CZ20002656A3 - Farmaceutický prostředek na bázi bibapcitidinu pro léčení trombózy - Google Patents

Abstract

Řešení poskytuje nové reagencie prekurzoru, které se používají při výrobě zobrazovacích látek, které jsou odvozené od apcitidu. Zobrazovací látky, které jsou vyrobené z reagencií prekurzoru tohoto řešení jsou užitečné k in vivo detekci a diagnostice trombů. Reagencie prekurzoru tohoto řešení se také mohou používat při výrobě antitrombotických látek odvozených od apcitidu. Přítomnost volných karboxylových skupin zvyšuje rozpustnost těchto reagencií oproti bibapcitidu ve vodném médiu.

Description

Farmaceutické prostředky odvozené od bibapcitidu pro zobrazování a léčbu trombů

Oblast techniky

Tento současný vynález se týká oblasti diagnostického zobrazování trombů. Vynález se týká zvláště farmaceutických prostředků používaných k zobrazování trombů. Vynález se také týká oblasti léčby trombózy, ke které se používají léky vyrobené z nových prekurzorových reagencií.

Dosavadní stav techniky

Trombóza a tromboembolismus, zvláště trombóza hlubokých žil (Deep vein trombosis = DVP) a plicni embolie (PE) patří mezi běžné klinické stavy, které doprovází významná nemocnost a úmrtnost. Odhaduje se, že v U.S.A. má přibližně 5 miliónů pacientů za rok zkušenost s jednou nebo více epizodami trombózy hlubokých žil a vyskytuje se 500 000 případů plicni embolie, které jsou vedou k 100 000 úmrtí. Také se odhaduje, že přes 90 % všech plicních embolií vzniká z trombózy hlubokých žil dolních končetin. Protisrážlivá léčba může tyto stavy účinně léčit, pokud je zahájena dostatečně včas. Avšak tuto léčbu doprovází vysoká rizika (například vnitřní krvácení), která předchází nezbytnému profylaktickému podání. Dokonalejší způsoby trombolytického zásahu O'ako je například podávání rekombinantního aktivátoru tkáňového plasminogenu nebo streptokinázy) se mohou použít u akutních případů, avšak tyto způsoby přinášejí mnohem vyšší rizika. Navíc účinné klinické používání těchto způsobů vyžaduje, že je stanoveno místo trombů tak, aby se mohl monitorovat účinek léčby.

těchto důvodů jsou vysoce žádoucí rychlé způsoby lokalizace trombů in vivo, nejvýhodněji při použití neinvazivních způsobů. V minulosti se používaly metody kontrastní venografie a kompresní B-mode ultrazvuk ke stanovení míst trombózy hlubokých žil; výběr použité metody závisel na předpokládané lokalizaci trombů.

Bohužel však jsou dřívější metody invazivní a obě jsou pro pacienta nepříjemné. Navíc tyto metody jsou pro mnoho případů nevhodné nebo neposkytují přesné výsledky. Mezi it ···· • · • · ··

• · • ·· současné metody, které se používají k diagnostice plicni embolie, patří rentgen, elektrokardiogram (EKG), arteriální tlak kyslíku, perfusní a ventilační plicni scany, a plicni angiografie. Žádná z těchto novějších invazivních metodik není schopna poskytovat jednoznačnou diagnostiku.

V poslední době byly dokončené klinické pokusy na scintigrafické zobrazování akutní trombózy hlubokých žil pomocí peptidu apcitidu, radioaktivně označeného ^mTc, který se váže na GPIIb/llla receptor krevních destiček, jenž je součástí trombů a tím poskytuje zobrazovací látku specificky cílenou na tromby. Souprava k výrobě apcitidu radioaktivně označeného ^99mTc, ACUTEST™ je tvořena bibapcitidem jehož chemický vzorec I je uveden níže.

HaC

-S

I ch₂

I li ι II ι π i II _;_,j_c-_c-_re-c-_rc-c-_rc-c·

H CHj

J I H Ctít I

O OH

O HO HO H .11 I II I II I ‘N— C— C—N-C—C—N-C—- C— N-CH CHa I

O

II •c— N I

H I τι

Η H

O HO HO HO HO

II i II I II , I II I II •C—N-C— c— N-C—C—N—C— c— N-C—C—NHH CH₂

V¹

NH

I c=o

I

CH>

CH,

NH

I

C=O

I

CHa

Ot,

CH,

Wh

•Λχ I I ι i » · c—n—c—c—n-c—c—x-cH O HO H

OH

Η H

H O

HjČ·

-εΙ ¹¹ I o

CHa

-S

Η H I I -N-CI

H

CH, c=o

I

NH

CHI

S

I

CHa •C— C—N-C—C—N * * II

CH,

C=O

NH I

CH, s I

H CH, H I I I c— C~N-C— C—N I 11

-C—N-CII I O H

I

H CHa S (

o <

S

H CH,

I I •C—N-C— C— NH, (O,

Bibapcitid a jeho radioaktivní značení je popsáno v patentu U.S. Pat. Nos. 5,508,020 a 5,645,815; a dále USSN 08/253,317; a WO 93/23085; WO 93/25244 a WO 95/33496. WO 94/07918 popisuje, že bibapcitid může být také použít v neznačené formě jakožto antitrombotická látka.

Bibapcitid je dimer monomerů apcitidu, který je také popsán ve výše uvedených U.S. patentech a žádostech a mezinárodních patentových žádostech. Dimer bibapcitid • · ··· · ► · · • · ·· vzniká bismaleimidovou vazbou cysteinů karboxylových konců ze dvou monomerů apcitidu. Monomerický apcitid se sloučí s TcO a komplex apcitid/Tc popisuje Zheng a kol., Abstract 336, 213^th American Chemical Society Meeting, Duben 13-17,1997.

Podstata vynálezu

Současní vynálezci objevili dva nové dimery apcitidu, bibapcitid monokarboxylát a bibapcitid dikarboxylát, které jsou přítomny ve vodních roztocích bibapcitidu při pH vyšším než 5. Tyto nové dimery apcitidu se mohou použít jako prekurzory při výrobě apcitidu značeného ^99mTc.

Jedna část vynálezu poskytuje reagencii prekurzoru, která obsahuje bibapcitid monokarboxylát.

Další část vynálezu poskytuje reagencii prekurzoru, která obsahuje bibapcitid dikarboxylát.

Další část vynálezu poskytuje prostředek, který obsahuje bibapcitid monokarboxylát.

Další část vynálezu poskytuje prostředek, který obsahuje bibapcitid dikarboxylát.

Další část vynálezu poskytuje farmaceutický prostředek, která obsahuje bibapcitid monokarboxylát a farmaceuticky přijatelný nosič.

Další část vynálezu poskytuje farmaceutický prostředek, který obsahuje bibapcitid dikarboxylát a farmaceuticky přijatelný nosič.

Podrobný popis vynálezu

Patent a odborná literatura, která je součástí referencí, jsou založené na znalostech dostupných znalcům z oboru. Vydané U.S. patenty a povolené žádosti jsou zde zahrnuty v referencích.

Farmaceutický prostředek tohoto vynálezu poskytuje nové reagencie prekurzoru, bibapcitid monokarboxylát a bibapcitid dikarboxylát, pro výrobu jak zobrazovacích látek tak i antitrombotických látek odvozených od bibapcitidu.

• · · · · · • · • fl ··

Chemický vzorec (I) bibapcitid monokarboxylátu je znázorněn níže:

H»CHO HO HO HO I O .UL^-O-^-ř-P^-éJ-N-LK

A A A A«, l·' (f' 'OH

HH, bt, bť.

in, f

bt.

• · • ···

HO HO HO HO HO HO’ HO HO _N_A_ 8_Ν_Α_ί_Ν_Α_8_Ν_Α_8_Ν_Α_8_Ν_Α_Ε_Ν_Α_8_Ν_Α_8_ΝΗ, AA AA A Ah, A A A Ah, A A AA A Ah, i i

Ah,

Ah'

A—o

Ah,

Ahj Ah A—o Ah, 'C1

CH,

A—o Ah Ah, i ’ νπ, n .................... ^H Ůt,

A_íc-J‘-AJc_A_A_r_A_A_r_A_A_c_A_A_c_A_A_c_A_A_c ~A a A 8 A fl AU ^8 A 8 A 8 A 8 —_i‘

O OH h bt.

Η H

-A_A—C. A 8 •CH,

A₌O

Ah

Ah, i

h Ah,

-A-A—cA 8

Η H .A_A_

A

_A_A_c_J A 8

-A—C—NH,

A 8 (O,

Chemický vzorec (II) bibapcitid dikarboxylátu je znázorněn níže:

H,C •S

I

CH,

Η t) I II

H O I II

O

II

H O I II

H O I II

H O I II

H O I .11

H O I II

H O I II

H O I II

H O I II

C— N—C— C—N-C— C— Η— r— <— N-C— C— N—C—C—N—C— C—N-C— C—N-C— C— N— C— C— N-C— C—N-C—C— N— C— C—N—C—C—NH;

I I Η H

I I H CH,

I <Λ

O OH

1 H CH,

I

S

I

CH,

NH

C=O

I

CH,

I I H CH,

S

I

CH,

NH

I

C=O

I

CH»

I I H CH·» I S

Mí, í*

CH.

I

Ϊ

I í*

0, OH

V i

CH, c=o i

NH I

CH,

I S I

H CH,

CH?

C=O I

NH I

CH»

I s I

H CH»

0° (

f

HN n HOOC 7^° í

7*

C—N—C—C—NH,

HOOC , γ^,γ^γγ 7?77 7 7 7 7 7 7^Hj 7 7 7 7*77 7 7 7 7* ^-n-c-^-Y-c-^c-c-^y-c-n-c-c-n-c-c-n-c-c-n-c-c-n-c-c-n-c-c-n-c-c-n-c-c-n-c-cHO HO HO HO |o HOHO HO HO HO HO HO HO

H,Č

CH,

I

-s (H),

Přítomnost volných karboxylových skupin zajišťuje reagenciím prekurzoru vyšší rozpustnost než má bibapcitid ve vodních médiích. V tabulce 1 viz níže je například φ Φ · ·· · • · φφφφ • φφ • · · · ·· φφφ φφ φ φ φ φφφφ φφφφ φφφ φφφ φφ φφ φφ φφ znázorněno porovnání rozpustnosti bibapcitidu a bibapcitid dikarboxylátu v 0,1 M fosfátovém pufru při různých hodnotách pH, při teplotě místnosti.

Tabulka 1

Rozpustnosti

	Bibapcitid	Bibapcitid-(COO')2
pH 7	< 0,05 mg/ml	1,3 mg/ml
pH 8	< 0,05 mg/ml	1,3 mg/ml
pH 9	< 0,05 mg/ml	1,3 mg/ml

Je k dispozici bibapcitid od firmy Diatide, lne., Londonderry, NH U.S.A. Bibapcitid se může vyrábět například při použití syntézy peptidu na pevné fázi, jak je uvedeno v U.S. patentech č. 5,508,020 a 5,645,815; v USSN 08/253/317 a WO 93/23085; WO 93/25244; WO 94/23758; WO 94/07918 a WO 95/33496. Bibapcitid se s výhodou vyrábí při pH nižším než 4 a izoluje se jako triflouroctová sůl. Bibapcitid trifluoracetát se rozpouští za použití acetonitrilu nebo ethanolu a vody nebo vodného roztoku před formulací. Pro použití u savců jako je člověk je upřednostňováno rozpouštění v etanolu a vodě nebo ve vodném roztoku.

Bibapcitid monokarboxylát a bibapcitid dikarboxylát se výhodně vyrábí z bibapcitidu zvyšováním pH rozpuštěného bibapcitidu za použití vhodného pufru jako je například fosfátový pufr přizpůsobený na požadované pH, jak je znázorněno na Příkladu 1 nebo použití bikarbonátového pufru jak je popsáno v Příkladu 2.

Nejvýhodněji se bibapcitid monokarboxylát a bibapcitid dikarboxylát vyrábějí z lyofilizovaného bibapcitid trifluoracetátu s pufrem při fyziologickém pH. K úpravě pH bibapcitidu při výrobě bibapcitid monokarboxylátu a/nebo bibapcitid dikarboxylátu se může požít jakýkoliv pufr. Například fosfátový pufr, bikarbonátový pufr, borátový pufr, citrátový pufr, sulfátový pufr apod. může být použit k výrobě reagencií prekurzoru tohoto vynálezu. Bibapcitid monokarboxylát a/nebo bibapcitid dikarboxylát se alternativně může vyrábět enzymaticky, například použitím hydrolázy. Bibapcitid monokarboxylát a

0000 • · • 000

0 • · bibapcitid dikarboxylát se může izolovat a purifikovat známými způsoby, jako je například HPLC, jak je uvedeno v Příkladu 1 a 2.

Stability bibapcitidu, bibapcitid monokarboxylátu a bibapcitid dikarboxylátu při různých hodnotách pH jsou uvedeny níže v tabulce 2. Stabilita uvedená v tabulce 2 znamená 95% stabilitu při teplotě místnosti.

• 0 0 4

00

Tabulka 2

Stability

PH	Bibapcitid	Bibapcitid-(COO)	Bibapcitid-(COO')2
<4	> 5 hodin	minuty	minuty
4-5	1 -5 hodin	1 hodina	1 hodina
5-6	1 hodina	> 5 hodin	> 5 hodin
6-7	minuty	> 5 hodin	>2 dny
7-8	minuty	1 hodina	> 5 hodin
>8	minuty	minuty	1 hodina

Reagencie prekurzoru tohoto vynálezu se dodávají ve formě farmaceutického prostředku. Farmaceutický prostředek s výhodou obsahuje bibapcitid monokarboxylát nebo bibapcitid dikarboxylát. Výhodněji farmaceutický prostředek tohoto vynálezu obsahuje bibapcitid monokarboxylát i bibapcitid dikarboxylát. Nejvýhodněji farmaceutický prostředek tohoto vynálezu obsahuje bibapcitid monokarboxylát i bibapcitid dikarboxylát i bibapcitid. Množství bibapcitid monokarboxylátu i bibapcitid dikarboxylátu i bibapcitidu ve farmaceutickém prostředku je různé podle jednotlivých částí tohoto vynálezu. Komerčně vyráběný bibapcitid, prodávaný pod jménem ACUTEST™, typicky obsahuje mezi 10 % a 50 % bibapcitid monokarboxylátu a mezi 3 % a 12 % bibapcitid dikarboxylátu.

Farmaceutický prostředek tohoto vynálezu může dále obsahovat farmaceuticky přijatelný diluent nebo nosič, jako jsou například různé druhy příslušného albuminu. Pod φφ φφ ·· «φφφ • φ • · φφ • φ φφ

• φ · φ φφ φφ zde použitým pojmem „farmaceuticky přijatelný diluent nebo nosič“ patří rozpouštědla, disperzní média, antibakteriální a protiplísňové látky, izotonické látky, inhibitory enzymů apod. V oboru je používání takovýchto médií a látek dobře známo. Například infúze chloridu sodného a Ringerova roztoku patří mezi běžně používané diluenty. Reagencie prekurzoru se vyrábějí jakožto sterilní, apyrogenní, vodné roztoky vhodné pro parenterální použití, které mohou být volitelně skladovány v lyofilizované formě a rekonstituovány uživatelem. Příprava takovýchto roztoků vhodných pro parenterální použití, která mají požadované pH, izotonicitu a stabilitu apod. je v oboru známa.

Nové reagencie prekurzoru tohoto vynálezu se používají k výrobě diagnostických nebo léčebných látek, které jsou odvozeny od bibapcitidu. Mezi takovéto látky patří scintigrafické zobrazující látky pro záchyt a diagnostiku trombů, tak jak je podrobněji popsáno v U.S. patentech č. 5,508,020; 5,645,815; v USSN 08/253,317 a ve WO 93/23085; WO 93/25244; WO 94/23758; a WO 95/33496. Bibapcitid monokarboxylát a/nebo bibapcitid dikarboxylát se rovněž může použít k výrobě antitrombotických látek, jak je uvedeno ve WO 94/07918. Reagencie prekurzoru tohoto vynálezu se mohou také používat k výrobě antitrombotických látek, které obsahují cílový peptid odvozený od bibapcitidu, který je kovalentně navázán na trombolytickou proteinázu, jak je podrobně popsáno v podaných žádostech USSN 08/753,781 a USSN 08/982,981.

Pokud se reagencie prekurzoru tohoto vynálezu se používají k výrobě značených diagnostik nebo léčebných látek odvozených od bibapcitidu, může se použít jakákoliv značkovací látka, která generuje signál. Takovéto značkovací látky mohou být přímo inkorporovány do nebo spojeny s reagenciemi prekurzoru tohoto vynálezu jakýmkoliv způsobem, který je pro toto značení vhodný, buď přímou kovalentní nebo nekovalentní vazbou s reagenciemi prekurzoru nebo nepřímou kovalentní nebo nekovalentní vazbou. Mezi vhodné značkovací látky patří radioaktivní značkovací látky, fluorescenční značkovací látky, paramagnetické značkovací látky, těžké kovy nebo prvky vzácných zemin, které jsou vhodné pro použití při počítačové tomografii apod. Radioaktivní značkovací látky jsou upřednostňovány. Ještě výhodnější pro použití v tomto vynálezu jsou γ-emitující radionuklidy jako je například ¹²³l, ⁶⁷Ga,¹¹¹ In a ^mTc. Nejvýhodnější je ^99mTc, který se používá k označování reagencií prekurzoru tohoto vynálezu. Pokud se používá jako značkovací látka ^99mTc, přidává se ^99mTc k farmaceutickém prostředku, který obsahuje bibapcitid monokarboxylát a/nebo bibapcitid dikarboxylát při pH vyšším φ« ···· • · • ··· ·· ·· ·· ·· ···· ♦ · · *

J * ·♦ j· · • · · · · · ··«· ··· «♦· ·· ·♦ ·· ♦· než 5 a výsledná směs se zahřívá po určitou dobu při teplotě, která stačí ke vzniku monomeru apcitidu a radioaktivního označení zmíněného monomeru. Směs farmaceutického prostředku, která obsahuje bibapcitid monokarboxylát a/nebo bibapcitid dikarboxylát a ^99mTc, se s výhodou ohřívá po dobu 15 minut ve vroucí vodní lázni za vzniku scintigrafické zobrazující látky, která obsahuje apcitid značený ^mTc.

Značené nebo neznačené znázorňování trombů nebo antitrombotické látky se vyrábějí tak, že se živým savcům mohou používané reagencie prekurzoru tohoto vynálezu podávat nitrožilní cestou v kombinaci s farmaceuticky přijatelným nosičem. Podle tohoto vynálezu zobrazovací nebo antitrombotické látky se vyrábějí z farmaceutických prostředků, které obsahují bibapcitid monokarboxylát a/nebo bibapcitid dikarboxylát a které se podávají s výhodou v oddělených injekčních dávkách v jakémkoliv tradičním médiu určenému k nitrožilnímu podávání jako je například médium vodného fyziologického roztoku nebo v médiu krevní plasmy. Množství roztoku, který se používá pro jednotlivou injekční dávku, je od 0,01 ml do 10 ml.

Diagnostické nebo léčebné látky, které se vyrábějí z farmaceutických prostředků a které obsahují bibapcitid monokarboxylát a/nebo bibapcitid dikarboxylát se savcům s výhodou podávají v diagnosticky nebo léčebně účinném množství ve stádiu možného rizika trombotického onemocnění nebo v případě tohoto onemocnění. Zde použitý výraz „diagnosticky účinné množství“ znamená celkové množství každé aktivní složky farmaceutického prostředku diagnostické látky, které se vyrábí z bibapcitid monokarboxylátu a/nebo bibapcitid dikarboxylátu, nebo celkové množství tohoto prostředku, které je podáno ve formě diagnostické látky a které je má schopnost vytvořit měřitelný signál lokalizovaný in vivo v místě trombu. Zde použitý výraz „léčebně účinné množství“ znamená celkové množství každé aktivní složky farmaceutického prostředku léčebné látky, které se vyrábí z bibapcitid monokarboxylátu a/nebo bibapcitid dikarboxylátu, nebo celkové množství tohoto prostředku, které je podáno ve formě léčebné látky, které vykazuje dostatečně významnou výhodu pro pacienta, tj. snížení výskytu a závažnosti trombů v porovnání se skupinou pacientů, kteří tuto léčebnou látku nedostávali, jak je stanoveno ošetřujícím lékařem. Pokud se podává jedinci aktivní přísada samostatně pojem znamená vlastní přísadu. Pokud se podává v kombinaci, pojem znamená kombinované množství aktivních přísad, které mají výsledný diagnostický nebo léčebný účinek, ať už se podávají v kombinaci, po sobě nebo • 9 9999 • 9 9 9 99

99 9* 99

99 9 9 99 9

9 99 9 9 9 9

99· 99 9 9 9 99 9

9 9 9 9 9 9999

999 φ»· 99 ·9 ·9 99 současně. Například zobrazovací látky nebo léčebné látky, které se vyrábějí z bibapcitid monokarboxylátu a/nebo bibapcitid dikarboxylátu se mohou podávat v dávce od 0,1 do 10 mg/kg tělesné hmotnosti a podávají se nitrožilně buď najednou jako bolus nebo částečně jako bolus s následnou infuzí po dobu 1 až 2 hodin. Pokud se radiačně značené diagnostické nebo léčebné látky vyrábějí z bibapcitid monokarboxylátu a/nebo bibapcitid dikarboxylátu, jednotlivá podávaná dávka má radioaktivitu od 0,01 mCi do 100 mCi, s výhodou od 1 mCi do 20 mCi. Po nitrožilním podání se sleduje místo trombu určitým způsobem radiačního zobrazování in vivo. Způsoby výroby bibapcitid monokarboxylátu a bibapcitid dikarboxylátu jsou podrobněji uvedeny v následujících příkladech, které jsou uvedeny pro znázornění nikoliv však limitujícím způsobem.

Příklady provedení vynálezu

Příklad 1

Syntéza bibapcitid monokarboxylátu

Bibapcitid trifluoracetát (100 mg) se suspenduje v 10 ml acetonitrilu (CH₃CN), nechá se působit ultrazvuk po dobu jedné minuty a potom se naředí pomocí 40 ml vody (H2O). Peptid se rozpustí kompletně po přidání vody (H2O). K tomuto roztoku se přidá 40 ml 0,05 M fosfátu sodného při pH 7, což způsobí, že se roztok lehce zakalí. pH roztoku peptidu je 7,2. Roztok se nechá inkubovat ve vroucí vodní lázni po dobu tří minut, čímž vymizí zakalení. Pomocí analýzy HPLC se stanoví přítomnost bibapcitid dikarboxylátu, bibapcitid monokarboxylátu a bibapcitidu v přibližných množstvích 26 %, % a 14 %. Reakční roztok se přidal přímo na sloupce 47 x 300 mm delta-Pak C18 ustálené v 10 mmol hydrogenuhličitanu amonného (NH4HCO3) upraveného na pH 6 až 6,5 pomocí tuhého CO2 (pohyblivá fáze C). Sloupec se poléval pohyblivou fází C po dobu pěti minut, následoval gradient od 100/0 C/D do 90/10 C/D po dobu pěti minut a potom od 90/10 C/D do 80/20 C/D po dobu 30 minut (pohyblivá fáze D = 10 mmol NH4HCO3 v 75/25 CH3CN/H2O při pH 6 až 6,5). HPLC pufry se průběžně udržovaly při pH 6 až 6,5 pomocí tuhého CO2. Frakce se sbíraly na základě monitorování efluentu při 220 nm. Frakce se potom analyzovaly pomocí analytické HPLC a ty, které byly zjištěny, ti« titititi • ti • ti titi • ti titi ti titi ti titi·· • · · · titi ti titi ti • ti titi • ti titi ► » · a > titi « • ti ti ti

.......

že obsahují čistý (>_98 %) bibapcitid monokarboxylát se sloučily a lyofilizovaly tak, aby se získalo přibližně 30 mg bibapcitid monokarboxylátu (30% výnos) ve formě soli uhličitanu amonného, bílého prášku. Takto provedená analýza NMR bibapcitid monokarboxylátu (20 % CD3CN/80%H2O, pH 6, T = 20 °C) je uvedena v tabulce 3 viz níže.

♦ ···

Chemické údaje (δ, ppm) pro bibapcitid monokarboxylát

9*9 9999 #999

999 9 9 99 9 9 9 ·

999 99 999 99 9

9 9999 9999

9999 999 99 99 99 99

Tabulka 3

Aminokyselina	NHiAmid)	a-CH ·	Další protony v aminokyselině
D-Tyr'	8,57	4,54	3,00 (CH,) 3,37,3,43 (CO-CH,-S) 6,85, 7,15 (aromatic)
Apc2	8,45	4,49	2.81,2.89 (CH,) 3,06 (CH,-NH2) ' 2,50 (-S-CH,) 1,90 (CH.-CHj-CHj)
Gly3	8,36	3,09,4,90
Asp4	8,40	4,63	9,67 (CH,)
Cys5	8,33	4,46	3,.00,3.08
Gly6	8,41	4,00
Gly7	8,16	4,02
Cys8	8,30	4,61	2,95,3,13
Gly’	8,47	4,01
Cys10*	8,25; 8,26	4,62; 4,64	2,93,3χ 13; 2,94,3,14
Acm8·10	8,50	V3	2,03 (CH3)
Gly11	8,50	3,99
Gly12	8,23	4,01
Cys13*	8,31; 8,54	4,65; 4,52	3,25; 3,05
C-terminal amide	7,65,7,11; 7,60,7,11; 7,64, 7,19
í_z* Ha 7 / H.C 0			H, 4,11,4,08* Hb 3,37,3,35* Hc2,72,2,69* CH, 5,12,4,69*
L/- n>-7 γ-κ= “'„Λ0 7 'o			Ha 3,.66,3,62* Hb 2,86,2,84* Hc 2,62,2,60* CH, 5,12, 4,69* NH 8,50, 8,63*

Diasterometrické rezonance ftft ftft· · ftft ·· ftft ·· ftftft ftftftft ftftftft • ftftft · ftftft · ftft ft ft ftftft ftft ftftft ftft · • · ftftftft ftftftft

........ ** ’· ··

Příklad 2

Syntéza bibapcitid dikarboxylátu

Bibapcitid trifluoracetát (100 mg) se suspenduje v 5 ml CH₃CN, nechá se působit ultrazvuk po dobu jedné minuty a potom se naředí pomocí 25 ml H₂O. Peptid se rozpustí kompletně po přidání H₂O. K tomuto roztoku se přidá jeden ml nasyceného hydrogenuhličitanu sodného (NaHC0₃) a 0,5 ml 1 M uhličitanu draselného (K₂CO₃). pH roztoku peptidu bylo pomocí pH papírku stanoveno na 8,5. Roztok se lehce zakalí po přidání K₂CO₃, zakalení pomalu vymizí během dvou hodin při teplotě místnosti. Po uplynutí tří hodin bylo stanoveno analýzou HPLC, že reakce obsahuje 84 % bibapcitid dikarboxylátu. Reakční roztok se přidal přímo na sloupce 47 x 300 mm delta-Pak C18 ustálené v 10 mmol hydrogenuhličitanu amonného (NH₄HCO₃) upraveného na pH 6 až 6,5 pomocí tuhého CO₂ (pohyblivá fáze C). Sloupec se poléval 100% pohyblivou fází C po dobu pěti minut, následoval gradient od 100/0 C/D do 90/10 C/D po dobu pěti minut a potom od 90/10 C/D do 70/30 C/D po dobu 30 minut. HPLC pufry se průběžně udržovaly při pH 6 až 6,5 pomocí tuhého CO₂. Frakce se sbíraly na základě monitorování efluentu při 220 nm. Frakce se potom analyzovaly pomocí analytické HPLC a ty, které byly zjištěny, že obsahují čistý (>,98 %) bibapcitid dikarboxylát se sloučily a lyofilizovaly tak, aby se získalo přibližně 54 mg bibapcitid dikarboxylátu (obsah peptidu 86 %, izolovaný výnos 53 %) ve formě soli uhličitanu amonného, bílého prášku. Takto provedená analýza NMR bibapcitid dikarboxylátu (20% CD₃CN/80% H₂O, pH 6, T = 20 °C) je uvedena v tabulce 4 viz níže.

Chemické údaje (δ, ppm) pro bibapcitid dikarboxylát • ft ··»· ·» ·« • * * · · · · • · ftft ft · ftft ft ·«··«· • · · · · · ft······ ftft ftft ·· ·· ft ftft · ft · · « • ftft ft • · · ft • ft ftft

Tabulka 4

Aminokyselina	NH Amid	a-CH	Další protony v aminokyselině
D-Tyr*	8,53	V3	3,01 (CHj) 3,39,3,42 (CO-CH.-S) 6,86,7,17 (aromatic)
Apc2	8,37	4,5!	2,83,79 ] (CHJ 3,06 (CK-NHJ 2,51 (-S-CH,) 1,92 (CHj-CHj-CHJ
Gly3	8,34	3,88,4,09
Asp4	8,37	4,66	2,75 (CH,)
Cys5	$.30	4,45	3,00,3,08
Gly6	8^35	3,98
Gly’	8,10	5.OI
Cys8	8,27	4,61	2,97,3,14
Gly’	8,41	4,00
Cys”	8,21	4,63	2,96,3,14
AcmSJ0	8,45	4,33	2,03 (CH3)
Gly“	8,47	4,01
Gly'2	8,18	4/)0
Cys13*	8,30; 8,50	4,54; 4,53	3,15; 3,09
C-terminal amide*	7,63, 7,05; 7,58, 7,05
s u 1/* \ Hc HOOC / H,C A 0			Ha 3,70, 3,67* Major hydrolysis Hb 2,86, 2,85* product (>80% by Hc 2,63,2,62* NMR) CH2 ý68 NH 8,54
S u i/Hb ' Ha-W YHc COOH NH / H2C 0			H, 3,78,3,75* Minor hydrolysis Hb 2,89,2,88* product (<20% by Hc 2,69,2,67* NMR) CH, 4,73,4,72* NH 8,80, 8,74*

* Diasterometrické rezonance ti· 999· ti ti titititi titi titi ti* titi ti ·· ti ti titi ti ti ti titi titititi ti tititi titi tititi ti* ti • titititi titititi titititi· ti· titi titi titi

Je pochopitelné, že následující objev zdůrazňuje určité specifické částí tohoto vynálezu a že všechny modifikace nebo jejich ekvivalenty patří do rámce tohoto vynálezu tak, jakje uvedeno v přiložených patentových nárocích.

Claims (10)

1. Prekurzorové činidlo vyznačující se tím, že obsahuje bibapcitid monokarboxylát.

2. Prekurzorové činidlo vyznačující se tím, že obsahuje bibapcitid dikarboxylát.

3. Prostředek vyznačující se tím, že obsahuje bibapcitid monokarboxylát.

4. Prostředek podle nároku 3 vyznačující se tím, že dále ještě obsahuje bibapcitid dikarboxylát.

5. Prostředek podle nároku 4 vyznačující se tím, že dále ještě obsahuje bibapcitid.

6. Prostředek vyznačující se tím, že obsahuje bibapcitid monokarboxylát.

7. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje bibapcitid monokarboxylát a farmaceuticky přijatelný nosič.

8. Farmaceutický prostředek podle nároku 7 vyznačující se tím, že dále ještě obsahuje bibapcitid dikarboxylát.

9. Farmaceutický prostředek podle nároku 8 vyznačující se tím, že dále ještě obsahuje bibapcitid.

10. Farmaceutický prostředek vyznačující se tím, že obsahuje bibapcitid dikarboxylát a farmaceuticky přijatelný nosič.