CZ20001053A3 - Diagnostický test na Alzheimerovu chorobu - Google Patents

Abstract

Způsob diagnózy Alzheimerovy choroby u pacienta, který se skládá z následujících kroků: 1) zajištění vzorku příslušné tělní tekutiny od řečeného pacienta; 2) detekce přítomnosti acetylcholinesterázy s porušenou glykosylaci v řečeném vzorku. Bylo zjištěno, že zhruba 75 až 95 % acetylcholinesterázy v mozkomíšním moku pacientů s Alzheimerovou chorobou se váže na Concavalin A, Con A nebo pšeničný zárodečný aglutinin (WGA), ovšem s odlišnou specifitou ke každému. Abnormální izoforma acetylcholinesterázy s porušenou glykosylacije charakteristická relativně nižší afinitou k Con A a relativně vyšší afinitou k WGA oproti acetylcholinesteráze s neporušenou glykosylaci.

Description

Diagnostický test na Alzheimerovu chorobu

Oblast techniky
Předkládaný vynález Alzheimerovu chorobu.	se	týká	diagnostického	testu na
Dosavadní stav techniky
Alzheimerova choroba	je	časté	onemocnění	charakterizované
progresivní demencí.	Tato	nemoc	zahrnuje	ztrátu	paměti a

vyšších kognitivních funkcí. Pro onemocnění jsou typická depozita v mozku postižených lidí. Tato depozita se nalézají extracelulárně (amyloidní plaky) i intracelulárně (neurofibrilární klubíčka). Hlavní složkou amyloidních plaků je amyloidový protein (Αβ), který je tvořen proteolytickým štěpením prekurzoru amyloidového proteinu (APP) (Evin et al., 1994). Hlavní složkou neurofibrilárních klubíček je cytoskeletální protein tau (Kosik, 1992).

Jednou z charakteristických neurochemických změn pozorovaných u Alzheimerovy choroby je ztráta aktivity acetylcholinesterázy a cholinacetyltransferázy v oblastech mozku jako je například mozková kůra, hipokampus, amygdala a nucleus basalis (Whitehouse et al., 1981, 1982; Struble et al., 1982; Mesulam a Geula, 1988). Ztráta cholinergní struktury a markérů koreluje s počtem přítomných plaků a klubíčkových lézí, stejně tak jako s klinickou závažností onemocnění (Perry et al., 1978; Wilcock et al., 1982; Neary et al., 1986; Perry 1986).

Určení přesné diagnózy Alzheimerovy choroby je pro pacienta nezbytné. Avšak přesnost klinického vyšetření je přinejlepším 80%. Z tohoto důvodu existuje potřeba nalézt specifické biochemické markéry pro Alzheimerovu chorobu. Doposud nebyl nalezen analýzou krve nebo mozkomíšního moku biochemický markér, který by měl dostatečnou diagnostickou hodnotu (Blass et al., 1998), ačkoli byly popsány detekovatelně rozdíly v hladinách určitých proteinů (Motter et al., 1995).

Stanovení hladin aktivity acetylcholinesterázy v krvi a v mozkomíšním moku bylo navrženo jako in vivo diagnostický test na Alzheimerovu chorobu. Nebylo však dosaženo shody, zdali jsou hladiny acetylcholinesterázy v těchto tělních tekutinách opravdu ovlivněny. U pacientů s Alzheimerovou chorobou bylo popsáno zvýšení (Perry at al., 1982; Atack et al., 1985), snížení (Nakano et al., 1986; Yamamoto et al., 1990) nebo žádná změna (St.Clair et al., 1986; Sirvio et al., 1989) koncentrace sérové nebo plazmatické acetylcholinesterázy. Hladina acetylcholinesterázy v erytrocytech byla popsána buďto jako nezměněná (Atack et al., 1985; Perry et al., 1982), nebo snížená (Chipperfield et al., 1981). Hladina aktivity acetylcholinesterázy v mozkomíšním moku pacientů s Alzheimerovou chorobou byla popsána jako snížená (naposledy v pracích Appleyard a McDonald, 1992; Shen et al., 1993), nebo nezměněná (naposledy v pracích Appleyard et al, 1987; Ruberg et al., 1987).

Bylo prokázáno, že acetylcholinesteráza existuje v šesti molekulových izoformách, z nichž tři jsou monomerní (Gl), čimerní ((G2) a tetramerní (G4) izoformy (Massoulié et al., 1993) . Relativní poměr jednotlivých izoforem acetylcholinesterázy je u Alzheimerovy choroby významně ovlivněn, kdy je snížena G4 izoforma v parietální kůře (Atack et al., 1983) a zvýšena Gl izoforma (Arendt et al., 1992). Podobné změny byly identifikovány i v jiných oblastech mozku pacientů s Alzheimerovou chorobou. Tyto oblasti zahrnují Brodmanovy oblasti 9, 10, 11, 21 a 40 a také amygdalu (Fishman et al., 1986). Asymetrické izoformy s kolagenovým koncem (A12) jsou zvýšeny v Brodmanově oblasti 21 až o 400%, ačkoli představují pouze stopové množství celkové acetylcholinesterázy v lidském mozku (Younkin et al., 1986).

• ·

Avšak doposud nebyly změny v expresi a rozloženi izoforem acetylcholinesterázy shledány, že by měly dostatečnou senzitivitu nebo specifitu jako užitečný diagnostický markér pro Alzheimerovu chorobu.

V mozkomišnim moku pacientů s Alzheimerovou chorobou byly nalezeny anomálni izoformy acetylcholinesterázy, které lze odlišit podle jejich izoelektrického bodu (Navaratnam et al., 1991; Smith et al., 1991). Metoda pro plošné vyhledáváni Alzheimerovy choroby, která je založena na těchto poznatcích, je popsána v patentu US patent č. 5200324 z určení pomocí izoelektrické fokusace, v mozkomišnim moku přítomnu . Metoda se skládá zdali má pacient anomálni formu acetylcholinesterázy. Avšak izoformy detekované Navartnamem et al. a Smithem et al. byly také detekovány v mozkomišnim moku pacientů s jinými neurologickými chorobami (Shen a Zhang, 1993) . Toto je uvedeno v patentu US patent č. 5200324 ve sloupci 7, řádky acetylcholinesteráza pacientů s klinickou

19-22, kde stojí, že anomálni 'byla přítomna v mozkomišnim moku u 4 z 8 diagnózou možné demence, kteří však nesplňovaly přísná histopatologická kritéria pro Alzheimerovu chorobu.

Navíc pasáž ve sloupci 7, řádky 60-61 v US patentu ukazuje, že detekce acetylcholinesterázy v lumbálním mozkomišnim moku závisí na množství analyzovaného mozkomíšního moku. Ve sloupci 8, řádky 38-40 se uvádí, že anomálni proužek byl často spíše slabší a že provedení elektroforézy nebylo vždy ideální. Z tohoto důvodu byla upravena nanáška na 5 mU na stopu jako standardní postup pro vyšetřování mozkomíšního moku v přítomnosti anomálních forem acetylcholinesterázy a každý gel byl odečítán nezávisle 4 osobami, které zaznamenávali svoji interpretaci. To ukazuje na technické problémy popsaného stanoveni, které mohou být překonány pouze přizpůsobením arbitrárních podmínek, aby se vyloučily falešně pozitivní výsledky, které samozřejmě činí interpretaci výsledků obtížnou.

Myšlenka, že anomálni formy acetylcholinesterázy detekované Navaratnamem et al. a Smithem et al. nejsou specifické pro pacienty s Alzheimerovou chorobou, spolu s technickými problémy spojenými s popsanou metodou v US patentu č. 5200324, naznačuje, že abnormální elektroformy acetylcholinesterázy objevené Navaratnamem et al. a Smithem et al. neutvoří diagnostický test pro pacienty s Alzheimerovou chorobou, který by byl vhodný pro klinické použití.

Popis vynálezu

Existuje potřeba diagnostického testu pro Alzheimerovu chorobu, která by byla založena na biochemické analýze tělních tekutin, jako je například krev nebo mozkomíšní mok. Předkládaný vynález zajišťuje takový test, jehož podstatou je fakt, že acetylcholinesteráza pacientů s Alzheimerovou chorobou je odlišně glykosylovaná než acetylcholinesteráza ve skupinách bez Alzheimerovy choroby.

Podle prvního aspektu předkládaného vynálezu je zajištěna diagnostická metoda pro Alzheimerovu chorobu. Tato metoda se skládá z následujících kroků:

1) zajištění vzorku příslušné tělní tekutiny od řečeného pacienta;

2) detekce acetylcholinesterázy s porušenou glykosylací v řečeném vzorku.

V jedné formě předkládaného vynálezu je měřen relativní poměr acetylcholinesterázy s jedním typem glykosylace a acetylcholinesterázy s druhým typem glykosylace.

Měření relativního poměru acetylcholinesterázy s jedním typem glykosylace a acetylcholinesterázy s druhým typem glykosylace může být provedeno jakýmkoli příhodným způsobem, například použitím technik 'biochemické analýzy jako je HPLC a hmotová

• 4

44444 4 4

spektrometrie, nebo imunologické techniky, jako je například ELISA stanovení. Zejména preferovaným způsobem měření relativních poměrů izoforem acetylcholinesterázy je lektinvazebná analýza.

Bylo prokázáno, že přibližně 75-95% acetylcholinesterázy v mozkomíšním moku pacientů s Alzheimerovou chorobou se váže na Concavalin A nebo pšeničný zárodečný aglutinin, ovšem s odlišnou specifitou ke každému. Z tohoto důvodu v zejména preferované formě předkládaného vynálezu je určována vazba ke Concavalinu A a následně k pšeničnému zárodečnému aglutinu za účelem identifikace typu glykosylace acetylcholinesterázy. Poté je spočítán poměr jednotlivých vazeb. Je zejména vhodné měřit v každém experimentu aktivitu nenavázané acetylcholinesterázy a poté určit poměr acetylcholinesterázy nenavázané ke Concavalinu A a acetylcholinesterázy nenavázané k pšeničnému zárodečnému aglutininu. Tento poměr je uváděn v předkládaném vynálezu jako C/W poměr. U pacientů s Alzheimerovou chorobou je C/W poměr obecně nad 0,95, zatímco jedinci bez Alzheimerovy choroby mají C/W poměr typicky pod 0,95.

Celková aktivita acetylcholinesterázy je s výhodou měřena jako C/W poměr vyjádřený proti aktivitě acetylcholinesterázy.

V alternativní formě předkládaného vynálezu je zajištěna monoklonální protilátka, která je specifická pro acetylcholinesterázu s porušenou glykosylaci, a která je používána k detekci tohoto typu acetylcholinesterázy. Monoklonální protilátka je typicky MA3-042 (klon HR2), která je dostupná od společnosti Chemicon International lne., Temecula, Kalifornie. Mohou být použity i jiné vhodné monoklonální protilátky, například MA304 (klon AE1), také dostupné od Chemicon International lne.

00 0 0 0 0 0 0 0 · >0 0

000 0000 000 0000 00 0 00 00

Je předpokládáno, že abnormální izoforma je amfifilní, monomerní izoforma acetylcholinesterázy a/nebo amfifilní, dimerická izoforma acetylcholinesterázy.

Analyzovaná tělní tekutina může být mozkomíšní mok, krev nebo krevní plazma. Pokud je řečenou tělní tekutinou krev, je krevní plazma s výhodou připravena z krve určené k analýze. Krevní plazma je upravena před analýzou za účelem odstranění nebo inaktivace butyrylcholinesterázy.

Podle druhého aspektu předkládaného vynálezu je zajištěna abnormální izoforma acetylcholinesterázy s porušenou glykosylací, která je amfifilní, monomerní izoformou acetylcholinesterázy, a která je charakterizována relativně menší afinitou ke Concavalinu A a relativně větší afinitou k pšeničnému zárodečnému aglutininu než acetylcholinesteráza s neporušenou gylkosylací.

Podle třetího aspektu předkládaného vynálezu je zajištěna abnormální izoforma acetylcholinesterázy s porušenou glykosylací, která je amfifilní, dimerickou izoformou acetylcholinesterázy, a která je charakterizována relativně menší afinitou ke Concavalinu A a relativně větší afinitou k pšeničnému zárodečnému aglutininu než acetylcholinesteráza s porušenou glykosylací.

Stručný popis obrázků

Obrázek 1 je graf C/W poměru u pacientů v kontrolní skupině, u pacientů s Alzheimerovou chorobou, u pacientů s jinými neurologickými onemocněními odlišnými od Alzheimerovy choroby a u pacientů s demencí, která není Alzheimerova typu. Kroužky představují ventrikulární mozkomíšní mok, trojúhelníčky představují lumbální mozkomíšní mok, otevřené symboly znamenají 60 a více let, černé symboly 60 a méně let. Průměrné hodnoty jsou vyjádřeny ± S.E.M. * = signifikantně odlišné od • 9 •» ·

9 9 • 9 • 9 9 · · · ·

9 9 9 9 9

999999 99 9

9999 99

Alzheimerovy choroby (p < 0,001). Experiment je popsán v Příkladu 1.

Obrázek 2 znázorňuje graf C/W poměru vs. aktivita acetylcholinesterázy v post mortem odebraných vzorcích lidského mozkomíšního moku. Čárkované linky ukazují hodnoty C/W a aktivity acetylcholinesterázy, které maximálně odlišují skupinu pacientů s'Alzheimerovou chorobou od skupiny bez této choroby. Přibližně 80% všech vzorků pacientů s Alzheimerovou chorobou bylo nad cut-off hodnotou C/W = 0,95, zatímco všechny vzorky byly nad hodnotou 0,60. Podobně všechny vzorky pacientů s Alzheimerovou chorobou měly aktivitu acetylcholinesterázy menší než 15,8 U/ml. Experiment je popsán v Příkladu 2.

Na Obrázku 3 je uvedena aktivita acetylcholinesterázy vs. číslo frakce po hydrofobni interakční chromatografií acetylcholinesterázy z mozkomíšního moku na fenylagaróze. Vzorky mozkomíšního moku od pacientů Alzheimerovou chorobou (otevřená kolečka), nebo kontrol (uzavřená kolečka) byly aplikovány na 10 ml kolony fenylagarózy. Hydrofilní izoformy acetylcholinesterázy byly eluovány 50 mM Tris salinickým pufrem a navázané amfifilní izoformy byly eluovány 50 mM Tris-HCl (pH 7,4), obsahující 2% (w/v) Tritonu X-100. Frakce po 1,4 ml byly sbírány a analyzovány na aktivitu acetylcholinesterázy.

Na Obrázku 4 je uvedena analýza izoforem acetylcholinesterázy a glykosylace v mozkomíšním moku pacientů s Alzheimerovou chorobou a kontrol. Hydrofilní a amfifilní frakce byly získány z celkové frakce mozkomíšního moku pomocí hydrofobni interakční chromatografie (Obr. 2) . Byl určen poměr C/W v celém mozkomíšním moku a v hydrofilních i amfifilních frakcích. Poté byly frakce centrifugovány v 5-20% denzitním gradientu sacharózy obsahující 0,5% (w/v) Brij 97. Centrifugace probíhala při 150 000 g po dobu 18 hodin. Frakce ze sacharózového gradientu byly sbírány a analyzovány na aktivitu acetylcholinesterázy. Enzymy se známými sedimentačními • 0« 00 0 ·0 ·0

0 0 0 000 0000

0 0000 000·

0 0 · 00000 00 00 ·

000 0000 000 0000 00 · 00 00 koeficienty, kataláza (C, 11,4S) a alkalická fosfatáza (P,

6,1S) byly použity k určení přibližných sedimentačních koeficientů izoforem acetylcholinesterázy.

Na Obrázku 5 je uvedena analýza izoforem acetylcholinesterázy a glykosylace ve frontální mozkové kůře a v mozečku kontrolních jedinců, jedinců bez demence s difúzními plaky a u pacientů s Alzheimerovou chorobou. Vzorky mozku byly homogenizovány a extrahovány, aby mohly být získány SS a TS frakce. Stejné' objemy SS a TS frakcí byly smíšeny a centrifugovány v 5-20% denzitním gradientu sacharózy obsahující 0,5% (w/v) Brij 97.

Centrifugace probíhala při 150 000 g po dobu 18 hodin. Frakce byly sbírány a analyzovány na aktivitu acetylcholinesterázy. Jednotlivé izoformy acetylcholinesterázy byly identifikovány pomocí jejich sedimentačních konstant za použití enzymových markérů: kataláza (C, 11,4S) a alkalická fosfatáza (P, 6,1S).

Enzymová maxima acetylcholinesterázy G₄ a G₂ + Gi byla sebrána, zakoncentrována a dialyzována za účelem odstranění sacharózy. Hlavní G₄ a G₂ + Gi maxima byla poté analyzována stanovením vazby k lektinu za použití Concavalinu A a pšeničného zárodečného aglutininu. Pro každé maximum byl určen poměr C/W.

Na obrázku 6 je ukázán efekt monoklonální protilátky ΜΆ3-042 na sedimentační rychlost izoforem acetylcholinesterázy z lidské frontální mozkové kůry, jak je popsáno v Příkladu 3.

Příklady provedení vynálezu

Použité zkratky:

Ache = acetylcholinesteráza, Che = cholinesteráza, Αβ = amyloid β protein, AD = Alzheimerova choroba, DP = difúzní plaky, ND = jiná neurologická onemocnění, PMI = post mortem interval, PBS = fosfátový salinický pufr, TB = Tris pufr, TSB = Tris salinický pufr, SS = solemi rozpustný supernatant, TS = Tritonem X-100 rozpustný supernatant, AF = amfifilní frakce, HF = hydrofilní »0 • 0 • 00 0000

000 9 ·· *

9 0900 0 0 0 0 0

0 0 0 0 9 0

0 09 *· frakce, G^a = globulární amfifilní izoforma, G^na globulární nonamfifilní izoforma, a aglutininy z Canavalia ensiformis (Concavalin A) , ConA, Triticum vulgaris (pšeničný zárodečný aglutinin) = WGA, Ricinus communis = RCAi₂₀, Lens culinaris = LCA, Dolichus biflorus, DBA, Ulex europaeus = UEA_IZ Glycine max = SBA a Arachis hypogaea, PNA.

Materiál

Imobilizované lektiny (ConA- a LCA-Sefaróza, WGA-, RCAi₂₀-, DBA, UEAi-, SBA a PNA-garóza), fenylagaróza, bovinní jaterní kataláza, alkalická fosfatáza získaná z E.coli, polyoxyetylén10-oleyl éter (Brij 97), Triton X-100, tetraizopropyl pyrofosforamid (izo-OMPA), 1,5-bis(4-alyldimetyl-amoniumfenyl)pentan-3-1 dibromid (BW284c51), acetylthiocholin jodid a 5,5'dithio-bis-2-nitrobenzoová kyselina (DTNB) byly získány od společnosti Sigma-Aldrich Pty. Ltd. (Seven Hills, NSW, Austrálie). Sefaróza CL-4B byla zakoupena od společnosti Pharmacia Biotech AB (Uppsala, Švédsko).

Přiklad 1

Lektin vazebné experimenty u pacientů s Alzheimerovou chorobou

Lumbální nebo ventrikulární mozkomíšní mok byl získán post mortem od 18 kontrolních jedinců s žádnými klinickými nebo patologickými známkami demence a s žádnými známkami mozkové patologie, dále od 27 případů Alzheimerovy choroby, 7 případů demence, která neměla původ v Alzheimerově chorobě (DNAT, 5 případů demence frontálního laloku, 1 případ demence s Lewyho tělísky/Parkinsonovou chorobou a 1 případ multiinfarktové demence/kongofilní amyloidní angiopatie), a od 6 případů s jinými neurologickými onemocněními (ND, 4 případy případ schizofrenie a 1 případ Průměrný věk v kontrolní skupině byl 68±4 roky, bylo zde 10 žen a 8 mužů a PMI byl 40±6. Ve skupině AD byl věk 81±2 roky, bylo zde 13 žen a 14 mužů a PMI byl 35±6. Ve skupině ND byl věk 65±6 roky, byly zde 3 ženy a 3

Huntingtonovy choroby, 1 kortikobazální degenerace) • · · • · η · · ······ ιυ ··· ···· ·· · ·· ·· muži a PMI byl 45±12. Ve skupině DNAT byl věk 7 6±3 roky, byly zde 4 ženy a 3 muži a PMI byl 34±11. Vzorky mozkomíšního moku byly zamraženy na -70°C a centrifugovány při 1000 g po dobu 15 minut před analýzou. Aktivita acetylcholinesterázy byla stanovena při teplotě 22°C modifikovanou mikrometodou dle Ellmana (Ellman et al, 1961). Alikvóty (0,3 ml) byly smíšeny s 0,1 ml Sefarózy 4B v PBS (kontrola), Concavalinem A (ConA) nebo pšeničným zárodečným aglutininem (WGA, Triticum vulgaris) a imobilizovány na Sefaróze. Enzym-lektinová směs byla přes noc inkubována při teplotě 4°C a poté centrifugována (1000 g, 15 minut). Ve frakcích supernatantu byla stanovena aktivita acetylcholinesterázy. Data byla analyzována za použití Studentova t-testu.

Celkové hodnoty acetylcholinesterázy ve vzorcích mozkomíšního moku jedinců starších 60 let byly signifikantně nižší ve skupině pacientů s Alzheimerovou chorobou (6,98±0,82 nmol/min/ml) než u kontrol (17,24±4,28 nmol/min/ml, p<0,001). Avšak podobně jako bylo popsáno dříve (Appleyard et al., 1983), zabraňuje velké překrývání (40%) hodnot použiti celkové acetylcholinesterázy jako signifikantního diagnostického markéru.

Avšak lektin-vazebná analýza prokázala signifikantní rozdíl mezi skupinou pacientů s Alzheimerovou chorobou a kontrolami. Přibližně 75-95% acetylcholinesterázy v mozkomíšním moku se vázalo na ConA nebo WGA. C/W poměr byl definován jako acetylcholinesteráza nenavázaná na ConA děleno acetylcholinesteráza nenavázaná na WGA. Průměr C/W poměrů pro skupinu pacientů s Alzheimerovou chorobou byl signifikantně odlišný od kontrol (Obrázek 1) . Z 27 vzorků mozkomíšního moku od pacientů s potvrzenou Alzeheimerovou chorobou byl u 21 vzorků C/W poměr >0,95. Všech 18 kontrolních vzorků mělo C/W poměr <0,95, bez signifikantních rozdílů mezi vzorky mladších (n=5, C/W = 0,37 ± 0,10) a starších jedinců (n=6, 0,38 ± 0,08).

• · · · · · · • · · · · ·· · • ······· ·· · post mortem Obrázku 1.

íi

Nebyla nalezena korelace mezi C/W poměrem a intervalem (PMI). Data jsou graficky zobrazena na

Data ukazují, že lektin vazebná analýza acetylcholinesterázy v mozkomišnim moku by se mohla stát diagnostickým testem na Alzheimerovu chorobu s 80% senzitivitou a 97% specifitou. Proto bylo navrženo použití testování rozdílů v glykosylaci acetylcholinesterázy v mozkomišnim moku jako ante mortem diagnostický markér pro Alzheimerovu chorobu, zejména je-li použit v kombinaci s ostatními biochemickými markéry.

Příklad 2

Další lektin-vazebné experimenty

Experimentální postupy

Lidský mozek a vzorky mozkomíšního moku

Ventrikulární nebo lumbální mozkomíšní mok a vzorky frontální mozkové kůry a mozečku byly získány post mortem a uskladněny při -80°C. Byl definovány tři skupiny vzorků bez postižení Alzheimerovou chorobou: 1) kontroly bez klinických nebo patologických známek demence (n=18), 2) jedinci bez klinických známek demence, ale s určitým počtem non-neuritických Abimunoreaktivních difúzních plaků (DP), avšak bez známek neokortikálních neurofibrilárních změn (n=6), a 3) jedinci s různými neurologickými onemocněními (ND) zahrnujícími 7 případů demence, která neměla původ v Alzheimerově chorobě (5 případů demence frontálního laloku, 1 případ demence s Lewyho tělísky a 1 případ vaskulární demence), a 7 případů s jinými neurologickými onemocněními (4 případy Huntingtonovy choroby, 1 případ Parkinsonovy choroby, 1 případ schizofrenie a 1 případ kortikobazální degenerace). Případy Alzheimerovy choroby byly vybrány na základě anamnézy demence a neurologické CERAD diagnózy (Mirra et. al. 1994). Všechny vzorky mozkomíšního moku ze skupin AD a ND byly získány ventrikulární punkcí a pouze 5 kontrol a 1 DP vzorek mozkomíšního moku (z celkového množství 18 a 6 jedinců, respektive) byly získány lumbální punkcí.

• 0

Imunohistochemické vyšetření vzorků mozečku prokázalo ve shodě s předchozími studiemi (Mann et al., 1996), že na rozdíl od frontální kůry žádný vzorek tkáně jedinců s Alzheimerovou chorobou neobsahoval kompaktní depozita amyloidních plaků (údaje nejsou zobrazeny).

Bylo prokázáno (Grassi et al., 1982 Fishman et al., 1986; SáezValero et al., 1993), že pro post mortem interval (PMI) delší než 72 hodin způsobuje uskladnění při teplotě -20°C nebo opakované zamrazení a rozmražení degradaci acetylcholinesterázy, která znemožňuje validní glykosylační analýzu. Z tohoto důvodu byly použity pouze vzorky s PMI kratším než 72 hodin (PMI = 36 ± 4 hodiny) . Mezi jednotlivými skupinami nebo vzorky nebyly patrné významné rozdíly v PMI.

Příprava vzorků a extrakce acetylcholinesterázy

Vzorky mozkomíšního moku byly pomalu rozmraženy při teplotě 4°C a poté před použitím centrifugovány při 1000 g po dobu 15 minut. Malé kousky (0,5g) frontální mozkové kůry a mozečku byly pomalu rozmraženy při teplotě 4°C, zváženy a zhomogenizovány (10% w/v) v ledovém Tris-salinickém pufru (TSB; 50 mM Tris-HCl, 1 M NaCI a 50 mM MgCl₂, pH 7,4) obsahujícím koktejl inhibitorů proteáz (Silman et al., 1978). Tkáně byly homogenizovány skleněným/teflonovým homogenízátorem a poté rozbity ultrazvukem 10-15 salvami při 50% intermitenci při nastavení 4 za použití sonikačního přístroje Branson. Suspenze byla centrifugována při 100000 g při teplotě 4°C v ultracentrifúze Beckman L8-80M za použití rotoru 70,1 Ti po dobu 1 hodiny za účelem získání v solích rozpustné frakce cholinesterázy (SS). Peleta byla reextrahována stejným objemem TSB obsahujícím 1% (w/v) Triton X-100 a suspenze byla centrifugována při 100000 g při teplotě 4°C po dobu 1 hodiny za účelem získání v Tritonu X-100 rozpustné frakce (TS). Tato dvojitě extrakční metoda vedla • · · · · • · · · · · • · · · · · · ····· · · ·· · • · · · · · • ·· ·· k zisku 80-90% celkové aktivity cholinesterázy (Sáez-Valero et al., 1993; Moral-Naranjo et al., 1996.

Stanovení acetylcholinesterázy a bílkoviny

Aktivita acetylcholinesterázy byla určena modifikovanou mikrometodou dle Ellmana (Sáez-Valero et al., 1993). Jedna jednotka aktivity acetylcholinesterázy byla definována, jako počet nmolů acetylcholinu hydrolyzovaného za minutu při teplotě 22°C. Koncentrace bílkoviny byla určena metodou s použitím bicinchoninové kyseliny s bovinním sérovým albuminem jako standardou (Smith et al., 1985)

Hydrofobní chromatografie na fenylagaróze

Amfifilní formy acetylcholinesterázy byly separovány od forem hydrofilních pomocí hydrofobní chromatografie na fenylagaróze, jak bylo dříve popsáno (Sáez-Valero et al., 1993). Mozkomíšní mok (10 ml stažených ze 4 vzorků od různých jedinců) byl aplikován na kolonu (10x1 cm) fenylagarózy. Hydrofilní frakce (HF) obsahující hydrofilní izoformy acetylcholinesterázy byla eluována 30 ml TSB s následnou eluci amfifilní frakce (AF) obsahující navázané amfifilní izoformy. Tato eluce byla provedena pomocí 50 mM Tris-HCl (TB, pH 7,4) obsahující 2% (w/v) Tritonu X-100. Frakce s vysokou aktivitou acetylcholinesterázy byly sebrány a zakoncentrovány za použití koncentrátoru Ultrafree-4 Centrifugal Filter Device Biomax 10 kDa (Millipore Corporation, Bedford, MA, USA).

Sedimentační analýza

Molekulární izoformy acetylcholinesterázy byly analyzovány ultracentrifugací při 150000 g v kontinuálním sacharózovém gradientu (5-20% w/v) po dobu 18 hodin při teplotě 4° v rotoru Beckman SW40. Gradienty obsahovaly 10 ml 50 mM Tris-HCl (pH 7,4) obsahující 0,5 M NaCl, 50 mM MgCl₂ 0,5% (w/v) Brij 97. Přibližně 40 frakcí bylo sesbíráno ze dna každé zkumavky. K určení přibližných sedimentačních koeficientů izoforem acetylcholinesterázy byly použity enzymy o známém sedimentačním • · • · • · « • · · · * · · · • · fcfc · koeficientu, bovinní jaterní kataláza (11,4 S, S₂o,_w, Svendbergovy jednotky) a alkalická fosfatáza pocházející z E. coli (6,1 S) . Byl určen poměr izoforem acetylcholinesterázy G₄/(G₂+Gi), které odrážejí poměr G₄ molekul (G₄ ^na+G4^a) versus lehké globulární izoformy acetylcholinesterázy G2^a a Gi^a. Odhad relativních poměrů každé z molekulárních forem acetylcholinesterázy byl proveden přidáním aktivit pod každé maximum (G₄ nebo G₂+G_x) a výpočtem relativních procent (znovunabytí >95%).

Lectin-vazebné studie acetylcholinesterázy

Na 0,1 ml (hydratovaný objem) Sefarózy 4B (kontrola) byly aplikovány vzorky (0,3 ml), ConA, WGA, RCAi₂o, LCA, DBA, UEAi, SBA nebo PNA imobilizovaných na agaróze nebo Sefaróze. Enzym lektinové směsi byly inkubovány přes noc při teplotě 4°C za mírného míchání. Navázaná i volná acetylcholinesteráza byly separovány centrifugací při 1000 g po dobu 15 minut při teplotě 4°C v centrifugací Beckman J2-21M/E za použití rotoru JA-20 a nenavázaná acetylcholinesteráza byla analyzována v supernatantové frakci. Bylo vypočítáno procento nenavázané acetylcholinesterázy při inkubaci s lektinem jako (Acetylcholinesteráza nenavázaná na lektin/Acetylcholinesteráza nenavázaná na Sefarózu) x 100. Podle vzorce aktivita acetylcholinesterázy nenavázané při ConA inkubaci děleno aktivita acetylcholinesterázy nenavázané při WGA inkubaci byl vypočítán poměr C/W. Bylo pozorováno, že tento poměr detekuje specifické poruchy glykosylace acetylcholinesterázy, která se vyskytuje v mozkomíšním moku pacientů s Alzheimerovou chorobou.

Lektin-vazebné studie acetylcholinesterázy z mozkomíšního moku

Abychom vyšetřili glykosylaci acetylcholinesterázy, byly vzorky mozkomíšního moku 18 kontrol a 30 případů Alzheimerovy choroby inkubovány s odlišnými zmobilizovanými lektiny, které rozpoznávají odlišné cukry. Acetylcholinesteráza se vázala silně na ConA, WGA a LCA, ale pouze slabě na RCAi₂₀, PNA, DBA, UEAi a SBA (Tabulka 1), což naznačuje, že většina enzymu ·

	15	0 00 000 00 00 0000 000 0000 0 0 0000 0 0 00 • · 00 0000000 00 0 00 000 0000 0000000 00 0 00 00
postrádala	terminální	galaktózu,	terminální N-acetyl-
galaktosamin	nebo fukózu.

Byl pozorován malý, ale signifikantní rozdíl ve vazbě acetylcholinesterázy na ConA a WGA mezi ^skupinou AD a kontrolami (Tabulka 1) . Protože v mozkomíšním moku pacientů s Alzheimerovou chorobou bylo zvýšeno procento nenavázané acetylcholinesterázy na ConA a sníženo pro WGA, byl definován poměr (C/W=[% Acetylcholinesterázy, která se neváže na ConA]/[% Acetylcholinesterázy, která se neváže na WGA]), které zajistilo větší rozlišení mezi oběmi skupinami (Tabulka 1) . Za použití této metody bylo prokázáno, že průměrný poměr C/W pro skupinu s Alzheimerovou chorobou byl významněji vyšší než u jiných kontrolních skupin včetně případů difúzních plaků (bez demence, DP) a pacientů s jinými neurologickými a neuropsychiatrickými chorobami (ND) (Obr. 2), což je ve shodě s výsledky v Příkladu 1. Ze 30 vzorků mozkomíšního moku od pacientů s potvrzenou diagnózou Alzheimerovy choroby, bylo 24 vzorků nad cut-off hodnotou C/W = 0,95 (Obr. 2). Pouze jeden vzorek z 18 kontrol, jeden ze 6 vzorků případů s difúzními plaky a jeden ze 14 vzorků ze skupiny jiných neurologických onemocnění, konkrétně případ demence frontálního laloku, byly nad touto hodnotou. Šest vzorků ze skupiny Alzheimerovy choroby s C/W poměrem nižším než 0,95 mělo tento poměr > 0,60, což je hodnota vyšší než průměr C/W ze skupin bez Alzheimerovy choroby (kontrola = 0,53 ± 0,1; DP = 0,46 ± 0,2; ND = 0,53 ± 0,1).

Nebyla nalezena korelace mezi C/W poměrem a PMI, které by naznačovaly, že odlišný C/W poměr ve skupině Alzheimerovy choroby byl způsoben rozdíly v PMI. Nebyl nalezen signifikantní rozdíl ani v PMI mezi skupinou s Alzheimerovou chorobou (33 ± 6 hodin) a vzorky ze skupin bez Alzheimerovy choroby (40 ± 6 hodin).

Vzorky mozkomíšního moku byly dodatečně analyzovány na celkovou aktivitu acetylcholinesterázy (Obr. 2). Jak bylo popsáno dříve • · to to · · toto ·· • · · · tototo to · to to • to to · to to to··· • · ·· ········» « ·· · · · · · · · ··· ···· «· · «o 99

Appleyard et al., 1983; Atack et al., 1988), byla v mozkomíšním moku pacientů s Alzheimerovou chorobou signifikantně nižší aktivita acetylcholinesterázy (6,5 ± 0,8 U/ml) než kontrol (15,8 ± 2,9 U/ml) nebo pacientů s jinými onemocněními (12,4 ± 2,4 U/ml). Ovšem poměr C/W byl mnohem spolehlivější index klinického stavu než celková aktivita acetylcholinesterázy v mozkomíšním moku (Obr. 2).

Izoformy acetylcholinesterázy v mozkomíšním moku

Za účelem určení, zdali porucha glykosylace byla způsobena změnami specifické izoformy acetylcholinesterázy byly vzorky mozkomíšního moku analyzovány hydrofobní chromatografií k odlišení amfifilních (G^a) a hydrofilních forem (G^na) (Obr. 3) a dále centrifugací v sacharózovém denzitním gradientu v 0,5% (w/v) Brij 97 k odlišení jednotlivých izoforem dle molekulové váhy (G4, G2 a Gx) (Fig.3). Bylo pozorováno snížení poměru acetylcholinesterázy G4 v mozkomíšním moku pacientů s Alzheimerovou chorobou ve srovnání s kontrolami (Obr. 4, horní panel). Poměr (G4/(G2+Gi) byl signifikantně vyšší (p < 0,01) u kontrol (1,80 ± 0,12; n=4) než v případech Alzheimerovy choroby (1,16 + 0,12; n=4). K odlišení hydrofilních a amfifilních izoforem byl mozkomíšní mok frakcionován hydrofobní chromatografií na fenylagaróze (Obr. 3) . Na fenylagarózu se vázalo menší procento acetylcholinesterázy v normálním mozkomíšním moku (12 ± 3%, n=4) než v mozkomíšním moku vzorků ze skupiny Alzheimerovy choroby (38 ± 4%, n=4; p < 0,001). V sedimentační analýze nenavázané hydrofilní frakce (HF) byla zjištěna sedimetační konstanta hlavní frakce 10,8 S, což je ve shodě s hodnotou pro hydrofilní tetramerní (G4^na) izoformu (Atack et al., 1987), stejně tak jako menší množství lehčích izoforem Acetylcholinesterázy, 5,1 S dimerů a 4,3 S monomerů (Obr. 4). Navázaná amfifilní frakce z kolony fenylagarózy obsahovala menší frakci s konstantou 9,0-9,5 S (pravděpodobně amfifilní tetramer, G4^a) a větší frakci amfifilního globulárního dimeru (G₂ ^a, 3,1 S) . Koncentrace amfifilních • 99 ·1 9

9 19 19 9 19 11 ι 1 1 1 9 9 9 9 1

1 11 1919199 99 1 / 111 9111 91 1 11 11 lehkých izoforem byla větší v mozkomíšním moku jedinců s Alzheimerovou chorobou než u kontrol (Obr. 4).

Glykosylace jednotlivých izoforem acetylcholinesterázy v mozkomíšním moku

Inkubací HF a AF s imobilizovanými ConA a WGA bylo prokázáno zvýšení poměru C/W v mozkomíšním moku jedinců s Alzheimerovou chorobou. Dále bylo prokázáno, že vysoký C/W poměr byl spojen s amfifilní frakcí obsahující dimery a monomery (Obr. 4). Data ukazují, že podíl G₂ a Gi acetylcholinesterázy v mozkomíšním moku jedinců s Alzheimerovou chorobou byl zejména zodpovědný za zvýšený poměr C/W celkové acetylcholinesterázy v mozkomíšním moku jedinců s Alzheimerovou chorobou.

Hladina acetylcholinesterázy ve frontální mozkové kůře a mozečku

Za účelem určení, zdali změny v glykosylaci acetylcholinesterázy odrážejí změny v expresi nebo glykosylaci mozkových izoforem acetylcholinesterázy, byly vyšetřeny aktivity acetylcholinesterázy ve vzorcích frontální mozkové kůry a mozečku. Vzorky byly homogenizovány spolu se solí a Tritonem X-100 za účelem extrakce solubilních a membránově vázaných izoforem acetylcholinesterázy, poté byla určena aktivita acetylcholinesterázy v obou frakcích (Tabulka 2). Vzorky frontální mozkové kůry od pacientů s Alzeheimerovou chorobou měly ve srovnání s kontrolami signifikantně nižší aktivitu acetylcholinesterázy v Tritonu X-100 rozpustné frakci (zhruba 40%), bez žádného rozdílu v soli rozpustné frakci (SS) (Tabulka 3) . Výsledky jsou ve shodě s předchozími studiemi, které ukazují, že hlavní izoforma G₄ je snížena pouze v TS frakci (Younkin et al., 1986; Siek et al., 1990). Bylo pozorováno malé, ale signifikantní snížení (zhruba 15%) v obsahu bílkoviny TS frakce ve skupině s Alzheimerovou skupinou i skupině ND. Hladina acetylcholinesterázy ve frontální mozkové kůře skupiny ND byla signifikantně odlišná od kontrol v SS i TS frakci (Tabulka 2) . Skupina ND však byla • ♦· ·· · 9 9 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9999 9 9 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 9999 99 9 99 99 laloku, 1 Huntingtonova proto sígnifikance změn heterogenní (2 demence frontálního choroba a 1 Parkinsonova choroba), hladin acetylcholinesterázy zůstává nejasná. Hladiny acetylcholinesterázy v mozečku byly také signifikantně sníženy v TS frakci skupiny s Alzheimerovou chorobou. (Tabulka 2).

Glykosylace acetylcholinesterázy z frontální kůry a mozečku

Za účelem zjištění, zdali odlišná glykosylace Acetylcholinesterázy v mozkomíšním moku jedinců s Alzeheimerovou chorobou byla přítomna také v mozku těchto jedinců, byla pomocí lektin-vazebné analýzy vyšetřena také glykosylace mozkové cetylcholinesterázy. Homogenáty z frontální kůry a mozečku byly inkubovány s imobilizovanými ConA nebo WGA a bylo vypočítáno množství aktivity nenavázaného enzymu. Ve frontální mozkové kůře jedinců s Alzheimrovou chorobou bylo % aktivity acetylcholinesterázy, která se nenavázala ani na ConA ani na WGA, signifikantně odlišné od kontrol (Tabulka 3) . Podobně jako v případě acetylcholinesterázy v mozkomíšním moku byl poměr C/W acetylcholinesterázy z frontální mozkové kůry větší u vzorků Alzheimerovy choroby než u vzorků bez této nemoci (Tabulka 3). Zvýšení bylo způsobeno velkým nárůstem acetylcholinesterázy, která se nenavázala na ConA navzdory nárůstu acetylcholinesterázy, která se nenavázala na WGA (Tabulka 3) . V DP a ND skupině nebylo nalezeno zvýšení C/W poměru (Tabulka 3) . V mozečkových frakcích nebyl pozorován rozdíl ve vazbě na lektin mezi skupinami AD a non-AD (Tabulka 3) .

Izoformy acetylcholinesterázy ve frontální mozkové kůře a mozečku

Za účelem určení příčiny porušené glykosylace v mozku jedinců s Alzheimerovou chorobou byly vyšetřeny izoformy acetylcholinesterázy ve frontální mozkové kůře a v mozečku. Byly sebrány stejné objemy SS a ST supernatantu (celková aktivita acetylcholinesterázy), které byly poté analyzovány pomocí sedimentace v kontinuálním sacharózovém gradientu s 0,5%

00

0 0 0

0 0 0 · 0 0

0 0 0

00 (w/v) Brij 97 k oddělení hlavních izoforem acetylcholinesterázy (Obrázek 5). Na podkladě jejich sedimentačních koeficientů (Atack et al·., 1956; Massoulié et al., 1982) bylo možné identifikovat hydrofilní (G₄ ^na, 10,7 ± 0,1 S) a amfifilní tetramery (G₄ ^a, 8,6 ± O,1S), amfifilní dimery (G2^a, 4,7 ± 0,1 S) a monomery (Gi^a, 3,0 ± 0,1 S) acetylcholinesterázy (Obr. 6). Nebyly pozorovány rozdíly v sedimentačním koeficientu (S) jednotlivých izoforem z každé skupině. Pro překrývání sedimentačních koeficientů mezi acetylcholinesterázou G4^na a G4^a nebylo možné tyto izoformy kompletně oddělit (Obrázek 5). Podíl G4^a byl však větší než G4^na. V některých frakcích byly identifikovány ve stopových množstvích (2-5%) asymetrické izoformy (Ai2) acetylcholinesterázy. Signifikantní snížení G₄ (40% průměrné kontrolní hodnoty, p < 0,001) a G₂ + Gi acetylcholinesterázy (60% průměrné kontrolní hodnoty, p = 0,002) bylo detekováno ve frakcích z frontální mozkové kůry jedinců z Alzheimerovou chorobou. Tato změna v relativním poměru izoforem acetylcholinesterázy se odrazila v poměru G₄/(G₂+Gi), který byl významně nižší s Alzheimerovou chorobou (Tabulka 3) .

významné snížení bylo kupodivu nalezeno také v případě poměru G₄/(G2+Gi) pro DP jedince. Tato změna v poměru byla způsobena 25% zvýšením hladiny G₂+Gi a malým snížením (10%) v G₄ Acetylcholinesterázy, ačkoli žádná změna sama o sobě nebyla Nebyly nalezeny rozdíly

G₄/(G₂+Gi) v mozečku jedinců (Tabulka 3), i přes statisticky acetylcholinesterázy ve frakci TS (Tabulka 2) a v celkové hladině acetylcholinesterázy G₄ (G₄ u kontrol = 380 ± 40 U/ml, G₄ u jedinců s Alzheimerovou chorobou = 195 ± 70 U/ml, p = 0,008).

ve vzorcích jedinců Podobné a statisticky statisticky významná, v acetylcholinesteráze s Alzheimerovou chorobou významné snížení (40%)

Glykosylace jednotlivých izoforem acetylcholinesterázy ve frontální mozkové kůře a v mozečku

Protože bylo prokázáno porušení poměru acetylcholinesterázy ve frontální mozkové kůře pacientů s Alzeheimerovou chorobou, byly ·· · ·· ·· » · · « t · · « ► · · i » · · « ·· ·· ♦ · · • ···· provedeny kroky k ověření, zdali zvýšení v C/W poměru mozkové acetylcholinesterázy byl způsoben změnou v glykosylaci nebo v expresi specifické izoformy acetylcholinesterázy. Jednotlivé izoformy acetylcholinesterázy byly separovány centrifugaci v sacharózovém gradientu a poté byly sesbírány frakce odpovídající G₄ nebo G2+G1, dialyzovány proti pufru TSB-Triton

X-100 a koncentrovány acetylcholinesterázy byly poté analýzou a byl vypočítán poměr (Obrázek 5).

ultrafiltrací. Izoformy stanoveny lektin vazebnou C/W pro každou z izoforem

Mezi AD a non-AD skupinami nebyly pozorovány rozdíly v C/W poměru acetylcholinesterázy G₄ (Obr. 5). Ve všech vzorcích frontální mozkové kůry však frakce G₂+Gi měla C/W poměr >1,00, což ukazuje, že acetylcholinesteráza G₂ nebo Gi je odlišně glykosylovaná než její izoforma G₄. Navíc byl poměr C/W pro acetylcholinesterázu G₂+Gi vyšší ve skupině s Alzheimerovou chorobou než u kontrol nebo DP. Podobně byl vyšší i poměr C/W amfifilní frakce z mozkomíšního moku (obsahujícího zejména acetylcholinesteráza G2+G1) jedinců s Alzheimerovou chorobou než u kontrol (Obr. 3). Nebyla nalezena korelace mezi poměrem G₄/(G₂+Gi) a poměrem C/W v DP skupině ve frontální mozkové kůře. V mozečku skupin AD a non-AD nebyly pozorovány rozdíly v poměrech C/W pro acetylcholinesterázu G₄ nebo G₂+Gi (Obr.4). Frakce G₂+Gi z mozečků skupin AD i non-AD měly poměr C/W < 0,50 na rozdíl od stejné frakce z frontální mozkové kůry (C/W > 1,00), což ukazuje na rozdíly v glykosylaci acetylcholinesterázy G₂+Gi mezi oběmi oblastmi mozku.

Tento příklad ukazuje, že acetylcholinesteráza je odlišně glykosylována ve frontální mozkové kůře a v mozkomišnim moku pacientů s Alzheimerovou chorobou ve srovnání s acetylcholinesterázou skupin bez této nemoci, včetně pacientů s demencí, která není způsobena Alzheimerovou chorobou. Tento rozdíl v glykosylaci je způsoben zvýšením poměru odlišně glykosylované amfifilní dimerické a monomerické • 4 · 44 44 • · 4 4 444 4444 • 4 4444 4444

4 4 · 4 4444 4 4 4 4 4 ·· 4444444 acetylcholinesterázy ve vzorcích pacientů s Alzheimerovou chorobou. Výsledky naznačují, že abnormálně glykosylovaná acetylcholinesteráza v mozkomíšním moku pacientů s Alzheimerovou chorobou může být mozkového původu, neboť podobný rozdíl v glykosylaci byl také nalezen ve frontální mozkové kůře pacientů s Alzheimerovou chorobou.

Tabulka 1

Lektin-vazebná studie acetylcholinesterázy v mozkomíšním moku

Lektin	Nenavázaná acetylcholinesteráza
	Kontrola	Alzheimerova nemoc
ConA	5,5 + 0,8	10,1 ± l,lb
WGA	11,3 ± 1,7	7,0 ± 0, 6b
ConA/WGA (C/W)	0,53 ± 0,1	1,37 ± 0,la
LCA	17,2 ± 4,2	15,0 ± 1,3
RCA120	74,1 ± 3,4	70,8 ± 2,7
SBA	83,0 ± 2,1	82,2 ± 1,9
UEAr	91,6 ± 2,2	87,6 ± 1,9
PNA	92,4 ± 1,7	92,3 ± 1,4
DBA	98,9 ± 0,8	95,8 ± 1,7

Všechny vzorky mozkomíšního moku byly získány post mortem a diagnóza byla potvrzena patologickým vyšetřením. Vzorky mozkomíšního moku od normálních jedinců (kontrolní skupina: n=18; 67±4 roky při úmrtí; 11 žen/ 11 mužů) a pacientů s Alzheimerovou chorobou (n=30; 79±2 roky; 15 žen/15 mužů) byly inkubovány se stejným objemem odlišných imobilizovaných lektinů a poté centrifugovány. Acetylcholinesteráza byla analyzována ve frakcích supernatantu. Data představují průměry ± SEM. ^a signifikantně odlišné (p < 0,001) od kontrolní skupiny podle Studentova t-testu; ^b signifikantně odlišné (p < 0,05) od kontrolní skupiny podle Studentova t-testu.

·· ·· · ·· ·· • · ··· *··· • · · · · · · · · • · · · ··*· 9 9 9 9 · • · · · 9 9 9 9

9999 99 9 99 99

Tabulka 2. Aktivita acetylcholinesterázy a koncentrace bílkoviny v lidské frontální mozkové kůře a mozečku

	Aktivita Ache (U/ml)	Bílkovina (mg/ml)
Skupina/zdroj	SS	TS	SS	TS
Kontrola
Frontální mozková kůra (n=ll; 63±5 let 7 žen/4 muži)	3,7 ± 0,4	15,1 ± 1,5	2,1 ± 0,1	2,4 ± 0,1
Mozeček (n=7; 66±5 let 4 ženy/3 muži)	64 ± 6	264 + 25	2,5 ± 0,1	1,9 ± 0,1
DP
Frontální mozková kůra (n=6; 81±2 roky 4 ženy/2 muži)	5,5 ± 0,9	12,7 ± 1,7	2,1 ± 0,1	2,2 ± 0,1
Mozeček (n=5; 81±3 roky 3 ženy/2 muži)	49 ± 8	182 ± 46	2,6 ±0,1	1,9 ± 0,1
ND
Frontální mozková kůra (n=4; 67±9 let 2 ženy/2 muži)	5,4 ± 0,6a	9,3 ± l,7b	2,1 ± 0,2	2,0 ± 0,lb
Mozeček (n=2; 78+4 roky 1 žena/1 muž)	45 ± 8	160 + 50	2,7 ± 0,2	2,3 ± 0,2
AD
Frontální mozková kůra (n=14; 73±3 roky 8 žen/6 mužů)	3,7 ± 0,3	9,0 ± 0, 9a	2,1 ± 0,1	2,1 ± 0,la
Mozeček (n=7; 73+6 let 5 žen/2 muži)	48 + 12	160 + 28b	2,6 ± 0,1	2,0 ± 0,1

Tkáně z frontální mozkové kůry nebo mozečku byly homogenizovány a byly připraveny v solích rozpustné (SS) a v Tritonu X-100 rozpustné (TS) extrakty. Extrakty byly poté analyzovány na přítomnost acetylcholinesterázy a bílkovinu. DP = nedementní jedinci s difusními plaky; ND jedinci s jinými neurologickými onemocněními a demencí nezpůsobenou Alzheimerovou chorobou, AD jedinci Alzheimerovou chorobou. Hodnoty představují průměry ± SEM. ^a signifikantně odlišné (p < 0,005) od kontrolní skupiny podle Studentova t-testu; ^b signifikantně odlišné (p < 0,05) od kontrolní skupiny podle Studentova t-testu.

0»

0· ·

0 • «0

0 0 0

0 0 0 0 0 • 00 • 0 0

0· 00

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 0 0

0 ··

Tabulka 3. Lektin-vazebná analýza izoforem acetylcholinesterázy ve frontální mozkové kůře a mozečku

	Vazba k lektinu	Poměr Ache
Skupina/zdroj	Ache nenavázaná na ConA (%)	Ache nenavázaná na WGA (%)	C/W	G4/(G2+G1)
Kontrola
Frontální mozková kůra {n=ll; 63±5 let 7 žen/4 muži)	6,9 ± 0,8	12,3 + 1,2	0,56 ± 0,03	1,90 ± 0,14
Mozeček (n=7; 66±5 let 4 ženy/3 muži)	1,8 ± 0,1	1,7 ± 0,9	0,18 ± 0,02	3,02 ± 0,2
DP
Frontální mozková kůra (n=6; 81±2 roky 4 ženy/2 muži)	7,4 ± 0,8	15,0 + 1,0	0,50 ± 0,06	1,32 ± 0,12e
Mozeček (n=5; 81±3 roky 3 ženy/2 muži)	2,9 ± 0,7	12,2 + 1,3	0,23 ± 0,05	2,18 ± 0,33
ND
Frontální mozková kůra (n=4; 67±9 let 2 ženy/2 muži)	7,0 ± 0,6	13,2 ± 1,7	0, 47 ± 0,05	2,61 ± 0,73
Mozeček (n=2; 78+4 roky 1 žena/1 muž)	1,8 ± 0,2	10,1 ± 0,3	0,21 ± 0,1	2,50 ± 0,70
AD
Frontální mozková kůra (n=14; 73±3 roky 8 žen/6 mužů)	13,1 ± l,3a	19,7 + l,4a	0,66 ± 0,03°	1,34 ± 0,18D
Mozeček (n=7; 73+6 let 5 žen/2 muži)	2,4 ± 0,3	13,5 ± 2,3	0,19 ± 0,02	2,33 ± 0,49

SS a TS frakce z frontální mozkové kůry nebo mozečku byly sebrány ve stejném objemu a poté analyzovány na vazbu k lektinům za použití imobilizovaných ConA a WGA. Podle definice v Tabulce 2 byl vypočítán poměr C/W. Alikvóty supernatantu (SS+TS) byly také analyzovány pomocí sedimentace v sacharózovém denzitním gradientu za účelem identifikace izoforem Acetylcholinesterázy. Hodnoty představují průměry ± SEM.

··

9 99 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 99 9 9999 9 9 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9

999 9999 99 9 9 9 99 ^a signifikantně odlišné (p < 0,005) od kontrolní skupiny podle

Studentova t-testu; ^b signifikantně odlišné (p < 0,05) od kontrolní skupiny podle Studentova t-testu.

♦ • »00« *· • · • · ( · ♦

««0 0

Příklad 3

Vazba na monoklonální protilátku MA3-042

Vzorky acetylcholinesterázy solubilizované pomocí Tritonu X-100 (1% w/v) byly přes noc inkubovány při teplotě 4°C bez (viz levá část Obr. 6) nebo s (viz pravá část Obr. 6) protilátkou MA3-042 (ředění 1:50 objemově). Izoformy acetylcholinesterázy byly separovány centrifugací v 5-20% sacharózovém gradientu v 50 mM Tris salinickém pufru, pH 7,4, obsahujícím 0,5% Triton X-100. Zkumavka byla centrifugována při 150000 g při teplotě 4°C, frakce byly staženy ze dna a analyzovány na aktivitu acetylcholinesterázy. Sedimentačními markéry byly kataláza (11,4 S) a alkalická fosfatáza (6,1 S). Jak je vidět na Obr. 6, v přítomnosti MA3-042 došlo k posunu všech vrcholů, což ukazuje na vazbu monoklonální protilátky ke konkrétní izoformě reprezentované každým vrcholem s výjimkou vrcholu okolo 4 S. Rozdíl mezi 4,0 S a 4,2 S je statisticky nevýznamný, což ukazuje na fakt, že vrchol 4,2 S představuje modifikovaně glykosylovanou izoformu, která není rozpoznávána protilátkou MA3-042. Jak ocení osoby znalé oboru, představuje toto maximum monomer acetylcholinesterázy o molekulové váze přibližně 70000 kDa.

Příklad 4

Analýza krve za použití monoklonální protilátky

Po odebrání krve je stažen 1 ml plazmy nebo séra za použití standardních technik. Tekutina je nanesena na 5 ml RCA-agarózy (RCA znamená ricinus communis aglutinin) za účelem odstranění butyrylcholinesterázy. Při eluci z kolony za použití Ellmanova stanovení je monitorována aktivita acetylcholinesterázy a je sbíráno 2 ml maximum aktivity. Tento materiál je poté inkubován po dobu 10 minut při okolní teplotě s 50 mM izoOMPA za účelem inhibice zbývající butyrylcholinesterázy a poté nanesen na 1 ml kolonu monoklonální protilátky MA3-042 navázané na Sepharosu za účelem odstranění nespecifických izoforem acetylcholinesterázy.

• · · · · · ···· ··♦ ···· • · ···· · · · · • · « · ······· ·· · • · · · · ···· ······· ·· · · · ··

Aktivita v eluovaných frakcích je stanovena pomocí Ellmanovy metody. Aktivita přítomná v této frakci je vyšší u pacientů s Alzheimerovou chorobou než u jedinců bez této nemoci. V původní plazmě/séru je méně než 40 mU/ml acetylcholinesterázy.

Průmyslová využitelnost

Předkládaný vynález poskytuje diagnostický test pro Alzheimerovu chorobu.

« · • · • · · · · · · fcfcfcfc • fc fcfcfcfc fcfcfcfc • fc fcfc ······· fcfc · ·· ··· fcfcfcfc

..............

Reference

Jako reference jsou začleněny do předkládaného vynálezu následující práce:

Appleyard M.E., McDonald B. (1992) Acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase activities in cerebrospinal fluid from different levels of the neuraxis of patients with dementia of the Alzheimer type. J. Neurol. Neurosurg. Psychiat. 55, 10741078.

Appleyard M.E., Smith A.D., Berman P., Wilcock G.K., Esiri M.M., Bowen D.M., Neary D. (1987) Cholinesterase activities in cerebrospinal fluid of patients with senile dementia of the Alzheimer type. Brain 110, 1309-1322.

Appleyard M.E., Smith A.D., Wilckock G.K., Esiri M.M. Decreased CSF acetylcholinesterase activity in Alzheimer's disease. Lancet 1983;20:452.

Arendt T., Bigl V., Walther F., Sonntag M. (1984) Decreased ratio of CSF acetylcholinesterase activity in Alzheimer's disease. Lancet i, 173.

Arendt T. Bruckner M.K., Lange M., Bigl V. (1992) Changes in acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in Alzheimer's disease resemble embryonic development - A study of molecular forms. Neurochem. Intl. 21, 381-396.

Atack J.R., Perry E.K., Bonham, J.R, Candy, J.M., Perry R.H. (1986) Molecular forms of acetylcholinesterase in the aged human centrál nervous systém. J. Neurochem. 47, 267—267.

Atack J.R., Perry E.K., Bonham, J.R, Perry R.H. (1987) Molecular forms of acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase in human plasma and cerebrospinal fluid. J. Neurochem. 48, 1845-1850.

« 4 • · · ·

44 4 4

94 » 4 4 4 » · 4 4

I · · 4 » · · 4

4 4 ·

Atack J.R., May C., Kaye J.A., Kay A.D., Rapoport S.I. (1988) Cerebrospinal fluid cholinesterase in aging and in dementia of the Alzheimer type. Ann. Neurol. 23, 161-167.

Atack J.R., Perry E.K., Bonham, J.R, Perry R.H., Tomlinson

B.E., Blessed G., Fairbairn A. (1983) Molecular forms of acetylcholinesterase in senile demential of Alzheimer's type: selective loss of the intermediate (10S) form. Neurosci. Lett. 40, 199-204.

Atack J.R., Perry E.K., Perry R.H., Wilson I.D., Bober M.J., Blessed G., Tomlinson B.E. (1983) Blood acetyl- and butyrylcholinesterase in senile demential of Alzheimer^zs type. J. Neurol. Sci. 70, 1-12.

Blass J.P., Blennow K., Dealcourte A., Frisoni G.B., Jefferies

W.A., McRae A., Wisniewski H.M., Parshad R., Scinto L.F.M., Scheltens P., Riekkinen P.J., Schwanwick G.R.J., Wahlund L.O., Trojanowski J.Q., Winbland B., Ihara Y., et al. (1998) Concensus report of the Working group on biochemical markers of Alzheimer^zs disease.

19, 109-116.

“molecular and Neurobiol. Aging

Davies C.A., Mann D.M.A., Sumpter P.Q., Yates P.O. (1987) A quantitative morphometric analysis of the neuronal and synaptic content of the frontal and temporal cortex in patients with Alzheimer's disease. J. Neurol. Sci. 78, 151-164.

Ellman G.E., Courtney K.D., Andres Jr. V., Featherstone R.M. (1961) A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 7, 88-95.

Fishman E.B., Siek G.C., MacCallum R.D., Bird E.D., Volicer L., Marquis J.K. (1986). Distribution of the molecular forms of • · · · • · · · • · · · ··· ·· · · · ·· acetylcholinesterase in human brain, alterations in dementia of Alzheimer type. Ann. Neurol. 19, 246-252.

Friede R.L. (1965) Enzyme histochemical studies of senile plaques. J. Neuropathol. Exp. Neurol. 24, 477-491.

Geula C., Mesulam M.M. (1989) Speciál properties of cholinesterases in the cerebral cortex of Alzheimer's disease. Brain Res. 498, 185-189.

Grassi J., Vigny M., Massoulié J. (1982) Molecular forms of acetylcholinesterase in bovine caudate nucleus and superior cervical ganglion: solubility properties and hydrophobic character. J. Neurochem. 38, 457-469.

Guillozet A.Z., Smiley J., Mash D.C., Mesulam M.M. (1997) Butyrylcholinesterase in the life cycle of 'amyloid plaques. Ann. Neurol. 42, 909-918.

Hogan B., Constantini F., Lacy E. (1986) Manipulating the mouše embryo, A laboratory manual, Cold Spring Habor, New York.

Inestrosa N.C., Alvarez A., Perez C.A., Mořeno R.D., Vicente M., Linker C., Casaneuva O.I., Soto C., Garrido J. (1996a) Acetylcholinesterase accelerates assembly of amyloid-b-peptides into Alzheimer's fibrils - possible role of the peripheral site of the enzyme. Neuron 16, 881-891.

Inestrosa N.C., Alvarez A., Calderon F. (1996b) Acetylcholinesterase is a senile plaque component that promotes assembly of amyloid beta-peptide into Alzheimer's filaments. Mo 1. Psychiatry 1, 359-361.

Kang J., Lemaire H.G., Unterbeck A., Salbaum J.M., Masters

C.L., Grzeschik K.H., Multhaup G., Beyereuther K., Míiller-Hill • · to

QA · · ······

JU «·· ···· ·· · ·· ··

B. (1987) The precursor of Alzheimer's disease amyloid A4 protein resembles a cell-surface receptor. Nátuře 325, 733-736.

Liao J., Heider H., Sun M.C., Brodbeck U. (1992) Different glycosylation' in acetylcholinesterase from mammalian brain and erythrocytes. J. Neurochem. 58, 1230-1238.

Luo Z., Fuentes M.E., Taylor P. (1994) Regulation of acetylcholinesterase mRNA stability by calcium during differentiation from myoblasts to myotubes. J. Biol. Chem. 269, 27216-27223.

Mann D.M.A., Iwatwubo T., Sowden J.S. (1996) Atypical amyloid (Ab) deposition in the cerebellum in Alzheimer^zs disease: an immunohistochemical study using end-specific Ab monoclonal antibodies. Acta Neuropathol. 91,647-653.

Massoulié J., Bon S. (1982) The molecular forms of cholinesterase and acetylcholinesterase in vertebrates. Ann. Rev. Neurosci. 5, 57-106.

Massoulié J., Pezzementi L., Bon S., Krejci E., Vallette F.M. (1993) Molecular and cellular biology of cholinesterases. Prog. Neurobiol. 41, 31-91.

Masters C.L., Simms G., Weinman N.A., Multhaup G., McDonald B.L., Beyeruther K. (1985) Amyloid plaque core protein in Alzheimer's disease and Down syndrome. Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 4245-4249.

Méflah K., Bernard S., Massoulié J. (1984) Interactions with lectins indicate differences in the carbohydrate composition of the membrane-bound enzymes acetylcholinesterase and 5^Znucleotidase in different cell types. Biochimie 66, 59-69.

* 9

999 9 99 9 99 9999999 99 9 • 9 9 9 9 9 9 99 9 99 · ·

Mesulam Μ.M., Geula C., Morán M.A. Anatomy of cholinesterase inhibition in Alzheimer's disease, effect of physostigmine and tetrahydroaminoacridin on plaques and tangles. Ann. Neurol. 22, 683-691.

Michaelson S., Smáli D.H. (1993) A protease is recovered with a dimeric form of acetylcholinesterase in fetal bovine sérum. Brain Res. 611, 75-80.

Mirra S.S., Gearing D.W., McKeel D.W., Crain B.J., Hughes J.P., Vanbelle G., Heyman A., Balí M.J., Clark A.W., Hansen L.A., Hedreen J.C., Joachim C.L., Kim R.C., Kirkpatrick J.B., Markesberry W.R., Davis D., Martínez A.J., Miller C.A., Moosy J., Morris J., Nochlin D., Perl D.P., Purohit D., Petito C.K., Rao G.R., et al. (1994) Interlaboratory comparison neuropathology assessments in Alzheimer's disease: A study of the Consortium to establish a Registry of Alzheimer's disease (CERAD). J. Neuropath. Exp. Neurol. 53, 303-315.

Moral-Naranjo M.T., Cabezas-Herrera J., Vidal C.J. (1996) Molecular forms of acetyl- and butyrylcholinesterase in normál and dystrophic mouše brain. J Neurosci. Res. 43, 224-234.

Morán M.A., Mufson E.J., Goméz-Ramos P. (1993) Colocalization of cholinesterase with b amyloid protein in aged and Alzheimer's brains. Acta Neuropathol. 85, 362-369.

Motter R., Vigopelfrey C., Kholodenko D., Barbour R., Johnsonwood K., Galasko D., Chang L., Millern B., Clark C., Green R., Olson D., Southwick P., Wolfert R., Munroe B., Lieberburg I., Seubert P., Schenk D. (1995) Reduction of bamyloid peptide₄₂ in the cerebrospinal fluid of patients with Alzheimer's disease. Ann. Neurol. 38, 643-648.

Navaratnam D.S., Priddle J.D., McDonald B., Esiri M.M., Robinson J.R., Smith A.D. (1991) Anomalous molecular form of • · • to · • to • · • to acetylcholinesterase in cerebrospinal fluid in histologically diagnosed Alzheimer's disease. Lancet 337,447-450.

Pfeffer R.I., Afifi A.A., Chance J.M. (1987) Prevalence of Alzheimer's disease in a retirement community. Am. J. Epidemiol. 125, 420-436.

Probst A., Langui D., Ulrich J. (1991) Alzheimer's disease: a description of the structural lesions. Brain Pathol. 1, 229239.

Sáez-Valero J., Tornel P.L., Muňoz-Delgado E., Vidal C.J. (1993) Amphiphilic and hydrophilic forms of acetyl- and butyrylcholinesterase in human brain. J. Neurosci. Res. 35, 678-689.

Sáez-Valero J., Sběrna G., McLean C., Masters C.L., Smáli D.H. (1997) Glycosylation of acetylcholinesterase as diagnostic markér for Alzheimer's disease. Lancet 350, 929.

Saxena A., Raveh L., Ashani Y., Doctor B.P. (1997 Structure of glycan moieties responsible for the extended circulatory life time of fetal bovine sérum acetylcholinesterase and equine sérum butyrylcholinesterase. Biochemistry 36, 7481-7489.

Saxena A., Ashani Y., Raveh L., Stevenson D., Patel T., Doctor B.P. (1998) Role of oligosacharides in the pharmacocinetics of tissue-derived and genetically engineered cholinesterases. Mol. Pharmacol. 53, 112-122.

Sběrna G., Sáez-Valero j., Beyeruther K., Masters C.L., Smáli

D.H. (1997) The amyloid b-protein of Alzheimer's disease increases acetylcholinesterase expression by increasing intracellular calcium in embryonal carcinoma P19 cells. J. Neurochem. 69, 1177-1184.

• 44 ·· · 44 44 4 4 · 4 4 4 4 4444 · 4 · 4 4 4 · · * 4 4 44 4444444 44 4 44 444 4444

........* ’ ·· *·

Sběrna G., Sáez-Valero J., Li Q.X., Czech C., Beyeruther K., Masters C.L., McLean C.A., Smáli D.H. (1998) Acetylcholinesterase is increased in the brains of transgenic mice expressing the C-terminal fragment (CT100) of the bamyloid protein precursor of Alzheimer^zs disease. J. Neurochem. 71, 723-731.

Schegg K.M., Harrington L.S., Nielsen S., Zwieg R.M., Peacock J.H. (1992) Soluble and membrane-bound forms of brain acetylcholinesterase in Alzheimer's disease. Neurobiol. Aging 13, 697-704.

Schoenberg B.S., Kokmen E., Okazaki H. (1987) Alzheimer's disease and other dementing illnesses in a defined United States population: incidence rates and clinical features. Ann. Neurol. 22, 724-729.

Shen Z.X., Zhang Z. (1993) Anomalous acetylcholinesterase in CSE without clinical diagnosis of Alzheimer's disease. Lancet 342, 62.

Shen Z.X. (1997 An CSF anomalous form of acetylcholinesterase in demented and non-demented subject. Neuroreport 8, 3229-3232.

Siek G.C., Katz L.S., Fishman E.B., Korosi T.S., Marquis J.K., (1990) Molecular forms of acetylcholinesterase in subcortical areas of normál and Alzheimer disease brain. Biol Psychiatry 27, 573-580.

Silman I., Lyles J.M., Barnard E.A. (1978) Intrinsic forms of acetylcholinesterase in skeletal muscle. FEBS Letters 94, 166170.

Smáli D.H., Michaelson S., Sběrna G. (1996) Non-classical actions of cholinesterases: role in cellular differentiation, • ·« ··· 9· 99

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9 9 9 9 9 9 9 9 9

9999 ··♦· 99 99 9

9 9 9 9 9 9 9 9

....... ·· · ·· ·* tumorigenesis and Alzheimer's disease. Neurochem. Intl. 28, 453-483.

Smith P.K., Krohn R.I., Hermanson G.T., Mallia A.K., Gartner F.H., Provenzano M.D., Fujimoto E.K.Goeke N.M., Olson B.J., Klenk D.C. (1985) Measurement of protein using biconchoninic acid. Anal. Biochem. 150, 76-85.

Smith A.D., Jobst K.A., Navaratnam D.S., Shen Z.X., Priddle J.D., McDonald B., King E., Esiri M.M. (1991) Anomalous acetylcholinesterase in lumbar CSF in Alzheimer's disease. Lancet 338, 1538.

Soreq H., Ben-Aziz R., Prody C.A., seidman S., Gnatt A., Neville L., Lieman-Hurwitz J., Lev-Lehman E., Ginzberg D., Lapidot-Lifson Y., Zakut H. (1990) Molecular cloning and construction of the coding region for human acetylcholinesterase reveals a G+C rich attenuating structure. Proč. Nati. Acad. Sci. USA 87, 9688-9692.

Treskatis S., Christoph E., Layer P.G. (1992) Butyrylcholinesterase from chicken brain is smaller that that of sérum: its purification, glycosylation and membrane association. J. Neurochem. 58, 2236-2247.

Ulrich J., Meier-Ruge W., Probst A., Meier E., Ipsen S. (1990) Senile plaques, staining for acetylcholinesterase and A4 protein, a comparative study in the hippocampus and entorhinal cortex. Acta Neuropathol 80 80, 624-628.

Vidal C.J. (1996) Glycosylation of cholinesterases and its alteration in some pathological States. Recent Res. Devel. Neurochem. 1, 37-54.

Wright C.I., Geula C., Mesulam M.M. (1993) Neuroglial cholinesterases in the normál brain and in Alzheimer's disease, ♦

0

0 • 00

0 0 0 0

0 0 ·0 relationship to plaques, tangles and patterns of selective vulnerability. Ann. Neurol. 34, 373-384.

Younkin S.G., Goodridge B., Katz J., Lockett G., Nafziger D., Usiak M.F., Younkin L.H. (1986) Molecular forms of acetylcholinesterase in Alzheimer's disease. Fed. Proč. 45, 2982-2888.

Claims (2)

1. Způsob diagnózy Alzheimerovy choroby u pacienta. Tento způsob se skládá z:

   1. zajištění vzorku příslušné tělní tekutiny od řečeného pacienta;
2. 2. detekce přítomnosti acetylcholinesterázy s porušenou glykosylací v řečeném vzorku.

   Způsob definovaný v patentovém nároku 1, kterým je stanoven relativní. poměr acetylcholinesterázy s prvním typem glykosylace a acetylcholinesterázy s druhým typem glykosylace.

   Způsob definovaný v patentovém nároku 2, v kterém je použita lektin-vazebná analýza za účelem stanovení relativního poměru acetylcholinesterázy s řečeným prvním typem glykosylace a acetylcholinesterázy s řečeným druhým typem glykosylace.

   Způsob definovaný v patentovém nároku 3, kde lektin-vazebná analýza zahrnuje navázání na Concavalin A (ConA) a pšeničný zárodečný aglutinin (WGA).

   Způsob definovaný v patentovém nároku 4, kterým je určena nenavázaná acetylcholinesteráza.

   Způsob definovaný v patentovém nároku 5, kterým je vypočítán poměr nenavázané acetylcholinesterázy na ConA ku acetylcholinesteráze nenavázané na WGA.

   Způsob definovaný v patentovém nároku 6, v kterém je řečený poměr u pacientů Alzheimerovou chorobou nad hodnotou 0,95. Způsob definovaný v jakémkoli z patentových nároků 1-7, kde je určena také celková aktivita acetylcholinesterázy.

   Způsob definovaný v patentovém nároku 8, v kterém je poměr nenavázané acetylcholinesterázy na ConA ku acetylcholinesteráze nenavázané na WGA vyjádřen proti celkové aktivitě acetylcholinesterázy.

   Způsob definovaný v patentovém nároku 1, v kterém je použita monoklonálni protilátka MA3-042 k detekci přítomnosti acetylcholinesterázy s porušenou glykosylací.

   10.

   fc fcfcfcfc • fc fc fcfc fcfc fcfcfc fcfcfc* • fcfcfc fc fcfc · fcfc · fcfcfcfc fcfc fcfc fc • · · fcfcfcfc • fc « fcfcfcfc

   11. Způsob definovaný v patentovém nároku 10, v kterém je použita monoklonální protilátka MA3-042 a acetylcholinesteráza s porušenou glykosylaci je detekována prostřednictvím selhání této vazby.

   12. Způsob definovaný v jakémkoli z patentových nároků 1 až 11, v kterém je detekována acetylcholinesteráza s porušenou glykosylaci.

   13. Způsob definovaný v patentovém nároku 12, kde řečená abnormální izoforma je amfifílní, monomerní izoforma acetylcholinesterázy a/nebo amfifílní, dimerní izoforma acetylcholinesterázy.

   14. Způsob definovaný v jakémkoli z patentových nároků 1 až 13, kde řečená tělní tekutina je mozkomíšní mok (CSF), krev nebo krevní plazma.

   15. Způsob definovaný patentovém nároku 14, kde řečená tělní tekutina je krev nebo krevní plazma, které jsou připraveny z krve určené pro analýzu.

   16. Způsob definovaný patentových nárocích 14 nebo 15, kde řečená tělní tekutina je krevní plazma a kde je před analýzou na přítomnost acetylcholinesterázy s porušenou glykosylaci odstraněna a/nebo inaktivována butyrylcholinesteráza.

   17. Abnormální izoforma acetylcholinesterázy s porušenou glykosylaci, která je amfifilní a monomerní izoformou acetylcholinesterázy a je charakterizována relativně nižší afinitou ke Concavalinu A (ConA) a relativně vyšší afinitou k WGA než je tomu u acetylcholinesterázy s neporušenou glykosylaci.

   18. Abnormální izoforma acetylcholinesterázy s porušenou glykosylaci, která je amfifilní a dimerní izoformou acetylcholinesterázy a je charakterizována relativně nižší afinitou ke Concavalinu A (ConA) a relativně vyšší afinitou k WGA než je tomu u acetylcholinesterázy s neporušenou glykosylaci.