CZ20003074A3

CZ20003074A3 - Způsob snižování obsahu složek obsahujících fosfor z poživatelných olejů

Info

Publication number: CZ20003074A3
Application number: CZ20003074A
Authority: CZ
Inventors: Kim Clause
Original assignee: Novo Nordisk A/S
Priority date: 1999-04-07
Filing date: 1999-04-07
Publication date: 2000-12-13

Abstract

Způsob snížení obsahu složek obsahujících fosfor z poživatelných olejů s obsahem fosforu 50 až 10 000 ppm zahrnuje inkubaci olejů při pH od 1,5 do 8 s vodným roztokem fosfolipázy Al - PLA1 nebo fosfolipázy B-PLB, které jsou emulgovány v oleji dokud obsah fosforu neklesne pod 12 ppm, po dobu 1,5 až 8 hodin. Poté se vodná fáze oddělí od oleje. Fosfolipáza je získána z mikroorganizmů, výhodně z vláknitých hub, kvasinek nebo bakterií.

Description

OBLAST TECHNIKY

Navrhovaný vynález popisuje vylepšené procesy pro enzymatickou redukci obsahu látek obsahujících fosfor v poživatelných olejích.

DOSAVADNÍ STAV TECHNIKY

Oleje získané standartními postupy výroby olejů a tuků, lisováním z materiálů které je obsahují a odstraněním přítomných nečistot jako jsou polární lipidy, zejména pak fosfolipidy, stejně jako mastné kyseliny, pigmenty, látky způsobující zápach a podobně. Je tedy nezbytné tyto nečistoty odstraňovat přečišťovacím procesem. Tento proces pak může zahrnovat i odklizování. V současném stavu techniky je pro tento účel používán enzym fosfolipáza (US 5,264,367, JP-A2153997 a EP 622446), který tak výrazně snižuje obsah fosforu těchto ve vodě odklízených jedlých olejů.

Tyto práce však nepopisují konkrétně použití malého množství vody v odkližovacím procesu. Naproti tomu EP 622446 popisuje použití velkého množství vody v enzymatickém odkližovacím procesu. Viz str. 3, řádky 34 až 44 a nárok 4 řečeného dokumentu, který popisuje použití více než 30 % hmotnostních procent vody pro tento proces.

PODSTATA VYNÁLEZU

Problém, který řeší navrhovaný vynález, je zajištění jednoduššího a ekonomičtějšího odkližovacího procesu pro poživatelné oleje.

Roztok podle navrhovaného vynálezu používá v procesu odklizování menší množství vody. Navrhovaný vynález tedy popisuje proces snížení obsahu látek obsahujících fosfor v poživatelných olejích, které mají obsah fosforu 50 až 10000 částic na milion (ppm), a tato technika zahrnuje inkubaci těchto olejů při pH od 1,5 do 8 svodným roztokem fosfolipázy Al (PLA1) nebo fosfolipázy B (PLB), která jsou emulgovány v oleji dokud není obsah fosforu redukován na méně než 12 ppm, a poté je vodná fáze oddělena od opracovaného oleje a tento proces je charakteristický tím, že emulgační podmínky jsou připravené pomocí 0,01 až 1,5 % vody vzhledem k hmotnosti oleje, lépe pak od 0,01 do 0,75 % vody vzhledem k hmotnosti oleje, • · ··· ··· ··· ·· ·· · · ještě lépe pak od 0,01 do 0,5 % vody vzhledem k hmotnosti oleje a nejlépe od 0,01 do 0,4% vody vzhledem k hmotnosti oleje.

Spodní hranice pod 0,1 % vody vzhledem k hmotnosti oleje, může být spíše 0,1 % vody vzhledem k hmotnosti oleje.

Výhodou zde popsaného procesu je snížení ceny za vodu a následné vyčištění vodního odpadu. Navíc, výtěžky přečištěného oleje budou vyšší, neboť méně oleje zůstane v odpadní vodné fázi. Další výhodou tohoto procesu je, že olejový mlýn používaný při tomto postupu může vynechat recyklaci kalu v znečištěné vodě používané při procesu.

Procesy odkližování pomocí enzymů známé v současném stavu techniky způsobují znečištění značného množství vody, kterou je poté potřeba draze čistit. To je samozřejmě faktor ovlivňující cenu výrobků.

Dále, olejové mlýnky jsou obvykle nastaveny tak aby používaly znečištěnou vodu při procesech probíhajících ve vodě tak aby bylo možno ušetřit za přečišťování vody.

Takový recyklační krok může být ušetřen pokud je použita dále popsaná technika.

Enzymatické odkližování podle současného stavu techniky (např. US 5,264,367) probíhá obvykla v emulzi olej voda zahřívané na 65 až 75 °C tak aby byla zajištěna separace olejové a vodné fáze např. centrifugací. Pokud je použita termostabilní fosfolipáza Lecitása ™ (Novo Nordisk A/S), Denmark) v odkližovacím procesu, vodná fáze, která obsahuje enzym může být použita opakovaně několikrát (s a nebo bez přídavku enzymu).

Pro olejové mlýnky je tedy výhodné aby byla recyklace vodné fáze zcela vypuštěna. To potom v normálním případě znamená, že stoupá spotřeba vody a tím samozřejmě i cena. Pokud je pro enzymatický odkližovací proces použit pouze malý objem vody, může být i proces recyklace někdy problematické kalové fáze vypuštěna.

Konkrétní formy navrhovaného vynálezu jsou dále uvedeny formou příkladů.

Poživatelné oleje

V podstatě jakékoliv poživatelné oleje je možné odkližovat pomocí postupu popsaného v navrhovaném vynálezu. Příkladem můžou být surové oleje a ve vodě odklížené oleje.

Surové oleje (také označované jako neodklížené oleje) mohou být buď lisované nebo extrahované oleje a jejich směsi např. z řepkového semena, ze sóji nebo slunečnice. Obsah fosfatidů v surovém oleji může kolísat mezi 0,5 až 3 % hmotnosti odpovídající obsahu fosforu v rozmezí od 200 do 10 000 ppm, spíše však v rozmezí od 250 do 1200 ppm. Kromě fosfatidů surový olej také obsahuje

malé množství uhlovodíků cukerné složky a komplexy iontů (např. Ca, Mg a Fe) s kyselinou fosforečnou.

Je vhodnější aby tyto poživatelné oleje byly nejprve zbaveny klihu a v nichž je obsah fosforu snížen na 50 až 250 ppm.

Tyto oleje jsou obvykle získávány odkližovacím procesem ve vodě a pak označovány jako „ve vodě odklizované oleje“.

Ve vodě odkližované oleje jsou obvykle získávány smícháním 1 až 3 % hmotnosti horké vody s horkým (60 až 90 °C) surovým olejem. Obvyklý použitý čas je 30 až 60 minut. Tento proces odstraní fosfatidy a klihové složky, které se stanou v hydratovaném oleji nerozpustné. Hydratované fosfatidy a klihy mohou být odděleny od oleje usazováním, filtrováním nebo centrifugací, přičemž centrifugace je nejvhodnější postup.

Proces zde označovaný jako „odkližovaní ve vodě“ může být také označované jako „mokrá rafinace odstraňující klih“ (viz (US 5,264,367).

Z poživatelnýcb olejů jsou nejvhodnější rostlinné oleje.

Fofolipázy použité v procesu

Nejvhodnějšími fosfolipázami použitelnými v procesu podle navrhovaného vynálezu jsou fosfolipázy získané z mikroorganismů, nejlépe vláknitých hyb, kvasinek nebo bakterií. Pro účely navrhovaného vynálezu termín ,,získané z“ tak jak je zde používán v souvislosti s konkrétním mikroorganismem, znamená, že tento enzym a samozřejmě i DNA kódující takový enzym je produkována tímto organismem.

Enzym je pak izolován specifickými postupy standartními technikami umožňujícími odborníkovi v oboru získat vzorek obsahující takový enzym, který je pak použitelný v procesu popisovaném navrhovaným vynálezem. Toto standartní technikou může být přímé přečištění z tohoto konkrétního zdroje nebo klonováním DNA sekvence tento enzym kódující následovanou rekombinantní expresí buď ve stejném organismu (homologní rekombinace) nebo v jiném organismu (heterologní rekombinace).

Vhodnější je aby fosfolipázy použitelné v navrhovaném vynálezu byly získané z vláknitých hub v rámci rodu Fusarium, a kmenech jako jsou F. culmorum, F. heterosporum, F. solani nebo kmen F. oxysporum a jiných druzích vláknitých hub v rámci rodu Aspergillus jako jsou kmeny Aspergillus awamori, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus niger nebo Aspergillus oryzae.

Příklady vhodných fosfolipáz izolovaných z houby rodu Fusarium jsou uvedeny v ;

• ·

i) Tsung-Che te al., (Phytopatological notes 58:1437-38 (1967) (a fosfolipáza z Fusarium solani) a ii) EP patentová aplikace č. 97610056 popisující vhodné fosfolipázy z F. culmorum (viz. příklad 18 tohoto dokumentu) a vhodné fosfolipázy zF. oxysporum (viz. příklady 117 tohoto dokumentu)

Příklady vhodných fosfolipáz izolovaných z houby rodu Aspergilus jsou uvedeny v :

iii) EP 575133 popisující řadu odlišných fosfolipáz původem z Aspergilu (viz. nárok 14) a konkrétně pak fosfolipázy z Aspergilus oryzae (nároky 17 al8) a fosfolipázy z Aspergilus niger (nárok 19) a iv) DE 19527274 Al popisující vhodné fosfolipázy z houby rodu Aspergilus (viz. příklady)

Jsou také vhodné komerčně dostupné preparáty obsahující fosfolipázy z houby rodu Aspergilus (Degoma VOD, Roehm, Německo), které jsou použitelné v procesu podle navrhovaného vynálezu.

Je vhodné aby fosfolipázy použitelné v tomto procesu vykazovaly některé konkrétní vlastnosti. Potom konkrétní varianty vynálezu popisují:

v) proces podle navrhovaného vynálezu , kde použitá fosfolipáza je v podstatě nezávislá na koncentraci iontů vápníku, což je měřeno jako relativní fosfolipázová aktivita v roztoku s 5 mM EDTA a 5 mM Ca²⁺ a aktivita fosfolipáz je měřena uvolňováním volných mastných kyselin z lecitinu v pufru obsahujícím 2 % lecitinu, 2 % Tritonu X100, 20 mM kyselinu citrónovou, při pH 5 a inkubace trvala 10 minut při 37 °C, po čemž následuje zastavení reakce inkubací po dobu 2 minut v 95 °C. Míra relativní fosfolipázové aktivity v 5 mM EDTA/5 mM Ca²⁺ je pak větší než 0,25, lépe pak větší než 0,5 a/nebo vi) proces podle navrhovaného vynálezu , kde použitá fosfolipáza má takovou fosfolipázovou aktivitu kdy je schopná uvolnit alespoň 7 pmol volných mastných kyselin / min,/ mg enzymu, měřeno pomocí techniky stanovení uvolňování volných mastných kyselin z lecitinu v pufru obsahujícím 2 % lecitinu, 2 % Tritonu X-100, 20 mM kyselinu citrónovou, při pH 5 a inkubace trvala 10 minut při 37 °C, po čemž následuje zastavení reakce inkubací po dobu 2 minut v 95 °C.

Detailní popis výše uvedených technik je popsán v příkladech. Ještě podrobnější popis je uveden pak v patentové přihlášce EP 97610056.0 (viz příklad 9 tohoto dokumentu).

Bylo také publikováno, že fosfolipázy vhodné pro enzymatické odkližovací procesy obecně a konkrétně pro postupy popisované zde by měla mít konkrétní primární aminokyselinovou sekvenci.

Další konkrétní variantou navrhovaného vynálezu popisující proces podle navrhovaného vynálezu, kde fosfolipáza má polypeptidovou sekvenci:

(a) polypeptidy s aminokyselinovou sekvencí v pozicích 31 až 346 v sekvenci č. 1, (b) polypeptidy s aminokyselinovou sekvencí v pozicích 31 až 303 v sekvenci č. 1, (c) polypeptidy který má alespoň 70 % homologie s těmito polypeptidy definovanými pod (a) a (b) a nebo fragmenty (a) (b) a (c).

Detailní popis klonování a přečištění fosfolipáz o zmíněné polypeptidické sekvenci je uveden v patentové přihlášce EP 97610056.0.

V tomto dokumentu je dále uvedeno, že fosfolipáza izolovaná z F. oxysporum a mající polypeptidovou sekvenci uvedenou v (b) vykazuje obě výše uvedené funkční charakteristiky. Z toho vyplývá, že tato fosfolipáza je nej vhodnější fosfolipázou použitelnou v procesu podle navrhovaného vynálezu. Dále uvedené příklady uvádějí použití této fosfolipázy.

Příkladem fosfolipáz které nejsou mikrobiálního původu může být komerčně dostupná fosfolipáza získaná z vepřové slinivky(Lecitáza™, Novo Nordisk A/S, Dánsko).

Standartní parametry procesů podle navrhovaného vynálezu

Kromě specifického použití malého množství vody v procesu podle navrhovaného vynálezu, je třeba definovat některé další parametry podle současného stavu techniky.

Enzymatické odkližování probíhá v disperzním vodném roztoku fosfolipázy ve formě kapiček s průměrným průměrem pod 10 p(mikro)m.

Podle navrhovaného vynálezu je množství vody je od 0,01 do 1,5 % hmotnosti vzhledem k množství oleje.

Je také možné přidat nějaký emulzifikátor. Pro zlepšení vlastností emulze je možno použít i mechanické míchadlo.

Enzymatické odkližování může proběhnout při jakémkoliv pH v rozmezí od 1.5 do 8, spíše však při pH od 3 do 6. Upravit pH je možné pomocí přidám kyseliny citrónové, citrátového pufru, NaOH nebo HC1.

Vhodná teplota je obvykle od 30 do 75 °C (spíše však 40 až 60 °C). Reakce obvykle probíhá 0,5 až 12 hodin (spíše však2 až 6 hodin) a vhodná dávka enzymu je obvykle 100 až 5000 IU na litr oleje, spíše však 200 až 2000IU/1.

Enzymatické odkližování může probíhat v velkém objemu, t.j. ve velké nádrži s míchadlem, nebo může probíhat kontinuálně v sérii následných nádrží s míchadly.

Enzymatické odkližování je následováno izolací vodné fáze od oleje. Tato separace může proběhnout standartním způsobem, například centrifugací. Proces podle navrhovaného vynálezu může snížit tuto hodnotu pod 12 ppm, spíše však pod 10 ppm a nejspíše pod 5 ppm.

PŘÍKLADY PROVEDENÍ VYNÁLEZU

PŘÍKLAD 1. Obecný popis techniky enzymatického odkližování poživatelných olejů

Vybavení pro enzymatické odkližování

Základní součástí je 1 1 ocelová reakční nádoba s izolační vrstvou a s ocelovým víkem obsahující míchadlo (asi 600 rpm), tlumič, teplotní čidlo, vstupní trubici ve víku, refluxní chladič na víku (asi 4 °C) a výstupní trubici na dně. Izolační vrstva reakční nádoby je připojena k termostatické lázni. Výstupní trubice je pak připojena silikonovou hadicí k Siversonovu mixéru vybavenému filtrem s čtvercovými otvory o vysokém střižném momentu poháněnému Silversonovým L4RT laboratorním míchadlem o vysokém střižném momentu (asi 8500 rpm, průtok 1,1 1 za minutu). Hlava mixéru je upevněna dohromady s chladicí spirálou a výpustní trubicí, která je připojena ke vstupní trubici reakční nádoby silikonovými hadičkami. Teplotní čidlo je umístěno v silikonové hadici těsně za mixérem. Jedinou spojkou mezi reaktorem, mixérem a atmosférou je prostřednictvím refluxního chladiče.

Obecný postup enzymatického odkližování

Veškeré chladící a termostatické okruhy jsou vypnuty. Do reaktoru je přidáno 0,6 1 (asi 560 g) oleje a reaktor je udržován při teplotě potřebné pro konkrétní experiment. Laboratorní mixér je zapnut a olej začne cirkulovat z reaktoru do mixéru a zpátky do reaktoru. Systém je ponechán i

v běhu 10 minut a během této doby je přesně vyladěna požadovaná teplota. Před-inkubační perioda začne přidáním 0,6 g (2,86 mmol) monohydrátu kyseliny citrónové v odpovídajícím množství vody nebo stejného množství směsi kyseliny citrónové a citrátu trisodného (viz. tabulka 1 a 7 níže, (citrónová kyselina) ve emulzi voda / olej = 4,6 mM) a čas je označen jako t = 0. V čase t = 30 je přidáno odpovídající množství 4 M roztoku NaOH (viz. tabulka 1 a 7).

• · ·

Tabulka 1. obsah vody v experimentech A až D olej ze semene řepky olejky.

Experiment	obsah vody	voda v 560 g oleje	voda přidaná v t = 0	voda v roztoku NaOH	voda v roztoku enzymu	celková voda
A	5,3 %	0,56 g	27 g	1,1 g	1,0 g	29,7 g
B	1,3 %	0,56 g	5g	0,7 g	1,0 g	7,3 g
C	0,3 %	0,56 g	0,05 g*	0g	1,0 g	1,6 g
D	0,3 %	0,56 g	0,07 g**	0g	1,0 g	1,6 g

* voda přidaná s 0,6 g monohydrátu kyseliny citrónové ** voda přidaná ve směsi 0,5 g monohydrátu kyseliny citrónové a 0,14 g dihydrátu citrátu trisodného

V čase t = 35 minut jsou odehrány vzorky pro P-analýzu a stanovení pH. Těsně poté je přidáno požadované množství enzymu (konec pre-inkubační periody). Vzorky pro P-analýzu a stanovení pH jsou odebírány v časech t = 1,2, 3,5, 5, 6 hodin a poté je reakce zastavena.

Soustava reaktor/mixér je vyprázdněna a promyta 2 x 500 ml 10 % roztoku Deconex v DI vodě a následně 3 x 500 ml destilované vody. Tabulka 2 představuje různé varianty dávkování během reakce.

• · .(

Tabulka 2. postup enzymatického odklizování

Čas	přidáno	vzorky
		P-analýza	stanovení pH
		X
0	kyselina citrónová
5 min			X
30 min		X	X
30 + δ min	NaOH
35 min		X	X
35 + δ min	enzym
1 h		X	X
2h		X	X
3,5 h		X	X
5h		X	X
6h		X	X

Analýza obsahu fosforu

Vzorky pro P-analýzu:

ml vody bylo přidáno do olejové emulze v skleněné centrifugační zkumavce. Emulze byla poté zahřívána ve vařící vodě po dobu 30 minut. Směs byla centrifugována 10 minut při 5000 rpm. 8 ml horní (olejové) fáze bylo přeneseno do 12 ml polystyrénové zkumavky a ponecháno sedimentovat 12 až 24 hodin. Po usazení bylo odebráno 1 až 2 g horní čiré fáze pro P-analýzu. P-analýza probíhala podle postupu 2,421 z „Standart Methods for the Analysis of Oils, Fats and Derivatives“, 7 vydání (1987):

100 mg MgO (Merck #5862) v porcelánové misce bylo zahříváno plynovým kahanem. Bylo přidáni 1 až 2 g oleje a zapáleno kahanem tak aby vznikla černá tvrdá hmota. Ta byla zahřívána v peci Vucstar při 850 °C po dobu 2 hodin tak aby vznikl bílý popel. Ten byl rozpuštěn v 5 ml 6

Μ ΗΝΟ₃ a bylo přidáno 20 ml reakční směsi. Roztok byl ponechán 20 minut. Absorbance byla měřena při 460 nm (použit blank (5 ml HN0₃ + 20 ml reakční směsi) pro stanovení nulové hladiny). Koncentrace byla spočítána za použití kalibrační křivky.

Stanovení pH ml vody byly přidány do olejové emulze a ta byla poté smíchána s 2 ml MilliQ vody. Po fázové separaci byla odstraněna horní vrstva oleje. Měření pH probíhalo ve vodné fázi s pH elektrodou Orion. Měření byla přepočítána na skutečné hodnoty pH pomocí vzorce pHreal pHměření 0,38

Kalibrační křivkabyla získána rozpuštěním 0,6 g monohydrátu kyseliny citrónové v 27 g DI vody. Také pH tohoto roztoku bylo měřeno pH elektrodou Orion (pH_reai). 100 μΐ bylo smícháno s 2 ml MilliQ vody a pH tohoto roztoku bylo měřeno pH elektrodou Orion (pH_máření). Přidáváním NaOH k roztoku kyseliny citrónové bylo kontinuálně měněno pH a po každém přidání bylo ředění a stanovené pH zaznamenáno.

PŘÍKLAD 2. Odklizování, ve vodě odklízeného řepkového oleje (I)

Experimenty proběhly podle obecného postupu, tak jak byl popsán v příkladu 1.

Olej:

Ve vodě odklízený řepkový olej od Arhus Oliefabrik (AOM), Dánsko. Vzorky C00730/B01700 a C00730/B01702, obsah fosforu 231 až 236 ppm. Obsah vody méně než 0,1 % hmotnosti.

Enzym:

Fosfolipáza z houby Fusarium oxysporum s aminokyselinovou sekvencí uvedenou jako sekvence č. 1.

Vzorky F-9702027, stanovená koncentrace 0,75 mg/ml.

Enzym byl rekombinantně exprimována a přečištěn jak popisuje EP patentová aplikace č. 97610056,0.

Experiment A (obsah vody 5,3 %)

0,6 1 (560 g) ve vodě odklízeného řepkového oleje bylo přeneseno do reakční nádoby a zahřáto na 40 °C. V čase t = 0 byl přidán roztok 0,6 g monohydrátu kyseliny citrónové v 27 g vody. V Čase t = 30 bylo přidáno 1,07 ml (4,3 mmol) 4 M NaOH což upraví pH na přibližně 5. V čase t = 35 min, bylo přidáno 1 ml (0,75 mg) přečištěného roztoku fosfolipázy z F. oxysporum. Stanovené hodnoty naměřeného obsahu fosforu v olejové fázi po centrifugací a stejně tak hodnoty pH ve vodné fázi jsou uvedeny v tabulce 3.

Tabulka 3. výsledky odklizování ve vodě odklíženého řepkového oleje pomocí fosfolipázy zF. oxysporum, obsah vody 5,3 %

čas (hodiny)	obsah fosforu v olejové fázi	pH
0	243
0,5	215	4,7
0,58	216	5,5
1,0	66	4,9
2,0	10	4,9
3,5	8	5,4
5,0	9	5,0

Experiment B (obsah vody 1,3 %)

Probíhá stejně jako v experimentu A jen v čase t = 0 minut je přidáno 0,6 g monohydrátu kyseliny citrónové v 5,0 g vody a v čase t = 30 min je přidáno 0,71 ml (2,86 mmol) 4 M roztoku NaOH což upraví pH na asi 5. Stanovené hodnoty naměřeného obsahu fosforu v olejové fázi po centrifugací a stejně tak hodnoty pH ve vodné fázi jsou uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 4. výsledky odklizování ve vodě odklízeného řepkového oleje pomocí fosfolipázy z F.

oxysporum, obsah vody 1,3 %

čas (hodiny)	obsah fosforu v olejové fázi	pH
0	237
0,5	213	4,7
0,58	197	5,7
TO	78	4,9
2,0	9	4,9
3,5	10	5,0
5,0	12	5,1
6,0	10	5,0

Experiment C (obsah vody 0,3 %)

Probíhá stejně jako v experimentu A jen v čase t = 0 minut je přidáno 0,6 g práškového monohydrátu kyseliny citrónové a v čase t = 30 min je přidáno 0,71 ml (2,86 mmol) 4 M roztoku NaOH což upraví pH na asi 5. Stanovené hodnoty naměřeného obsahu fosforu v olejové fázi po céntrifugaci a stejně tak hodnoty pH ve vodné fázi jsou uvedeny v tabulce 5.

Tabulka 5. výsledky odklizování ve vodě odklízeného řepkového oleje pomocí fosfolipázy z F. oxysporum, obsah vody 0,3 %

čas (hodiny)	obsah fosforu v olejové fázi	pH
0	246	4,9
0,5	234	5,1
0,58
1,0	101	4,8
2,0	18	5,2
3,5	11	V

• ·

Experiment D (obsah vody 0,3 %)

Probíhá stejně jako v experimentu C jen v čase t = 0 minut je přidána směs 0,6 g práškového monohydrátu kyseliny citrónové a 0,14 g citrátu trisodného ve formě bezvodého prášku což upraví pH na asi 5. Stanovené hodnoty naměřeného obsahu fosforu v olejové fázi po centrifugací a stejně tak hodnoty pH ve vodné fázi jsou uvedeny v tabulce 6.

Tabulka 6. výsledky odkližování ve vodě odklíženého řepkového oleje pomocí fosfolipázy z F. oxysporum, obsah vody 0,3 %

čas (hodiny)	obsah fosforu v olejové fázi	pH
0	243
0,5	244	5,5
0,58
1,0	101	5,1
2,0	8	4,9

PŘÍKLAD 3. odkližování surového řepkového oleje (směsi pouze lisované a extrahované) (Π)

Olej

Surový řepkový olej od MILO Olomouc, Česká republika, vzorek C00745/B02042, obsah fosforu 263 ppm, obsah vody 0,17 % hmotnosti.

Tabulka 7. obsah vody v experimentech E a F, surový řepkový olej

Experiment	obsah vody	voda v 560 g oleje	voda přidaná v t = 0	voda v roztoku NaOH	voda v roztoku enzymu	celková voda
E	5,4 %	0,95 g	27 g	Ug	1,0 g	30,1 g
F	1,4 %	0,95 g	5g	0,7 g	1,0 g	7,7 g

Experiment E (obsah vody 5,4 %)

0,6 1 (560 g) ve surového řepkového oleje bylo přeneseno do reakční nádoby a zahřáto na 40 °C. V čase t = 0 byl přidán roztok 0,6 g monohydrátu kyseliny citrónové v 27 g vody. V čase t = 30 bylo přidáno 1,07 ml (4,3 mmol) 4 M NaOH což upraví pH na přibližně 5. V čase t = 35 min, bylo přidáno 1 ml (0,75 mg) přečištěného roztoku fosfolipázy zF. oxysporum. Stanovené hodnoty naměřeného obsahu fosforu v olejové fázi po centrifugací a stejně tak hodnoty pH ve vodné fázi jsou uvedeny v tabulce 8.

Tabulka 8. výsledky odkližování surového řepkového oleje pomocí fosfolipázy z F. oxysporum, obsah vody 5,3 %

čas (hodiny)	obsah fosforu v olejové fázi	pH
0	222
0,5	165
0,58	136	4,8
1,0	38	5,1
2,0	10	5,0
3,5	11	5,0
5,0	11	5,0
6,0	10	V .

'» ·

Experiment F (obsah vody 1,4 %)

Probíhá stejně jako v experimentu E jen v čase t = 0 minut je přidáno 0,6 g monohydrátu kyseliny citrónové v 5,0 g vody a v čase t = 30 min.je přidáno 0,71 ml (2,86 mmol) 4 M roztoku NaOH což upraví pH na asi 5. Stanovené hodnoty naměřeného obsahu fosforu v olejové fázi po centrifugací a stejně tak hodnoty pH ve vodné fázi jsou uvedeny v tabulce 4.

Tabulka 9. výsledky odkližování ve vodě odklíženého řepkového oleje pomocí fosfolipázy z F. oxysporum, obsah vody 1,4 %

čas (hodiny)	obsah fosforu v olejové fázi	pH
0	223
0,5	119
0,58	92	5,1
1,0	31	5,1
2,0	12	5,0
3,5	11	5,1
5,0	9	4,8
6,0	8	4,3

PŘÍKLAD 4. postupy použité pro charakterizaci fosfolipáz použitelných v odkližovacím procesu olejů podle navrhovaného vynálezu.

Technika měření aktivity fosfolipáz;

Aktivita fosfolipáz (PHLU) byla měřena jako uvolňování volných mastných kyselin z lecitinu. 50 μΐ 4 = α-fosfatidylcholínu (rostlinný lecitin od Avanti USA), 4 % Triton X-100, 5 mM CaCU v 50 mM HEPES, pH = 7 bylo smícháno s 50 μΐ roztoku enzymu naředěného na optimální koncentraci v 50 mM HEPES, při pH = 7. Vzorky byly inkubovány 10 minut při 30 °C a reakce byla zastavena inkubací v 95 °C po dobu 5 minut před centrifugací (5 minut při 7000 rpm). Volné mastné kyseliny byly stanoveny za použití NEFA kitu od firmy Wako Chemicals GmbH. 25 μΐ reakční směsi bylo přidáno k 250 μΐ reagens A směs byla inkubována 10 minut při 37 °C. Poté

bylo přidáno 500 μΐ reagens B a vzorek byl opět inkubován opět 10 minut při 37 °C. Nakonec byla měřena absorpce při 550 nm za použití HP 8452A diodového spektorfotometru. Vzorky byly měřeny v duplikátu. Jako blank byl použit substrát bez aktivního enzymu (tepelně inaktivovaný enzym (10 minut při 95 °C) + substrát). Olejová kyselina byla použita jako standart mastné kyseliny. 1 PHLU odpovídá takovému množství enzymu, které je schopné uvolnit 1 μιηοΐ volné mastné kyseliny za minutu za těchto podmínek.

Alternativně může tento test probíhat i při 37 °C v 20 mM citrátovém pufru, pH 5 (Ca²⁺závislost) nebo 20 mM Britton-Robinsonově pufru (pH-profil/teplotní profil/stabilita).

Aktivita fosfolipázy Al (PLA1) byla měřena pomocí použití l-(s-dekanoyl)-2-dekanoyl-l-thio-snglycero-3-fosfocholín (D3761 Molecular Probes) jako substrátu. 190 μΐ substrátu (100 μΐ D3761 2 mg/ml v ethanolu) + 50 μΐ 1 % Triton X-100, 2 mM CaCl₂, 1,85 ml 50 mM HEPES, 0,3 mM DTNB, pH = 7 v 200 μΐ kyvetě bylo smícháno s 10 μΐ roztoku enzymu a absorpce při 410 nm byla měřěna jako funkce času na HP 8452A diodovém spektrofotometru při pokojové teplotě. Aktivita byla spočítána ze sklonu křivky v lineárním rozsahu. PLA1 odpovídá množství enzymu schopnému uvolnit 1 pmol volné mastné kyseliny (thiol)/minutu za těchto podmínek.

Aktivita fosfolipázy A2 (PLA2) byla měřena pomocí použití l-hexadekanoyl-2-dekanoyl-(lpyrodekanoyl)-sn-glycero-3-fosfocholín (H361 Molecular Probes) jako substrátu. 2 ml substrátu (50 μΐ 1 % Triton X-100, 25 μΐ 0,1 %H361 v methanolu, 10 ml 50 mM HEPES, pH = 7) v 2 ml kývete bylo smícháno s 10 μΐ roztoku enzymu a fluorescence pyrenu byla měřena při 376 nm (excitace 340 nm) jako funkce času (1 vteřinové intervaly) na aparátu Perkin Elmer LS50. V micelách Triton X-100/fosfolipid byla koncentrace fosfolipidu nastavena tak aby měla excimemí formaci (emise při 480 nm). Po odštěpení mastných kyselin ve 2-poloze navázaná pyrenová skupina je uvolněna do vodné fáze, což vede k nárůstu monomerní emise. PLA2 byla vyhodnocena ze sklonu lineární části kalibrační křivky.

Claims

1. Způsob snižování obsahu složek obsahujících fosfor z poživatelných olejů, s obsahem fosforu 50 až 10000 ppm, vyznač uj ící se tím, že tento postup je charakteristický

a) emulzifíkací vodného roztoku fosfolipázy Al - PLA1, fosfolipázy Al - PLA2 nebo fosfolipázy B - PLB, v oleji za použití 0,01 do 0,5 % vody vzhledem k hmotnosti oleje,

b) inkubací oleje s emulgovanou fosfolipázou pri pH od 1,5 do 8 po dobu 1,5 až 8 hodin, dokud obsah fosforu neklesne pod 12 ppm a nakonec

c) oddělením vodné fáze od oleje.

2. Způsob snižování obsahu složek obsahujících fosfor z poživatelných olejů, s obsahem fosforu 50 až 10000 ppm, vyznač uj ící se tím, že tento postup je charakteristický

a) upravením pH na 3 až 6 a emulzifíkací vodného roztoku fosfolipázy Al - PLA1, fosfolipázy Al - PLA2 nebo fosfolipázy B - PLB, v oleji za použití 0,01 do 0,5 % vody vzhledem k hmotnosti oleje,

b) inkubací oleje s emulgovanou fosfolipázou dokud obsah fosforu neklesne pod 12 ppm a nakonec

c) oddělením vodné fáze od oleje.

3. Způsob podle nároků 1 a 2, vyznačující se tím, že olej je olej ze kterého byl klih předtím odstraněn a který má obsah fosforu od 50 do 250 ppm.

4. Způsob podle nároků 1 až 3, vyznačující se tím, že enzym fosfolipáza je získán z mikroorganismů, nejlépe vláknitých hub, kvasinek nebo bakterií.

5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že vláknité houby patří k rodu Fusari um, jako jsou druhy F. culmorum, F. heterosporum, F. solani nebo druh F. oxysporum.

6. Způsob podle nároku 4, vyznačuj ící se tím, že vláknité houby patří k rodu Aspergilus, jako jsou druhy Aspergilus awamori, Aspergilus foetidus, Aspergilus japonicus, Aspergilus niger, nebo Aspergilus oryzae.

7. Způsob podle jakéhokoliv předchozího nároku, vyznač uj ící se tím, že fosfolipáza je v podstatě nezávislá na koncentraci iontů Ca což je měřeno jako relativní fosfolipázová aktivita pri 5 mM EDTA a 5 mM Ca²⁺ pomocí techniky měřící uvolňování volných mastných φ φ kyselin z lecitinu v pufru obsahujícím 2 % lecitinu, 2 % Tritonu X-100, 20 mM kyselinu citrónovou, při pH = 5, inkubováno 10 minut při 37 °C a reakce je ukončena 5 minutovou inkubací v 95 °C, přičemž poměr relativní fosfolipázové aktivity v 5 mM EDTA / 5 mM Ca je větší než 0,25, spíše pak je větší než 0,5.

8. Způsob podle jakéhokoliv předchozího nároku, vyznačující se tím, že fosfolipáza má takovou aktivitu, že je schopna uvolnit alespoň 7 pmol volných mastných kyselin / minutu / mg enzymu, spíše pak alespoň 15 mol volných mastných kyselin / minutu / mg enzymu, což je měřeno jako fosfolipázová aktivita měřená pomocí techniky měřící uvolňování volných mastných kyselin z lecitinu v pufru obsahujícím 2 % lecitinu, 2 % Tritonu X-100, 20 mM kyselinu citrónovou, při pH = 5, inkubováno 10 minut při 37 °C a reakce je ukončena 5 minutovou inkubací v 95 °C.

9. Způsob podle jakéhokoliv předchozího nároku , vyznačující se tím, že fosfolipáza obsahuje polypeptidovou sekvenci uvedenou jako :

a) polypeptid o aminokyselinové sekvenci uvedené v pozicích 31 až 346 v sekvenci č. 1,

b) polypeptid o aminokyselinové sekvenci uvedené v pozicích 31 až 303 v sekvenci č. 1,

c) polypeptid, který má alespoň 70 % homologie s polypeptidem charakterizovaným v bodech (a) a (b) a

d) fragmenty (a), (b) a nebo (c).