vodou (2 x 100 ml), nasyceným NaCl (2 x 100 ml) a suší se (Na₂SO₄) . Surový olej se se frakčně destiluje (vigreux, 125-130 °C, 0,7 mm Hg) za zisku čirého oleje (55,5 g, 68%, čistota - 95 %). Podle NMR analýzy je čirým olejem methylhydrogenpimelat (7) (¹H NMR): TLC (SÍO2, MeOH/EtOAc/hexan (2:8:15, obj./obj.)) Rf = 0,25-0,34; ³H NMR (300 MHz, CDC1₃) δ 3,67 (s, 3 Η) , 2,40-2,28 (m, 4 Η), 1,721,58 (m, 4 Η) , 1,45-1,32 (m, 2 H) .

B. Methylpimeloylchlorid (8). padesát tři gramů (53 g) methylhydrogenpimelatu (7) (0,3 mol) ze stupně A se smísí s thionylchloridem (30 ml, 0,4 mol) a dimethylformamidem (0,3 ml) a směs se mísí za zahřívání přes noc (olejová lázeň, 52 °C). Nadbytek thionylchloridu se odstraní destilací. Získaný surový olej se destiluje (0,6 mm Hg, 80-90 °C) za zisku čirého oleje (54,1 g, 92%, čistota - 95 %). Podle NMR analýzy je čirým olejem methylpimeloylchlorid (8) (¹H NMR)): ¹H NMR (300

MHz, CDCI3) δ 3,67 (s, 3 Η) , 2,90 (t, J = 7,8 Hz, 2 Η) , 2,33 (t, J = 7,3 Hz, 2 Η) , 1,80-1, 60 (m, 4 Η) , 1,45-1,30 (m, 2 H) .

C. O-benzylmethylpimelylhydroxamat (6). Připraví se suspense

O-benzylhydroxylaminhydrochloridu (43,3 g, 0,27 mol) a triethylaminu (80 ml, 0,57 mol) v CH2CI2 (800 ml) v atmosféře N₂ a do suspenze se přidá během 15 minut 52,2 g methylpimeloylchloridu (8) (0,27 mol) ze stupně B. Po míšení přes noc při teplotě okolí se směs promyje 0,5 N HCI (1 x 500 ml), 10 % NaHCCb (1 x 500 ml) a suší se (Na₂SO₄) . Po přečištění • · rychlou chromatografií (silikagel; EtOAc/hexan (2:3, obj./obj.) a EtOAc/hexan (1:1, obj./obj.) se získá světle žlutý olej (68,2 g, 98%), kterým je O-benzylmethylpimelylhydroxamat (6); TLC (SiO₂, EtOAc/hexan (1:1, obj./obj.) R_f =

0,13; ÍH	NMR (	360 MHz,	CDC13) δ 7,	34 (br	s,	5 Η) , 4,85	(br s, 2
H), 3,62	(s, 3	Η), 2,26	(t, J=7,4	Hz, 2	Η) ,	2,10-1,90	(m, 2
H), 1,70-	-1,50	(m, 4 Η) ,	1, 30-1,20	(m, 2	H) ;	Hmotnostní
spektrum	(ESI)	, m/z 280	(MH+) .

D. (L)-N-Boc-6-hydroxynorleucin (9). Do roztoku (L)-6-hydroxynorleucinu (16) (12,0 g, 81,5 mmol) a triethylaminu (11,4 ml, 81,8 mmol) ve směsi tetrahydrofuran (THF)- voda (1:1, 420 ml) se přidá roztok di-terc-butyldikarbonatu (BOChO (21,3 g, 97,6 mmol) v THF (30 ml). Po míšení přes noc při teplotě okolí se objem zmenší na jednu polovinu pomocí redukovaného tlaku. Do směsi se přidá IN NaOH (100 ml) a směs se promyje EtOAc (3 x 100 ml). Vodná vrstva se okyselí na pH 3 kyselinou citrónovou (19,4 g, 101 mmol) a extrahuje se EtOAc (3 x 100 ml). Organická vrstva se suší (Na₂SO4) , filtruje se a rozpouštědlo se odstraní za redukovaného tlaku za zisku čirého oleje, který krystalizuje při skladování na chladném místě za zisku bílé pevné substance (18,7 g, 93%). Materiál se rozpustí v EtOAc (350 ml) za zahřívání (lázeň, 65 °C) a do horkého roztoku se postupně přidá hexan (300 ml) . Roztok se nechá stát přes noc při zeplotě okolí a bílé krystalky se určené jako (L)-N-Boc-6-hydroxynorleucin (9) se odfiltrují a promyjí se EtOAc-hexanem (1:1, 4 x 30 ml) (16,1 g, 80%) : t.t. 113-115 °C (lit.¹ t.t. 112-113 °C).

E. Allylester (L)-N-Boc-6-hydroxynorleucinu. Směs (L)-N-Boc-6-hydroxynorleucinu (9) (28,5 g, 115 mmol), NaHCO3 (15,5 g, 184 mmol), trikaprylmethylammoniumchloridu (katalyzátor fázového přenosu), (10,1 g, 25 mmol), allylbromidu (13 ml, 150 mmol),

CH₂C1₂ (100 ml a vody (100 ml) se důkladně mísí při teplotě okolí v atmosféře N₂. Po 8 dnech se směs přefiltruje a přečistí se rychlou chromatografií (silikagel; EtOAc/hexan (1:9, obj./obj.) a EtOAc/hexan (2:3, obj./obj.)) za zisku světle žlutozeleného oleje (29,6 g, 89%), kterým je allylester (L)-N-Boc-6-hydroxynorleucinu (10): TLC (SiO₂, EtOAc/hexan (1:1, obj./obj.)) R_f = 0,20; ^XH NMR (300 MHz, CDC1₃) δ 5, 96-5,85 (m, IH), 5,38-5,21 (m, 2 Η) , 5,09 (br s, 1 Η), 4,72-4,58 (m, 2 Η), 4,33 (br s, 1 Η) , 3,64 (t, J= 6,3 Hz, 2 Η) , 1,96-1,20 (m, 15 H); hmotnostní spektrum (ESI), m/z 286 (M-H).

Pro chránění karboxylové skupiny (L)-N-Boc-6-hydroxynorleucinu (9) byl vybrán allylester. Allylester se připraví za mírných podmínek bez nutnosti chránění alkoholu. Allylester může být odstraněn za mírných podmínek za použití palladiem katalyzované reakce pro přenosu allylu, za přítomnosti methylesteru. Tato strategie byla úspěšně použita při přípravě sloučeniny 2, jak je popsána dále. Jiné strategie chránění jsou také použitelné, jako je použití fenacylových,

2-(trimethylsilyl)ethylových a 2,6-dimethoxybenzylových esterů. Při použití těchto jiných chránících skupin pro karboxylovou skupinu může být nutné chránění alkoholové skupiny 9 a činidla (Zn/HoAc, DDQ) používaná pro jejich odštěpení mohou být nevhodná pro jiné skupiny přítomné ve sloučenině 2.

F. Allylester (L)-N-Boc-6-bromnorleucinu (11a). Do chladného (lázeň 10-20 °C) roztoku allylesteru (L)-N-Boc-6-hydroxynorleuoinu (10) ze stupně E (40,6 g, 141 mmol) a bromidu uhličioého (51,6 g, 156 mmol) v bezvodém CH₂C1₂ (400 ml) v atmosféře N₂ se přidá trifenylfosfin PPh₃ (40,9 g, 156 mmol) během 23 minut. Směs se zahřeje na teplotu okolí. Po přibližně 2 hodinách se směs zahustí za redukovaného tlaku za

zisku viskózního oleje. Do oleje se přidá EtOAc/hexan (3:17 (obj./obj.), 200 ml) a sraženina se odfiltruje a promyje se EtOAc/hexanem (3:17 (obj./obj.), 500 ml). Filtrát se zahustí za redukovaného tlaku a přečistí se rychlou chromatografií (silikagel; EoOAc/hexan (1:19, obj./obj.) a EtOAc/hexan (1:4, obj./obj.) za zisku světle žlutého oleje, kterým je allylester (L)-N-Boc-6-bromnorleucinu (11a) (41,8 g, 84%): TLC (SiO₂,

EtOAc/hexan (1:1 , obj./obj.) Rf = 0,60; ³H NMR (360 MHz,

CDCI3) δ 5, 97-5,85 (m, 1 Η) , 5,36-5,24 (m, 2 Η) , 5,20 (br s,

IH), 4,70-4,53 (m, 2 Η), 4,32 (br s, 1 Η) , 3,39 (t, J = 6,6 Hz, 2 Η), 1,95-1,80 (m, 3 Η), 1,72-1,25 (m, 12 H); hmotnostní spektrum (ESI), m/z 350 (MH⁺) .

Výše uvedená reakce může být také provedena v tetrahydrofuranu (THF) se stejným výsledkem. Jako třetí možnost může být použit N-brom-sukcinimid pro přípravu sloučeniny 11a za použití dimethylformamidu (DMF) nebo methylenchloridu (CH₂C1₂) . Výtěžek nebyl stanoven, ale produkt Rf byl identický s 11a (TLC (SiO₂, EtOAc/hexan (1:3, obj./obj.)) R-- = 0,36.

G. Allylester (L)-N-Boc-6-methansulfonylnorleucinu (11b). V alternativním postupu se do chladného (0 °C lázeň) roztoku allylesteru (!)-N-Boc-6-hydroxynorleucinu (10) ze stupně E (80 mg, 0,28 mmol), triethylaminu (80 ml, 0,57 mmol), dimethylaminopyridinu (DMAP) (cat) v bezvodém 0Η₂01₂ (1 ml) v atmosféře N₂ přidá methansulfonylchlorid (27 ml, 0,34 mmol). Reakční směs se zahřeje na teplotu okolí a zahustí se za redukovaného claku a přečistí se rychlou chromatografií (silikagel; EzOAc/hexan, (1:19, obj./obj.)) za zisku světle žlutého oleje, kterým je allylester (L)-N-Boc-6

-methansulfonvlnorleucinu (11b) (81 mg, 79%): TLC (SiO₂,

EtOAc/hexan (1:1, obj./obj.)) R_f = 0,36; ^jH NMR (360 MHz, CDC1₃) • · · · « · ···· ·· · · • ··· · · · · δ 5, 98-5,84 (m, 1 Η), 5,38-5,24 (m, 2 Η), 5,08-4,96 (m, 1 Η),

4,70-4,58 (m, 2 Η), 4,38-4,26 (m, 1 Η), 4,21 (t, J= 6,4 Hz, 2 H), 2,99 (s, 3 Η) , 1,95-1,35 (m, 15 H) .

Alternativně může být methanesulfonat připraven jako reaktant pro kopulační reakci s hydroxamatem 6. Předpokládá se, že methansulfonat bude snižovat celkový reakční čas a zlepšovat výtěžek 5.

H. Allylester (L)-N⁶-methylpimelyl-N⁶-(benzyloxy)-N²-Boc-lysinu Směs allylesteru (L)-N-Boc-6-bromnorleucinu (11a) (19,5 g,

55,7 mmol), O-benzylmethylpimelylhydroxamatu (6) (20,0 g, 71,6 mmol), jodidu draselného (KI) (5,0 g, 30,1 mmol) a uhličitanu draselného (BůCCb) (20,0 g, 144,7 mmol) v bezvodém acetonu (125 ml) se zahřívá při teplotě zpětného toku v atmosféře N₂ za důkladného míšení. Po 6 dnech se přidá další jodid draselný (1,0 g, 6,0 mmol) a uhličitan draselný (4,0 g, 28,9 mmol). Po 8 dnech se přidá ještě další jodid draselný (1,0 g, 6,0 mmol) a uhličitan draselný (4,0 g, 28,9 mmol) pro zvýšení výtěžku.

Po 10 dnech se směs ochladí na teplotu okolí, přidá se EtOAc (100 ml) a pevný materiál se odfiltruje. Filtrát se zahustí za redukovaného vlaku a vzniklý žlutozelený olej se přečistí rychlou chromatografií (silikagel; EtOAc/hexan (1:4, obj./obj.), EvOAc/hexan (2:3, obj./obj.) a EtOAc/hexan (3:2, obj./obj.)) za zisku světle žlutého oleje, kterým je allylester (L)-N⁶-methylpimelyl-N⁶-{benzyloxy)-N²-Boc-lysinu (5) (21,4 g, ~0%): TLC (SiO₂, EtOAc/hexan (1:1, obj./obj.)) R_f = 0,36, O-alkylované produkty, R_f = 0,56); ^XH NMR (360 MHz, CDC1₃) δ 7,45-^,30 (m, 6 Η) , 5,95-5,82 (m, 1 Η) , 5,35-5,20 (m,

Η), 5,10-5, C3 (m, 1 Η), 4,79 (s, 2 Η), 4,65-4,55 (m, 2 Η) , 4,32-4,20 (m, 1 Η), 3,66 (s, 3 Η), 3,70-3,55 (m, 2 Η), 2,37 (t, J = 7,5 Hz, 2 H), 2,29 (t, J= 7,5 Hz, 2 Η), 1,88-1,22 (m, 21 H); hmotnoszní spektrum (ESI), m/z 549 (MH) .

• ·

I. Allylester (L)-N⁶-methylpimelyl-N⁶-(benzyloxy)-N²-((L)-N-(2-(benzyloxy)benzoyl)serin)lysinu

Kyselina trifluoroctové (TFA) (25 ml, 325 mmol)se přidá k allylesteru (1)-N⁶-methylpimelyl-N⁶-(benzyloxy)-N²-Boc-lysinu (5) (23,2 g, 12,3 mmol) v ledové lázni. Směs se zahřeje (lázeň °C). Po přibližně 2 hodinách se nadbytek TFA odstraní za redukovaného tlaku, přidá se CH2CI2 (50 ml) a pH se upraví na přibližně 8,0 (pH papírek 0-14) pomocí Na₂CO₃ (1,5 M, 70 ml). Organická vrstva se separuje a vodná vrstva se extrahuje CH2CI2 (20 ml). Kombinovaná organická fáze se suší přes K₂CO₃/Na₂SO₄ (2:3, 50 g) a a přefiltruje se za zisku pevného meziproduktu. Meziprodukt se promyje CH2CI2 (50 ml) a filtrát se přidá k (1)-N-(2-(benzyloxy)benzoyl)šeřinu (4) (13,8 g,

43.8 mmol). Do vzniklého světle žlutého roztoku se při teplotě okolí přidá 2-ethoxy-l-ethoxykarbonyl-l,2-dihydrochinolin (EEDQ) (11,3 g, 45,7 mmol) a směs se mísí přes noc v atmosféře N₂. Rozpouštědlo se odstraní za redukovaného tlaku, přidá se EtOAc (150 ml) a směs se promyje 0,25 M HCI (2 x 100 ml) a 10 % NaHC0₃/nasycenou solankou (4:1, 250 ml). Po pomalé separaci emulze se základní vrstva zpětně extrahuje EtOAc {1 x 50 ml). Organické vrstvy se kombinují a promyjí se nasycenou solankou (2 x 150 ml) a suší se (Na₂SO₄) . Zbytek ve formě broskvově zabarveného oleje se přečistí rychlou chromatografií (silikagel; EtOAc/hexan (2:1, obj./obj.), EtOAc/hexan (4:1, obj./obj.) a EtOAc/hexan (9:1, obj./obj.)) za zisku světle hnědého viskozního oleje, kterým je allylester (L)-N⁶-methylpimelyl-N⁶- (benzyloxy) -N²- ( (L) -N- (2- (benzyloxy) benzoyl)serin)-lysinu (12) (24,8 g, 79 %, čistota - 95 %) ^:H

NMR (jedna skvrna při TLC): TLC (SiO₂, EtOAc/hexan (3:1, obj./obj.)) R_;= 0,20); 3 NMR (360 MHz, CDC1₃) δ 8,73 (br d, J=

6.8 Hz, 1 Η), 3,20-8,14 (m, 1 Η), 7,71-7,22 (m, 11 Η), 7,10-20

7,00 (m, 2 Η),	5,	95-	-5,80 (m, 1 Η),	5,	35-	-5, 18	(m, 4 Η) ,	4,72
(s, 2 Η), 4,70	-4,	45	(m, 4 Η), 4,08	-4,	00	(m,	1 Η) , 3,65	(s, 3
H), 3,65-3,40	(m,	3	Η), 3,15-3,05	(m,	1	Η) ,	2,38-2,24	(m, 4
Η) , 1,90-1,48	(m,	8	Η), 1,38-1,20	(m,	4	H) ;	hmotnostní

spektrum (ESI), m/z 746 (MH⁺) .

J. Allylester (L)-N^s-methylpimelyl-N⁶-(benzyloxy)-N²-((S)-2- (2- (benzyloxy)fenyl)-2-oxazolin-4-karbonyl)-lysinu (13)

Thionylchlorid (SOCI2) (19 ml, 260 mmol) se postupně přidává do chladného (lázeň 30 °C) roztoku lysinového allylesteru ze stupně I (24,0 g, 32,2 mmol) v bezvodém tetrahydrofuranu (THF) (80 ml). Po promísení se reakční směs uloží přes noc do ledničky (-20 °C). Chladná směs se přidá po kapkách do 1,2 M Na2CC>3 (500 ml) (konečné pH - 8)) a extrahuje se EtOAc (2 x 150 ml). Kombinované organické materiály se promyjí nasycenou solankou (1 x 150 ml) a suší se (Na2SO₄). Zlatavě zabarvený olej se potom přečistí rychlou chromatografií (silikagel; iPrOH/hexan (1:9, obj./obj.), EtOAc/hexan (2:1, obj./obj.) za zisku světle hnědého viskozního oleje, kterým je allylester (L)-N⁶-methylpimelyl-N⁶-(benzyloxy)-N²-((S) -2-(2-benzyloxy)fenyl)-2-oxazolin-4-karbonyl)lysinu (13) (17,1 g, %, čistota - 95 % (^ΧΗ NMR): TLC (SiO2, EtOAc/hexan (3:1, obj./obj.) Rf= 0,40); ^XH NMR (360 MHz, CDC13) δ 7,83-7,78 (m, 1 Η) , 7,53-7,25 (m, 11 Η), 7,20-7,12 (m, 1 Η) , 7,05-6,97 (m, 2 Η) , 5,95-5,80 (m, 1 Η), 5,35-5,18 (m, 4 Η), 4,91 (dd, J =

10,3, 8,4 Hz, 1 H), 4,71 (s, 2 Η) , 4, 65-4, 47 (m, 5 Η) , 3,65 (s, 3 Η), 3,52-3,40 (m, 2 Η) , 2,33-2,25 (m, 4 Η), 1,80-1,15 (m, 12 H); hmotnostní spektrum (ESI), m/z 728 (MH⁺) , 726 (M-H)'

K. Sloučenina 14a. Do roztoku oxazolin-lysinového allylesteru (13) ze stupně J (8,1 g, 11,1 mmol) v bezvodém CH2CI2 (50 ml) se přidá morfolin (1,1 ml, 12,5 mmol) a tetrakis(trifenylfosfin) palladium (Pd(PPh₃)₄) (0,1 g, 0,09 mmol) v atmosféře N₂ • »

při teplotě okolí. Po 1 hodině se rozpouštědlo odstraní za redukovaného ulaku, přidá se EtOAc (100 ml) a organický materiál se promyje 0,25 M HCI (1 x 60 ml), nasycenou solankou (3 x 50 ml), suší se (Na₂SO₄) , filtruje se a rozpouštědlo se odpaří za redukovaného tlaku. Světle hnědý olej se odpaří současně s toluenem (3 x 10 ml) a suší se ve vakuu po dobu přibližně 1 hodiny, za zisku kyseliny 2 ve formě světle hnědé skloviny (hmornostní spektrum (ESI), m/z 688 (MH⁺) , 686 (M-H)'). Do roztoku kyseliny 2, (L)-N^a-(S)-3-hydroxybutyryl)α-amino-N-(benzyloxy)kaprolaktamu (3a) nebo (3b) (3,5 g, 10,9 mmol) a PPh₃ (5,6 g, 21,4 mmol) v bezvodém THF (70 ml), ochlazeného (0 °C lázeň) v atmosféře N₂ se postupně přidá diethylazodikarboxylat (DEAD) (3,4 ml, 21,6 mmol). Chladící lázeň se odstraní a obsah se mísí přes noc. Rozpouštědlo se odstraní za redukovaného tlaku a zlatavý olej uvedený na obr.

jako sloučenina 14a se přečistí dvěma postupnými rychlými chromatografiemi: chromatografie 1 (silikagel; i-PrOH/hexan (3:7, obj./obj.), i-PrOH/hexan (2:3, obj./obj.), chromatografie 2 (silikagel; CH₂C1₂/ EtOAc (3:17, obj./obj.), EtOAc) za zisku světle hnědé skloviny (5,3 g, 49 %, čistota 90-95% (IH NMR: TLC (SiO₂, MeOH/EtOAc, (1:32, obj./obj.) R_f = 0,30); ^_1Η NMR (360 MHz, CDC1₃) δ 7,80 (dd, J= 8,0, 1,7 Hz, 1 Η), 7,49 (br d, J= 7,0 Hz, 2 Η), 7,45-7,24 (m, 14 Η), 7,19 (br d, J = 8,0 Hz, 1 Η), 7,04-6,96 (m, 3 Η), 5,37-5,18 (m, 3 Η), 5,02-4,85 (m, 3 H, zahrnuje AB kvartet 4,98 (J- 8,0 Hz), 4,88 (J= 8,0 Hz), 4,71 (s, 2 Η), 4,63-4,52 (m, 2 Η), 4,50-4,41 (m,

H), 3,68-3,40 (m, 4 Η), 3,65 (s, 3 Η), 2,55 (dd, J= 14,5,

6,8 Hz, 1 Η), 2,44 (dd,J= 14,5, 5,9 Hz, 1 Η), 2,36-2,25 (m, 4 H), 2,02-1,82 (m, 2 Η), 1,80-1,15 (m, 16 Η), 1,30 ( d, J = 6,3 Hz, 3 H); hmotnostní spektrum (ESI), m/z 991 (MH⁺) , 989 (M-H)'.

Pomocí TLC bylo zjištěno, že kyselina 2 by měla být použita ihned, protože určitý rozklad proběhne při skladování přes noc při nízké teplotě (4 °C).

Mezi alternativy k Mitsunobuově kopulační reakci patří:

1. Aktivace karboxylové skupiny za použití směsných anhydridu, N-acylimidazolů a aktivovaných esterů (např. BOP) .

2. Aktivace hydroxylové skupiny za použití dicyklohexylkarbodiimidu (DCC).

L. Sloučenina 14b. Tato sloučenina se připraví podobně jako sloučenina 14a s podobným výtěžkem s tou výjimkou, že se použij e (L)-N^a-((R)-3-hydroxybutyryl)-α-amino-N-(benzyloxy)kaprolaktam (3b): TLC (SiO2, MeOH/EtOAc (1:32, obj./obj.) Rf= 0,30); ^ΧΗ NMR (360 MHZ, CDC13) δ ^XH NMR (360 MHZ, CDC1₃) δ 7,80 (dd, J= 8,0, 1,7 Hz, 1 Η), 7,50 (br d, J= 7,1 Hz, 2 Η), 7,44726 (m, 14 Η), 7,18 (br s, 1 Η), 7,04-6,96 (m, 3 Η), 5,35-5,18 (m, 3 Η), 5,03-4,85 (m, 3 H, zahrnuje AB kvartet) 4,92 (J =

10,5 Hz), 4,82 (J = 10,5 Hz), 4,70 (s, 2 Η) , 4,63-4,55 (m, 2 Η), 4,48-4,39 (m, 2 Η), 3, 67-3,58 (m, 1 Η) , 3,65 (s, 3 Η), 3,56-3,41 (m, 3 Η), 2,57 (dd, J = 14,5, 6,9 Hz, 1 Η), 2,40 (dd, J = 14,5, 62 Hz, 1 Η), 2,36-2,24 (m, 4 Η), 2,02-1,95 (m,

Η), 1, 95-1,82 (m, 1 Η), 1,82-1,18 (m, 16 Η) , 1,33 (d, J= 6,3 Hz, 3 H) ; hmotnostní spektrum (ESI), m/z 990 (MH⁺) , 988 (M-H)“.

M. Exochelin 772SM(R) (la). materiál izolovaný ve stupni

K nebo L (5,5 g, 5,6 mmol) se smísí s MeOH (350 ml) v baňce s oblým dnem a provede se odplynování s N₂. Přidá se 10% Pd/C (0,5 g) a balónek naplněný H₂ se napojí na baňku. Po míšení přes noc při teplotě okolí se 10% Pd/C nechá usadit a roztok se přefiltruje přes 0,45 pm stříkačkový filtr. Získaný pevný materiál se promyje MeOH (20 ml) a přefiltruje se podobným způsobem. Rozpouštědlo se odstraní za redukovaného tlaku a odpaří se současně s CH2CI2 za zisku špinavě bílého vločkovitého materiálu (3,8 g, 95%, čistota - 95%, obsah Fe 1,9 %): NMR analýza ukázala, že tento materiál je exochelin vzorce la. TLC (SiO₂, MeOH/CH₂Cl₂ (1:19, obj./obj.) R_f= 0,140,24); ^XH NMR (360 MHz, CDC1₃) δ 7,63 (d (s další menší interakcí), J = 8,0 Hz, 1 Η), 7,35 (t (s další menší

interakcí), J = 8,3	Hz, I Η),	6, 95 (d, J = 8,3	Hz,	I Η), 7,4
6, 9 (m, 2 Η) , 6, 85	(t (s další	menší interakcí)	, J	= 8,0 Hz,
IH), 5,28-5,15 (m,	1 Η) , 4,90	(t, J= 9,5 Hz, 1	Η) ,	4,65-4,49
(m (zahrnuje dublet	4,60, J =	9,5 Hz), 3 Η) , 4,	45	(br dd, J
10,2, 6,3 Hz, 1 Η),	3,80-3,62	(m, 2 Η), 3,59 (s	, 3	Η), 3,55-

3,35 (m, 2 Η), 2,50 (d, J = 5, 7 Hz, 2 Η), 2,48-2,10 (m (zahrnuje triplet, 2,23 (J= 7,3 Hz), 4 Η), 1,98-1,42 (m, 13 Η), 1,42-1,20 (m (zahrnuje dublet, 1,28 (J= 6,1 Hz), 8 H); hmotnostní spektrum (ESI), m/z 720 (MH⁺) , 718 (M-H)’.

Sloučenina lb. Sloučenina lb se připraví podobným způsobem jako sloučenina la s podobným výtěžkem sloučeniny ve formě špinavě bílého vločkovitého pevného materiálu: TLC (SiO₂, MeOH/EtOAc (1:32, obj./obj.) R_f= 0,0 - 0,13); ^ΣΗ NMR (360 MHz, CDCI3) δ 7,69 (d (s další menší interakcí), J- 8,0 Hz, 1 Η), 7,42 (t (s další menší interakcí), J = 8,3 Hz, 1 Η), 7,20-7,0 (br s, 2 Η) , 7,02 (d, J = 8,6 Hz, I Η) , 6,91 (s další menší interakcí), J= 8,0 Hz, 1 Η), 5,35-5,25 (m, 1 Η) , 4,95 (t, J =

9,5 Hz, 1 Η), 4,65 (br d,J= 9,5 Hz, 2 Η) , 4,58-4,48 (m, 2 Η), 3,82-3,50 (m (zahrnuje singlet 3,65), 7 Η), 2,60-2,20 (m (zahrnuje triplet, 2,31 (J = 7,4 Hz)), 6 Η), 2,08-1,20 (m, zahrnuje dublet, 1,35 (J= 6,6 Hz), 21 H); hmotnostní spektrum (ESI), m/z 720 (MH⁺) , 718 (M-H)’.

Funkční testy syntetických desferri-exochelinů

Exocheliny připravené způsobem uvedeným výše byly testovány za účelem zhodnocení toho, zda je jejich účinnost v medicíně stejná jako dříve prokázaná účinnost exochelinů z biologických zdroj ů.

I. Syntetický desferri-exochelin 772SM(R)

A. Kapacita prs tvorbu chelátů s železem. Pro stanovení toho, zda může syntetický desferri-exochelin 772SM(R) tvořit cheláty s železem, jak to provádí přirozená forma, byl exochelin rozpuštěn v 0,1% TFA obsahující citrát železíto-amonný v 10násobném molárním nadbytku železa vzhledem k exochelinů.

Roztok se vložil do Bondapak Phenyl 125A 10 μπι (3,9 x 300 mm) HPLC kolony a exochelin byl podroben HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) s reverzní fází na Rainin (Woburn, MA) HPXL systému. Exochelin se eluoval za použití 0-100% gradientu pufru skládajícího se z 0,1 % TFA a 50% acetonitrilu při průtoku 1 ml/min. Ferri-exocheliny byly monitorovány podle absorbance při 220 nm a 450 nm. Množství ferri-exochelinu bylo určeno podle měření plochy pod pikem při 450 nm a použitím konverzního faktoru získaného z testování známých množství ferri-exochelinu 772SM(R).

<

Za nepřítomnosti citrátu železito-amonného bylo pouze malé množství ferri-exochelinu eluováno z HPLC kolony, přibližně 1,08% dodaného exochelinů. Za přítomnosti citrátu železitoamonného eluovalo 100% exochelinů z kolony ve ferri-formě.

Syntetický desferri-exochelin 772SM(R) tedy rychle tvoří cheláty s trojmocným železem v roztoku.

B. Eluční profil při HPLC s reverzní fází

4·*· ·· ·«·» * » * · • · ·«· · * 4 4 4 · * · ·· 4 · 4

Syntetický exochelin 772SM(R) a přirozený exochelin 772SM(R) byly odděleně naředěny ve vodě obsahující 0,1% TFA a nadbytek citra:u železito-amonného a jednotlivě byly vneseny do fénylové kolony, jak byla popsána výše. Exocheliny byly eluovány za použití 0-100% gradientu pufru skládajícího se z 0,1 % TFA a 50% acetonitrilu při průtoku 1 ml/min na Rainin (Woburn, MA) H?LX systému. Exocheliny byly identifikovány podle absorbance při 450 nm.

Syntetický exochelin 772SM(R) a přirozený exochelin 772SM(R) jsou eluovány při přesně stejné koncentraci acetonitrilu při HPLC s reverzní fází. Dále, když jsou tyto dva exocheliny smíseny dohromady a jsou zpracovány HPLC s reverzní fází, tak eluují jako jediný ostrý pík a množství exochelinu v píku hodnocené měřením plochy pod pikem absorbance při 450 nm a použitím konverzního faktoru odvozeného z měření známých množství Exochelinu 77SM(R) - se rovná součtu jejich individuálních množství.

Syntetický desferri-exochelin 772SM(R) má tedy stejný eluční profil při HPLC s reverzní fází jako přirozený exochelin 772SM(R).

C. Kapacita pro odstraňování železa z různých typů exochelinů

Pro hodnocení afinity syntetického desferri-exochelinu 772SM(R) pro železo byla hodnocena kapacita pro odstraňování železa z jiných typů exochelinů, jako je ferri-exochelin 758SM. Také byla hodnocena a srovnávána kapacita syntetického a přirozeného desferri-exochelinu 772SM(R) pro odstraňování železa z ferri-exochelinu 758SM. Buď přirozený, nebo syntetický desferri-exochelin 772SM(R) byly nezávisle smíseny s ferr-exochelinem 758SM. Množství železa přítomné po 1 hodině

v desferri-exochelinech bylo testováno tak, že exochelin byl zpracován HPLC s reverzní fází na fenylové koloně, jak bylo popsáno výše, a změřila se plocha pod křivkou absorbance při 450 nm. Množsoví exochelinů obsahujícího železo se potom vypočítalo pomocí konverzního faktoru odvozeného z analýzy známých množství ferri-exochelinu 772SM(R).

V prvním pokusu se 26,1 pg syntetického exochelinů 772SM(R) nasyceného železem z 1,1% se smísilo s 17,8 pg 100% železem nasyceného přirozeného exochelinů 758SM. Za předpokladu, že tyto dva exocheliny mají srovnatelné afinity pro železo, je rovnovážný stav pro nasycení železem 41,2%. V 1 hodině byl syntetický exochelin 772SM(R) nasycen železem z 33,5%, t.j. dosáhl 81,3% oeoretického rovnovážného nasycení železem (tabulka 1, pokus la).

Pokus se opakoval s 15,1 pg přirozeného exochelinů 772SM(R) nasyceného železem z 2,8%, který se smísil s 16,9 pg 100% železem nasyceného přirozeného exochelinů 758SM. Za předpokladu, že tyto dva exocheliny mají srovnatelné afinity pro železo, je rovnovážný stav pro nasycení železem 54,1%. V 1 hodině byl přirozený exochelin 772SM(R) nasycen železem z 46,4%, t.j. dosáhl 85,8% teoretického rovnovážného nasycení železem (tabulka 1, pokus lb).

Ve druhém pokusu se 17,3 pg syntetického exochelinů 772SM(R) nasyceného železem z 1,1% smísilo s 19,8 pg 100% železem nasyceného přirozeného exochelinů 758SM. Za předpokladu, že tyto dva exocheliny mají srovnatelné afinity pro železo, je rovnovážný stav pro nasycení železem 53,9%. V 1 hodině byl syntetický exochelin 772SM(R) nasycen železem z 48,6%, t.j. dosáhl 90,2% oeoretického rovnovážného nasycení železem (tabulka 1, pokus 2a).

• · · · « · ··« · · ··· ····· ·· € · · ♦ • « · r · · ···« · « «, ► «>··· · ♦ ·

..... ·' ·· .....

Pokus se opakoval s 15,8 μρ přirozeného exochelinů 772SM(R) nasyceného železem z 2,8% a 19,1 μα 100% železem nasyceného přirozeného exochelinů 758SM. Za předpokladu, že tyto dva exocheliny mají srovnatelné afinity pro železo, je rovnovážný stav pro nasycení železem 55,9%. V 1 hodině byl přirozený exochelin 772SM(R) nasycen železem z 45,6%, tj. dosáhl 81,6% teoretického rovnovážného nasycení železem (tabulka 1, pokus 2b) .

Tyto pokusy dokazují, že (a) syntetický desferri-exochelin 772SM(R) má velmi vysokou afinitu pro železo, protože je schopen rychle odstraňovat železo z molekul vážících železo, které mají vysokou afinitu pro železo; a (b) syntetický a přirozený desferri-exochelin 772SM(R) mají srovnatelné kapacity pro odstraňování železa z molekul vážících železo s vysokou afinitou.

Tabulka 1: Kapacita syntetického a přirozeného desferriexochelinu 772SM(R) pro odstraňování železa z jiných typů exochelinů (ferri-exocheiinu 758SM)

Pokus 1

	Hmotnost (H9)	% nasycení železem	% vypočítaného
nasycení v rovnová stavu	železem žném
		0 hod.	1 hod.	0 hod.	1 hod.
(a) přirozený 758SM	17,8	100	49,4	—	—
Syntetický 772SM(R)	26,1	1,1	33,5	2,7%	81,3%
(b) přirozený 758SM	16, 9	100	63, 9	—	—
Syntetický 772SM(R)	15,1	2,8	46,4	6, 8%	85,8%

• · • · · ·

• · · • · · · » ·< * · «. « · ·· ♦ ··

Pokus 2

	Hmotnost (pg)	% nasycení železem	% vypočítaného
nasycení v rovnová stavu	železem žném
		0 hod.	1 hod.	0 hod.	1 hod.
(a) přirozený 758SM	19,8	100	61,6	—	—
Syntetický 772SM(R)	17,3	1,1	48,6	2,0%	90,2%
(b) přirozený 758SM	19, 1	100	66,	—	—
Syntetický 772SM(R)	15,8	2,8	45, 6	5,0%	81,6%

II. Syntetický desferri-exochelin 772SM(S)

Testy uvedené výše pro (R) formu se opakovaly pro (S) formu.

A. Kapacita pro tvorbu chelátů s železem. Kapacita syntetického exochelinu 772SM(S) vytvářet cheláty se železem z roztoku obsahujícího 10-násobný molární nadbytek trojmocného železa (citrát železito-amonný) byla testovány způsobem popsaným výše. Za nepřítomnosti citrátu železito-amonného obsahovalo pouze 1,03% exochelinu železo. Za přítomnosti citrátu železito-amonného byl exochelin plně nasycen železem.

Syntetický desferri-exochelin 772SM(S) tedy rychle tvoří cheláty s železem v roztoku.

B. Eluční profil při HPLC s reverzní fází • 999 9 9 · · · · 9 9 9 • « · 9 9 9 9999

99999 «9 9 9 9 · »9 9 9 9 * 9 * * 9

9 9 * 9 9 · 9 · ·· ··· ** ** ·* *··

Syntetický exochelin 772SM(S) eluoval v acetonitrilovém gradientu přibližně o 1 minutu později než přirozený exochelin 772SM(R).

V důsledku sterické změny na jednom asymetrickém uhlíku má tedy syntetický exochelin 772SM(S) mírně odlišný eluční profil ve srovnání přirozeným exochelinem 772SM(R).

C. Kapacita pro odstraňování železa z různých typů exochelinů

Pro hodnocení afinity syntetického desferri-exochelinu 772SM(S) pro železo byla hodnocena jeho kapacita pro odstraňování železa z jiných typů exochelinů, jako je ferriexochelin 758SM. Také byla hodnocena a srovnávána kapacita syntetického desferri-exochelinu 772SM(S) a přirozeného desferri-exochelinu 772SM(R) pro odstraňování železa z ferriexochelinu 758SM. Buď syntetický desferri-exochelin 772SM(S), nebo přirozený desferri-exochelin 772SM(R), byl smísen s ferr-exochelinem 758SM. Množství železa přítomné po 1 hodině v desferri-exochelinech bylo testováno tak, že exochelin byl zpracován HPLC s reverzní fází na fenylové koloně, jak bylo popsáno výše, a změřila se plocha pod křivkou absorbance při 450 nm. Množství exochelinů obsahujícího železo se potom vypočítalo pomocí konverzního faktoru odvozeného z analýzy známých množství ferri-exochelinu 772SM(R) a ferri-exochelinu 772SM(S).

Konkrétně, 17,4 pg syntetického exochelinů 772SM(S) nasyceného železem z 1,0% se smísilo s 13,5 pg 100% železem nasyceného přirozeného exochelinů 758SM. Za předpokladu, že tyto dva exocheliny mají srovnatelné afinity pro železo, je rovnovážný stav pro nasycení železem 41,2%. Po 1 hodině byl syntetický exochelin 772SM(S) nasycen železem z 39,7%, tj .

·· ···· · · ···· · · ·«* · · · · fe · • · · · · · · · * fe dosáhl 89,6% teoretického rovnovážného nasycení železem (tabulka 2, pokus 1).

V pokusu 2 se 13,0 gg přirozeného exochelinu 772SM(R) nasyceného železem z 2,8% smísilo se 13,3 gg 100% železem nasyceného přirozeného exochelinu 758SM. Za předpokladu, že tyto dva exocheliny mají srovnatelné afinity pro železo, je rovnovážný stav pro nasycení železem 52,1%. Po 1 hodině byl přirozený exochelin 772SM(R) nasycen železem z 46,2%, t.j. dosáhl 88,7% teoretického rovnovážného nasycení železem (tabulka 2, pokus 2).

Ve třetím pokusu se kapacita pro odebírání železa z jiných typů exochelinů syntetického desferri-exochelinu 772SM(S) srovnávala s kapacitou syntetického desferri-exochelinu 772SM(R).

15,6 gg syntetického exochelinu 772SM(R) nasyceného železem z 1,1% smísilo s 13,6 gg 100% železem nasyceného přirozeného exochelinu 758SM. Za předpokladu, že tyto dva exocheliny mají srovnatelné afinity pro železo, je rovnovážný stav pro nasycení železem 47,3%. Po 1 hodině byl syntetický exochelin 772SM(R) nasycen železem z 42,9%, tj. dosáhl 90,7% teoretického rovnovážného nasycení železem (tabulka 2, pokus 3) .

Tyto pokusy dokazují, že (a) syntetický desferri-exochelin 772SM(S) má velmi vysokou afinitu pro železo, protože je schopen rychle odstraňovat železo z molekul vážících železo, které mají vysokou afinitu pro železo; (b) syntetický desferri-exochelin 772SM(S) a přirozený desferri-exochelin 772SM(R) mají srovnatelné kapacity pro odstraňování železa z molekul vážících železo s vysokou afinitou; a (c) že ·· ···· «· ··«« * · < * · · * ···· · · <

syntetické stereoizomery desferri-exochelinu 772SM(S) a 772SM(R) mají srovnatelnou afinitu k železu.

Tabulka 2: Kapacita syntetického desferri-exochelinu 772SM(S), přirozeného desferri-exochelinu 772SM(R) a syntetického desferri-exochelinu 772SM(R) pro odstraňování železa z jiných typů exochelinů (ferri-exochelinu 758SM)

Pokus 1

	Hmotnost (Mg)	% nasycení železem	% vypočítaného
nasycení v rovnová stavu	železem žném
		0 hod.	1 hod.	0 hod.	1 hod.
(a) přirozený 758SM	13,5	100	54,1	—	—
(b) syntetický 772SM(S)	17,4	1,0	39,7	2,3%	89, 6%

Pokus 2

	Hmotnost (Mg)	% nasycení železem	% vypočítaného nasycení železem v rovnovážném stavu
		0 hod.	1 hod.	0 hod.	1 hod.
(a) přirozený 758SM	13,3	100	61,7	—	—
(b) syntetický 772SM(R)	13,0	2,8	46,2	5,4%	88,7%

• · · ·

Pokus 3

	Hmotnost (fig)	% nasycení železem	% vypočítaného
nasycení v rovnová stavu	železem žném
		0 hod.	1 hod.	0 hod.	1 hod.
(a) přirozený 758SM	13,6	100	55,9	—	—
(b) syntetický 772SM(R)	15,6	1,1	42, 9	2,3%	90,7%

III. Syntetický desferri-exochelin 772SM(R) vs. 772SM(S)

Pro další hodnocení relativních afinit stereoizomeru desferri-exochelinů 772SM(R) a 772SM(S) pro železo byla stejným způsobem srovnávána jejich schopnost odstraňovat železo z jiných typů exochelinů.

V pokusu se 15,6 pg syntetického exochelinu 772SM(R) nasyceného železem z 1,1% a 17,4 pg syntetického exochelinu 772SM(S) nasyceného železem z 1,0% smísilo s 13,5 pg 100% železem nasyceného přirozeného exochelinu 758SM. Za předpokladu, že tyto tři exocheliny mají srovnatelné afinity pro železo, je rovnovážný stav pro nasycení železem 29,9%. Po 1 hodině byl syntetický exochelin 772SM(R) nasycen železem z 28,2%, t.j. dosáhl 94,3% teoretického nasycení železem v rovnovážném stavu a syntetický exochelin 772SM(S) byl nasycen železem z 25,9%, t.j. dosáhl 86,6% teoretického nasycení železem v rovnovážném stavu (tabulka 3).

Tyto dva steroizomery mají tedy téměř stejnou afinitu pro železo.

« · « « · • · ·

Tabulka 3: Kapacita syntetického desferri-exochelinu 772SM(S) a syntetického desferri-exochelinu 772SM(R) pro odstraňování železa z jiných typů exochelinu (ferri-exochelinu 758SM) ve stejné zkumavce

	Hmotnost (Mg)	% nasycení železem	% vypočítaného
nasycení v rovnová stavu	železem žném
		0 hod.	1 hod.	0 hod.	1 hod.
přirozený 7 58SM	13,5	100	40,0	—	—
syntetický 7725M(R)	15,6	1,1	28,2	3,7%	94,3%
syntetický 7723M(S)	17,4	1,0	25,9	3,3%	86, 6%

IV. Schopnost přirozeného desferri-exochelinu 772SM(R), syntetického desferri-exochelinu 772SM(R) a syntetického desferri-exochelinu 772SM(S) odstraňovat železo z transferinu, holo-transferinu a apotransferinu nasycených ze 40% železem

A. Lidský transferin nasycený ze 40% železem. Pro hodnocení schopnosti 3 různých desferri-exochelinů odstraňovat železo z lidského transferinu nasyceného ze 40% železem byl každý z těchto exochelínů inkubován po dobu 1, 3 a 24 hodin s transferinem nasyceným ze 40% železem tak, že poměr Fe³⁺: desferri-exochelinu se rovnal 10:1. Inkubace se provedla v PBS, pH 7,4. Potom se exochelin a transferin separovaly odstředěním přes filtr s hraniční hodnotou 10000 daltonů. Transferin (hmotnost 76000 daltonů) byl tímto filtrem zcela zachycen, zatímco 85% exochelínů (hmotnost < 1000) zůstal ve filtrátu. Pro stanovení celkového množství získaného exochelinu byl exochelin ve filtrátu nasycen 20-násobným molárním nadbytkem citrátu železito-amonného a zpracován HPLC s reverzní fází, jak je popsána výše. Pro stanovení množství • · ···· · · *«·« · · •·· 9 9 9 9 9 9

99999 9 9 9 9 <

»· · « 9 · ·*·· • · · *·· 9-9 9 9 9 9 · exochelinů nasyceného železem ve filtrátu v každém čase byl filtrát zpracován HPLC s reverzní fází bez přidání železa. % nasycení železem bylo vypočítáno následujícím způsobem:

Exochelin nasycený železem za přidání FAC (μς) x 100

Exochelin nasycený železem bez přidání FAC (Hg)

Každý s desferri-exochelinů odstraňoval železo z transferinu nasyceného ze 40% železem způsobem závislým na čase (tabulka 4). Po 24 hodinách byl přirozený desferriexochelin 772SM(R) nasycen železem z 34,0%, syntetický desferri-exochelin 772SM(R) byl nasycen železem z 39,2% a syntetický desferri-exochelin 772SM(S) byl nasycen železem z 35,3%. Všechny tři exocheliny tedy účinně odstraňují železo z transferinu nasyceného ze 40% železem a jejich kapacita je přibližně stejná.

Tabulka 4: Schopnost syntetického a přirozeného desferriexochelinu 772SM(R) a syntetického desferriexochelinu 772SM(S) odstraňovat železo z lidského transferinu nasyceného ze 40% železem

	Hmotnost (Hg)	% nasycení železem
		0 hod.	1 hod.	3 hod.	24 hod.
Přirozený desferri- exochelin 7725M(R)	8	2,8	9,3	13,8	34
Syntetický desferri- exochelin 7725M(R)	12,8	1,1	6,8	12,8	39,2
Syntetický desferri- exochelin 7723M(S)	12,8	1,0	14,2	13,8	35,3

B. Holo-transferin (lidský transferin nasycený z 92% železem).

Pro hodnocení schopnosti 3 různých desferri-exochelinů odstraňovat železo z lidského holo-transferinu (lidského transferinu nasyceného z 92% železem) byl každý z těchto exochelinů inkubován po dobu 1, 3 a 24 hodin s transferinem nasyceným z 92% železem tak, že poměr Fe³⁺: desf erri-exochelinu se rovnal 10:1, stejně jako ve výše uvedeném pokusu s transferinem nasyceným ze 40% železem. % nasycení železem bylo vypočítáno způsobem uvedeným výše.

Každý s desferri-exochelinů odstraňoval železo z transferinu nasyceného z 92% železem způsobem závislým na čase (tabulka 5). Po 24 hodinách byl přirozený desferriexochelin 772SM(R) nasycen železem z 54,1%, syntetický desferri-exochelin 772SM(R) byl nasycen železem z 60,0% a syntetický desferri-exochelin 772SM(S) byl nasycen železem z 47,2%. Všechny tři exocheliny tedy účinně odstraňují železo z transferinu nasyceného z 92% železem a jejich kapacita je přibližně stejná.

Tabulka 5: Schopnost syntetického a přirozeného desferriexochelinů 772SM(R) a syntetického desferriexochelinů 772SM(S) odstraňovat železo z lidského transferinu nasyceného z 92% železem

	Hmotnost (μα)	% nasycení železem
		0 hod.	1 hod.	3 hod.	24 hod.
Přirozený desferri- exochelin 772SM(R)	10,1	2,8	11,6	19	54,1
Syntetický desferri- exochelin 772SM(R)	12,1	1,1	13,6	31,5	60
Syntetický desferri- exochelin 772SM(S)	13,7	1,0	18,1	15,5	47,2

C. Apotransferin (lidský transferin nasycený železem z < 0,7%). Pro kontrolu byly tři desferri-exocheliny inkubovány po dobu 3 hodin a 24 hodin s lidským apotransferinem (lidským transferinem nasycený železem z < 0,7%) v koncentraci 38 mg/ml, což je stejná kocentrace proteinu, jako byla použita v pokusu B s transferinem nasyceným železem z 92%. Žádný z desferriexochelinů nezískal hodnotitelné množství železa (Tabulka 6).

Tabulka 6: Schopnost syntetického a přirozeného desferriexochelinu 772SM(R) a syntetického desferriexochelinu 772SM(S) odstraňovat železo z lidského apotransferinu (nasyceného železem z < 0,7%)

	Hmotnost (pg)	% nasycení železem
		0 hod.	3 hod.	24 hod.
Přirozený desferri- exochelin 772SM(R)	10,1	2,8	9,3	6, 8
Syntetický desferri- exochelin 772SM(R)	12,1	1,1	5,2	6,9
Syntetický desferri- exochelin 772SM(S)	13,7	1,0	5,0	4,1

Podle výše uvedených výsledků bude odborníkům v oboru jasné, že když se kyselina pimelová 15 nahradí kyselinami ze skupiny obecného vzorce B, získají se různé exocheliny uvedené v tabulce 7. Tabulka 7 uvádí seznam representativních kyselin a z nich vzniklých exochelinů.

CO₂H- (CH₂) n-C0₂H • · · · ·· ···· « « « · • · · * · ·

Tabulka 7: Alternativní kyselé reaktanty a výsledné exocheliny

Serinová nasycená serie

B	n	Exochelin	(mol.	hmotnost
Kyselina azelainová	n = 7	800 SM(R)	nebo	SM(S)
Kyselina korková	n = 6	786 SM(R)	nebo	SM (S)
Kyselina pimelová	n = 5	772 SM(R)	nebo	SM (S)
Kyselina adipová	n = 4	758 SM(R)	nebo	SM (S)
Kyselina glutarová	n = 3	744 SM(R)	nebo	SM (S)
Kyselina jantarová	n = 2	730 SM(R)	nebo	SM (S)
Kyselina malonová	η = 1	716 SM(R)	nebo	SM (S)
Threoninová nasycená	série
B	n	Exochelin	(mol.	hmotnost
Kyselina azelainová	n = 7	814 TM(R)	nebo	TM (S)
Kyselina korková	n = 6	800 TM(R)	nebo	TM(S)
Kyselina pimelová	n = 5	786 TM(R)	nebo	TM(S)
Kyselina adipová	n = 4	772 TM(R)	nebo	TM(S)
Kyselina glutarová	n = 3	758 TM(R)	nebo	TM (S)
Kyselina jantarová	n = 2	744 TM(R)	nebo	TM(S)
Kyselina malonová	η = 1	730 TM(R)	nebo	TM(S)

Také pokud se kyselina pimelová 15 nahradí kyselinou vzorce D, vzniknou exocheliny uvedené v tabulce 8. Levý sloupec uvádí alternativní složení kyselin.

CO₂H- (CH₂) xCH= (CH₂) _y-CO₂H

Tabulka 8: Alternativní kyselé reaktanty a výsledné exocheliny

Serinová nenasycená série _D_ Kyselina Exochelin

X	y	X	Y
1	0	0	1	kys .	trans-glutakorová	742SM(R)	nebo	(S)
		1	1	kys .	trans-3-hexendiorová	756SM(R)	nebo	(S)
0	2	2	0	kys.	trans-2-hexendiorová	756SM(R)	nebo	(S)
1	2	2	1	kys .	trans-3-heptendiorová	770SM(R)	nebo	(S)
0	3	3	0	kys .	trans-2-hexendiorová	770SM(R)	nebo	(S)
0	4	4	0	kys .	trans-2-oktendiorová	784SM(R)	nebo	(S)
1	3	3	1	kys.	trans-3-oktendiorová	784SM(R)	nebo	(S)
		2	2	kys.	trans-4-oktendiorová	784SM(R)	nebo	(S)
0	5	5	0	kys.	trans-2-oktendiorová	798SM(R)	nebo	(S)
1	4	4	1	kys .	trans-3-nonendiorová	798SM(R)	nebo	(S)
2	3	3	2	kys.	trans-4-nonendiorová	798SM(R)	nebo	(S)
Threoninová	nenasycená serie
		D		Kyselina	Exochelin
X	y	X	Y
1	0	0	1	kys.	trans-glutakorová	752TM(R)	nebo	(S)
		1	1	kys.	trans-3-hexendiorová	770TM(R)	nebo	(S)
0	2	2	0	kys.	trans-2-hexendiorová	770TM(R)	nebo	(Ξ)
1	2	2	1	kys.	trans-3-heptendiorová	784TM(R)	nebo	(S)
0	3	3	0	kys.	trans-2-hexendiorová	784TM(R)	nebo	(S)
0	4	4	0	kys .	trans-2-oktendiorová	798TM(R)	nebo	(S)
1	3	3	1	kys.	trans-3-oktendiorová	798TM(R)	nebo	(S)
		2	2	kys.	trans-4-oktendiorová	798TM(R)	nebo	(S)
0	5	5	0	kys .	trans-2-oktendiorová	812TM(R)	nebo	(S)
1	4	4	1	kys.	trans-3-nonendiorová	812TM(R)	nebo	(S)
2	3	3	2	kys.	trans-4-nonendiorová	812TM(R)	nebo	(S)

Podle výše uvedeného popisu může odborník snadno vybrat alternativní nasycené nebo nenasycené kyseliny pro přípravu různých exochelinů.

Ačkoliv byl předkládaný vynález popsán na jistých přednostně prováděných variantách a použitích, jsou možné i jiné varianty a použití. Rozsah připojených patentových nároků není tedy omezen na uvedený popis výhodných variant.

Claims (3)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Způsob synrézy exochelinů, vyznačující se tím, že zahrnuje stupně:

   (a) reakci organické kyseliny s dimethylpimelatem, kyselinou chlorovodíkovou, methanolem a di-n-butyletherem za vzniku methylované kyseliny;

   (b) smísení methylované kyseliny s thionylchloridem a dimethylformamidem pro nahrazení OH skupiny chlorem;

   (c) přidání látky získané ve stupni (b) do suspenze O-benzylhydroxylamin hydrochloridu, a triethylaminu v CH2CI2, za vzniku O-benzylmethylhydroxamátu;

   (d) přidání roztoku di-terc-butyldikarbonátu v tetrahydrofuranu (THF) do roztoku (L)-6-hydroxynorleucinu a triethylaminu v tetrahydrofuranu-vodě;

   (e) separování vodné vrstvy a okyselení vodné vrstvy na pH 3 kyselinou citrónovou a extrakci této vrstvy EtOAc;

   (f) sušení a přečištění EtOAc vrstvy za vzniku (L)-N-Boc-6-hydroxynorleucinu;

   (g) reakci (L)-N-Boc-6-hydroxynorleucinu s allylbromidem za vzniku allylesteru (L)-N-Boc-6-hydroxynorleucinu;

   (h) přidání bromidu uhličitého v bezvodém CH2CI2 a trifenylfosfinu k allylesteru (L)-N-Boc-6-hydroxynorleucinu za vzniku viskozního oleje;

   (i) přidání viskozního oleje k EtOAc/hexanu za zisku allylesteru (1)-N-Boc-6-bromnorleucinu;

   (j) smísení allylesteru (L)-N-Boc-6-bromnorleucinu s 0benzylmethylhydroxamatem, jodidem draselným (KI) a uhličitanem draselným v bezvodém acetonu za vzniku allylesteru (L)-N⁶-methyl-N⁶-(benzyloxy)-N²-Boc-lysinu;

   (k) přidání kyseliny trifluoroctové k allylesteru (L)-N⁶-methyl-N⁶-(benzyloxy)-N²-Boc-lysinu za vzniku pevného meziproduktu a přidání pevného meziproduktu k (L)-N-(241 ·· · · * · «· · ···

   -(benzyloxy)benzoyl)šeřinu a 2-ethoxy-l-ethoxykarbonyl-l,2dihydrochinolinu za vzniku allylesteru (L)-N^{3 * * 6}-methyl-N⁶- (benzyloxy) -i²- ( (L) -N- (2- (benzyloxybenzoyl) serin) lysinu;

   (l) postupné přidávání thionylchloridu do roztoku allylesteru lysinu v bezvodém tetrahydrofuranu a přečištění vzniklé kapaliny za vzniku allylesteru (L) -N⁶-methyl-N⁶-(benzyloxy)-N² -((S)-N-(2-(2-benzyloxy)fenyl)-2-oxazolin-4-karbonyl)lysinu;

   (m) přidání morfolinu a tetrakis(trifenylfosfin)palladia k allylesteru oxazolin-lysinu v bezvodém CH₂C1₂ za vzniku kyseliny;

   (n) přidání (1) -N^a-((S)-3-hydroxybutyryl)-a-amino-N-(benzyloxy)kaprolaktamu v bezvodém tetrahydrofuranu ke kyselině a pooom přidání diethylazodikarboxylátu; a (o) smísení výsledné látky s MeOH 10% Pd/C a H₂, po kterém následuje současné odpaření MeOH s CH2CI2 za vzniku exochelinů
2. 2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že kyselinou je kyselina pimelová a konečnou látkou je exochelin 7723M(R).
3. 3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že organickou kyselinou je směs kyselin obecného vzorce

   CO2H-A-CO2H kde A znamená (CH₂)_n nebo (CH₂) _XCH=CH (CH₂) _y, n je 1 až 7 a x a jsou 0 až 5.