CZ20012362A3 - Prípravek pro lécení rakoviny obsahující kombinaci vektoru a acetaminophenu, jeho pouzití a souprava - Google Patents

Abstract

Je popsán prípravek, který obsahuje kombinaci alespon jednoho vektoru, který zahrnuje alespon jedengen P450, nebo jeho úcinnou cást, a acetaminophenu, nebo jeho strukturálne odvozeného derivátu. Prípravek je vhodný pro výrobu léciva pro lécení ruzných druhu rakoviny. Rovnez je popsána souprava obsahující vektor, acetaminophen, methionin a/nebo acetylcystein a prípadne doplnkovou a prípadne doplnkovou pomocnou látku, nosic nebo redící roztok.

Description

(57) Anotace:

Je popsán přípravek, který obsahuje kombinaci alespoň jednoho vektoru, který zahrnuje alespoň jeden gen P450, nebo jeho účinnou část, a acetaminophenu, nebo jeho strukturálně odvozeného derivátu. Přípravek je vhodný pro výrobu léčiva pro léčení různých druhů rakoviny. Rovněž je popsána souprava obsahující vektor, acetaminophen, methionin a/nebo acetylcystein a případně doplňkovou a případně doplňkovou pomocnou látku, nosič nebo ředící roztok.

CZ 2001 2362 A3 • ♦· ·♦ ·* ·· ·· ···· 4 4 · 4 · 4 ·· ··♦···* 4 4· • ♦♦♦ ♦· ·· · · « 99 • 9 9 9 9 4 9 99

999 99 99 99 999999

Přípravek pro léčení rakoviny obsahující kombinaci vektoru a acetaminophenu, jeho použití a souprava

OBLAST TECHNIKY

Tento vynález se týká přípravku pro léčení rakoviny, který obsahuje kombinaci vektoru a acetaminophenu, jeho použití a soupravy. Vynález se týká oblasti genové terapie známé jako geneticky řízená enzymová prekursorová terapie (GDEPT).

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Běžné terapie pro léčení rakoviny zahrnují, mezi ostatními věcmi, radioterapii a chemoterapii, ze kterých každá, ačkoliv účinná ve zpomalování růstu rakovinných buněk, má významné nevýhody, poněvadž každá léčba je typicky selektivní pro buňky, které se aktivně dělí. V důsledku toho jsou ničeny i normální dělící se buňky, což má za následek významné nežádoucí vedlejší účinky, takové jako je pocit nevolnosti a potlačení imunity, ze kterých posledně zmíněný může vést ke komplikacím druhotných infekcí. V posledních letech byl výzkum zaměřen na poskytnutí selektivních léčeb, které zmenšují tyto nežádoucí vedlejší účinky. Jedna taková terapie je GDEPT ’.

GDEPT je mimořádně zajímavá s ohledem na léčbu rakoviny v tom, že nabízí výhody nad běžnými chemoterapeutickými způsoby léčby rakoviny. U takovýchto běžných způsobů napadají léky podávané pacientům nejenom cílové rakovinné buňky, ale také normální buňky. Odbourávání rakovinných buněk je dosahováno za cenu způsobení poškození normálních buněk a vytváření vážných vedlejších účinků. V léčbě rakoviny pomocí GDEPT je cílem vytvořit protirakovinný lék in šitu uvnitř rakovinné buňky, zatím, co se vytváří málo nebo vůbec v normálních buňkách, takto napadající rakovinné buňky, zatím, co nechává normální buňky v podstatě nedotčené. Tohoto je typicky dosaženo podáváním vektoru pacientovi, obsahujícího gen pro enzym, který může měnit relativně netoxickou sloučeninu (běžně doporučenou jako prekursor) na cytotoxické činidlo. Vektor též obsahuje promotor, tj. sekvence DNA určující přepínač pro gen, tento promotor je citlivý k regulačnímu proteinu, nacházejícímu se pouze v rakovinných buňkách, nebo k většímu rozsahu v rakovinných buňkách než v normálních buňkách. Gen je takto exprimován v podstatě v rakovinných buňkách, tak je to jenom (nebo hlavně) v rakovinných buňkách, že je enzym produkován, a že

koná především v rakovinných buňkách. Tímto způsobem jsou rakovinné buňky selektivně napadány, s relativně malým poškozením normálních buněk.

·· · ·

V jednom příkladu použití GDEPT v léčbě rakoviny, je prekursor 5-fluorocytosin (5-FC).

5-FC je sám o sobě relativně netoxický k lidským buňkám, ale může být přeměněn na silně účinný protirakovinný lék, 5-fluorouracil (5-FU), pomocí enzymu cytosindeaminasy. Bakteriální gen, který exprimuje cytosindeaminasu je včleněn do virového vektoru ve spojení s promotorem, který je citlivý k regulačnímu proteinu, který je charakteristikou určitého napadeného typu rakovinné buňky. Například při léčbě rakoviny prsu by promotor mohl být ten, který je citlivý k regulačnímu proteinu ERBB2 nebo při léčbě rakoviny jater ten, který je citlivý k a-fetoproteinu.

Ve známých GDEPT technikách se setkáváme s obtížemi v dosažení tak vysokého stupně selektivity jaký je žádoucí, (tj. ve zničení rakovinných buněk, zatím, co je limitováno poškození normálních buněk). To je alespoň částečně způsobeno skutečností, že normální buňky mohou podlehnout napadení cytotoxickými činidly, která byla vytvořena v rakovinných buňkách, ale nalezla svou cestu ven z těchto buněk, například, když se tyto buňky rozpadnou cytotoxickým působením léku.

Kromě toho jsou některá chemoterapeutická činidla selektivní pro dílčí fáze buněčného cyklu (např. Gl, S, G2 nebo mitózu). Je žádoucí poskytnout chemoterapeutická činidla, která nejsou tak omezená ve svých účincích a mohou zabít buňky bez ohledu na stav v buněčném cyklu.

PODSTATA VYNÁLEZU

Acetaminophen jako prekursor

Acetaminophen je široce používaný, bolest zmírňující a horečku snižující lék. Nicméně je to potenciálně nebezpečný lék v případě předávkování, které může způsobit vážné, dokonce smrtelné poškození jater ³. To je způsobeno skutečností, že jatemí buňky exprimují gen pro enzym P450, konkrétně CYP1A2, také v mnohem menším rozsahu CYP 2E1 a CYP 3A4. Tento enzym může přeměnit acetaminophen na metabolit, Y-acetylbenzochinonimin (NABQI), který je vysoce cytotoxický. Pro standardní dávkování acetaminophenu je toxicitě NABQI v játrech čeleno konverzí NABQI na netoxickou látku reakcí s glutathionem, normální součástí lidských buněk^4,5. Dodávka glutathionu je nicméně nedostačující k tomu, aby se mohla odstranit vysoká množství NABQI vytvořená vjatemích buňkách po předávkování acetaminophenem a buňky jsou proto poškozeny nebo zničeny.

*··· · ·· ·· ·· • ·· · · · · · • · · · ·· · · • · · · · · ·♦· · • · « ······ • · ··· · · *· · · ·

Tvoří-li acetaminophen prekursor v GDEPT, podávaný vektor obsahuje gen pro enzym P450⁷’⁸, raději CYP1A2 a cytotoxické činidlo tvořené v rakovinných buňkách je NABQI. Na rozdíl od ostatních cytotoxických činidel způsobuje NABQI malou nebo žádnou toxicitu týkající se tělesné soustavy.

Nádorově specifická genová exprese

Možná by mohlo být očekáváno, že použití acetaminophenu jako prekursoru v GDEPT by bylo nepraktické. Selektivní exprese genu pro enzym CYP1A2 v rakovinných buňkách by mohla být ovlivněna podáváním vektoru obsahujícího tamten gen ve spojení s promotorem, který je citlivý k regulačnímu proteinu nacházejícímu se pouze v rakovinných buňkách. Enzym CYP1A2, vytvořený jako výsledek vstupu tohoto vektoru do buněk, by pak přeměnil acetaminophen na NABQI v rakovinných buňkách a poškodil je nebo je zničil. Jako v běžně GDEPT užívajících prekursorů jiných než acetaminophen by byla selektivita mezi rakovinnými buňkami a normálními buňkami dosažena, protože vstup vektoru do normálních buněk by nezpůsobil expresi CYP1A2 genu obsaženého ve vektoru poněvadž normální buňky neobsahují regulační protein, který aktivuje vybraný promotor pro gen. Obecně by pak normální buňky neobsahovaly enzym CYP1A2 a nebyly by ovlivňovány přítomností acetaminophenu, protože v takových buňkách by nepodléhal intracelulární konverzi na NABQI. Nicméně, jak je zmíněno výše, normální jatemí buňky přirozeně exprimují gen pro CYP1A2. Bylo by proto očekávané, že podávání dávky acetaminophenu dost vysoké pro vytvoření hladiny NABQI v rakovinných buňkách schopné takové buňky zabít, by mohlo mít též za následek tvorbu dostatečného NABQI v normálních jatemích buňkách a zabít je také. Překvapivě to tak není, pravděpodobně v důsledku rozdílu v obsahu glutathionu v normálních jatemích buňkách a buňkách rakovinných. Zdá se, že nejvíc rakovinných buněk může obsahovat jen okolo jedné pětiny glutathionu přítomného v normálních jatemích buňkách. Koncentrace cytotoxického NABQI je proto udržována mnohem níže v normálních jatemích buňkách než v buňkách rakovinných, protože více NABQI může být odstraněno kombinací NABQI s glutathionem v normálních jatemích buňkách než v buňkách rakovinných.

Vektory genové terapie & enzym P450

Vektor používaný v předloženém vynálezu je takový, že obsahuje gen pro enzym P450, raději pro CYP1A2, a promotor, který pracuje jako přepínač pro tento gen a který je citlivý * · · · · ·♦ ·· · 99999999

9 9 9 99 99 · ·· 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 9 99

9 999 9 9 9 99 9 9 k regulačnímu proteinu charakteristickému k typu dané rakoviny. Gen může být odvozený od lidské DNA (Ikeyak et al, Molecular Endocrinology (1989), 3:1399-1408). Nicméně může být výhodné použít gen P450 odvozený od nelidské DNA, například myší DNA nebo křeččí DNA. Enzym P450 vytvořený myším genem je relativně neovlivnitelný určitými sloučeninami, například furafyllinem, který pracuje jako inhibitor formy enzymu CYP1A2 tvořené lidským genem. Podávání takových inhibitorů dělá možným zvyšování dávkování acetaminophenu nad normální bezpečnou dávku; inhibitor jako je furafylin může chránit normální jatemí buňky inhibicí formy P450 generované expresí lidského genu v těchto buňkách, zatím, co mají malý nebo žádný vliv na formu P450 tvořenou expresí myšího genu v rakovinných buňkách. Hladina NABQI v normálních jatemích buňkách je relativně neovlivnitelná inhibitory.

Pokud jde o nevirové podávání, syntetická absorpce DNA do savčích buněk může být ulehčena kondenzací s lipidy, proteiny nebo peptidy. Toto zahrnuje například a není to tím limitováno, polymery, dendrimery a kationaktivní lipidy jako podávači prostředky (např. liposomy).

Liposomy jsou na lipidech založené vezikuly, které obalují vybrané terapeutické činidlo, které je pak vneseno do pacienta. Liposom je vyroben buď z čistého fosfolipidu nebo ze směsi fosfolipidu a fosfoglyceridu. Liposomy mohou být typicky vyráběny s průměry méně než 200 nm, to jim umožňuje být nitrožilně injektovány a být schopny procházet skrz plicní kapilární řečiště. Mimo to, biochemická podstata liposomů jim uděluje propustnost přes membrány krevních cév a tak získat přístup k vybraným tkáním. Liposomy mají relativně krátkou životnost. Byly vyvinuty tak zvané STEALTH^R liposomy, které zahrnují liposomy obalené v polyethylenglykolu (PEG). PEG upravené liposomy významně zvyšovaly životnost, když byly podávány nitrožilně pacientovi. Kromě toho STEALTH^R liposomy vykazují sníženou absorpci v retikuloendotelovém systému a zvyšují hromadění ve vybraných tkáních. Kromě toho byly vyvinuty tak zvané imunoliposomy, které spojují na lipidech založené vezikuly s protilátkou nebo protilátkami pro zvýšení specifity přenosu vektoru DNA do vybrané buňky/tkáně.

Použití liposomů jako prostředků pro přenos je popsáno v US 5 580 575 a US 5 542 935.

Bakterie jako je salmonela by mohly být novým přenašečovým prostředkem. DNA může být též zabalena do mikrostřel a odpálena do jader nebo cílových buněk genovou zbraní.

Přenos DNA

Bylo vyvinuto mnoho metod v průběhu posledních třiceti let k usnadnění vnesení DNA do buněk, které hlavně přispívaly, mimo jiné, našemu porozumění kontrole genové exprese.

···· 0 #0 ♦ · ·· · ··· · · ♦ · · · ·· • · · ♦ ·· · · · • · · · ·· · · · · · • · · ······· • · ··· · · 0· · · · · ·

Běžné způsoby vnesení DNA do buněk jsou v oboru dobře známy a typicky zahrnují použití chemických činidel, kationaktivních lipidů nebo fyzikálních způsobů. Chemické způsoby, které usnadňují absorpci DNA buňkami, zahrnují použití DEAE-dextran (Vaherí, Pagano Science 175: 434). DEAE-dextran je negativně nabitý kation, který spojuje a vnáší DNA do buněk, ale který může způsobovat ztrátu životaschopnosti buněk. Kalcium fosfát je též běžně používaným chemickým Činidlem, které, když je vysráženo společně s DNA, vnáší DNA do buněk (Graham etal Virology (1973) 52: 456).

Použití kationaktivních lipidů (např. liposomů (Felgner (1987) Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 84: 7413) se stalo běžným způsobem, poněvadž nemá stupeň toxicity ukázaný výše popsanými chemickými způsoby. Kationaktivní hlava lipidu se spojuje s negativně nabitým hlavním řetězcem nukleové kyseliny, aby byl vnesen. Komplex lipid/DNA se spojuje s buněčnou membránou a fúzuje s buňkou za vnesení napojené DNA do buňky. Liposomem zprostředkovaný přenos DNA má mnoho výhod před existujícími způsoby. Například buňky, které jsou vzpurné tradičním chemickým způsobům, jsou snáze přístupné přenosu použitím přenosu zprostředkovaného liposomem.

Ještě přesněji, fyzikální způsoby vnesení DNA se staly efektivními prostředky jak DNA opakovatelně přenést do buňky. Přímá mikroinjekce je jedním takovým způsobem, který může přenést DNA přímo do jádra buňky (Capecchi (1980) Cell, 22: 479). Toto dovoluje analýzu jednoduchých buněčných přenašečů. Tak zvané „biolistické“ způsoby fyzicky vstřelují DNA do buněk a/nebo organel použitím částečné zbraně (Neumann (1982) EMBO J, 1: 841). Elektroporace je prokazatelně nejpopulárnějším způsobem přenosu DNA. Způsob zahrnuje použití elektrického náboje vysokého napětí ke krátkodobému zvýšení propustnosti buněčných membrán, tvořících je propustnými k makromolekulárním komplexům. Nicméně fyzikální způsoby přenosu DNA mají za následek významnou ztrátu buněčné životaschopnosti vedoucí k intracelulárnímu poškození. Tyto způsoby proto vyžadují rozsáhlou optimalizaci a také vyžadují drahé vybavení.

Co je zřejmé z výše uvedeného je, že přenos DNA do buněk, buď krátkodobě nebo trvale, je rutinní procedura proveditelná člověkem zkušeným v oboru a je rozsáhle uváděna v akademických publikacích, laboratorních manuálech a encyklopediích. Použily jsme buněčné linie s krátkodobým i trvalým přenesením DNA, abychom analyzovali použití acetaminophenu v GDEPT.

Cílem vynálezu je poskytnout rakovinnou terapii, která snižuje nežádoucí vedlejší účinky běžných léčeb rakoviny.

φφφφ « φφφφ φφ · φφφ φ φφ · φ φφφ φ φ φφφφ φφφ • · φφ φφ φφφ φ φ φφφ φφφφ φφφ φφ φφφ φφ φφ φφ φφφ

Dalším cílem vynálezu je poskytnout genovou terapii, která je založena na léčbě rakoviny, a která zasahuje rakovinné buňky.

Z prvního hlediska vynálezu je zde poskytována rakovinná terapie obsahující:

i. podávání účinného množství alespoň jednoho vektoru schopného přenosu DNA do alespoň jedné nádorové buňky savce charakterizované tak, že daný vektor zahrnuje alespoň jeden gen P450 nebo jeho účinnou část, expresi, která je řízena promotorovou sekvencí, nebo její účinnou částí, která vykazuje v podstatě specifickou expresi v nádorové buňce; a ii. podávání terapeuticky účinného množství alespoň acetaminophenu, nebo jeho strukturálně odvozeného derivátu.

V upřednostňovaném způsobu vynálezu je savec člověk.

V dalším upřednostňovaném způsobu vynálezu je vektor vektor exprese běžně přizpůsobený pro eukaryotní expresi.

Typické přizpůsobení zahrnuje, například a není to tím limitováno, zajištění sekvencí kontroly transkripce (sekvence promotoru), které zprostředkovávají buněčnou/tkáňovou specifickou expresi. Tyto promotorové sekvence mohou být buněčně/tkáňově specifické, induktivní nebo konstitutivní.

Promotor je termín uznávaný v oboru a pro objasnění zahrnuje následující rysy, které jsou poskytovány pouze například a není to tím limitováno. Prvky zesilovače transkripce jsou cis působící sekvence nukleové kyseliny často zahájené 5' pro iniciační místo transkripce genu (zesilovače transkripce mohou být také zahájeny 3' ke genové sekvenci nebo dokonce umístěny v intronních sekvencích). Funkce zesilovačů transkripce pro zvýšení rychlosti transkripce genu, ke kterému je zesilovač transkripce vázán. Aktivita zesilovače transkripce je citlivá k trans působícím transkripčním faktorům (polypeptidům), které byly ukázány, aby se vázaly specificky k prvkům zesilovače transkripce. Vaznost/aktivita transkripčních faktorů (prosím, viz Eukaryotic Transcription Factors, David S Latchman, Academie Press Ltd, San Diego) je citlivá k množství vnějších vlivů, které zahrnují, například a není to tím limitováno, intermediální metabolity (např. glukóza, lipidy) nebo vnější efektory (např. světlo, teplo).

Prvky promotoru také zahrnují tak zvané TATA-boxy a sekvence iniciačního místa RNA polymerasy (RIS), které fungují k vybrání místa iniciace transkripce. Tyto sekvence váží také polypeptidy, které fungují, mimo jiné, pro podpoření výběru iniciace transkripce RNA polymerasou.

·* ti*

Přizpůsobení také zahrnují vybavení volitelnými indikátory a autonomními replikačními sekvencemi, které obě napomáhají uchování daného vektoru buď veukaryotní buňce nebo v buňce prokaryotní.

Kromě toho přizpůsobení, která napomáhají expresi vektoru, kódují geny včetně vybavení pro transkripční terminační/polyadenylační sekvence. Toto také zahrnuje vybavení pro vnitřní lokalizace ribozomálního vstupu (IRES), která fungují pro maximalizaci exprese vektoru kódujícího geny uspořádané v bicistronických nebo multicistronických expresních kazetách.

Tato přizpůsobení jsou v oboru dobře známá. Existuje významné množství publikované literatury s ohledem na stavbu expresního vektoru. Prosím, viz, Sambrook et al (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, Cold Spring Harbour, NY a jejich odkazy; Marston, F (1987) DNA Cloning Techniques: A Practical Approach Vol IIIIRL Press, Oxford UK.

V dalších upřednostňovaných způsobech vynálezu je vektor vektorem na bázi viru. Ideální virový vektor je vybraný z následujícího: adeno virus; retro virus; adenoodvozené viry; herpesvirus; lentivirus; bakulovirus.

Vektory na bázi viru mohou podle vynálezu také zahrnovat hybridní virové vektory, které zahrnují výhodné rysy vybraných virů, které napomáhají, například a není to tím limitováno, virové nakažlivosti, replikaci nebo expresi genů nesoucích hybridní vektor.

V ještě dalších upřednostňovaných způsobech vynálezu je sekvence promotoru raději vybrána z alespoň jedné z následujících: TRP-1; HER2; HER3; ERBB2; ERBB3; CEA; MUC-1; α-fetoprotein; dlouhá koncová repetice Rousova viru zhoubného nádoru pojivových tkání; promotor cytomegaloviru; dlouhá koncová repetice myší leukémie; 40 počátečních a koncových promotorů opičího viru; promotor thymidinkinasy virů oparu prostého; promotor specifického antigenu předstojné žlázy (PSA); promotor vilin genu; promotor amylasy slinivky břišní; promotor peptidu příslušejícího tyrosinase; promotory prekursoru antigenu nádorového odloučení.

V již dalším upřednostňovaném způsobu vynálezu je P450 nelidského původu. Ideálně je gen P450 odvozen od hlodavců. Ještě ideálněji je hlodavčí gen P450 vybrán ze shodných hlodavčích genů kódujících CYP1A2; CYP 2E1; nebo CYP 3A4.

GDEPT, který používá hlodavčí shodné skupiny P450 jsou výhodné, poněvadž inhibitory lidského CYP1A2, například furafylin, mohou být používány v kombinaci s acetaminophenem. Jak bylo poznamenáno dříve je hlodavčí shodná skupina rezistentní k tomuto inhibitoru na rozdíl od lidské formy enzymu. To by mohlo pak umožnit použití zvýšených hladin acetaminophenu, poněvadž by se netvořilo toxické množství NABQI v játrech.

4444 4 44 4444 • 44 4 4 4 4 4 44 • 4 4 4 44 ··

4 4444 44

444 44 44 444

Podávání vektoru savcům podle vynálezu je běžnými technikami. Typicky to zahrnuje, například a není to tím limitováno, nitrožilní, nitrosvalové nebo nitropobřišnicové injekce, nebo přímé injekce do nádorové tkáně.

V ještě dalším upřednostňovaném způsobu vynálezu je nádorová buňka vybrána z alespoň jedné z následujících rakovin: rakovina prsu, slinivky břišní, vaječníků, děložního hrdla, plic, jater, sítnice, ledvin, varlat, předstojné žlázy, trávicího traktu, gliom, nádor tvořený z pigmentových buněk, rakovina močového měchýře, lymfom, leukemie, rakovina epitelu, rakovina výstelky břišní dutiny.

V ještě dalším upřednostňovaném způsobu vynálezu je poskytováno použití acetaminophenu ve výrobě léků pro léčbu rakoviny.

Podle dalších hledisek vynálezu je zde poskytována rakovinová terapie obsahující:

i. podávání účinného množství alespoň jednoho vektoru schopného přenosu DNA do alespoň jedné nádorové buňky savce charakterizované tak, že daný vektor zahrnuje alespoň jeden gen P450 nebo jeho účinnou část, expresi, která je řízena promotorovou sekvencí, nebo její účinnou částí, která vykazuje v podstatě specifickou expresi v nádorové buňce;

ii. podávání účinného množství alespoň jednoho činidla schopného regulace množství glutathionu v savci; a iii. podávání terapeuticky účinného množství acetaminophenu, nebo jeho strukturálně odvozeného derivátu.

Činidla schopná zvýšit glutathion v játrech jsou v oboru velmi dobře známá a zahrnují, například a není to tím limitováno, methionin a acetylcystein.

Nyní bude popsáno ztvárnění vynálezu, pouze například, a s odkazy na následující tabulky a obrázky.

Tabulka 1 reprezentuje vedlejší účinek na životaschopnost tvořený inkubací H1A2 MZ buněk (s trvalým přenesením lidského CYP1A2) s různými buněčnými liniemi za přítomnosti acetaminophenu. Nádorové buňky nebo V79 MZ buňky (buňky slinivky břišní bez přenosu), byly kultivovány přes noc spolu s různými směsmi H1A2 MZ buněk (jak je zachyceno v tabulce), promyty s PBS a inkubovány s 4 mM acetaminophenem v PBS po 6 hodin při 37 °C, buňky byly pak promyty jednou s PBS a uchovány buď po 24 nebo po 48 hodin v kultivačním médiu odpovídajícím každému buněčnému typu, jak je detailně popsáno v metodické části. V 0, 6, 24 nebo 48 hodinách byly buňky promyty v PBS a životaschopnost populace směsi buněk byla stanovena vyloučením trypanové modře. Ukazované údaje jsou průměrnými hodnotami ± SEM ze 4 oddělených stanovení. Statistická významnost byla stanovena v každém časovém bodu ·«·· ·

9

9

999

99

9999 •4

999 srovnáváním měření životaschopnosti u populací směsí buněk s životaschopností stanovenou v 0 hodinách a v nepřítomnosti H1A2 MZ buněk ve směsi 2x2 kontingentačních tabulek požívajících 2-dílný Chi-čtvercový (Chi-squared) test s Yate korekcí. Životaschopnost byla stanovena u celkem 1500 buněk v každém časovém bodě. Hladiny významnosti jsou určeny jako **p<0,001; ***p<0,0001;

PŘEHLED OBRÁZKŮ NA VÝKRESECH

Obrázek 1 je grafickým znázorněním titrace acetaminophenu ukazující citlivost COS buněk s krátkodobým přenosem vektoru vbudovaného myšího CYP1A2 a kontrolních COS buněk bez přenosu. Buněčná životaschopnost je měřena zabudováním titrovaného thymidinu.

Obrázek 2 je časový průběh buněčné životaschopnosti COS buněk s krátkodobým přenosem myšího CYP1A2 a kontrolních COS buněk bez přenosu po 24 hodinové periodě. Koncentrace acetaminophenu je 10 mM. Buněčná životaschopnost je měřena zabudováním titrovaného thymidinu;

Obrázek 3 znázorňuje účinek acetaminophenu na životaschopnost buněk V79 MZ a H1A2 MZ s trvalým přenosem. V79 MZ buňky (tečkované sloupce) a H1A2 MZ buňky (vyplněné sloupce) byly ponechány tak, aby přilnuly ke komůrkám destiček tkáňové kultury přes noc, promyty PBS a pak inkubovány s různými koncentracemi acetaminophenu po 6 hodin při 37 °C. Životaschopnost byla stanovena podle schopnosti buněk vylučovat trypanovou modř. Údaje jsou znázorněny jako průměrná hodnota ± SEM ze 4 oddělených stanovení a analyzován srovnáváním životaschopnosti u buněk H1A2 MZ s buňkami V79 MZ při každé koncentraci acetaminophenu použitím 2-dílného nepárového Studentova t-testu. Hladiny významnosti jsou určeny jako *p<0,01; ***p<0,0001;

Obrázek 4 znázorňuje vedlejší účinek na životaschopnost vytvořený inkubováním acetaminophen-aktivovaných H1A2 MZ buněk s trvalým přenosem s buňkami slinivky břišní V79 MZ bez přenosu. V79 MZ buňky byly společně kultivovány přes noc se směsmi buněk H1A2 MZ, promyty PBS a pak inkubovány s 4 mM acetaminophenem po 6 hodin při 37 °C. Buňky byly pak promyty v PBS a životaschopnost populace směsné buněčné populace byla stanovena vyloučením trypanové modře. Kultury obsahující V79 MZ buňky (prázdné čtverce) a V79 MZ buňky smíchané s 5 % (plné čtverce), 10 % (prázdné trojúhelníky), 25 % (prázdné kroužky) a 50 % (vyplněné kroužky) H1A2 MZ buněk. Kromě toho je ukázána životaschopnost H1A2 MZ buněk v přítomnosti (křížky) a nepřítomnosti (vyplněné trojúhelníky) ··♦· • ·

·♦ · · • · ·· 9 • · ·

99

9

9 acetaminophenu. Údaje jsou znázorněny jako průměrná hodnota ± SEM ze 4 oddělených stanovení. Statistická analýza údajů v časovém bodě 6 h je předložena v tabulce 1.

Obrázek 5 znázorňuje postup klonování pro vytvoření expresního vektoru používaného v experimentech s krátkodobým přenosem; a

Obrázek 6 je sekvence DNA z vektoru pEFPčlánku 6.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

Příklad 1: Techniky rekombinace DNA

CYP1A2 cDNA je klonován ve směru 544 bp fragmentu blízkého 5' přilehlé oblasti lidského genu ERBB2 vpBluescript II SK+ a pak je chimérický minigen (ERBB2 promotor-CYPlA2 cDNA) nakloňován do různých eukaryotních expresních vektorů zahrnujících:

a) plasmid pPolyA (založený na běžném vektoru pcDNA [InVitrogen], ze kterého byl vyříznut CMV promotor). Přenos DNA je upřednostňován použitím plasmidu DNA v přítomnosti kationaktivních liposomálních komplexů, buď běžně získaných činidel, takových jako Lipofektin (Life Technologies) nebo nových experimentálních činidel (Genzyme). Za účelem zahrnutí výběru geneticky transformovaných klonů je ERBB2-CYP1A2 plasmid spolupřenesen v molárním poměru 9:1 s pSV2neo, který kóduje rezistenci ke geneticinu.

b) dvojitá kopie retroviru N2A, která umožňuje podmíněnou expresi inzertu vně transkripční jednotky řízenou dlouhou koncovou repeticí retrovirálního promotoru. Amfotropní retrovirální výchozí materiál je produkován balením viru v GP+env AM12 buňkách.

c) adeno-spojený virový vektor psub 201, který když je přenesen do expresních buněk adenoviru společně s pAAV/Ad, vede k produkci rekombinantního AW, který umožňuje podmíněnou expresi inzertu v cílových buňkách.

Cílové buňky jsou v tomto příkladě linie buněk lidské rakoviny prsu a slinivky břišní, které buď překonají expresi ERBB2 kvůli vyšší regulaci transkripce nebo exprimují normální (nedetekovatelné) hladiny.

Φ4ΦΦ · 44 44 ·4 ··· Φ 4 » φ Φ Φ φ

Φ Φ Φ 4 ΦΦ Φ 4

ΦΦΦ ΦΦΦΦΦΦΦ

ΦΦ 044 ΦΦ ΦΦ ΦΦ Φ4Φ

Příklad 2: Stavba vektoru pro krátkodobý buněčný přenos

Shrnutí postupu klonování je umístěno na obrázku 5. Stručně byly zachyceny následující kroky. CYP1A2 byl klonován z pCR^(TM)Bac (Invitrogeri) štěpením restrikčními enzymy EcoRl a BamHl. Tento fragment byl klonován do pEFPčlánku 6 štěpeného EcoRl/BamHl, který je odvozen od pEFPčlánku 2 (Marais et al (1995) EMBO J 14: 3136-3145). pEFPčlánek 6 je přeměněný selektivním přesunem restrikčních míst a zajištěním víceúčelovějšího mnohonásobného klonovacího místa. Sekvence pEFPčlánku 6 je dána na obrázku 4.

Klonovaný CYP1A2 gen byl sekvenován, aby byla potvrzena jeho shodnost s publikovanou CYP1A2 sekvencí. Vektor obsahující CYP1A2 gen se nazývá pEF+cyp+.

Nekódující 5’ a 3’ sekvence byly pak odstraněny, aby byla vytvořena restrikční místa, která napomáhají klonování CYP1A2 do eukaryotního expresního vektoru. CYP1A2 byl rozvíjen PCR a štěpen s Clal a Srna 1 a klonovaným pozadím do pEF+cyp+, aby byl nahrazen původní CYP1A2 gen. Toto odstraňuje mnoho z 3’ oblasti, kde neproběhla translace. Tento vektor je nazýván pEF+cyp. 5’ vedoucí sekvence byla smazána následující cestou. Specifické primery sekvence byly použity k rozvinutí CYP1A2 z pEF+Pčlánku+ a vytvoření Nco 1 místa. Je výhodnější použít ATG iniciační kodón v Nco 1 místě k zajištění účinné iniciace translace CYP1A2. Rozvinutý fragment byl štěpen sNco 1 a Hindin a klonován do pEFPčlánkuó. Tento vektor byl sekvenován pro potvrzení jeho klonování. pEFPčlánek byl štěpen s Nco 1 a HindlII a klonován do pEF+cyp. Tento vektor byl nazýván pEFcyplA2.

Tato modifikovaná CYPA12 cDNA byla pak klonována do eukaryotního expresního vektoru pMCEF, který je odvozen od pEFPčlánku2 a obsahuje NeoR gen umožňující výběr v G418. Exprese modifikované CYPA12 cDNA je pod kontrolou elongačního faktoru la promotoru, (Marais et al Cancer Research (1996) 56: 4735-42). Toto bylo provedeno štěpením pEFcypA2 pomocí Ncol a Spe 1 a klonováním fragmentu obsahujícího modifikovaný CYP1A2 do pMCEF pro vytvoření expresního vektoru pMCEFcyplA2.

pMCEFcyplA2 včleněného myšího CYP1A2 byl použit v experimentech krátkodobého přenosu popsaných níže.

Příklad 3: Krátkodobý přenos do buňky používající LipofectAMINE

LipofectAMINE (LPA) (Gibco BRL UK) je lipidové činidlo, které přenáší DNA do buněk a bylo dokázáno,že je velmi úspěšné pro buňky s krátkodobým přenosem. Zjistili jsme, že můžeme dosáhnout přenosových frekvencí přibližně 50 % (závisející na buněčné linii a stavbě ···· « ·· ·* ·· • ♦· · · · · ··· • · · · ·· · 9 • · · ♦ · 9 9 9 9 · • ♦ ♦ ····«» ·♦ 999 99 99 99 9

DNA). Toto je s velkou oblibou srovnatelné s DEAE-dextran přenosem, který může dosáhnout pouze průměrně 0,5 až 2,5 % účinnosti. Odhadujeme, že LPA má za následek pouze5 % mrtvých buněk v porovnání s 50 % mrtvých buněk, když je používán DEAE-dextran.

COS buňky jsou pokládány 1,5 x 10⁵ na komůrku v 6 komůrkové nádobě na tkáňovou kulturu večer před přenosem. Buňky jsou ponechány, aby rostly přes noc v Dulbecco-Vogtově modifikovaném červenavě žlutém médiu (DMEM) doplněném s 10 % plodovým telecím sérem, 2 mM L-glutaminem, penicilinem (100 U/ml) a streptomycinem (100 pg/ml). Všechna činidla tkáňové kultury mohou být získána z Gibco BRL, Paisley, UK.

LPA/DNA komplexy jsou připraveny v souladu s výrobními pokyny. Stručně jsou provedeny následující kroky. V den experimentu přenosu jsou připraveny roztoky vektoru DNA v PBSA (0,4 g KC1; 8,0 g NaCl; 0,2 g KH2PO4; 1,15 g Na₂HPO₄ na litr) obsahující 0,5 hmotn. % albuminu. Je důležité nepoužívat polypropylenové reakční zkumavky jinak se LPA/DNA komplex přichytí k plastu.

Vektor DNA je připraven v množství 0,4 až 0,6 pg najeden přenos v 16 μΐ PBSA. Typicky je výchozí materiál vektoru DNA připravován v množství 0,025 pg/ml v PBSA pro použití v experimentech přenosu. V experimentech, kde je používáno více než jeden vektor, je obvyklé používat tu samou koncentraci DNA a souhlasně nastavený objem. Poznámka, že když jsou používány mnohonásobné vektory, je důležité smíchat vektory před přídavkem LPA.

Typicky, když jsou připravovány LPA/DNA komplexy, čtverce průměrně 1 cm x 1 cm jsou vyznačeny na dno petriho misky v souladu s počtem prováděných přenosů. 10 až 12 μΐ PBSA je umístěno do středu každého vyznačeného čtverce, do kterého je přidáno 4 až 6 μΐ LPA, aby byl získán celkový objem 14 až 16 μΐ. Ktéto reakční směsi je přidáno 16μ1 výchozího materiálu vektoru DNA a LPA/DNA komplex je řádně míchán pasážováním skrz špičku mikropipety nasáváním a vystřikováním reakční směsi 6 až 8 krát. Reakční směs je poté nechána v uzavřené Petriho misce po průměrně 15 minut.

Během této inkubační doby jsou buňky, u kterých bude prováděn přenos, promyty médiem prostým séra a pak je 800 μΐ média prostého séra přidáno před přidáním komplexu LPA/DNA.

K LPA/DNA komplexu je přidáno 200 μΐ média prostého séra ke každému LPA/DNA vzorku, který je pak jemně přidán k buňkám po dobu 3 až 4 sekund. Buňky jsou vráceny do CO₂ inkubátoru při 37 °C po 6 hodin. Buňky jsou promyty dvakrát v médiu a ke kultuře je přidáno 2,5 ml čerstvého média. Kultury mohou být pak analyzovány v jakémkoli čase, aby byla sledována transgenní exprese.

Výše popsaný způsob poskytuje spolehlivou, vysokou úroveň exprese transgenů nesených vektorem DNA. Způsob je snadno proveditelný člověkem zkušeném v oboru.

·♦·· 9 99 99 99

99 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 99 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9 •99 9 9 9 9 9 9

999 99 99 99 9

Příklad 4: Westernový přenos

Hladina exprese CYP1A2 je měřena analýzou westernového přenosu odbourávajícího antipeptidové protilátky popsané v literatuře (Edwards RJ et al, Biochem Pharmacol 1993; 46: 213-220 aMurray BP et al, Carcinogenesis 1993; 14 : 585-592). Tyto protilátky váží specificky CYP1A2 v mikrozomální části lidských jater. Kromě toho byla u jedné z těchto protilátek ukázáno, že váže snadněji CYP1A2 exprimovaný v lidské B lymfoblastoidní buněčné linii, ve které proběhl přenos pomocí plasmidového vektoru exprimujícího lidský CYP1A2. V těchto buňkách byla hladina exprese lidské CYP1A2 podobná té, která byla nalezena v lidských játrech, tj. 8 pmol na mg proteinu (Edwards RJ et al, Carcinogenesis 1994; 15: 829-836). Mikrozomální frakce jsou připravovány z nádorových buněk s přeneseným lidským CYP1A2, nebo z buněk s přeneseným nepříbuzným genem, např. cytosindeaminasa, v těch samých vektorech. Promyté buňky jsou rozbity použitím Douncova homogenizátoru a mikrozomální frakce připravena ultracentrifugací a uchována zmrazená při -80 °C. Westernový přenos mikrozomálních frakcí je prováděn tak, jak je popsáno dříve (Boobis AR et al, Br J Clin Pharmacol 1980; 9: 11-19) za užití rozšířené chemiluminiscence ke zvýšení citlivosti.

Příklad 5: Biochemická aktivita CYP1A2

Kromě toho je funkční aktivita exprimovaného lidského CYP1A2 stanovena v nádorových buňkách měřením rychlosti O-deethylace fenacetinu. Při odpovídající koncentraci substrátu (4 μΜ) je tato reakce specificky katalyzována CYP1A2 v mikrozomální frakci lidských jater. Mikrozomální frakce nádorové buňky, připravené jak je popsáno výše, jsou inkubovány při 37 °C v přítomnosti NADPH a produkce acetaminophenu je stanovena pomocí plynové chromatografie/negativní iontové chemické ionizační hmotnostní spektrometrie používající deuterovaný acetaminophen jako interní standard. Toto vysoce citlivé stanovení lehce měří aktivitu CYAP1A2 v malých množstvích (< 10 pg) mikrozomálních frakcí lidských jater, které mají typickou aktivitu 70 pmol/min./mg proteinu.

Příklad 6: Buněčná životaschopnost

Byly použity dva způsoby pro sledování buněčné životaschopnosti; vyloučení trypanové modři životaschopnými buňkami a následné počítání buněk; a včlenění tritiovaného thymidinu jako měření syntézy DNA.

9999 ♦ ·· 99 99

99 9 9 9 9 9 · 9 9*9 · • * 9 9 9 9 9 9 9 • · · 9999 99 9

999 99 99 99 999

Příklad 7: Vyloučení trypanové modři

Pro experimenty buněčné životaschopnosti bylo 200 000 buněk na komůrku naneseno na destiček s komůrkami (Beckton-Dickenson, Oxford, UK),za použití média a podmínek vyžadovaných linií nádorových buněk a ponechání, aby se přes noc přichytily. Potom byly buňky promyty s PBS před přídavkem acetaminophenu v 0,1 ml PBS (koncentrace 0,1 až 20 mM acetaminophenu byly rozpuštěny v PBS pomocí ultrazvuku) a pak uchovány při 37 °C. V odpovídajících časových bodech byly buňky odstraněny z destiček pomocí trypsinisace a sebrány odstředěním. Buněčné životaschopnost byla měřena jako schopnost vylučovat trypanovou modř. Buňky byly sečteny při 100 násobném zvětšení použitím vylepšeného Neubauerova přístroje na měření množství krevních tělísek; všechny součty buněk jsou průměrem paralelních stanovení pěti polí z paralelních experimentů.

Příklad 8: Včlenění ³H-thymidinu jako měření buněčného dělení

COS buňky s přenosem jsou buď vystaveny různým koncentracím acetaminophenu nebo inkubovány v přítomnosti 10 mM acetaminophenu a buněčná životaschopnost je sledována s časem. ³H-thymidin (Amersham Intemational UK, 1000 Ci/mmol, 5 pCi na stanovení), je přidán, aby účinkoval a kontrolní kultury a poměrné části odstraněny a kyselinou srazitelné počty posouzeny kapalným scintilátorem používajícím Becktonův tekutý scintilační počítač.

Příklad 9: Spotřebování glutathionu

Obsah intracelulárního glutathionu, obsahující redukované a oxidované formy glutathionu, je měřen použitím kinetického stanovení, ve kterém glutathion v přítomnosti glutathionreduktasy katalyzuje pokračující redukci 5,5’-dithio-bis(2-nitrobenzoové) kyseliny pomocí NADPH. Rychlost reakce je přímo úměrná koncentraci glutathionu. Reakce je sledována při 412 nm a kvantifikována srovnáním se standardy.

Příklad 10: Měření [¹⁴C] acetaminophenu

Po vystavení radioaktivnímu acetaminophenu následuje kovalentní vazba radioaktivity na buněčný protein. Buňky jsou inkubovány po 90 minut s [¹⁴C] acetaminophenem. Po promytí je buněčný protein vysrážen s trichloroctovou kyselinou a sraženina dobře promyta s 80%

9999 • 99 ·· 9* 9 ♦ ·* · 9 · · 99 99 • 9 9 9 «♦ 9 9 9

999 99 999 9 9 •9 9 9999 99 9

999 99 99 99 999 methanolem, aby byla odstraněna nenavázaná radioaktivita. Proteinová peleta je štěpena v hydroxidu sodném, neutralizována a vázaná radioaktivita měřena scintilační spektroskopií.

Příklad 11: Buněčné kultura buněčných linií s trvalým přenosem

Buňky V79 MZ čínského křečka byly uchovány v Dulbecco-Vogtově modifikovaném červenavě žlutém médiu (DMEM) doplněném s 10 % plodovým telecím sérem (9FCS), 2 mM L-glutaminem, penicilinem (100 U/ml) a streptomyčinem (100 pg/ml) (všechna činidla tkáňové kultury byla získána z Gibco BRL, Paisley, UK). H1A2 MZ buňky, které jsou buňkami V79 MZ s přeneseným lidským genem CYP1A2⁹, byly též uchovány v doplněném DMEM s přídavkem geneticinu o koncentraci 4 mg/ml. SK-OV-3 buňky byly kultivovány v DMEM doplněném s 15 % FCS a 2 mM L-glutaminem, bez přídavku antibiotik. RPMI-1640 médium s 10 % FCS, 2 mM L-glutaminem, penicilinem (100 U/ml) a streptomycinem (100 pg/ml) bylo požadováno buňkami HCT116. Tyto buněčné linie byly uchovány při 37 °C ve 100 % vlhkosti a 5 % CO2. MDA-MB-361 buňky byly kultivovány v Leibovitzově (L-15) médiu doplněném s 15 % FCS a 2 mM L-glutaminem a byly uchovány při 37 °C ve 100 % vlhkosti a nebyl požadován CO2. Souhrnně byly buňky odstraněny z baněk tkáňových kultur inkubací s trypsin-EDTA po 5 minut, zředěny 1:3 až 1:6 v čerstvém médiu a vsazeny do čistých baněk. Linie nádorových buněk byly získány z Evropské sbírky buněčných kultur.

Příklad 12: Buňky H1A2 MZ s trvalým přenosem

Exprese lidského CYP1A2 v těchto buňkách byla ověřena měřením aktivit 7-ethoxyrezorufin-G-deethylasy a 7-methoxyrezorufinu-O-deethylasy na proteinové frakci prosté cytozolu jak je popsáno dříve⁹. Příslušné získané hodnoty 5,4 ± 0,1 a 12,1 ± 0,2 pmol/min./mg proteinu (n=6) jsou podobné těm uvedeným dříve, tj. 6,5 a 12,8 pmol/min./mg proteinu⁹ a žádná aktivita nebyla pozorována v V79 MZ buňkách slinivky břišní.. Kromě toho byla exprese lidského CYP1A2 v proteinové frakci prosté cytozolu H1A2 MZ buněk, ale ne V79 MZ buněk, také prokázána westernovým přenosem používajícím protilátku specifickou pro tento P450 enzym¹⁰ (údaje nejsou uvedeny).

• 9«·	9		49	• 9		v
	*9	9	9	• ·	• ·	• *
•	•	•	•	• 9	9 ·	•
• 9	•	•	«	• ·	• a	•
··	···		• ·	9»	»9	«1

Výsledky

Ukázali jsme, že krátkodobý přenos u COS buněk používající LP A s vektorem nesoucím CYP1A2 řízeným promotorem, který ukazuje zvýšenou expresi v nádorových buňkách, je schopen zcitlivění buňky k terapeuticky důležitým koncentracím acetaminophenu.

Obrázek 1 ukazuje titraci acetaminophenu srovnávající COS buňky s přenosem s kontrolními COS buňkami bez přenosu. U buněk byl proveden přenos a byly ponechány regeneraci a exprimovány CYP1A2 po 48 hodin. Ačkoli linie buněk slinivky břišní bez přenosu ukazují nějakou citlivost k acetaminophenu, jak bylo měřeno titraci za včlenění thymidinu, buňky s přenosem ukazují významný vzrůst v citlivosti. Zdánlivá citlivost kontrolních buněk k acetaminophenu může být přisouzena faktu, že COS buňky obsahují významné množství aktivity P450, která má za následek produkci NABQI v přítomnosti acetaminophenu. Nicméně vzrůstem základních hladin P450 přenosem sCYPlA2 je ukázáno, že podávání menšího množství acetaminophenu má za následek snižování buněčné životaschopnosti pro ekvivalentní množství acetaminophenu, prosím viz obrázek 1, 4 mM koncentrace acetaminophenu.

Obrázek 2 ukazuje časový průběh buněčné životaschopnosti COS buněk v citlivosti k 10 mM acetaminophenu. U COS buněk byl proveden přenos a byly srovnány s kontrolními COS buňkami bez přenosu po 24 hodinové periodě. Rozsah citlivosti k acetaminophenu vzrůstá významně během prvních 4 až 8 hodin. Toto je v souladu s expresí CYP1A2 jak bylo sledováno westernovým přenosem, údaje nejsou uvedeny. Citlivost COS buněk s krátkodobým přenosem je pravděpodobně nedoceněním toho, co může být dosaženo u stabilních buněčných linií exprimujících CYP1A2 nebo in vivo u transgenních živočišných modelů, poněvadž vektor DNA je citlivý ke štěpení nukleasou, což má za následek postupný pokles v teoretické citlivosti. To není ovšem ukázáno kontrolními buňkami, poněvadž pokles v buněčné životaschopnosti je výsledkem endogenní exprese P450, která pokračuje.

Tyto výsledky svědčí o tom, že COS buňky s krátkodobým přenosem mohou být učiněny citlivými k aceaminophenu expresí vektoru nesoucího gen kódující CYP1A2. Tyto výsledky jsou potvrzeny produkováním buněčných linií s trvalým přenosem CYP1A2, který je popsán níže.

Inkubování H1A2 MZ buněk, které trvale exprimují CYP1A2, v rozsahu koncentrací acetaminophenu (0,1 až 20 mM) po 6 hodin umožňuje stanovení cytotoxických koncentrací (obr. 1). V nepřítomnosti acetaminophenu nebo v 0,1 mM acetaminophenu nebyla pozorována žádná cytotoxicita. Nicméně po vystavení vlivu 1 mM acetaminophenu poklesla životaschopnost na 62 %. Inkubace s 4 mM acetaminophenem měla za následek další pokles životaschopnosti na 8 %. Vyšší koncentrace acetaminophenu měly za následek podobné množství zabitých buněk

···»	•	··	• 4
•	··	• ·	• ·	• ·	99
•		• ·	··	• ·
• ·	•	• ·	♦ ♦	« 9
··	···		··	99	99

(obr. 3). Na rozdíl od toho, inkubace V79 MZ buněk, kteiým chybí CYP1A2, s acetaminophenem neměla za následek žádnou ztrátu buněčné životaschopnosti (obr. 3). Proto byl 4 mM acetaminophen minimální dávkou dávající maximální účinek, tato koncentrace byla vybrána pro další experimenty.

Pro stanovení, měl-li toxický metabolit, tvořený CYP1A2, cytotoxický účinek na okolní buňky neschopné aktivování acetaminophenu, byly H1A2 buňky smíchány s V79 MZ buňkami před vystavením vlivu 4 mM acetaminophenu. Percentuální pokles v celkové buněčné životaschopnosti značně převyšuje procentuální zastoupení acetaminophen aktivujících buněk ve směsi ukazující významný vedlejší účinek (obr. 4). V přítomnosti 5 % H1A2 MZ buněk poklesla životaschopnost směsné buněčné populace na 52 % a jak se zvyšoval poměr H1A2 MZ buněk, klesal počet životaschopných buněk ve směsi (obr. 4, tab. 1) a blízký maximální účinek byl nalezen se směsí stejného počtu V79 MZ a H1A2 MZ buněk (obr. 4). Na rozdíl od toho nebyl pozorován žádný pokles v buněčné životaschopnosti v V79 MZ buňkách inkubovaných v 4 mM aceaminophenu nebo H1A2 MZ buňkách inkubovaných ve fyziologickém roztoku tlumeném fosfátem (PBS) bez aceaminophenu (obr. 4, tab. 1).

Citlivost buněk, odvozených od nádorových, k cytotoxicitě tvořené aktivací acetaminophenu byla ověřena smícháním H1A2 MZ buněk s SK-OV-3, HCT116 a MDA-MB-361 buňkami a jejich inkubováním v přítomnosti 4 mM acetaminophenu po 6 hodin. Bylo nalezeno, že jako V79 MZ buňky, SK-OV-3 buňky byly vysoce citlivé tak, že jak životaschopnost postupně klesala tak podíl H1A2 MZ buněk vzrůstal (tab. 1). HCT116 buňky ukazovaly nepřiměřený pokles v životaschopnosti, když byly inkubovány s5alO%HlA2 MZ buňkami, ačkoli s 50 % H1A2 MZ buňkami mohlo být množství zabitých buněk vysvětleno ztrátou samotných H1A2 MZ buněk (tab. 1). Nicméně MDA-MB-361 buňky se jeví býti vysoce rezistentní k cytotoxicitě zatímco pokles v buněčné životaschopnosti byl podobný podílu přítomných H1A2 MZ buněk (tab. 1).

Pro stanovení, byly-li zbylé životaschopné buňky naprogramovány na smrt, jak jsme nalezli dříve¹¹, byly pokusy prováděny s kulturou různých buněčných typů v normálním růstovém médiu po tom, co byly vystaveny vlivu acetaminophenu po 6 hodin v přítomnosti aktivujících H1A2 MZ buněk. Bylo nalezeno, že po 24 hodinách v kultuře spadla životaschopnost V79 MZ, SK-OV-3 a HCT116 buněk smíchaných stak málo jako 5 % H1A2 MZ buňkami na nulu (tab. 1). Jenom MDA-MB-361 buňky vykazovaly rezistenci k buněčnému zabíjení, ačkoliv stejně s těmito buňkami poklesla životaschopnost na 18% v kulturách obsahujících stejný počet MDA-MB-361 a H1A2 MZ buněk a žádné životaschopné buňky nebyly nalezeny po 48 hodinách (tab. 1). Přesto s přítomností menšího množství H1A2 MZ ··· · ·· · · ·· • · 4 4 44 4 4'

4 44 44 444 4

4 4444 44

444 44 44 44 4 rozsáhle vzrůstat u všech druhů přednostním spotřebováním GSH chemikáliemi takovými jako je diethylmaleát¹⁴. Tak je toxicita acetaminophenu závislá na rovnováze mezi aktivitou NABQI tvořícího enzymu a koncentrací GSH.

GSH koncentrace v nádorech prsu (913 nmol/g tkáně) jsou dvakrát větší v normální prsní tkáni¹⁵, ale jsou méně než 20 % z těch, které jsou nalezeny v normálních lidských játrech (5000 nmol/g tkáně). Tedy jestliže mohou být nádorové buňky tvořeny, aby exprimovali NABQI-produkční aktivitu podobnou lidským játrům, tak by měly terapeutické dávky acetaminophenu být selektivně cytotoxické k nádorovým buňkám. Kromě toho bude možné selektivně chránit játra od jakýchkoli toxických efektů acetaminophenu orálním podáváním GSH prekursorů takových jako je methionin nebo 7V-acetylcystein¹⁶, které zvyšují GSH v játrech, ale ne v ostatních tkáních¹⁷.

Může být možné zvýšit účinnost enzym aktivujícího systému nahrazením lidského CYP1A2 jiným P450 enzymem s vyšší kapacitou pro aktivaci acetaminophenu. Ačkoli lidský CYP2E1 a CYP3A4 jsou známy jako katalyzátory této reakce⁷, rychlosti vztahující se k CYP1A2 při vysokých koncentracích acetaminophenu mají být ještě stanoveny. Nebo jinak, orthologní hlodavci formy CYP1A2, CYP2E1 nebo CYP3A4 mohou poskytovat zdroj účinnějšího enzymu.

Literatura

1. Connors TA. The choice of prodrugs for gene directed enzyme prodrug therapy of cancer. Gene Ther. 1995;2:702-709

2. Harris JD, Gutierrez AA, Hurst HC, Sikora K, Lemoine NR. Gene therapy for cancer using tumour-specific prodrug activation. Gene Ther. 1994;1:170175

3. Davidson DG, Eastham WN. Acute liver necrosis following overdose of acetaminophen. Br Med J. 1966;5512:-1990.

4. Mitchell JR, Jollow DJ, Potter WZ, Gillette JR, Brodie BB. Acetaminophen-induced hepatic necrosis. IV. Protective role of glutathione.

JPharmacol Exp Ther. 1973;187:211-217 ···· · ·· ·· · • · · · · · · · • · · · ·· · · • · · · ·· · · · · • · · ···· · · • · ··· · · 9 · 9 9

5. Miner DJ, Kissinger PT. Evidence for the involvement of N-acetyl-p- quinoneimine in acetaminophen metabolism. Biochem Pharmacol. 1979;28:

3285-3290.

6. Boobis AR, Fawthrop DJ, Davies DS. Mechanisms of cell death. Trents

Pharmacol Sci. 1989;10:275-280.

7. Patten CJ, Thomas PE, Guy RL, Lee M, Gonzalez FJ, Guengerích FP,

Yang CS. Cytochrome P450 enzymes involved in acetaminophen activation by rat and human liver microsomes and their kinetics. Chem Res Toxicol. 1993;6:511-518.

8. Thatcher NJ, Murray S, Edwards RJ, Davies DS. Measurement of N- acetylbenzoquinoneimine formation by human hepatic microsomes. 12^,h

International Symposium on microsomes and Drug Oxidations 1998; abstract

74.

9. Wolfel C, Heinrich-Hirsch B, Schulz-Schalge T, Seidel A, et al.

Genetically engineered V79 Chinese hamster cells for stable expression of human cytochrome P450IA2. Eur JPharmacol. 1992;228:95-102

10. Edwards RJ, Murray BP, Singleton AM, Murray S, Davies DS, Boobis

AR. Identifícation of the epitope of an anti-peptide antibody which binds to

CYP1A2 in many species including man. Biochem Pharmacol 1993 ;46:213220.

11. Tee LB, Boobis AR, Huggett AC, Davies DS, Reversal of acetaminophen toxicity in isolated hamster hepatocytes by dithiothreitol. Toxicol Appl

Pharmacol. 1986;83:294-314.

• · · 9 9 9 9 9 99

9 9 9 99 99 • · 9 9 9 9 9 9 99

9 9 9 9 9 99

999 99 99 999

12. Boobis AR, Tee LB, Hampden CE, Davies DS. Freshly isolated hepatocytes as a model for studying the toxicity of acetaminophen. Food Chem Toxicol. 1986;24:731-736.

13. Tee LB, Davies DS, Seddon CE, Boobis AR. Species differences in the hepatotoxicity of acetaminophen are due to differences in the rate of conversion to its cytotoxic metabolite. Biochem Pharmacol. 1987;36: 1041 1052.

14. Potter WZ, Thorgeirsson SS, Jollow DJ, Mitchell JR. Acetaminopheninduced hepatic necrosis. V. Correlation of hepatic necrosis, covalent binding and glutathione depletion in hamsters. Pharmacology. 1974; 12: 129-143.

15. Perry RR, Mazetta JA, Levin M, Barranco SC. Glutathione levels and variability in breast tumours and normál tissue. Cancer. 1993; 72: 783-787.

16. McLean AE, Day PA. The effect of diet on the toxicity of acetaminophen and.the safety of acetaminophen-methionine mixtures. Biochem Pharmacol. 1975;24:37-42.

17. Aebi S, Lauterburg BH. Divergent effects of intravenous GSH and cysteine on renal and hepatic GSH. Am JPhysiol. 1992; 263:348-352.

9999 ·

• 4 ·· ·· • · · · · · · • · ·· 9 9

Table 1,

Životaschopnost (%)

Buněčný typ	H1A2MZ buňky (%)	Oh	6 h	24 h	48 h
V79MZ	0	99 ± 1	94 ±7	98 ± 1	-
	5	98 ± 1	52 ±5***	0 ± 0***	-
	10	98 ± 1	22 + β***	0 + o***	-
	25	97 ±2	20 ± 4***	o± 0***	-
	50	96 ± 3	J5 4- 7***	0 ± 0***	-
SK-OV-3	0	97 ± 1	98 ±2	96 + 3.	-
	5	98 ±1	55 ±2***	0 ± 0***	-
	10	98 ± 1	+ 7***	0 ± 0***
	25	97 ± 1	22+ 11***	0 ± 0***
	50	98 ±1	16±9***	0 ± 0***
HCT116	0	96 ±1	96 ±5	96 + 2
	5	98 ± 1	69 + 9***	0 ± 0***
	10	98 ±1	60 ±6***	0 ± 0***
	25	97 ± 1	56 + 4***	0 ± 0***
(	50	98 ± 1	42 ±6***	0 ± 0***
MDA-MB-361	0	96 ±1	98 + 4	95 ±3	97 ± 1
	5	98 ±2	85 ±2**	84 + 7**	92 ± 4
	10	96 ±3	74 4. 7***	81 ±9**	94 ±7
	25	97 ± 1	70± 11***	7g 4.9***	91 ±6
	50	98 ±3	42 + 4***	18 ±5***	0 + 0***

Claims (20)

1. PATENTOVÉ NÁROKY

   1. Přípravek, v y z n a ču j í c í se t í m, že obsahuje kombinaci alespoň jednoho vektoru, který zahrnuje alespoň jeden gen P450, nebo jeho účinnou část; a acetaminophenu, nebo jeho strukturálně odvozeného derivátu.
2. 2. Přípravek podle nároku 1,vyzná ču jící se t í m, že, exprese alespoň jednoho genu P450, nebo jeho účinné části, je řízena promotorovou sekvencí, nebo její účinnou částí, která vykazuje v podstatě specifickou expresi v nádorové buňce; a acetaminophen, nebo jeho strukturálně odvozený derivát.
3. 3. Přípravek podle nároků 1 nebo 2, vyznačující se t í m, že vektor je eukaryotní expresní vektor.
4. 4. Přípravek podle nároku 3, vyznač ující se tím, že vektor je vektorem na bázi viru.
5. 5. Přípravek podle nároku 4, v y z n a č u j í c í se t í m, že vektor je hybridní virový vektor.
6. 6. Přípravek podle nároků 4 nebo 5, vyznačující se t í m, že vektor na bázi viru je vybrán z alespoň jednoho z následujících: adenovirus; retrovirus; adenoodvozené viry; herpesvirus; lentivirus nebo bakulovirus.
7. 7. Přípravek podle nároku 1, vyznačující se t í m, že exprese alespoň jednoho genu P450, nebo jeho účinné části, je řízena promotorovou sekvencí, nebo její účinnou částí, která je vybrána z alespoň jedné z následujících: dlouhá koncová repetice Rousova viru zhoubného nádoru; promotor cytomegaloviru; dlouhá koncová repetice myší leukémie; 40 počátečních a koncových promotorů opičího viru; promotor thymidinkinasy virů oparu prostého.

   ♦ ♦44

   4 4 4 *)

   4 44 • 444·

   44444

   4»44 •♦ 4 4 • 44 •44 • 44

   4«4444
8. 8. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 2až6, vyznačující se tím, že specifický promotor zhoubných buněk je vybrán z promotorů spojených s alespoň jedním z následujících genů: TRP-1; HER2; HER3; ERBB2; ERBB3; CEA; MUC-1; α-fetoprotein; specifický antigen předstojné žlázy (PSA); vilin; amylasa slinivky břišní; peptid příslušející tyrosinase; prekursor antigenu nádorového odloučení.
9. 9. Přípravek podle nároku 8, vyznačující se t ím, že promotor je hybridní promotor alespoň účinných částí z alespoň dvou specifických promotorů nádorových buněk.
10. 10. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 9, vyznačující se t í m, že gen P450 je savčího původu.
11. 11. Přípravek podle nároku 10, vyznačující se tím, že gen P450 je lidského původu.
12. 12. Přípravek podle nároku 11,vyznačující se tím, že gen P450 je vybrán z: CYP1A2; CYP2E1 nebo CYP3A4.
13. 13. Přípravek podle nároku 12, vy z n a č u j í c í se t í m, že gen P450 je hlodavčího původu.
14. 14. Přípravek podle nároku 13, vyznačující se tím, že gen P450 je vybrán z: hlodavčího CYP1A2; hlodavčího CYP2E-1 nebo hlodavčího CYP3A4.
15. 15. Přípravek podle kteréhokoliv z nároků 1 až 14, v y z n a č u j í c í se t í m, že dále obsahuje alespoň jedno činidlo schopné modulovat množství glutathionu u savce.
16. 16. Přípravek podle nároku 15, vyznačující se tím, že toto činidlo je vybráno z alespoň jednoho z: methioninu nebo acetylcysteinu.

    • ·· 99 ·· ·♦ · • * • • 9 ♦ * • · • · • * * 99 * · 9 • · · • · • · • 9 9 9 • 9 • • • · • 9 • · 9 ··· ·· ♦ · 99 ·· 9999
17. 17. Přípravek obsahující vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 16 a terapeuticky účinné množství alespoň acetaminophenu, nebo jeho strukturálně odvozeného derivátu, jako kombinované léčivo pro současné, oddělené nebo následné použití pro léčbu rakoviny.
18. 18. Použití přípravku obsahujícího vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 a terapeuticky účinné množství alespoň acetaminophenu, nebo jeho strukturálně odvozeného derivátu, pro přípravu farmaceutické kompozice pro léčení nemoci.
19. 19. Použití přípravku podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17 pro výrobu léčiva pro léčení alespoň jedné z následujících rakovin: rakovina prsu, slinivky břišní, vaječníků, děložního hrdla, plic, jater, ledvin, varlat, předstojné žlázy, trávicího traktu, gliom, nádor tvořený z pigmentových buněk, rakovina močového měchýře, lymfom, leukemie, rakovina epitelu, rakovina výstelky břišní dutiny a sítnice.
20. 20. Souprava, vyznačující se tím, že obsahuje vektor podle kteréhokoliv z nároků 1 až 17; acetaminophen; methionin a/nebo acetylcystein a případně doplňkovou pomocnou látku, nosič nebo ředící roztok.