CZ20013532A3 - Nový typ genetického markeru na bázi transpozonu - Google Patents

Nový typ genetického markeru na bázi transpozonu Download PDF

Info

Publication number
CZ20013532A3
CZ20013532A3 CZ20013532A CZ20013532A CZ20013532A3 CZ 20013532 A3 CZ20013532 A3 CZ 20013532A3 CZ 20013532 A CZ20013532 A CZ 20013532A CZ 20013532 A CZ20013532 A CZ 20013532A CZ 20013532 A3 CZ20013532 A3 CZ 20013532A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
primer
seq
nucleic acid
sequence
μιτε
Prior art date
Application number
CZ20013532A
Other languages
English (en)
Inventor
Thomas Bureau
Ruying Chang
Louise Stéphanie O´Donoughue
Benoit Landry
Original Assignee
Mcgill University
Dna Landmarks Inc.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Mcgill University, Dna Landmarks Inc. filed Critical Mcgill University
Publication of CZ20013532A3 publication Critical patent/CZ20013532A3/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6809—Methods for determination or identification of nucleic acids involving differential detection
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6827—Hybridisation assays for detection of mutation or polymorphism

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Description

Předkládaný vynález se týká způsobu pro genotypizaci sekvence nukleové kyseliny za použití amplifikace s párem primerů obsahujícím první primer mající DNA sekvenci homologni s miniaturním invertovaným-repetitivnim trans- pozonem (ΜΙΤΕ) a druhý primer, který je stejný nebo jiný než první primer. Vynález se týká použití ΜΙΤΕ primerů při otiscích DNA nebo ve vazebných studiích.
Dosavadní stav techniky
Po objevu transpozonového systému Ac/Ds McClintockem (McClintock B., 1946, Maize genetics, Carnegie Inst. Wash. Yearbook 45: 176-186; a McClintock B., 1947, Cytogenetic studies of maize and neurospora, Carnegie Inst.Wash.Yearbook 46:146-152), se stala genetická identifikace nových transpozonových systémů (rodin) populární oblastí v genetických studiích na rostlinách (Peterson P. A. 1986, Mobile elements in maize, Plant Breeding Reviews 4:3-122), stejně jako na jiných organismech. Potom následovala molekulární charakterizace transpozonů a využití těchto elementů jako prostředků pro identifikaci a izolaci genů, zejména po klonování white lokusu s copia retrotranspozonem u Drosophila (Bingham P. M., R. Lewis a G.M.Rubín 1981, Cloning of DNA sequences from the white locus of D.melanogaster by a novel and generál method, Cel 125:693-704), a po molekulární charakterizaci kukuřičného transpozonu Ac (Pohlman R.F., N.V. Fedoroff a J.Messing 1984, The nucleotide sequence of the maize controlling element Activator, Cell 37:635-643) a En/Spm (Pereira A., Zs. Schwarz-Sommer, A. Gierl, I. Bertram, P.A.
Peterson a H.Saedler 1985, Genetic and molecular analysis of the Enhancer(En) transposable element systém of Zea mays. EMBO J. 4:17-25). Od té chvíle se studie transpozonů staly jednou z hlavních oblasti biologických věd.
Stejně jako v jiných oblastech biologického výzkumu byla identifikace transpozonů urychlena moderními počítačovými technologiemi. Bureau et al. (Bureau T. E., P. C. Ronald, and S. R. Wessler 1996, A computer-based systematic survey reveals the predominance of smáli inverted-repeat elements in wildtype rice genes, Proč. Nati. Acad. Sci. 93: 8524-8529) použil tento postup pro identifikaci mnoha členů nové rodiny transpozonů. Tyto elementy napodobují tradiční DNA-mediované transpozony (oproti retroelementům, které účinkují přes RNA meziprodukty, Boeke J.D., D.J. Garfinkel, C.A. Stylesand, G.R. Fink 1985, Ty elements transpose through an RNA intermediate, Cell 40:491-500) v tom, že obsahují koncové invertované repetice (TIR). Nicméně, oproti klasickým geneticky charakterizovaným transpozonům mají tyto elementy malou velikost a nemají žádnou kódovací kapacitu.. Tyto elementy jsou označovány jako . miniaturní invertované-repetitivní transpozony, neboli ΜΙΤΕ (Bureau et al., výše).
Od zavedení techniky polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP) (Bostein D., R. White, M. Skolnick and R.W. Davis 1980, Construction of a genetic linkage map in man using restriction fragment length polymorphism, Am. J. Hum. Genet. 32:314-331) jako molekulárního mapovacího nástroje, techniky genomového mapování a otisku DNA značně pokročily, jak dokazují nové techniky, jako je polymorfismus náhodně amplifikované DNA (RAPD, Welsh J. and M. McClelland 1990, Fingerprinting genomes using PCR with arbitrary primers, Nucleic Acids Res. 18: 7213-7218; Williams J. G. K., A. R.
Kubelik, K.J. Livak, J.A. Rafalski and S.V. Tingey 1990, DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers, Nucleic Acids Res. 18:6531-6535), a polymorfismus délky amplifikovaných fragmentů (AFLP, Vos P., R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. van de Lee, M. Hornes, A. Frijters, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiper and M.Zabeau 1995, AFLP: a new technique for DNA fingerprinting, Nucleic Acid Res. 23:4407-4414). Nověji používané techniky využívající retroelementů (Sinnet D., J.M. Deragon, L.R. Simard and D. Labuda 1990, Alumorphs-human DNA polymorphisms detected by polymerase chain reaction using Alu-specific primers, Genomics 7: 331-334; a Nelson D. L., S. A. Ledbetter, L. Corbo, M. F. Victoria, R. Ramirez-Solis, T. D. Webster, D. H. Ledbetter and C. T. Caskey 1989, Alu polymerase chain reaction: A method for rapid isolation of human-specific DNA sequences from complex DNA sources, Proč. Nati. Acad. Sci. 86: 6686-6690) a jednoduchých repetitivních sekvencí (SSRs) (Litt M. and J. A, Luty 1989, A hypervariable microsatellite revealed by in vitro amplification of a dinucleotide repeat within the cardiac muscle actin gene, Am. J. Hum. Genet. 44: 397401; Tautz D. 1989, Hypervariability of simple sequences as a generál source for polymorphic DNA markers.Nucleic Acids Res.17:6463-6471; a Weber J.L. and P.E. May 1989, Abundant class of human DNA polymorphisms which can be typed using the polymerase chain reaction, Am. J. Hum. Genet. 44: 388-396.) jsou dalším stupněm pro přípravu nových nástrojů pro mapování genomu a otisky DNA.
Izvak a spol. popisují repetitivní elementy, nazývané Angel, které mají schopnost tvořit vlásenkovou strukturu. Na základě jejich malého rozměru a možnosti tvořit sekundární strukturu je autoři definují jako ΜΙΤΕ. Angel však neodpovídá obecné ani zvláštní definici ΜΙΤΕ podle tohoto vynálezu, protože neexistuje náznak, že je lemován zdvojenými cílovými místy (target site duplication, TSD) jakéhokoli druhu. Protože TSD jsou charakteristickým znakem nejen ΜΙΤΕ, ale prakticky všech známých transponovatelných elementů, je zřejmé, že byl Angel neměl být označován pouze jako ΜΙΤΕ ani jako transpozon.
Sinnett a spol. popisují metodu používající značně odlišný transponovatelný element, nazývaný Alu. Transpozony je možno obecně rozdělit na dvě velké skupiny. Elementy třídy I zahrnují endogenní retroviry, LTR-retrotranspozony, LINE (long interspersed nuclear elements), SINE (short interspersed nuclear elements) a zpracované pseudogeny. Alu je SINE. Elementy třídy II zahrnují ΜΙΤΕ a jiné transpozony s převrácenými koncovými repeticemi. Alu nemá převrácenou koncovou repetici. Elementy třídy I procházejí přes meziprodukt RNA a působení reverzní transkriptázy, zatímco elementy třídy II přecházejí přímo ve formu DNA prostřednictvím elementem kódované transpozázy. ΜΙΤΕ se nacházejí v mnoha eukaryotech a prokaryotech. Alu se nachází pouze u primátů. Alu a ΜΙΤΕ jsou jasně repetitivní, distribuované v celém genomu hostitele a mohou být spojovány s geny. Alu-PCR zahrnuje navržení primerů (konkrétně dvou) na základě terminálních sekvencí. 5' a 3' terminální sekvence se liší a primery jako takové mají odlišné sekvence. PCR na bázi ΜΙΤΕ k ΜΙΤΕ zahrnuje primer navržený k převráceným koncovým repeticím. Je tedy nutný pouze jeden primer.
Technika polymorfismu délky restrikčních fragmentů (RFLP) spočívá v štěpení genomové DNA restrikčním enzymem, separaci DNA fragmentů elektroforesou, přenosem separovaných DNA fragmentů na pevný nosič z nylonové membrány pro získání otisku gelu na nosiči, který může být potom použit pro hybridizační resty se známými DNA sekvencemi. Známá DNA sekvence může být klonovaná genomová nebo cDNA sekvence nebo specifický PCR produkt. Tato DNA sekvence (sondovací sekvence) • · je značena radioaktivními, fluorescenčními nebo barvenými nukleotidy. Výsledek hybridizace se pozoruje po expozici pevného nosiče na rentgenovém filmu nebo může být tento výsledek pozorován přímo na nosiči, když jsou pro značkování sondy použity barvené nukleotidy. Podle charakteru sondovací sekvence se často pozoruje jeden nebo několik DNA proužků. Polymorfismy délky restrikčních fragmentů se vizualizují jako rozdíly v charakteru proužků pro různé genotypy a odráží rozdíly v distribuci daných míst pro restrikční enzymy.
Technika polymorfismu náhodně amplifikované DNA (RAPD) r
spočívá v krátkých DNA sekvencích délky 10 nukleotidů, které jsou použity jako primery pro řízení PCR reakce využívající celkové genomové DNA jako templátu. Nukleotidové složení oligonukleotidových primerů je vybráno libovolně bez jakéhokoliv ohledu na existující DNA sekvenci. Produkty PCR jsou vizualizovány přímo po elektroforese na agarosovém gelu.
» Jako produkt amplifikace eukaryotického genomu se obvykle pozoruje jeden až 15 amplifikovaných DNA fragmentů. Polymorfismy jsou detekované přímo na agarosovém gelu po barvení jako rozdíly v charakteru amplifikace mezi genotypy a odrážejí změny v jednom nukleotidu v primeru a inserce/delece.
Technika polymorfismu délky amplifikovaných fragmentů (AFLP) spočívá ve štěpení genomové DNA restrikčními enzymy, ligaci vzniklých fragmentů genomové DNA s adaptérovou sekvencí (krátkou dvouřetězcovou DNA sekvencí, která má na jednom konci stejnou sekvenci, jako je sekvence generovaná restrikčním enzymem použitým pro štěpení genomové DNA) a provedení PCR reakce za použití oligonukleotidu homologického k adaptérové sekvenci jako primeru. Výsledky amplifikace se vizualizují přímo na akrylamidovém gelu po barvení jako několik (až 60) * DNA fragmentů. Polymorfismy se pozorují jako rozdíly • c v přítomnosti/absenci specifických amplifikovaných DNA fragmentů v různých genotypech a odrážejí, jako RFLP, rozdíly v distribuci míst pro daný restrikční enzym, ale v podsadě genomové DNA.
Technika jednoduchých repetitivních sekvencí (SSR) spočívá v použití jednoduchých repetitivních sekvencí DNA (jako jsou (TA)n, (CAGA)n, (GA)n atd., kde n je 5 až 18) jako sond pro identifikaci genomových klonů z genové knihovny organismu obsahujícího tyto jednoduché motivy sekvence. Klony, které jsou izolovány, se potom sekvencují a páry DNA primerů okolo SSR jsou navrženy pro PCR amplifikaci SSR a sousedních DNA sekvencí. Polymorfismy se pozorují jako jeden nebo velmi málo amplifikovaných DNA fragmentů obsahujících rozdíly v jednom nebo několika nukleotidech v různých genotypech a odráží rozdíly v počtu repeticí (n) jednoduché sekvence.
DNA markéry na bázi retroelémentů a jiných velkých repetitivních:elementů spočívají v navržení primerů okolo elementu a polymorfismy se vyskytují tehdy, když je element v různých genotypech přítomen nebo nepřítomen.
Existují jiné typy DNA markérů, ale jedná se o kombinaci typů DNA markérů popsaných výše. Například CAP jsou štěpené amplifikované polymorfní DNA, kde produkt PCR se štěpí restrikčními enzymy po amplifikaci PCR. Páry primerů mohou být navrženy z repetitivních elementů a AFLP primerů nebo z jiných repetitivních elementů.
Je žádoucí získat nové značně rozšířené sekvence nukleové kyseliny pro použití ve vazebných testech a v otiscích DNA.
Je také vysoce žádoucí mít metodu pro detekci polymorfismů « · — - « · · · 7 ...........
u eukaryotických organismů, která by využívala této nové značně rozšířené sekvence nukleové kyseliny.
Podstata vynálezu
Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí nové značně rozšířené sekvence nukleové kyseliny pro použití ve vazebných testech a v otiscích DNA.
r Předmětem předkládaného vynálezu je poskytnutí metody pro detekci polymorfismů u eukaryotických organismů, která by využívala této nové značně rozšířené sekvence nukleové kyseliny.
Předkládaný vynález poskytuje způsob detekce polymorfismů dané sekvence nukleové kyseliny. Způsob zahrnuje tyto kroky:
(a) amplifikaci dané sekvence nukleové kyseliny s prvním • primerem homologickým s miniaturním invertovaným repetitivním transpozonem (ΜΙΤΕ), jeho fragmentem nebo derivátem, a s druhým primerem, kde uvedený první primer tepelně hybridizuje s uvedeným ΜΙΤΕ, pokud je přítomen v dané sekvenci nukleové kyseliny, a uvedený druhý primer je identický nebo není identický s prvním primerem, a je homologický nebo není homologický se sekvencí ΜΙΤΕ;
(b) separovaní fragmentů dané nukleové kyseliny amplifikovaných v kroku (a); a (c) analýzu fragmentů získaných v kroku (b) vzhledem k referenčním fragmentům získaným z amplifikace sekvence nukleové kyseliny s alespoň jedním primerem, za účelem stanovení rozdílů v sekvenci nukleové kyseliny mezi fragmenty získanými v kroku (b) a referenčními fragmenty, kde uvedené rozdíly ukazují na polymorfismus dané nukleové kyseliny.
• ·
Předkládaný vynález dále poskytuje způsob genotypizace eukaryotického organismu. Způsob zahrnuje tyto kroky:
(a) amplifikaci sekvence nukleové kyseliny uvedeného eukaryotického organismu s prvním primerem homologickým s ΜΙΤΕ, jeho fragmentem nebo derivátem, a s druhým primerem, kde uvedený první primer tepelně hybridizuje s uvedeným ΜΙΤΕ, pokud je přítomen v dané sekvenci nukleové kyseliny, a uvedený druhý primer je identický nebo není identický s prvním primerem, a je homologický nebo není homologický se sekvencí r ΜΙΤΕ;
(b) separovaní fragmentů získaných amplifikaci nukleové ·» kyseliny v kroku (a); a (c) srovnání fragmentů získaných v kroku (b) s fragmenty referenční sekvence nukleové kyseliny od uvedeného eukaryotického organismu, kde identita fragmentů z kroku (b) s fragmenty referenční sekvence nukleové kyseliny ukazuje na to, že uvedený eukaryotický organismus obsahuje uvedenou » sekvenci nukleové kyseliny.
Předkládaný vynález dále poskytuje způsob otisku DNA eukaryotického organismu. Způsob zahrnuje tyto kroky:
(a) amplifikaci sekvence nukleové kyseliny uvedeného eukaryotického organismu s prvním primerem homologickým s ΜΙΤΕ, jeho fragmentem nebo derivátem, a s druhým primerem, kde uvedený první primer se váže na uvedený ΜΙΤΕ, pokud je přítomen v dané sekvenci nukleové kyseliny, a uvedený druhý primer je identický nebo není identický s prvním primerem, a je homologický nebo není homologický s uvedenou ΜΙΤΕ sekvencí;
(b) separovaní fragmentů získaných amplifikaci nukleové kyseliny v kroku (a), kde takto separované fragmenty jsou representativní pro eukaryotický organismus.
Výhodně je amplifikace provedena pomocí PCR. První primer • · je odvozen od konvenčni sekvence z ΜΙΤΕ elementu. Výhodně má první primer sekvenci nukleové kyseliny odvozenou z konvenční sekvence z Tourist, Stowaway, Bartly nebo Mariner.
Přednostně má první primer sekvenci nukleové kyseliny
vybranou z e sk upiny z ahrnu j ící SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ
ID NO: 3, SEQ ID NO 4, SE Q IE NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:
7, SEQ ID NO: 8, SE Q ID NC : 9, SEQ ID NO: 10 , SEQ ID NO: 11,
SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15,
SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19,
SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23,
SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27,
SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31,
SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 a SEQ ID NO: 35.
Druhým primerem je popřípadě primer vybraný ze skupiny zahrnující MITE-specifický primer, primer na bázi SSR » sekvence, primer na bázi sekvence retroelementu, primer na bázi sekvence klonované nukleové kyseliny detekované v RFLP, primer na bázi náhodné genomové sekvence, primer na bázi vektorové sekvence a primer na bázi genové sekvence.
Předkládaný vynález také poskytuje použití polymorfismu, jako například ve způsobu podle předkládaného vynálezu, pro sledování potomstva eukaryotického organismu, pro stanovení hybridnosti eukaryotického organismu, pro identifikaci variací vázaných na fenotypový znak v eukaryotickém organismu, pro identifikaci jednotlivých potomků při křížení, kdy uvedení potomci mají požadovaný vklad od původního rodiče a/nebo rodiče, který je příjemcem, nebo použití polymorfismů jako genetických markérů pro konstrukci genetických map.
Způsob podle předkládaného vynálezu může být použit pro
izolováni genomové DNA sekvence sousedící s kódující nebo nekódující DNA sekvencí. Genomová DNA sekvence sousedící s DNA kódující gen je výhodně promotor nebo regulační sekvence.
Dále předkládaný vynález poskytuje fragment nukleové kyseliny nebo jeho derivát, který je získaný amplifikací sekvence nukleové kyseliny eukaryotického organismu s alespoň jedním primerem homologickým s ΜΙΤΕ, který může být použit jako sonda pro sekvence nukleové kyseliny.
Fragment nukleové kyseliny nebo jeho derivát může být použit pro selekci pomocí markéru (MAS), klonování podle mapy, certifikaci hybridů, otisky DNA, genotypizaci a markér specifický pro alelu.
Eukaryotickým organismem je výhodně rostlina, živočich nebo houba.
Dále předkládaný vynález poskytuje způsob mapování génomu, který zahrnuje tyto kroky:
(a) frakcionaci genomu eukaryotického organismu;
(b) klonování takto frakcionovaného genomu do vektoru;
(c) testování takto klonovaných vektorů amplifikací DNA ve vektorech za použití prvního primeru homologického s ΜΙΤΕ, jeho fragmentem nebo derivátem, a druhého primeru, kde uvedený první primer hybridizuje miniaturní invertovaný repetitivní transpozon (ΜΙΤΕ) v DNA, a uvedený druhý primer je identický nebo není identický s prvním primerem, a je homologický nebo není homologický s uvedenou ΜΙΤΕ sekvencí;
(d) separaci produktů amplifikace podle velikosti;
(e) měření charakteru produktů amplifikace;
(f) rekonstrukci genomu z překrývajících se fragmentů.
Dále předkládaný vynález poskytuje způsob mapováni polymorfniho genetického markéru, který zahrnuje kroky:
(a) poskytnutí směsi sekvencí nukleové kyseliny z biologického vzorku z eukaryotického organismu štěpených restrikčním enzymem;
(b) amplifikaci směsi sekvencí nukleové kyseliny štěpených restrikčním enzymem za použití prvního primeru homologického s miniaturním invertovaným repetitivním transpozonem (ΜΙΤΕ), jeho fragmentem nebo derivátem, a druhého primeru, kde uvedený první primer je specifický pro ΜΙΤΕ, a uvedený druhý primer je identický nebo není identický s prvním primerem, a je homologický nebo není homologický s uvedenou ΜΙΤΕ sekvencí;
(c) identifikaci sady různě amplifikovaných sekvencí nukleové kyseliny ve směsi; a (d) mapování alespoň jedné různě amplifikované sekvence nukleové kyseliny na jedinečný genetický polymorfismus, čímž se získá markér pro polymorfismus.
Markerový systém na bázi ΜΙΤΕ podle předkládaného vynálezu je odlišný od postupů používaných dosud, je mnohem jednodušší, mnohem informativnější a je reprodukovatelný.
Pro účely předkládaného vynálezu jsou dále definovány následující terminy:
Termín ΜΙΤΕ označuje miniaturní invertovaný repetitivní transpozon. ΜΙΤΕ jsou superrodinou transpozonů. Tyto elementy mají délku menší než 3 kb, obsahují dokonalé nebo degenerované terminální invertované repetice, jsou obklopeny cílovým místem duplikace menším než nebo rovným 10 párů baží, jsou v genomu středně až vysoce početné.
ΜΙΤΕ mají výhodně délku menší než 1 kb, obsahuji dokonalé • « nebo degenerované terminální invertované repetice, jsou obklopeny TA nebo TAA cílovým místem duplikace menším než nebo rovným 10 párů baží, jsou středně často až velmi často přítomné v genomu.
Termín primer na bázi ΜΙΤΕ” označuje primer obsahující ΜΙΤΕ nebo jeho fragment, a primer odvozený od ΜΙΤΕ a primer rozpoznávající ΜΙΤΕ, hybridizující na ΜΙΤΕ nebo tepelně hybridizující s ΜΙΤΕ.
Termín genetický markér na bázi ΜΙΤΕ (MGM) označuje markér hybridizující na ΜΙΤΕ element nebo markér produkovaný PCR amplifikací sekvence nukleové kyseliny za použití alespoň jednoho ΜΙΤΕ primeru a volitelně dalšího ΜΙΤΕ primeru nebo primeru na bázi SSR sekvence, sekvence retroelementu, RFLP sekvence nebo genové sekvence.
Termín inter-MITE polymorfismus (IMP) označuje podskupinu MGM a označuje markér produkovaný PCR amplifikací sekvence nukleové kyseliny za použití jednoho ΜΙΤΕ primeru nebo dvou odlišných ΜΙΤΕ primerů.
Termín eukaryotický organismus označuje rostliny, zvířata nebo houby.
Termín homolog označuje v kontextu homologické sekvence nukleové kyseliny takovou sekvenci nukleové kyseliny, která hybridizuje za přísných podmínek na komplement sekvence nukleové kyseliny, se kterou je homologická.
Popis obrázků na připojených výkresech
Obr. 1 ilustruje produkty PCR při použití kombinace primerů • · · . . ...
• · · · : . ... .:.. ·..* ...........
ΤΕΜ-4/-10 nebe ΤΕΜ-10 samostatně na agarosovém gelu.
Obr. 2 ilustruje výsledky PCR při použití IRD700(tra| fluorescenčním barvivém značeného TEM-1 primeru, po vizualizaci na 6% akrylamidovém gelu pomocí LI-COR automatizovaného systému 4200 podle výhodného provedení předkládaného vynálezu, kde PÍ je rodič H. vulgare, Lina (Pl), P2 je rodič H. spontaneum, Canada Park (P2), a segregující jedinci jsou z křížení mezi Lina a Canada Park DH (dvojitě haploidní) populacemi.
Obr. 3 ilustruje výsledky PCR s TEM-3/-10 na agarosovém gelu s delším časem posunu (1 minuta a 15 sekund).
Obr. 4A a 4B ilustrují výsledky PCR s TEM-1/-4 na agarosovém gelu ukazující různé produkty při posunu 60 sekund a 75 sekund.
Obr. 5 ilustruje vazebnou mapu H. vulgare cv. Lina x H. spontaneum Canada Park populace ukazující distribuci IMP lokusů detekovaných při použití TEM-1 a TEM-10 primerů.
Obr. 6 ilustruje otisk DNA 27 linií Hordeum na agarosovém gelu.
Obr. 7 ilustruje výsledky otisku pro 27 linií Hordeum při použití IRD7 00:tml fluorescenčním barvivém značeného TEM-1 primeru.
Obr. 8 ilustruje dendrogram získaný z UPGMA seskupení geneticky podobné matrice 27 kultivarů, podle TEM-1 a TEM-10 charakteru proužků.
Obr. 9A, 9B, 9C a 9D ilustruji univerzální použití markérů na bázi ΜΙΤΕ v různých eukaryotických organismech a ukazují profily PCR amplifikace jedenácti různých zdrojů DNA při použití Master primeru TEM-12 (obr. 9A) ; Master primeru TEM-1 (obr. 9B); Master primeru TEM-10 (obr. 9C); a Master primeru TEM-11 (obr. 9D).
Obr. 10A, 10B, 10C, 10D a 10E ilustrují přiklad výsledků získaných při použiti Master primeru (TEM-1) a jeho příslušného ukotveného primerů.
Podrobný popis vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje nový genetický markér označovaný jako genetický markér na bázi ΜΙΤΕ (MGM). V tomto novém způsobu využívajícím PCR jsou polymorfismy detekovány pomocí primerů připravených podle četných transpozonů (ΜΙΤΕ. Použitelnost těchto primerů na bázi transpozonů byla určena testování charakteru segregace při mapování populace dvojitě haploidního ječmene a genotypizací 26 kultivarů Hordeum vulgare a jedné linie Hordeum spontaneum. Předkládaný vynález poskytuje nový typ DNA markérů, které jsou zde označovány jako genetické markéry na bázi ΜΙΤΕ, stejně jako chromozomální umístění těchto markérů, a je popsána jejich univerzálnost a všestrannost a výsledky otisků DNA. Nakonec je popisována vhodnost a obecná použitelnost MGM a IMP technik podle předkládaného vynálezu.
Výhody a zlepšení vzhledem k současným technikám
Jak bylo uvedeno výše, jsou ΜΙΤΕ elementy často asociovány s geny a tak nejsou omezeny na repetitivní regiony. Tato ·· · · . 1 ·· · ··· ··· . · ··· ···· Σ .··· · ♦·!·;···* ···· ·· · · · · všudypřítomnost ΜΙΤΕ má enormní význam. Ukazuje, že v podstatě jakýkoliv region genomu většiny eukaryotických organismů může být zpracován IMP amplifikací.
Celkem 50-100 hodnotitelných proužků bylo amplifikováno z každého primeru, což ukazuje, že ΜΙΤΕ jsou přítomné v genomu ve velkém počcu kopií. S několika primery a 50-100 lokusv na primer může být celý genom snadno pokryt při skríningu.
ΜΙΤΕ primer může být kombinován s jiným typem primerů, jako jsou primery specifické pro SSR, retroelementy, sekvencované RFLP, náhodné genomové sekvence, vektorové sekvence a geny. Toto dále zvyšuje kapacitu MGM metody podle předkládaného vynálezu.
Způsob podle předkládaného vynálezu, kombinovaný s LI-COR automatizovaným fluorescenčním genotypizačním systémem s vysokým rozlišením, je mimořádně účinným nástrojem pro mapování DNA a techniky otisků DNA. Jeho lepší účinnost a rozlišení ve srovnání s RAAPD a RFLP jsou zřejmé, protože v jedné reakci může být detekováno mnohem více lokusů. MGM a IMP analýzy jsou snadné, rychlé a levné. Oproti RAPD analýze je potřeba významně nižší počet primerů. Oproti AFLP a RFLP technikám nevyžadují MGM a IMP štěpení restrikčními enzymy nebo ligaci na adapter.
Příklady provedení vynálezu
i) Rostlinné materiály • · • · • ·
Populace použitá pro mapováni se skládala z 88 dvojitě haploidnich jedinců z křížení mezi Hordeum vulgare kultivarem Lina a H. spontaneum kultivarem Canada Park. Tato populace se použila pro konstrukci vazebné mapy pomocí RFLP markérů.
Celkem 27 kultivarů (viz tabulka 1) se použilo v experimentech s otisky DNA, včetně 26 jedinců Hordeum vulgare a 1 jedince H. spontaneum, Canada Park, kteří se použily společně s Lina jako rodiči pro přípravu populace pro mapováni. Tento soubor zahrnoval dvouřadé a šestiřadé typy. Dvouřadé typy zahrnovaly jak jarní kultivary, tak ozimy. Všech 27 kultivarů bylo dříve použito v genotypizaci pomocí RFLP a proto byly genetické vztahy určené podle RFLP mezi těmito kultivary známé.
Tabulka 1: Kultivary použité v pokusech s otisky DNA
Identifikační.Použitý kultivar číslo
1 Lina #0568
2 Canada Park
3 Alexis
4 Angóra
5 Ariel
6 Azhul
7 Ellice
8 Express
9 Fillipa
10 Goldie
11 Golf
12 High amylose glacier
13 Igri
14 Ingrid
15 Kinnan
16 Maud
17 Meltan
18 Mentor
19 Mette
20 Mona
21 Roland
22 Saxo
Sváni Tellus Tofta Třeboň
Vixen ii) PCR detekční systémy
Pro srovnáváni rozlišeni a účinnosti identifikací polymorfismů se použily dva detekční systémy. Prvním byl obvyklý agarosový detekční systém. V tomto systému byla PCR provedena s obvyklými primery (neznačenými). Produkty PCR se potom vizualizovaly na 2% agarosových gelech, s nebo bez Nusieve agarosy (2/3 Nusieve:l/3 obvyklá agarosa). Druhým systémem byl LI-COR automatizovaný DNA sekvenační/ genotypizační systém. Primery pro tento systém byly značeny IRD700<tra) fluorescentním barvivém (LI-COR, lne., Lincoln, Nebraska). Produkty PCR se vizualizovaly na 6% akrylamidovém denaturačním gelu na skleněných destičkách délky 41 cm. Gelová elektroforesa se prováděla na LI-COR 4200 systému.
iii) PCR
V tomto pokusu se navrhlo a hodnotilo 7 master primerů (tabulka 2) a jejich 3'-ukotvených derivátů. 6 master primerů byly ΜΙΤΕ primery (TEM-1, TEM-2, TEM-3, TEM-10, TEM-11 a TEM12) a TEM-4 byl segment konzervované sekvence domény reverzní transkriptasy (RT) několika Tyl/copia-like retrotranspozonů (Hirochika H. and Hirochika R., 1993, Tyl-copia group retrotranspozons as ubiquitous components of plant genomes, Jpn. J. Genet. 68: 35-46). Master primery byly připraveny jako primery, které mohou v některých pozicích obsahovat více než jeden nukleotid. Ukotvené primery byly master primery s dalšími nukleotidy přidanými na 3'-konec master primerů (tabulka 3). ΜΙΤΕ primery byly navrženy podle konvenčních sekvencí v terminálních invertovaných repetitivnich (TIR) regionech ΜΙΤΕ z každé kategorie. Oba TIR byly použity pro vývoj primerů. TEM-4 byl použit pouze v kombinaci s dalšími primery. Primery byly použity jak v agarosovém gelovém
detekčním systému, tak v LI-COR automatizovaném detekčním systému, s tím rozdílem, že primery pro druhý uvedený detekční systém byly značeny fluorescenčním barvivém.
Tabulka 2: Zdroje master primerů a jejich sekvence
Primer Transpozon
Hostitel Počet TIR
Sekvence v ΜΙΤΕ
-v TEM-1 Stowaway Hordeum vulgare 44 (AG)TATTl (TA)GGAACGGAGGGAG (SEQIDNO:1)
TEM-3 Tourist Triticum. aestivum 2 TT(TG)CCCAAAAGAACTGGCCC (SEQ ID NO:2)
TEM-10 Bartly H. vulgare 7 TCCCCA(CT)T(AG)TGACCA(CGT)CC (SEQ ID NO:3)
TEM-4 Ty1/copia§ Conserved RT NA GT(TC)TT(ACGT)AC(GA)TCCAT(TC)TG (SEQ ID NO:4)
TEM-11 Bartly H. vulgare 8 TC(CT)CCATTG(CT)G(AG)CCAGCCTA (SEQ ID NO: 5)
TEM-2 Tourist H. vulgare 4 CCTT(CT)TAA(AC)(ACGT)GAACAA(CG )CCC (SEQ ID NO: 6)
TEM-12 HsMar1(Ma riner)/MAD E1 Homo sapiens 58 AATT(CA)(CT)TTTTGCACCAACCT (SEQ ID NO: 7)
s
Hirochika and Hirochika 1993.
Tabulka 3: Master primery a příslušné ukotvené primery
TEM-1 (AG)TATTT(TA)GGAACGGAGGGAG SEQ ID N0:1
TEM-1A (AG)TATTT(TA)GGAACGGAGGGAGA SEQ ID NO:8
TEM-1 C (AG)TATTT(TA)GGAACGGAGGGAGC SEQ ID N0:9
TEM-1 G (AG)TATTT(TA)GGAACGGAGGGAGG SEQ ID NO: 10
TEM-1T (AG)TATTT(TA)GGAACGGAGGGAGT SEQ ID NO:11
TEM-2 CCTT(CT)TAA(AC)(ACGT)GAACAA(CG)CCC SEQ ID NO:6
TEM-2A CCTT(CT)TAA(AC)(ACGT)GAACAA(CG)CCCA SEQ ID NO:12
TEM-2C CCTT(CT)TAA(AC)(ACGT)GAACAA(CG)CCCC SEQ ID NO:13
TEM-2G CCTT(CT)TAA(AC)(ACGT)GAACAA(CG)CCCG SEQ ID NO:14
TEM-2T CCTT(CT)TAA(AC)(ACGT)GAACAA(CG)CCCT SEQ ID NO:15
TEM-3 TT(TG)CCCAAAAGAACTGGCCC SEQ ID NO:2
TEM-3A TT(TG)CCCAAAAGAACTGGCCCA SEQ ID NO:16
TEM-3C TT(TG)CCCAAAAGAACTGGCCCC SEQ IDNO:17
TEM-3G TT(TG)CCCAAAAGAACTGGCCCG SEQ ID NO:18
TEM-3T TT(TG )CCCAAAAGAACTGG CCCT SEQ ID NO:19
TEM-4 GT(TC)TT(ACGT)AC(GA)TCCAT(TC)TG SEQ ID NO:4
TEM-4A GT(TC)TT(ACGT)AC(GA)TCCAT(TC)TGA SEQ ID NO:20
TEM-4C GT(TC)TT(ACGT)AC(GA)TCCAT(TC)TGC SEQ ID NO:21
TEM-4G GT(TC)TT(ACGT)AC(GA)TCCAT(TC)TGG SEQ ID NO:22
TEM-4T GT(TC)TT(ACGT)AC(GA)TCCAT(TC)TGT SEQ ID NO:23
TEM-10 TCCCCA(CT)T(AG)TGACCA(CGT)CC SEQ ID NO:3
TEM-10A TCCCCA(CT)T(AG)TGACCA(CGT)CCA SEQ ID NO:24
TEM-10C TCCCCA(CT)T(AG)TGACCA(CGT)CCC SEQ ID NO:25
TEM-10G TCCCCA(CT)T(AG)TGACCA(CGT)CCG SEQ ID NO:26
TEM-10T TCCCCA(CT)T(AG)TGACCA(CGT)CCT SEQ ID NO:27
TEM-11 TC(CT)CCATTG(CT)G(AG)CCAGCCTA SEQ ID NO:5
TEM-11A TC(CT)CCATTG(CT)G(AG)CCAGCCTAA SEQ ID NO:28
TEM-11C TC(CT)CCATTG(CT)G(AG)CCAGCCTAC SEQ ID NO.29
TEM-11G TC(CT)CCATTG(CT)G(AG)CCAGCCTAG SEQ ID NO:30
TEM-11T TC(CT)CCATTG(CT)G(AG)CCAGCCTAT SEQ ID NO:31
TEM-12 AATT(CA)(CT)TTTTGCACCAACCT SEQ ID NO:7
TEM-12A AATT(CA)(CT)TTTTGCACCAACCTA SEQ ID NO:32
TEM-12C AATT(CA)(CT)TTTTGCACCAACCTC SEQ ID NO:33
TEM-12G AATT(CA)(CT)TTTTGCACCAACCTG SEQ ID NO:34
TEM-12T AATT(CA)(CT)TTTTGCACCAACCTT SEQ ID NO:35
PCR amplifikace pro agarosový detekční systém byly provedeny ve 25 μΐ objemu obsahujícím 2,5 mM MgC12, 0/4 dNTP, 1 μΜ každého primeru a 0,625 jednotek AmpliTaq1 mM
DNA • ·
polymerasy (Perkin-Elmer). Použil se následující profil: počáteční denaturace 1 minuta 30 sekund při 94 °C; potom 35 cyklů 30 sekund při 94 °C, 45 sekund při 58 °C a 1 minuta při 72 °C; a konečné prodloužení 5 minut při 72 °C. Tento profil se používal vždy, pokud není uvedeno jinak. Teplota reakce 60 °C se použila tehdy, když se používal TEM-1.
PCR amplifikace pro LI-COR detekční systém se provedly za stejných podmínek jako pro běžný agarosový systém, s tím rozdílem, že celkový reakční objem byl 20 μΐ a použilo se 0,5 jednotky AmpliTaq DNA polymerasy (Perkin-Elmer). Použil se stejný profil reakce (bez změny teploty pro TEM-1). PCR amplifikace se provedly ve dvou stupních. Prvním stupněm byla preamplifikace s neznačenými primery během 35 cyklů. 3 μΐ podíl preamplifikační směsi se použil ve druhé stupni amplifikace. V druhém stupni amplifikace se použil značený primer v koncentraci 0,1 μΜ (oproti 1 μΜ neznačeného primeru v prvním stupni).
iv) Odběr dat a statistická analýza
a) Otisky DNA s analýzy genetické podobnosti
Polymorfní, stejně jako společné proužky se skórovaly pro každého jedince jako přítomnost (1), nepřítomnost (0) nebo chybějící data (9). Získané hrubé datové matrice se použily pro určení matric relativní genetické podobnosti (GS) za použití způsobu podle Nei, M. a Li, W., 1979, Mathematical models for studying genetic variations in terms of restriction endonucleases, Proč. Nati. Acad. Sci. 76: 5269-5273), 2nxy/(nx+ny) , kde nx a ny jsou počty proužků v dráhách x a y, v příslušném pořadí, a nxy je počet společných proužků v obou dráhách. Pro výpočet GS hodnot se použily jak polymorfní, tak
7 společné proužky.
Dendrogramy se určily z GS matric za použití metody aritmetického průměru nevážených párů (UPGMA). Připravil se kombinovaný dendrogram z analýz se dvěma ΜΙΤΕ primery (TEM-1 a TEM-10).Normalizovaná Mantelova statistika (Mantel N.A., 1967, The detection of disease clustering and generalized regression approach, Cancer Res. 27: 209-220) se použila pro srovnání matric genetické podobnosti získaných pomocí genetických markérů na bázi ΜΙΤΕ s matricemi genetické podobnosti získanými pomocí 313 polymorfních RFLP markerových proužků. Test statistické významnosti se provedl srovnáním pozorované Z-hodnoty s distribucí 1000 náhodných permutací v matricích. Všechny statistické analýzy se provedly pomocí NTSYS-pc softwaru (Rohlf F.J., 1994, NTSYS-pc numerical taxonomy and multivariante analysis systém, verze 1.80, Exeter Software, N.Y.) .
b) Genetické mapování
Lokalizace genetických markérů na bázi ΜΙΤΕ generovaných při použití TEM-1 a TEM-10 primerů se provedla mapováním těchto primerů s pracovním rámcem 71 RFLP markérů, které byly použity dříve pro konstrukci mapy populace Hordeum vulgare kultivar Lina x H. spontaneum Canada Park. Pro mapování se použila podskupina dvojitě haploidních jedinců z této populace. Segregační poměry se analyzovaly pomocí χζ analýzy. Mapování se provedlo za použiti počítačového programu MAPMAKER (Lander E.S., P. Green, J. Abrahamson, A. Barlow, M.J. Daly, S.E. Lincoln and L. Newburg, 1987, MAPMAKER: An interactive computer package for constructing primary genetic linkage maps of experimental and natural populations, Genomics 1: 174-181). Genetické markéry na bázi ΜΙΤΕ se přiřadily k vazebným
skupinám za použiti dvoubodové analýzy při LOD prahu = 4 s výjimkou skupiny 7H, která tvořila při tomto prahu dvě skupiny, které byly vázané podle publikované lokalizace RFLP markérů. Vícebodová analýza s LOD prahem = 2 byla provedena pro umístění markérů ve vazebných skupinách.
Výsledky
Pro hodnocení ΜΙΤΕ sekvencí v PCR metodě podle předkládaného vynálezu byly primery navrženy podle terminálních invertovaných repetitivních (TIR) regionů a všechny primery směřovaly ven z TIR. Při tomto způsobu se předpokládá, že jakákoliv sekvence amplifikovaná těmito primery leží mezi dvěma sousedními ΜΙΤΕ v amplifikovatelné vzdálenosti. Tyto primery se použily samostatně nebo v kombinaci v segregační analýze za použití dvojitě haploidní populace 88 jedinců z křížení mezi Hordeum vulgare kultivarem Lina a H. spontaneum kultivarem Canada Park.
a) Amplifikace pomocí jednoho primeru
Na agarosových gelech generoval každý z ΜΙΤΕ primerů přibližně 10 hodnotitelných proužků, ze kterých byly 2-5 polymorfni. Tyto polymorfismy byly jasně detekovány mezi původními H. vulgare Lina a H.spontaneum Canada Park a nej častěji vykazovaly očekávanou Mendelovskou segregaci 1:1 u dvojitě haploidních jedinců. Obr. 1 ukazuje příklad charakteru segregace.
M je XPstl markér. Dráha 1 obsahuje PCR produkt H. vulgare Lina. Dráha 2 obsahuje PCR produkt H. spontaneum Canada Park. Dráhy 3-28 obsahují PCR produkty jednotlivců v populaci použité pro mapování.
Primer TEM-1 vykazoval vysoké pozadí s velmi slabými až téměř neviditelnými proužky, pravděpodobně z důvodu mnoha blízce příbuzných sekvencí, například těch, které vznikly z variací v TIR regionech. V takovém případě se do reakční směsi přidal 2% formamid, protože bylo popsáno, že formamid redukuje PCR pozadí a zvyšuje specificitu (Nagaoka T. and Y. Ogihara, 1997, Applicability of inter-simple sequence repeat polymorphisms in wheat and their use as DNA markers in comparison to RFLP and RAPD markers, Theor. Appl. Genet. 94: 597-602) .
Celkem přibližně 100 hodnotitelných proužků bylo detekováno na LI-COR sekvenačním gelu při použití primerů TEM-1, přibližně 60-70 při použití primerů TEM-10 a přibližně 30-40 mohlo být detekováno při použití primerů TEM-3. Výsledek elektroforesy na akrylamidovém gelu při použití TEM-1 je uveden na obr. 2. Stejně jako v agarosovém detekčním systému byly polymorfismy jasně detekovány mezi původními H. vulgare Lina a H.spontaneum Canada Park a nej častěji vykazovaly Mendelovskou segregaci 1:1 u dvojitě haploidních jedinců.
Dráha 1 obsahuje PCR produkty z H. vulgare Lina. Dráha 2 obsahuje PCR produkty z H. spontaneum Canada Park. Dráhy 3-45 obsahují PCR produkty z jednotlivců v populaci vzniklé křížením Lina x Canada Park.
b) Kombinace primerů
Testy s kombinací primerů byly provedeny pouze v agarosovém detekčním systému. Při použití různých kombinací těchto primerů bylo pozorováno několik situací. Zatímco kombinace TEM-4/TEM-10 vedle ke stejnému charakteru jako TEM-10 samotný, • ·
24- ·* · · · · · ···· ·· ··· ··· vedla kombinace TEM-l/TEM-10 k odlišnému výsledku, ve kterém byla většina proužků z TEM-10 samotného inhibována, proužky z TEM-1 samotného byly také méně viditelné a objevily se proužky menší velikosti. Kombinace TEM-3/TEM-10 s delším časem posunu (1 minuta 15. sekund) vedla k odlišnému charakteru proužků se třemi jasně detekovatelnými segregujícími proužky odlišnými od proužků získaných pro každý z těchto primeru samotný (obr. 3). Dráhy 1-16 jsou jedinci v populaci použité pro mapování. Nejsou uvedeni žádní rodiče.
Podobné situace byly pozorovány pro primer TEM-1. Zatímco charakter vazby se nezměnil, když byl TEM-1 kombinován s TEM-4 (obr. 4A), změnil se tento charakter tehdy, když byl tento primer kombinován s TEM-3 nebo s TEM-10. Dále, při delším čase posunu (1 minuta 15 sekund) vedla kombinace TEM-l/TEM-4 k většímu segregačnímu proužku s potlačením některých dalších proužků (obr. 4B). Je zajímavé, že větší proužek (označovaný jako T1-4AA podle kombinace primerů) segregoval téměř stejně jako proužek T4-10A (obr. 1). T1-4AA a T4-10A nebyly stejnými produkty společného primeru TEM-4, protože TEM-10 sám také amplifikoval proužek T4-10A. Také byl T1-4AA téměř o 300 bp větší než T4-10A. Toto naznačuje, že dvě kombinace primerů amplifikují těsně vázané regiony DNA. Toto není překvapivé, protože se předpokládá, že transpozony jsou přítomné ve velkém počtu kopií.
Legendy k obr. 4A a 4B jsou stejné jako pro obr. 1. Čísla drah si odpovídají v obr. 4A a 4B.
Některé kombinace primerů vedly k nekonsistentním výsledkům. Možná vysvětlení jsou:
- každý primer samostatně amplifikuje více než 10 proužků a proto vedou kombinace primerů ke vzniku příliš mnoha e · proužků, které nemohou být jasně vizualizovány, nebo vedou ke vzniku takových proužků, které fluktuuji se změnami mikropodmínek;
- různé teploty tepelného zpracování (jak je tomu u TEM-4, který má mnohem nižší teplotu tepelného zpracování) mohou být významným faktorem určujících charakter proužků; a různé afinity primerů mohou vést k převládnutí některých proužků, jak je tomu v případě TEM-1 a TEM-10.
Nicméně, je pravděpodobné, že stejně jako v reakcích s jedním primerem, budou některé z těchto problémů při použití fluorescenčně značeného detekčního systému vyřešeny a že kombinace primerů významně zvýší počet detekovatelných lokusů.
c) Chromosomální lokalizace genetických markérů na bázi ΜΙΤΕ
Při použití agarosového detekčního systému generují tři ΜΙΤΕ primery a Tyl/copia retrotanspozomový primer celkem 15 detekovatelných polymorfních markérů na mapované populaci. Všechny kromě dvou segregují v očekávaném segregačním poměru 1:1. 13 z těchto markérů může být umístěno na mapu. Další dva markéry zůstávají nenavázané. Těmito markéry jsou markéry vykazující významnou odchylku od očekávaného poměru segregace a je pravděpodobné, že se skládají ze dvou proužků podobné velikosti, které nebyly separovány na agarose.
Na obr. 5 jsou genetické markéry na bázi ΜΙΤΕ znázorněny větším a tučným písmem. Jsou vidět pouze lokusy detekované na akrylamidovém gelu s fluorescenčně značeným TEM-1 a TEM-10. Lokusy v závorkách jsou ty lokusy, které nemohly být umístěny s LOD skórem větším nebo rovným 2. Při použití primerů TEM-1 a TEM-10 v LI-COR sekvenačním gelu bylo detekováno přibližně 120 a 90 proužků, v příslušném pořadí. Velikost detekovaných
· · · 2^- ··♦··· proužků byla přibližně 100 bp až 1 kb. Část výsledků amplifikace s TEM-1, jak byly vizualizovány pomocí elektroforesy na polyakrylamidovém gelu, je uvedena na obr. 2.
a 19 polymorfních proužků se získalo při použití primerů TEM-1 a TEM-10, v příslušném pořadí. Některé páry se chovaly kodominantně (lokusy Tl-0,2 na 1H a Tl-16 na 2H, T10-6 na 3H, Tl-8 na skupinu 4H a Tl-36 na 7H, obr. 5), ale zbývající proužky byly přítomné/nepřítomné s přesně 41 od Lina rodičů a 4 od H. spontaneum rodičů, ze 70 mapovaných TEM-1 lokusů se 24 významně odchylovalo od očekávaného segregačního poměru 1:1. Všechny 24 lokusy kromě jednoho (Tl-19 na 7H) se mapovaly do oblastí, ve kterých vykazovaly RFLP markéry také narušené segregační poměry v této mapované populaci. 2 z 18 TEM-10 lokusů se významně odchylovaly od očekávaného segregačního poměru a tyto byly opět lokalizovány v oblastech, ve kterých se RFLP lokusy také odchylovaly od očekávaného poměru 1:1.
Celkem bylo mapováno 81 lokusů. Tyto lokusy pokrývaly všech 7 vazebných skupin (obr. 5) ., Dále, distribuce těchto lokusů nevykazovala žádné významné sdružování jiné než sdružování předpokládané v centromerických regionech, ve kterých je rekombinace obvykle omezena (například skupiny 1H, 3H a 7H, obr. 5). Ve skutečnosti byla distribuce podobná distribuci zjištěné pomoc RFLP detekce cDNA (L.S. 0'Donoughue, nepublikováno). Toto naznačuje, že ΜΙΤΕ jsou lokalizovány v oblastech genomu obsahujících kódující sekvence a že je možné pokrýt celý genom s omezenou sadou primerů na bázi ΜΙΤΕ.
d) Otisky DNA
Celkem 27 kultivarů, včetně rodičů H. vulgare Lina,
H.spontaneum Canada Park a 25 kultivarů H. vulgare (tabulka 1) • ·
2'7 ·····' ' «····· ······ se použilo pro hodnoceni použitelnosti těchto ΜΙΤΕ primerů v otiscích DNA. Na agarose se zjistilo, že primery a kombinace primerů TEM-3, TEM-10, TEM-1/-3 a TEM-1/-4 jsou použitelné pro rozlišení těchto kultivarů. Pro každý z těchto primerů a jejich kombinací se. pozoroval jeden až tři polymorfní proužky. Příklad otisku DNA na agarose je uveden na obr. 6.
Tři segregující proužky na obr. 6 ukazují, že 27 kultivarů se dělí do 7 skupin. M představuje markér molekulové hmotnosti XPstl. Čísla odpovídají číslům v tabulce 1.
Dva ΜΙΤΕ primery, TEM-1 a TEM-10, se studovaly v otiscích DNA za použití fluorescentně značeného detekčního systému. Pro TEM-1 se skórovalo celkem 62 proužků, z nichž 37 bylo polymorfnich a zbývajících 22 bylo stejných pro všech 27 kultivarů. Obrázek této elektroforesy je uvedena na obr. 7. Pro TEM-10 se skórovalo celkem 60 proužků, z nichž 34 bylo polymorfnich a zbývajících 26 bylo stejných pro všech 27 kultivarů. Identifikace drah na obr. 7 je uvedena v tabulce 1.
Dráhy 1-27 představují výsledky pro Lina, Canada Park, Alexis, Angora, Ariel, Azhul, Ellice, Express, Fillipa, Goldie, Golf, High amylose glacier, Iri, Ingrid, Kinnan, Maud, Meltan, Mentor, Mette, Mona, Roland, Saxo, Sváni, Tellus, Tfta, Třeboň a Vixen, v příslušném pořadí. Pomlčky ukazují markéry, které odlišují alespoň jeden kultivar od jiných.
GS matrice se připravily pomocí TEM-1, TEM-10, stejně jako kombinovaných dat pro oba primery, za použití Neiova a Liho koeficientu (Nei and Li, výše). Dendrogramy se připravily ze stejných dat. Dendrogram z kombinovaných dat pro TEM-1 a TEM10 je uveden na obr. 8. Dendrogram jasně separuje H. spontaneum linii od kultivarů H. vulgare. S výjimkou Azhul
I • « ρ »·····
Z (\ ······ ······ (šestiřadý typ) se jarní dvouřadé typy sdružovaly společně a separovaly se od 4 použitých zimních typů (Angora, Express, Igri a Vixen). High Amylosa Glacier sdružený se zimními dvouřadými typy je šestiřadý typ. Srovnání GS matrice s matricí získanou dříve pomocí RFLP analýzy ukázalo dobrou korelaci mezi dvěma matricemi, s Matlevovou statistikou Z = 0,69475. Tato pozitivní korelace byla vysoce statisticky významná s pravděpodobností p = 0,0020 toho, že by získaná hodnota Z byla náhodná.
e) Universalita primerů
Pro demonstrování universality primerů byly zvířecí master primery a rostlinné master primery použity na genomové DNA rostlin, hmyzu a na lidské genomové DNA.
Obr. 9A, 9B, 9C a 9D ukazují typický výsledek PCR amplifikace 11 různých zdrojů DNA za použití Master primeru TEM-12 (obr. 9A); Master primeru TEM-1 (obr. 9); Master primeru TEM-10 (obr. 9C) a Master primeru TEM-11 (obr. 9D), jak jsou popsány v tabulce 2. Zdroji DNA (uvedenými nad každou dráhou) jsou:
1) normální lidská DNA, muž.
2) normální lidská DNA, žena.
3) lidská DNA, muž s albinismem.
4) lidská DNA, žena s albinismem.
5) hmyz: Trichogramma.
6) luštěniny: sója.
7) luštěniny: vojtěška.
8) Křížaté rostliny: Canola.
9) obilniny: pšenice.
10) obilniny: oves.
11) obilniny: ječmen.
Tyto výsledky jasně ukazují, že markéry na bázi ΜΙΤΕ mohou být použity u různých druhů.
f) Všudypřítomnost sekvencí odvozených od Master
Pro demonstrování všudypřítomnosti markerového systému na bázi ΜΙΤΕ se sekvence Master primeru modifikovaly přidáním dalšího nukleotidu na 3'-konec. Toto způsobilo zvýšení specificity amplifikovaného produktu a je to zejména užitečné tehdy, když je amplifikační profil generovaný master sekvencí příliš komplexní pro interpretaci, jak je tomu u TEM-1 primeru odvozeného od Stowaway.
Obr. 10A, 10B, 10C, 10D a 10E ukazují příklad výsledků získaných s Master primerem TEM-1 v preamplifikačním stupni a s jeho příslušnými ukotvenými primery uvedenými v tabulce 3 v amplifikaci. Obr. ukazují profily PCR amplifikace DNA obilniny (ječmen) ve srovnání s profilem získaným při použití Master .primeru TEM-1 samostatně (obr. 10A); ukotveného primeru TEM-
IA, který je ukotven dalším A na : svém 3' konci (obr. 10B) ;
ukotveného primeru TEM-1C, který je ukotven C (obr. 10C) ;
ukotveného primeru TEM-1G, který je ukotven G (obr. 10D); a
ukotveného primeru TEM-1T, který je ukotven nipn (obr. 10E) .
Z těchto výsledků je jasné, že jednodušší charakter amplifikace je pozorován tehdy, když je TEM-1 ukotven na svém 3' konci buď A, C, T nebo G. Je také jasné, že při různých ukotveních na 3' konci se pozorují různé a komplementární charaktery amplifikace.
Obecné využití a komerční použití • ·
Různé studie prokázaly, že transpozony jsou přítomné prakticky ve všech doposud studovaných druzích. Retrotranspozony jsou přítomné v genomu rostlin ve velkém počtu kopií. Předpokládá se, že Alu rodina má 5 x 105 kopií na lidský genom, které se translatují na jeden Alu element na každých 5 kb DNA. Tento element samotný tvoří 5% genomu u primátů (Berg D.E. and M.M. Howe 1989, Mobile DNA, Washington, Američan Society of Microbiology). Tyl/copia skupina elementů může být přítomna až v počtu 106 kopií na genom v druhu Vicia, což tvoří více než 2% genomu, ačkoliv uvnitř tohoto druhu byly pozorovány variace (Pearce S. R., H. Gill, D. Li, J. S. HeslopHarrison, A. Kumar and A.J. Flavell 1996, The Tyl-copia group retrotranspozons in Vicia species: copy number, sequence heterogeneity and chromosome localisation, Mol.Gen.Genet. 250:305-315). BARE-1 retrotranspozon má počet kopií 3 x 104 a tvoří 6,7% genomu u ječmene (Suoniemi A., K. AnamthawatJonsson, T. Arna and A. H. Schulman 1996, Retrotranspozon BARE-1 is a major, dispersed component of the barley (Hordeum vulgare L.) genome, Plant Molecular Biology 30:1321-1329). Ve studii provedené SanMiguelem a kol. (SanMiguel P., A.
Tikhonov, Y.-K. Jin, N.Motchoulskaia, D.Zakharov, A.MelakeBerhan, P.S. Springer, K. J. Edwards, M. Lee, Z. Avramova and J. L. Bennetzen, 1996, Nested retrotranspozons in the intergenic regions of the maize genome, Science 274: 765-768), ukázalo sekvencování 280 kb regionu sousedícího s genem Adhl-F kukuřice izolovaným na kvasinkovém artificiálním chromosomovém (YAC) klonu 37 tříd repeticí nested transpozonů, které tvořily >60% klonu.
Tourist a Stowaway elementy (Bureau T.E. and S.R.Wessler 1992, Tourist:A large family of smáli inverted repeat elements frequently associated with maize genes, Plant Cell 4:12831294; a Bureau T.E.and S. R. Wessler 1994, Stowaway: A new • ·
family of inverted repeat elements associated with the genes of both monocctyledonous and dicotyledonous plants, Plant Cell 6: 907-916) jsou členy TIR třídy transpozonů, ačkoliv se významně liší od tradičních rodin TIR transpozonů jako je Ac a En/Spm. Bylo zjištěno, že Barfly, nový člen TIR transpozonů jako je Tourisc a Stowaway, je asociován s genem pro xylosa izomerasu ječmene. Tyto elementy, společně s dalšími elementy tohoto typu, souhrně označovanými jako ΜΙΤΕ (Bureau T. E., P. C. Ronald, and S. R. Wessler, 1996, A computer-based systematic survey reveals the predominance of smáli invertedrepeat elements in wild-type rice genes, Proč.Nati.Acad.Sci. 93:8524-8529), byly zjištěny ve velkém počtu dosud studovaných druhů rostlin. Také se předpokládá, že ΜΙΤΕ budou přítomny ve vysokém počtu kopií v eukaryotických genomech.
všudypřítomnost a rozložení transpozonů v celém genomu naznačují, že ryto elementy mohou být využity jako nástroje pro PCR mapování. Dále, Sinnet a kol. (Sinnet D., J.M. DeragonyL. R.Simard and D. Labuda 1990, Alumorphs-human DNA polymorphisms detected by polymerase chain reaction using Alu specific primers, Genomics 7:331-334) použily Alu specifické primery ve vyhledávání polymorfismů v různých vzorcích lidské DNA. Titi výzkumníci jasně prokázaly možné použití těchto polymorfismů (označovaných jako alumorfy) při analýze genomu (Sinnet et al., výše) a úspěšně použily tyto alumorfy pro detekci vazby jednoho alumorfu na lidské onemocnění (Zietkiewicz E., M. Labuda, D. Sinnet, F.
H. Glorieux ani D. Labuda 1992, Linkage mapping by simultaneous ssreening of multiple polymorphic loci using Alu oligonucleotide-directed PCR, Proč. Nati. Acad. Sci. 89: 84488451). Copia-psdobný retrotranspozon, PDR1, byl také úspěšně použit pro stučium polymorfismu a - v kombinaci s dalšími specifickými primery - pro diagnostiku různých linií v Pisum • ·
3· · · · · · /_- ······ ···♦·♦ (Lee, D., T.H.N. Ellis, L- Turner, R.P. Hellens and W.G. Cleary, 1990, A copia-like element in Pisum demonstrates the uses of dispersed repeated sequences in genetic analysis, Plant Molecular Biology 15: 707-722).
V předkládaném vynálezu jsou členy rodiny TIR transpozonů, ΜΙΤΕ, použity jako nástroje pro mapováni a otisky DNA u ječmene a jsou úspěšně použity jak v obvyklém agarosovém systému, tak v LI-COR automatizovaném systému pro analýzu DNA, pro detekci polymorfísmů, lokalizaci těchto MGM do existující mapy genetické vazby a pro získání otisků DNA kultivarů druhu H. vulgare.
V obvyklém agarosovém detekčním systému jsme prokázali, že při použití tří ΜΙΤΕ primerů a jednoho retrotranspozonového primeru se detekuje 15 jasně hodnotitelných polymorfísmů a 13 z těchto 15 polymorfísmů se mapovalo do 4 vazebných skupin ječmene. Každý ΜΙΤΕ primer nebo kombinace primerů generovala více než 10 hodnotitelných proužků, z nichž 2-5 byly polymorfní. V LI-COR automatizovaném genotypizačním systému generoval každý z těchto dvou ΜΙΤΕ primerů téměř 100 hodnotitelných proužků, z nichž až 75 bylo polymorfních. Markéry mapující se na všech 7 vazebných skupin ječmene byly získány za použití těchto dvou primerů. Toto ukazuje na náhodnou distribuci markérů na bázi ΜΙΤΕ v genomech.
Nové ΜΙΤΕ nejsou zachyceny při počítačových vyhledáváních podobných sekvencí. Se zvyšováním počtu ΜΙΤΕ mohou být snadno připraveny pouze podle MGM podrobné vazebné mapy v podstatě jakéhokoliv druhu s vysokým počtem kopií ΜΙΤΕ. Také mohou být snadno provedeny vazebné studie významných genů s MGM. Vysoká variabilita detekovaná těmito primery na bázi ΜΙΤΕ v kultivarech stejného druhu prokazuje praktickou hodnotu těchto a ·
3 primerů.
Bylo zjištěno, že některé transpozony, jako je Alu (Berg and Howe, výše; Makalowski W., G. A. Michell and D. Labuda, 1994, Alu sequeces in the coding regions of mRNA: a source of protein variability, Trends Genet. 10:188-193), a myši B2 element (Clemens M.J. 1987, A potential role for RNA transcribed from B2 repeats in the regulation of mRNA stability, Cell 49: 157-158), jsou často asociovány s geny. ΜΙΤΕ jsou také často identifikovány v rostlinných a jiných eukaryotických genech. Stowaway byl prvně objeven jako příčina mutace ve wx-locusu kukuřice (Bureau and Wessler, výše). Bylo objeveno více než 100 genů, které obsahují ΜΙΤΕ ve svých kódujících a nekódujících regionech (Bureau et al., výše). Těsná asociace retroelementů s živočišnými a rostlinnými geny a asociace ΜΙΤΕ s geny zemědělských plodin a jiných rostlin, nabízí nový způsob pro charakterizaci genů a genových sekvencí. Dále byly provedeny pokusy pro izolaci genových sekvencí (Nelson D.L., S.A. Ledbetter, L.Corbo, M.F.Victoria, R.Ramirez-Solis, T.D. Webster, D.H.Ledbetter and C.T.Caskey 1989, Alu polymerase chain reaction: A method for rapid isolation of human-specific DNA sequences from complex DNA sources, Proč. Nati. Acad. Sci. 86: 6686-6690; Souer E., F.Quattrocchio, N.de Vetten, J.Moland R. Koes 1995, A generál method to isolate genes tagged by a high copy number transposable element, Plant Journal 7: 677-685), pro analýzu genomu (Hirochika H, 1997, Retrotranspozons of rice: their regulation and use for genome analysis, Plant Molecular Biology 35:231-240; Lee D., T.H.N. Ellis, L.Turner, R.P.Hellens and W. G. Cleary, 1990, A copia-like element in Pisum demonstrates the uses of dispersed repeated sequences in genetic analysis, Plant Molecular Biology 15: 707-722), a pro analýzu struktur genů a jejich exprese (White, S.E., L.F.
Habera and S.R. Wessler, 1994, retrotranspozons in the flanking regions of normál plant genes: A role for copia-like elements in the exolution of gene structure and expression,
Proč. Nati. Acad. Sci. 91: 11792-11796) za použití jiných typů transpozonů.
Způsob podle předkládaného vynálezu je použitelný v několika aplikacích:
(1) Ve vazebných studiích (a) jak je popsáno v předkládaném vynálezu, mohou být vazebné mapy připraveny za použití ΜΙΤΕ markérů. Toto vyžaduje segregující populaci a rodiče. Vazebné mapy se připraví podle segregace.
(b) také může být provedena vazba na fenotypový znak nebo gen. Toto může být provedeno společně s rozsáhlou analýzou segregantů pro urychlení výzkumu. V tomto případě se dva rodiče a soubory, které jsou fenotypově (se znakem) nebo geneticky (s genem) odlišné použity v PCR amplifikaci s ΜΙΤΕ primery pro identifikaci polymorfních markérů a tak potenciální vazby.
(c) stejným způsobem může být asociace MGM nebo IMP s lokusem kvantitativního znaku (QTL) za komplexní genetické kontroly detekována pomocí různých postupů statistické analýzy, jako je jednomístný ANOVA, Intervalové mapování a kompozitní intervalové mapování.
(d) jakmile jsou známé vazby markérů se zemědělsky významnými znaky, mohou být tyto markéry použity v selekci pomocí markérů (MAS) pro urychlení šlechtění.
(2) V otiscích DNA
MGM a IMP postupy mohou být použity při konstrukci knihoven velkých insertů, jako jsou YAC (kvasinkový artificiální • ♦
3- .:. .:. * chromosom) a BAC (bakteriální artificiální chromosom), pro identifikaci kultivarů a pro identifikaci genů, stejně jako pro konverzi markérů.
(a) připravené MGM a IMP markéry mohou sloužit jako značky při sestavování souborů a při procházení chromosomu.
(b) MGM a IMP postupy mohou být snadno použity pro otisky DNA kultivarů a křížených linií pro stanovení jejich rodokmenů a genetických vztahů, pro stanovení příspěvku rodičů potomstvu a pro certifikaci nových linií a kultivarů.
MGM postup může být užitečný v izolaci genů a v subklonování genomových sekvencí:
(a) když je gen vázán na transpozon, může být využito MGM, díky jeho všudypřítomnosti v genomu. ΜΙΤΕ primer může být použit společně s primerem navrženým podle připojeného transpozonu. Může být amplifikována sousední sekvence, která může být potom použita pro izolaci přirozeného genu. Tento postup může ušetřit jedno kolo vyšetřování DNA knihovny ve srovnání s obvyklým klonování genu vázaného na transpozon.
(b) podobně jako při izolaci genu může být MGM použito pro izolaci genomových sekvencí sousedících se známou genovou sekvencí. ΜΙΤΕ primer a primer navržený podle známé genové sekvence mohou být použity v PCR pro amplifikaci sousedních sekvencí.
(c) amplifikace za použití primerů z DNA klonu detekujícího RFLP v kombinaci s ΜΙΤΕ primerem může být použita pro konverzi RFLP markéru na markér na bázi PCR.
Je jasné, že ačkoliv byl předkládaný vynález popsán ve svých specifických provedeních, existují různé další modifikace vynálezu a vynález zahrnuje všechny variace, použití nebo adaptace využívající základní principy vynálezu a je definován pouze připojenými patentovými nároky.
• ·
Seznam sekvenci <110> MCGILL UNIVERSITY DNA LANDMARKS INC. Bureau, Thomas Chang, Ruying Landry, Benoit 0'Donoughue, Louise <120> Nový typ genetického markéru na bázi transpozonů <130> 1770-222PCT <150> 60/127460 <151> 1999-01-04 <160> 35 <170> FastSEQ for Windows Verze 3.0 <210> i <211> 20 <212> DNA < 213 > Artificiální sekvence <220>
<223> Artificiální přiměř <400> 1 rtatttwgga acggagggag <210> 2 <211> 20 <212 > DNA < 213 > Artificiální sekvence <220>
< 2 2 3 > i Artificiální primer <400> 2 ttkcccaaaa gaactggccc <210> 3 <211> 18 <212> DNA <213> . .
Artificiální sekvence <220>
<223> i Artificiální primer <400> 3 tccccaytrt gaccabcc <210> 4 λ
<211> 17 <212> DNA < 213 > Artificiální sekvence <220>
< 2 2 3 > Artificiální primer <400> 4 gtyttnacrt ccatytg <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>
<223> Artificiální primer <400> 5 tcyccattgy grccagccta <210> 6 <211> 20 <212> DNA < 213 > Artificiální sekvence <220>
<223> Artificiální primer <400> 6 ccttytaamn gaacaasccc <210> 7 <211> 20 <212> DNA < 213 > Artificiální sekvence <220> .
< 2 2 3 > Artificiální primer <400> 7 aattmytttt gcaccaacct <210> 8 <211> 21 <212> DNA <213 > Artificiální sekvence 5 <220>
< 2 2 3 > Artificiální primer <400> 8 rtatttwgga acggagggag a <210> 9 <211> 21 • ·
9 9
<212> DNA
<213> Artificiální sekvence
<220> <223> Artificiální primerr
<400> 9
rtatttwgga acggagggag c
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificiální sekvence
<220> <223> Artificiální primer
<400> 10
rtatttwgga acggagggag g
<210> 11
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificiální sekvence
<220> <223> Artificiální primer.
<400> 11
rtatttwgga acggagggag t
<210> 12
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificiální sekvence
<220>
<223> Artificiální primer
<400> 12
ccttytaamn gaacaasccc a <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>
<2 2 3 > Artificiální primer <400> 13 ccttytaamn gaacaasccc c <210> 14 <211> 21 <212> DNA
< 213 > Artificiální sekvence <220>
<223> iArtificiální primer <400> 14 ccttytaamn gaacaasccc g
<210> 15
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificiální sekvence
<220> <223> ^Artificiální primer
<400> 15
ccttytaamn gaacaasccc t
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> ^Artificiální sekvence
<220> <223> Artificiální primer
<400> 16
ttkcccaaaa gaactggccc a
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificiální sekvence
<220> Artificiální primer
<223>
<400> 17
ttkcccaaaa gaactggccc c
<210> 18
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificiální sekvence 5
<220>
<223> Artificiální primer
<400> 18
ttkcccaaaa gaactggccc g
<210> 19
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificiální sekvence
r <220>
<223> Artificiální primer' <400> 19 ttkcccaaaa gaactggccc t <210> 20 <211> 18 <212> DNA <213 > Artificiální sekvence; <220>
<223 > Artificiální primer <400> 20 gtyttnacrt ccatytga
<210> 21
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificiální sekvence
<220>
<223> Artificiální primer -
<400> 21
gtyttnacrt ccatytgc <210> 22 <211> 18 <212> DNA <213> Artificiální sekvence <220>
<223> Artificiálníprimer <400> 22 gtyttnacrt ccatytgg
<210> 23
<211> 18
<212> DNA
<213> Artificiální sekvence
<220>
<223> Artificiální primer
<400> 23
gtyttnacrt ccatytgt <210> 24 <211> 19 <212> DNA < 213 > Artificiální sekvence
4Í <220>
<223> Artificiální primer <400> 24 tccccaytrt gaccabcca <210> 25 <211> 19 <212> DNA * 213 > Artificiální sekvence <220>
< 2 2 3 > Artificiální primer ' <400> 25 tccccaytrt gaccabccc <210> 26 <211> 19 <212> DNA < 213 > Artificiální sekvence : <220>
<223> ;Artificiální primer <400> 26 tccccaytrt gaccabccg <210> 27 <211> 19 <212> DNA < 213 * Artificiální sekvence <220>
<223> Artificiální primer r <400> 27 tccccaytrt gaccabcct <210> 28 <211> 21 <212> DNA <213> Artificiální sekvence : <220>
<223> Artificiální primer <400> 28 tcyccattgy grccagccta a <210> 29 <211> 21 <212> DNA < 213 > Artificiální sekvence <220>
•»···· <223> Artificiální primer <400> 29 tcyccattgy grccagccta c <210> 30 <211> 21 <212> DNA < 213 5 Artificiální sekvence: <220>
<223> Artificiální primer <400> 30 tcyccattgy grccagccta g
<210> 31 <211> 21 <212> DNA < 213 > Artificiální sekvence <220> <223> Artificiální primer-
<400> 31
tcyccattgy grccagccta t
<210> 32
<211> 21
<212> DNA
<2i3> Artificiální sekvence:
<220>
< 2 2 3 > Artificiální primer
<400> 32
aattmytttt gcaccaacct a
<210> 33
<211> 21
<212> DNA
< 213 > Artificiální sekvence
<220>
<223> 'Artificiální primer'
<400> 33
aattmytttt gcaccaacct c <210> 34 <211> 21 <212> DNA 213 * Artificiální sekvence ! <220>
<223 > Artificiální primer «
• · ·
<400> 34 aattmytttt gcaccaacct g <210> 35 <211> 21 <212> DNA c 213 > Artifíciální sekvence: <220>
< 2 2 3 > . Artifíciální primer <400> 35 aattmytttt gcaccaacct t

Claims (19)

  1. PATENTOVÉ
    NÁROKY
    1. Způsob detekce polymorfismů dané sekvence nukleové kyseliny vyznačující se tím, že zahrnuje tyto kroky:
    (a) amplifikaci dané sekvence nukleové kyseliny s prvním primerem homclogickým s miniaturním invertovaným repetitivnim transpozonem (ΜΙΤΕ), jeho fragmentem nebo derivátem, a s druhým primerem, kde uvedený první primer tepelně hybridizuje s uvedeným ΜΙΤΕ, pokud je přítomen v dané sekvenci nukleové kyseliny, a uvedený druhý primer je identický nebo není identický s prvním primerem, a je homologický nebo není homologický se sekvencí ΜΙΤΕ;
    (b) separováni fragmentů dané nukleové kyseliny amplifikovaných v kroku (a); a (c) analýzu fragmentů získaných v kroku (b) vzhledem k referenčním fragmentům získaným z amplifikace sekvence nukleové kyseliny s alespoň jedním uvedeným primerem, za účelem stanovení rozdílů v sekvenci nukleové kyseliny mezi fragmenty získanými v kroku (b) a referenčními fragmenty, kde uvedené rozdíly ukazuji na polymorfismus dané nukleové kyseliny.
  2. 2. Způsob genotypizace eukaryotického organismu vyznačující se tím, že zahrnuje tyto kroky:
    (a) amplifikaci sekvence nukleové kyseliny uvedeného eukaryotického organismu s prvním primerem homologickým s ΜΙΤΕ, jeho fragmentem nebo derivátem, a s druhým primerem, kde uvedený první primer tepelně hybridizuje s uvedeným ΜΙΤΕ, pokud je přítomen v dané sekvenci nukleové kyseliny uvedeného eukaryotického organismu, a uvedený druhý primer je identický nebo není identický s prvním primerem, a je homologický nebo není homologioký se sekvencí ΜΙΤΕ;
    (b) separování fragmentů získaných amplifikaci nukleové • · kyseliny v krcku (a) ; a (c) srovnání uvedených fragmentů získaných v kroku (b) s fragmenty referenční sekvence nukleové kyseliny od uvedeného eukaryotického organismu, kde identita fragmentů z kroku (b) s fragmenty referenční sekvence nukleové kyseliny ukazuje na to, že uvedený eukaryotický organismus obsahuje či neobsahuje uvedenou sekvenci nukleové kyseliny.
  3. 3. Způsob pro otisk DNA eukaryotického organismu vyznačující se tím, že zahrnuje tyto kroky:
    (a) amplifikaci sekvence nukleové kyseliny uvedeného eukaryotického organismu s prvním primerem homologickým s ΜΙΤΕ, jeho fragmentem nebo derivátem, a s druhým primerem, kde uvedený první primer tepelně hybridizuje s uvedeným ΜΙΤΕ, pokud je přítomen v dané sekvenci nukleové kyseliny, a uvedený druhý primer je identický nebo není identický s prvním primerem, a je homologický nebo není homologický s uvedenou ΜΙΤΕ sekvencí;
    (b) separování fragmentů získaných amplifikaci nukleové kyseliny v kroku (a), kde takto separované fragmenty jsou representativní pro uvedený eukaryotický organismus.
  4. 4. Způsob podle nároku 1, 2 nebo 3vyznačujici se tím, že krok amplifikace je proveden PCR.
  5. 5. Způsob podle nároku 1, 2, 3 nebo 4vyznačuj ící se t i m, že první primer je odvozen od konvenční sekvence ze sekvence Tourist, Stowaway, Barfly nebo HSMarl a MADEl elementu.
  6. 6. Způsob podle nároku 1, 2, 3, 4 nebo 5vyznačuj ící se t i m, že uvedený první primer má nukleotidovou sekvenci vybranou ze skupiny zahrnující SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ • * • ·
    46 • · · · · • • · • • · · · • « • a • ♦ · · • • • · • · « · ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NC : 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33, SEQ ID NO: 34 a SEQ ID NO : 35. 7. Způsob podle nároku 1, 2, 3, 4, 5 nebo 6
    že uvedený druhý primer je vyzná čujici se tím, skupiny zahrnující MITE-specifický primer, vybrán ze primer na bázi SSR sekvence, sekvence retroelementu, sekvence klonované nukleové kyseliny detekující RFLP, náhodné genomové sekvence, vektorové sekvence a genové sekvence.
  7. 8. Použití polymorfismu detekovaného způsobem podle nároku 1,
    2, 3, 4, 5, 6 nebo 7 pro vyhledávání potomstva eukaryotického organismu.
  8. 9. Použití polymorfismu detekovaného způsobem podle nároku 1,
    2, 3, 4, 5, 6 nebo 7 pro určení hybridity eukaryotického organismu.
  9. 10. Použití polymorfismu detekovaného způsobem podle nároku 1, 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7 pro identifikaci variací vázaného fenotypového znaku v eukaryotickém organismu.
  10. 11. Použití polymorfismu detekovaného způsobem podle nároku 1, 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7 jako genetického markéru pro přípravu genetických map.
  11. 12. Použití polymorfismu detekovaného způsobem podle nároku 1,
    4 · • ·
    47 ······.
    ···· *· ··· ···
    2, 3, 4, 5, 6 nebo 7 pro identifikaci jednotlivých potomků z křížení, kde uvedení potomci mají požadovaný genetický příspěvek od jednotlivých rodičů.
  12. 13. Způsob podle nároku 1, 2, 3, 4, 5, 6 nebo 7 vyznačující se tím, že jde o způsob izolování genomové DNA sekvence sousedící s gen kódující nebo nekódující sekvencí.
  13. 14. Způsob podle nároku 13 vyznačující se tím, že genomová DNA sekvence sousedící s DNA sekvencí kódující gen je promotor nebo regulační sekvence.
  14. 15. Fragment nukleové kyseliny nebo jeho derivát, získaný amplifikací sekvence nukleové kyseliny eukaryotického organismu s alespoň jedním primerem homologickým s ΜΙΤΕ, pro použiti jako sonda pro sekvence nukleové kyseliny.
  15. 16. Použití fragmentu nukleové kyseliny nebo jeho derivátu podle nároku 15 pro selekci pomocí markéru (MAS), klonování na bázi map, certifikaci hybridů, otisky DNA, genotypizaci a jako markéru specifického pro alelu.
  16. 17. Způsob podle nároku 2vyznačujicí se tím, že eukaryotickým organismem je rostlina, živočich nebo houba.
  17. 18. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že eukaryotickým organismem je rostlina.
  18. 19. Způsob mapování genomu vyznačující se tím, že zahrnuje tyto kroky:
    (a) frakcionaci genomu eukaryotického organismu;
    (b) klonování takto frakcionovaného genomu do vektoru;
    • · ····· ···· ·· ··· ··· (c) testováni takto klonovaných vektorů amplifikaci DNA v takto klonovaných vektorech za použití prvního primerů homologického s miniaturním invertovaným repetitivním transpozonem (ΜΙΤΕ), a druhého primerů, kde uvedený první primer hybridizuje miniaturní invertovaný repetitivní transpozon (ΜΙΤΕ) v DNA, a uvedený druhý primer je identický nebo není identický s prvním primerem, a je homologický nebo není homologický se sekvencí ΜΙΤΕ;
    (d) separaci produktů amplifikace podle velikosti;
    (e) měření charakteru produktů amplifikace;
    (f) rekonstrukci genomu z překrývajících se fragmentů.
  19. 20. Způsob mapování polymorfního genetického markéru vyznačující se tím, že zahrnuje tyto kroky:
    (a) poskytnutí směsi sekvencí nukleové kyseliny z biologického vzorku z eukaryotického organismu štěpených restrikčním enzymem;
    (b) amplifikaci směsi sekvencí nukleové kyseliny štěpených restrikčním enzymem za použití prvního primerů homologického s miniaturním invertovaným repetitivním transpozonem (ΜΙΤΕ), jeho fragmentem nebo derivátem, a druhého primerů, kde uvedený první primer je specifický pro ΜΙΤΕ, a uvedený druhý primer je identický nebo není identický s prvním primerem, a je homologický nebo není homologický se sekvencí ΜΙΤΕ;
    (c) identifikaci sady různě amplifikovaných sekvencí nukleové kyseliny ve směsi; a (d) mapování alespoň jedné různě amplifikované sekvence nukleové kyseliny na jedinečný genetický polymorfismus, čímž se získá markér pro polymorfismus.
CZ20013532A 1999-04-01 2000-03-30 Nový typ genetického markeru na bázi transpozonu CZ20013532A3 (cs)

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US12746099P 1999-04-01 1999-04-01

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CZ20013532A3 true CZ20013532A3 (cs) 2002-03-13

Family

ID=22430239

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20013532A CZ20013532A3 (cs) 1999-04-01 2000-03-30 Nový typ genetického markeru na bázi transpozonu

Country Status (11)

Country Link
EP (1) EP1163370A2 (cs)
JP (1) JP2002540799A (cs)
CN (1) CN1351671A (cs)
AU (1) AU3547800A (cs)
CA (1) CA2371128A1 (cs)
CZ (1) CZ20013532A3 (cs)
HK (1) HK1047139A1 (cs)
HU (1) HUP0201423A3 (cs)
PL (1) PL351816A1 (cs)
RU (1) RU2279482C2 (cs)
WO (1) WO2000060113A2 (cs)

Families Citing this family (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002012484A1 (fr) * 2000-08-02 2002-02-14 Japan Tobacco Inc. Marqueur destine a detecter un polymorphisme dans un genome vegetal et son procede de construction
CA2591043C (en) * 2004-12-17 2012-01-10 The University Of Tokyo Method for identifying gene with varying expression levels
WO2006094774A2 (en) * 2005-03-03 2006-09-14 Rijk Zwaan Zaadteelt En Zaadhandel B.V. Reverse progeny mapping
JP5563206B2 (ja) * 2007-07-24 2014-07-30 独立行政法人農業・食品産業技術総合研究機構 米の品種識別方法
CN101280338B (zh) * 2007-12-13 2011-08-17 中国人民解放军第三军医大学第一附属医院 一种检测核酸多态性的核酸扩增方法
TWI414607B (zh) * 2009-06-03 2013-11-11 Kaohsiung Distr Agricultural Res And Extension Station Council Of Agriculture 利用植物跳躍子建立檢測植物基因組多型性之分子標誌之方法及所建立之分子標誌
CA3214905A1 (en) * 2014-02-27 2015-09-03 Jumpcode Genomics, Inc. Methods for analysis of somatic mobile elements, and uses thereof
EP3384020B1 (en) * 2015-12-02 2022-08-03 Universität Basel Mobilisation of transposable elements to enhance genetic and epigenetic variability in a population
CN106868119B (zh) * 2017-02-14 2021-04-30 山东农业大学 一种鉴别刺槐种质资源亲缘关系的ssr标记引物组及其应用
WO2018211477A1 (en) * 2017-05-18 2018-11-22 Pharmacogenetics Limited Genome-wide capture of inter-transposable element segments for genomic sequence analysis of human dna samples with microbial contamination
KR101998526B1 (ko) * 2018-10-23 2019-07-09 경희대학교 산학협력단 배추 형질전환체 특이적 활성 전이인자인 pte-1 검출용 프라이머 세트
CN111455087B (zh) * 2020-05-12 2023-01-06 江苏省农业科学院 一种基于菜豆cacta转座子研发的新型分子标记、引物对、分子标记设计方法及应用
CN113817838A (zh) * 2021-08-31 2021-12-21 皖南医学院 一种粉尘螨微卫星标记、其引物及应用和引物的获取方法

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0879300B1 (de) * 1996-02-02 2002-12-18 Max-Planck-Gesellschaft Zur Förderung Der Wissenschaften E.V. Verwendung von primern für universelle fingerprint-analysen

Also Published As

Publication number Publication date
AU3547800A (en) 2000-10-23
JP2002540799A (ja) 2002-12-03
RU2279482C2 (ru) 2006-07-10
HUP0201423A2 (en) 2002-08-28
PL351816A1 (en) 2003-06-16
HK1047139A1 (zh) 2003-02-07
CN1351671A (zh) 2002-05-29
WO2000060113A2 (en) 2000-10-12
HUP0201423A3 (en) 2004-12-28
CA2371128A1 (en) 2000-10-12
WO2000060113A3 (en) 2001-04-05
EP1163370A2 (en) 2001-12-19

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Dida et al. The genetic map of finger millet, Eleusine coracana
US7977533B2 (en) Genetic loci associated with iron deficiency tolerance in soybean
Chang et al. Inter-MITE polymorphisms (IMP): a high throughput transposon-based genome mapping and fingerprinting approach
Mulpuri et al. Inheritance and molecular mapping of a downy mildew resistance gene, Pl 13 in cultivated sunflower (Helianthus annuus L.)
US10577623B2 (en) Quantitative trait loci (QTL) associated with shatter resistant capsules in sesame and uses thereof
US11445692B2 (en) Quantitative trait loci (QTL) associated with shatter resistant capsules in sesame and uses thereof
US9062352B2 (en) Loci associated charcoal rot drought complex tolerance in soybean
US20220010325A1 (en) Quantitative trait loci (qtl) associated with shattering-resistant capsules in sesame and uses thereof
CZ20013532A3 (cs) Nový typ genetického markeru na bázi transpozonu
CN109628627A (zh) 水稻广谱抗稻瘟病基因Pigm的SNP标记开发和应用
Boronnikova et al. Using IRAP markers for analysis of genetic variability in populations of resource and rare species of plants
WO2007125958A1 (ja) テンサイ黒根病抵抗性品種選抜マーカーとその選抜方法
KR20210114936A (ko) 개선된 내병성을 갖는 옥수수 식물
US20130040826A1 (en) Methods for trait mapping in plants
US20070048768A1 (en) Methods for screening for gene specific hybridization polymorphisms (GSHPs) and their use in genetic mapping and marker development
KR102024212B1 (ko) ＤＮＡ 마커를 포함하는 벼 키다리병 저항성 유전자 qBK1WD를 가진 벼 품종 선별용 조성물 및 이를 이용한 저항성 벼 품종 선별 방법
US20070192909A1 (en) Methods for screening for gene specific hybridization polymorphisms (GSHPs) and their use in genetic mapping ane marker development
CN105483281B (zh) 一种用于鉴定糯玉米沪五彩花糯1号的snp分子标记及其鉴定方法
US20150143575A1 (en) Major qtls conferring resistance of corn to fijivirus
Leišová-Svobodová et al. The application of microsatellite analysis in barley malting quality breeding programmes.
Velpula et al. Genetic diversity analysis of ripening specific genotypes using potential public domain SSR markers in tomato (Solanum Lycopersicum)
Thomson Genetic Diversity in Wheat: Analysis using Diversity Arrays Technology (DArT) in bread and durum wheats
CN116926222A (zh) 基于TaJMJ13-6B基因中SNP位点辅助筛选不同千粒重小麦的方法
CN113151552A (zh) 一种与小麦抗条锈病基因YrZY1095连锁的分子标记及其应用
CN113278719A (zh) 与谷子叶夹角基因紧密连锁的分子标记SIsv0523