CZ149999A3

CZ149999A3 - Způsob detekce sloučenin, které modulují účinky OB-proteinu

Info

Publication number: CZ149999A3
Application number: CZ991499A
Authority: CZ
Inventors: Lee James Beeley
Original assignee: Smithkline Beecham Plc
Priority date: 1996-11-01
Filing date: 1997-10-30
Publication date: 1999-10-13
Also published as: IL129685A0; NZ335489A; TR199900963T2; KR20000053007A; NO992107L; WO1998020158A1; AU4789297A; JP2001503982A; PL333187A1; EP0951564A1; CA2270431A1; AR010262A1; NO992107D0

Description

Způsob detekce sloučenin, které modulují účinky ob-proteinu

Oblast techniky

Tento vynález se týká nového způsobu, přesněji způsobu detekce sloučenin, které napodobují, potencují nebo inhibují fyziologické účinky ob-proteinu.

Dosavadní stav techniky

Ob-protein, neboli leptin, je secernovaný hormon, který působí jako signál z tukové tkáně adresovaný ostatním orgánům s účelem regulovat hmotnost a energetickou rovnováhu (Zhang a kol., Nátuře, 372, 425 (1994)). Byly také vysloveny předpoklady o existenci dalších účinků obproteinu na hematopoetické a reprodukční funkce (Cioffi a kol., Nátuře Medicine, 2(5), 585 (1996)). Mezi proteinové molekuly, které mají jádro složené ze čtyř a-šroubovic tvořících svazek s topologií nahoru-nahoru-dolu-dolu (upup-down-down topology), patří rodina cytokinů a růstových faktorů. Proteiny této skupiny způsobují homo- nebo heterooligomerizaci membránových receptorů, o kterých je známo, že aktivují kinázové kaskády vyúsťující v transkripci genu. Receptory z rodiny, která je aktivována oligomerizací, spadají do dvou širokých skupin. První z nich je receptor pro epidermální růstový faktor, který nese na svých intracelulárních doménách aktivitu integrální tyrosinkinázy (A. Ullrich a J. Schlessinger, Cell, 61, 203-212 (1990)). Druhá skupina, kam patří receptory pro IL4 a erythropoietin, obsahuje sloučeniny, které tuto aktivitu nemají a zprostředkovávají svou odpověď způsobem asociované proteinové tyrosinkinázy (J.N. Ihle a kol., TIBS, 19,

222-227 (1994)). Oba receptorové subtypy jsou aktivovány cytokiny, ale proteiny typu svazku čtyř šroubovic aktivují

pouze subtyp nonintegrální tyrosinkinázy. Receptory typu nonintegrální proteinové tyrozinkinázy působí obecně skrze cestu, která zahrnuje Janus-kinázu (JAK) a s nimi spojené signálové převaděče a aktivátory transkripčních (STÁT) proteinů. Při aktivaci se STÁT proteiny vážou na elementy zprostředkující odpověď DNA, a tím kontrolují genovou transkripci. Jako STÁT elementy zprostředkující odpověď DNA byly identifikovány oligonukleotidové sekvence obsahující regulační elementy DNA o obecné sekvenci TT(N)_nAA (Seidel a kol., Proč. Nat. Acad. Sci. USA, 92, 3041 (1995)). Tyto elementy vážou STÁT proteiny jako odpověď na signální molekuly, například cytokiny.

V související britské patentové přihlášce č. 9509164.1 jsme popsali zjištění, že ob-protein je charakterizován terciární strukturou svazku čtyř šroubovic. Nyní věříme, že ob-protein interaguje s membránovým vazebným receptorem, který aktivuje JAK-STAT kinázovou kaskádu, a tím utváří základ systému stanovení pro detekci sloučenin, které napodobují, potencují nebo inhibují fyziologické účinky ob-proteinu. Takovéto stanovení má použití při výběru sloučenin pro léčbu hmotnosti (poruch tělesné hmotnosti), energetické rovnováhy, poruch krvetvorby, poruch fertility a jiných poruch, které jsou modulovány ob-proteinem. Toto stanovení je užitečné zejména při výběru sloučenin pro léčbu těch poruch, které mají vztah k obezitě, anorexii, kachexii a diabetů.

Související mezinárodní patentová přihláška číslo PCT/EP96/02291 se týká nové detekční metody, která používá JAK-STAT technologii. Nyní jsme zjistili zvláště výhodný detekční způsob, který také využívá tuto technologii.

• · · · • · · · • ft · · • ftft · · · « · * · ftft

Tento vynález proto poskytuje způsob detekce sloučeniny, která napodobuje, potencuje nebo inhibuje fyziologický účinek ob-proteinu. Tento způsob zahrnuje:

a) detekci sloučeniny, která napodobuje fyziologický účinek ob-proteinu, a to stanovením účinku sloučeniny na ob-proteinem aktivovaný signálový převaděč a na aktivátor transkripce (STÁT) elementu zprostředkujícího odpověď DNA, který je kondenzován k reportérovému genu; nebo

b) detekci sloučeniny, která potencuje nebo inhibuje fyziologický účinek ob-proteinu, stanovením účinku sloučeniny na odpověď zprostředkovanou ob-proteinem na obproteinem aktivovaný STÁT element zprostředkující odpověď DNA kondenzovaný k reportérovému genu;

kde, element zprostředkující odpověď DNA a reportér jsou exprimovány v ob-protein-responsivní buněčné linii, jejíž buňky jsou zvoleny ze seznamu:

buněčná	linie	odvozená	od	hypothalamu,
buněčná	linie	odvozená	od	feochromocytomu,
buněčná	linie	odvozená	od	hematopoetických buněk,
buněčná	linie	buněčná .	linie odvozená od pankreatu,
buněčná	linie	odvozená	od	jaterních buněk,
buněčná	linie	odvozená	od	preadipocytú
buněčná	linie	odvozená	od	příčně pruhovaných svalových
buněk,
buněčná	linie	odvozená	od	ovariálních buněk,

nebo element zprostředkující odpověď DNA a reportér jsou exprimovány v buněčné linii, jejíž linie buněk (buněčná

• · · · · • · · · · • « ··· ··· • · · • · · · · linie připravená metodami genového inženýrství) jsou také transfekovány polypeptidem schopným zprostředkovat ob-proteinovou stimulaci ob-proteinem aktivovaného STÁT elementu zprostředkujícího odpověď DNA a obsahuje příslušné STÁT proteiny.

Vhodná buněčná linie	je	linie	buněk	odvozených	od
hypothalamu. Vhodná buněčná linie	je	linie	buněk	odvozených	od
buněk feochromocytomu. Vhodná buněčná linie	je	linie	buněk	odvozených	od
buněk hematopoetických. Vhodná buněčná linie	je	linie	buněk	odvozených	od
buněk pankreatických. Vhodná buněčná linie	je	linie	buněk	odvozených	od
buněk jaterních. Vhodná buněčná linie	je	linie	buněk	odvozených	od
preadipocytů. Vhodná buněčná linie	je	linie	buněk	odvozených	od
příčně pruhovaných svalových buněk. Vhodná buněčná linie je linie	buněk	odvozených	od

ovariálních buněk.

S výhodou jsou element zprostředkující odpověď DNA a reportér exprimovány v takové buněčné linii (linie připravená metodami genového inženýrství), jejíž buňky jsou transfekovány polypeptidem schopným zprostředkovat obproteinovou stimulaci ob-proteinem aktivovaného STÁT DNA elementu zprostředkujícího odpověď a navíc obsahuje příslušné STÁT proteiny.

Příklad buněčné linie odvozené od buněk hypothalamu je neuronální GT1-7 buněčná linie, kterou popsal W.C.

Wetsel v publikaci Cellular and Molecular Neurobiology, (1), 43 (1995) .

Příklad buněk odvozených od feochromocytomu jsou PC12 buňky feochromocytomu nadledviny krysy (L.A. Greene a A.S. Tischler, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 73(7), 2424 (1976)).

Příklad linie buněk odvozené od hematopoetického systému je buněčná linie HEL 92.1.7 (ATCC TIB 180) odvozená od humánní erythroleukemie (P. Martin, Science, 216(4551), 1233 (1982)) .

Další příklad buněčné linie odvozené od hematopoetických buněk je buněčná linie K562(ATCC CCL-243) odvozená od lidské chronické myeloidní leukémie (Proč. Soc. Exp. Biol. Med., 166, 546 (1981) a Blood, 4_5, 321 (1975)).

Příklad buněčné linie odvozené od buněk pankreatu je buněčná linie BetaTC-3 (T.J. Keiffer a kol., Biochem.

And Biophys. Res. Comm., 224, 552 (1996)).

Další příklady buněčných linií odvozených od pankreatu zahrnují RIN5mF buňky, o nichž byly nedávno podány zprávy, že odpovídají na leptin (Md Shahidul Islám a kol., Biochem. Biophys. Res. Comm., 238, 851-855 (1997)).

Příkladem buněčné linie odvozené od preadipocytů je buněčná linie 30A5 (Y. Bai a kol., J. Biol. Chem., 271(24) , 13939 (1996)).

Další příklady buněčných linií odvozených od preadipocytů zahrnují diferencované buněčné linie 3T3-L1 a 3T3-F442A, obě linie jsou komerčně dostupné.

Příklad buněčné linie odvozené od jaterních buněk je buněčná linie HepG2 (B. Cohen a kol., Science, 274,

1185-1188 (1996) a Y. Wang a kol., J. Biol. Chem., 272,

16216-16223 (1997)) nebo H35 buněčná linie (Y. Wang a kol.,

J. Biol. Chem., 272, 16216-16223 (1997)).

fc fcfc • fcfc · * · • fcfcfc • fcfcfcfc • · · · ······· ·· fcfc fcfcfcfc fcfc • fcfcfcfc • · · · · « · fcfcfc fcfcfc • fcfc • fcfc fcfc

Dalšími příklady buněčných linií odvozených od jaterních buněk jsou WRL68 a Change liver cells, oba typy jsou komerčně dostupné.

Příklad buněčné linie odvozené od příčně pruhovaného svalu je linie buněk C2 C12 myotuby myši (Nátuře, 270, 725 (1977)).

Příklad buněčné linie odvozené od buněk ovariálních je linie SK-OV-3, ATCC číslo HTB77 (J. Fogh a G. Trempe, Human Tumour Cells In Vitro, J. Fogh (ed) Plenům Press, New York, 155-159, (1975); J. Fogh a G. Trempe, J. Nati. Cancer

Inst. Bethesda, 587, 209-214 (1977)).

Vhodný polypeptid schopný zprostředkovat obproteinovou stimulaci ob-proteinem aktivovaného STÁT elementu zprostředkujícího odpověď DNA, je funkční izoforma receptoru pro ob-protein, například ten, který identifikoval Tartaglia a kol. v Cell, 83, 1263 (1995).

Element zprostředkující odpověď DNA je s výhodou kondenzován ke genu promotoru, s výhodou minimálního promotoru.

Vhodný element zprostředkující odpověď DNA je nukleotid o struktuře TT(N)_nAA, kde N je jakýkoliv nukleotid a n je 4, 5 nebo 6.

·· 994 · • 4 • 4

4 • 9 • 4

9 9 4 «4 4

444 444

4

Nej vhodnější element zprostředkující odpověď DNA je selektivně aktivován intracelulárními ději, které jsou zprostředkované interakcí ob-proteinu se svým receptorem. Takovéto selektivní elementy zprostředkující odpověď DNA mohou být určeny zkoušením relativní aktivace konstruktů o složení element zprostřed-kující odpověď DNA-reportérový gen, při transfekci do buněčné linie, která je citlivá, ob-proteinem v porovnání při aktivaci jinými cytokiny.

Vhodný element zprostředkující odpověď DNA je nukleotid o složení TT(N)_nAA, kde N je jakýkoliv nukleotid a n je 4 nebo 5.

Další vhodný element zprostředkující odpověď DNA je TTCCCGGAA.

Další vhodný element zprostředkující odpověď DNA je ten úsek promotoru genu regulovaného ob-proteinem, který je vyžadován pro STÁT interakce. Tento gen bude záviset na zvláštním léčebném použití sloučenin, které budou procesem stanovení vybírány.

Vhodný reportérový gen je gen pro luciferázu izolovaný ze svatojanských mušek nebo gen enzymu chloramfenikolacyltransferázy.

Vhodný promotor je minimální promotor, jako thymidinkináza viru herpes simplex nebo promotor SV40.

Ostatní citlivé buněčné linie mohou být identifikovány použitím metody stanovení odstranění vazby. Vazba nemusí být funkčně dlouhou formou receptoru, totiž tou formou, která přenáší signály do cytoplasmy. Identifikace • ·· · • · • · · · · • · · · · • · ··· · · · • · · • · · · · funkční dlouhé formy receptoru může být provedena PCR nebo Northern blot anylýzou (např. Human ob-receptor: Tartaglia a kol., Cell, 83, 1263 (1995)). Konečně citlivé buňky jsou detekovány prostřed-nictvím sledování buněčných dějů při různých koncentracích leptinu. Metody, které lze možné použít k identifikaci vhodných buněčných linií nebo k monitorování těchto buněčných dějů, zahrnují následující:

1. Mikrofyziometr: Tato metoda zaznamená malé změny v pH vyplývající z biochemických změn v buňce. V buňkách citlivých na ob-protein může v důsledku stimulace dojít k biochemickým změnám, které způsobí malou změnu v rychlosti extracelulární acidifikace, která může být stanovena silikonovým mikrofyziometrem. Principy biosenzoru mikrofyziometru byly shrnuty v publikaci McConnel, Science, 257, 1906 (1992) .

2. EMSA ( = Electrophoretic mobility shift assay): Jaderné extrakty buněk po léčbě ob-proteinem jsou míšeny s radioaktivně značenými oligonukleotidy, které obsahují náhodně vybrané nebo specifické STÁT sekvence elementu zprostředkujícího odpověď DNA. Extrakty z buněk, které jsou ob-protein citlivé mohou způsobit gelový posun oligonukleotidu STÁT elementu zprostředkujícího odpověď DNA.

Literární odkazy: Watson a kol., Recombinant DNA, 2. vyd., str. 158 (1992), Lamb a kol., Blood, 83, 2063 (1994).

3. Měření testu fosforylace proteinu: Připojení aktivace receptoru na konečnou odpověď skrze fosforylaci tyrosinu intracelulárních proteinů může být stanoveno použitím protilátek, které rozpoznají fosforylované tyrosiny. Více specificky, jelikož receptor pro leptin může stimulovat fosforylaci tyrosinu v JAK/STAT cestě, poskytuje tento způsob metodu detekce linií buněk citlivých na • 4 ···· • *

4

leptin. Za účelem detekce aktivace navozené leptinem v buněčných linií citlivých na leptin, mohou být použity specifické JAK/STAT protilátky společně s protilátkami pro fosforylaci tyrosinu. Může dojít jak k inhibici tak ke stimulaci fosforylace proteinu. Na krysích-1 fibroblastech, které over-exprimují inzulínové receptory, byla prokázána zejména inhibice inzulínem stimulované fosforylace inzulínového receptorů a substrátu 1 inzulínového receptorů, která byla navozená ob-proteinem (Kroder a kol., Exp. Clin. Endo-crinoi. Diabetes,

104 (dopl. 2), 66, (1996)).

4. Odstranění vazby: Po inkubaci buněčných linií s radioaktivně značeným leptinem, například [¹²⁵I]-leptinem, může být po přidání neznačeného leptinu studována jeho vazba nespecifická naproti vazbě specifické. Vysoký poměr vazeb specifických ku nespecifickým naznačuje, že buněčné linie může být vybavena receptorem pro leptin.

5. Detekce proteinu funkční formy ob-receptoru, zejména funkční dlouhé formy, použitím specifických protilátek.

6. Detekce mRNA funkční formy ob-receptoru, zejména funkční dlouhé formy, Northern blotem, RT-PCR nebo „slotblot analýzou.

7. Detekce zvýšení c-fos mRNA po léčbě leptinem. c-fos mRNA může být stanovena Northern blotem, RT-PCR nebo „slot-blot analýzou.

S výhodou jsou použity ty buněčné linie, o kterých je známo, že kontrolují znaky určitého chorobného stavu, pro který jsou hledány sloučeniny.

·· ····

• · · · · • · · · · • · · · · · · · • · · • · · · ·

Jako „ob-responsivní buňky pro stanovování sloučenin zamýšlených pro léčbu obezity a diabetů, jsou zvláště vhodné buněčné linie odvozené od tkáně jater, mozku nebo pankreatu a fibroblasty. Určité oblasti mozku jsou centrem pro kontrolu tělesné hmotnosti a energetické rovnováhy, a tyto regulují účinky ob-proteinu. Játra kontrolují mnoho metabolických procesů, které ovlivňují hladiny lipidů a glukózy. S výhodou jsou použity buňky odvozené od zvláštních částí těchto orgánů, které obsahují příslušné endogenní JAK, STÁT proteiny a jiné intracelulární proteiny, které jsou vyžadovány pro zprostředkování účinků leptinu.

Element zprostředkující odpověď DNA, reportér a zvláště promotor jsou vhodně inkorporovány do vektoru, který je je schopný transfekovat ob-responsivní buněčnou linii.

Vhodné vektory jsou komerčně dostupné vektory, jako například 'pGL2-basic luciferase vector (Promega) (dále pGL2-základní vektor nesoucí gen pro luciferázu).

Vhodná struktura vektoru je STÁT element zprostředkující odpověď DNA proti směru od genu promotoru a reportérového genu. Ještě vhodnější struktura vektoru je STÁT element zprostředkující odpověď DNA ve vícečetných tandemových opakováních (2 až 10), proti směru od genu promotoru thymidinkinázy a reportérového genu luciferázy.

Vektory jsou tvořeny tak, aby obsahovaly- reportérový gen, například pro luciferázu izolovanou ze svatojanských mušek nebo enzym chloramfenikolacetyltransferázu, napojený na minimální promotor, například thymidinkinázu ·· ···· ···· ·· · 4 4 4 4

4 9 4 9 9 9 4 9

9 99 4 9 4 444 449 ·· ··· 9 9 i* ······· 99 9 94 44 viru herpes simplex nebo SV40 promotor. Fragmenty DNA pro STÁT element zprostředkující odpověď DNA jsou vloženy do vektoru použitím míst působení příslušného restrikčního enzymu proti směru od minimálního promotoru.

Element zprostředkující odpověď DNA, reportér a promotor, dle potřeby, jsou vloženy do vektoru použitím běžných technik exprese. Například DNA fragmenty pro element zprostředkující odpověď DNA mohou být vloženy do vektoru využitím vhodných míst působení příslušného restrikčního enzymu proti směru od minimálního promotoru.

STÁT element zprostředkující odpověď DNA reportérových systémů luciferázy může být zkonstruován tak, jak popisuje Lamb a kol., Blood, 8^, 2063 (1994) a Seidel a kol., Proč.

Nat. Acad. Sci. USA, 92, 3041 (1995).

Ob-responsivní buňky jsou transfekovány konstrukty o složení STÁT element zprostředkující odpověď DNA-minimální promotor-reportér luciferázy, použitím standardních postupů, například způsobu fosforečnanu vápenatého (Graham a Van Der Eb, Virology, 52, 456 (1973)) . Za účelem korekce rozdílů transfekce, mohou být buňky ko-transfekovány referenčním plazmidem exprimujícím β-galaktosidázovou aktivitu. Po určitém časovém úseku od transfekce (12 až 24 hodin) jsou buňky ošetřeny sloučeninou v různých koncentracích a poté odebrány a lyžovány. V lyzátech je následně stanovena aktivita luciferázy, případně také aktivita β-galaktosidázy. Potenciace nebo antagonistická aktivita může být stanovena pre- nebo ko-adicí ob-proteinu v příslušné koncentraci ke zkoumané sloučenině, a následným *

měřením potenciace nebo redukce odpovědi luciferázy, a následným srovnáním vzhledem k odpovědi zprostředkované samotným ob-proteinem. Pro stanovení enzymatické aktivity *« toto·· • to* ·· « ♦ · · · « « • * to te to • t to· · · 9 · ·« ··· , * ·· ··♦ ·· ··» ··»· »· · ·· ·· luciferázy existují standardní postupy, například Ow. a kol., Science, 234, 856 (1986) a de Wet a kol., Mol. Cell Biol., Ί_, 725 (1987), a také několik komerčních kitů.

Stabilní buněčné linie mohou být vytvořeny transfekči „ob-responsivní buněčné linie konstruktem reportéru a dále volitelným markérem. Volitelné markéry jsou rutinně používány k tvorbě stabilních buněčných linií, jak popsal J.D. Watson a kol. v Recombinant DNA, 2. vyd., str. 216 (1992). Tyto stabilně transfekované linie buněk mohou být použity ke generování stanovení sloučenin, které napodobují, potencují nebo blokují fyziologické účinky ob-proteinu, přičemž přitom se použije velkého množství materiálu vloženého do procesu, hlavně ve specifikované časové periodě.

Vynález se také zabývá sloučeninami, které napodobují, potencují nebo inhibují fyziologické účinky ob-proteinu, pokud jsou identifikovány způsobem zde popsaným.

Vynález se rovněž týká kitu částí adaptovaných pro použití v postupu zde popsaném.

Pokud je v textu použit výraz „sloučenina, která napodobuje fyziologické účinky ob-proteinu, jde o sloučeninu, která je schopná působit v nepřítomnosti obproteinu, a to tak, že buď stimuluje receptor pro obprotein k poskytnutí v podstatě stejného fyziologického účinku jako má ob-protein, nebo aktivuje odpověď po směru tohoto receptoru.

Pokud je v textu použit výraz „sloučenina, která potencuje fyziologický účinek ob-proteinu, jde o sloučeninu, která zesiluje schopnost účinkovat a/nebo zesiluje maximální fyziologický účinek ob-proteinu.

Pokud je v textu použit výraz „sloučenina, která inhibuje fyziologický účinek ob-proteinu, jde o sloučeninu, která redukuje nebo v podstatě blokuje fyziologický účinek ob-proteinu.

Za účelem optimalizace exprese polypeptidů pro identifikaci agonistů nebo antagonistů, dle potřeby, může být cDNA, která kóduje funkční formu polypeptidů, transfekována pod kontrolou konstitučního promotoru (například virový promotor) nebo regulovatelného promotoru. Alternativně jsou element zprostředkující odpověď DNA a reportér exprimovány v buněčné linii, do které byly konstituční nebo regulovatelný promotor vpraveny metodou genového inženýrství do polohy proti směru od chromozomálně kódovaného genu pro receptor ob-proteinu, a to metodou homologní rekombinace. Tyto metody jsou shrnuty ve Waldman, Critical Rewievs in Oncology/Hematology, 12, 49 (1992), a konkrétní příklad je uveden v Riele a kol., Proceedings of National Academy of Sciences, 8 9, 5128 (1992) .

Následující příklady ilustrují vynález, ale v žádném případě ho neomezují.

Příklady provedení vynálezu

Obecný postup:

Ob-responsivní buňky jsou transfekovány reportérovým plazmidem, který nese STÁT element zprostředkující odpověď DNA ve vícečetných tandemových kopiích proti směru od genu minimálního promotoru, např. promotoru thymidinkinázy viru • ·

herpes simplex, a konstrukt reportérového genu pro luciferázu. Transfekce je provedena použitím standardního postupu, například způsobem fosforečnanu vápenatého (Graham and Van Der Eb, Virology, 52, 456 (1973) ) . Ke korekci rozdílů v účinnosti transfekce mohou být buňky kotransfekovány referenčním plazmidem, který exprimuje βgalaktosidázovou aktivitu. Po určitém časovém úseku od transfekce (12-24 hodin) jsou buňky ošetřeny sloučeninou v různých koncentracích a poté odebrány a lyžovány.

V lyzátech je stanovena aktivita luciferázy, případně i βgalaktosidázy. Antagonistická aktivita může být stanovena pre- nebo ko-adicí ob-proteinu v příslušné koncentraci ke zkoumané sloučenině a následným měřením redukce v odpovědi luciferázy, v porovnání k redukci způsobené ob-proteinem samotným. Ke stanovení enzymatické aktivity luciferázy existují standardní metody, např. Ow a kol., Science, 234, 856 (1986) a de Wet a kol., Science, 7, 725 (1987). Také existuje několik komerčních kitů.

Příklad 1

Buňky Gtl-7 (W.C. Wetsel, Cellular and Molécular Neurobiology, 15(1), 43 (1995)) jsou transfekovány reportérovým plasmidem, pGL2-základním vektorem nesoucím gen pro luciferázu (Promega), který obsahuje oligonukleotidový insert odpovídající čtyřikrát se opakujícímu tandemu STÁT elementu zprostředkujícího odpověď DNA, TTCCCGGAA, proti směru od genu minimálního promotoru thymidinkinázy viru herpes simplex (-35 až +10), použitím standardního postupu, například metody fosforečnanu vápenatého (Graham a Van Der Eb, Virology, 52., 456 (1973) ) . Za účelem korekce rozdílů v účinnosti transfekce, mohou být buňky ko-transfekovány referenčním plazmidem exprimujícím • · ····

β-galaktosidázovou aktivitu. Po určité době od transfekce (12 až 24 hodin) jsou buňky ošetřeny sloučeninou v různých koncentracích, poté odebrány a lyžovány. V lyzátech je stanovena aktivita luciferázy, případně také β-galaktosidázy. Antagonistická aktivita může být stanovena prenebo ko-adicí příslušné koncentrace ob-proteinu ke zkoumané sloučenině a měřením redukce odpovědi luciferázy v porovnání s případem, kdy by byl použit ob-protein samotný. Pro stanovení enzymatické aktivity luciferázy existují standardní postupy, jak uvedl například Ow a kol., Science, 234, 856 (1986) a de Wet a kol., Mol. Cell Biology, Ί_, 725 (1987), stejně jako několik komerčních kitů.

Příklad 2

Krysí PC12 buňky (L.A. Greene a A.S. Tischler, Proč. Nati. Acad. Sci. USA, 73(7), 2424 (1976)) jsou transfekovány reportérovým plazmidem, pGL2-základním vektorem nesoucím gen pro luciferázu (Promega), který obsahuje oligonukleotidový insert odpovídající čtyřikrát se opakujícímu tandemu STÁT elementu zprostředkujícího odpověď DNA, TTCCCGGAA, proti směru od genu minimálního promotoru thymidinkinázy viru herpes simplex (-35 až +10), za použití standardních postupů, například metody fosforečnanu vápenatého (Graham a Van Der Eb, Virology, 52, 456 (1973)). Ke korekci rozdílů v účinnosti transfekce mohou být buňky ko-transfekovány referenčním plazmidem, který exprimuje βgalaktosidázovou aktivitu. Po určité době od transfekce (12 až 24 hodin) jsou buňky ošetřeny sloučeninou v rozdílných koncentracích, poté odebrány a lyžovány. V lyzátech je stanovena aktivita luciferázy, a případně i β-galakto• 0 · ·· • •00 · · • 0 0 0 0 • · » · 0 » • · 0 0 0 0000000 · 0 · • ' • • · 0 0

0 sidázy. Enzymatická aktivita antagonisty a luciferázy může být stanovena tak, jak je probíráno výše.

Příklad 3

Buňky HEL 92.1.7 (ATCC TIB 180) odvozené od lidské erytroleukémie (P. Martin, Science, 216(4551), 1233 (1982)) jsou transfekovány reportérovým plazmidem, pGL2-základním vektorem nesoucím gen pro luciferázu (Promega), který obsahuje oligonukleotidový insert odpovídající čtyřikrát se opakujícímu tandemu STÁT elementu zprostředkujícího odpověď DNA, TTCCCGGAA, proti směru od genu minimálního promotoru thymidinkinázy viru herpes simplex (-35 až +10), použitím standardních postupů, například způsobem fosforečnanu vápenatého (Graham a Van Der Eb, Virology, 52, 456 (1973)). Za účelem korekce rozdílů v účinnosti transfekce mohou být buňky současně ko-transfekovány referenčním plazmidem, který exprimuje β-galaktosidázovou aktivitu. Po určité době od transfekce (12 až 24 hodin) jsou buňky ošetřeny sloučeninou v rozdílných koncentracích, poté odebrány a lyžovány. V lyzátech je stanovena enzymatická aktivita luciferázy, případně i β-galaktosidázy. Enzymatická aktivita antagonisty a luciferázy může být stanovena jak je diskutováno výše.

Příklad 4

Buňky K562 (ATCC CCL-243) odvozené od lidské chronické myeloidní leukémie (Proč. Soc. Exp. Biol. Med., 166, 546 (1981) a Blood, 45, 321 (1975)) jsou transfekovány reportérovým plazmidem, pGL2-základním vektorem nesoucím gen pro luciferázu (Promega), který obsahuje oligonukleotidový insert odpovídající čtyřikrát se opakujícímu tandemu STÁT elementu zprostředkujícího odpověď DNA, • 9 ·

TTCCCGGAA, proti směru od genu minimálního promotoru thymidinkinázy viru herpes simplex (-35 až +10), použitím standardních postupů, například způsobem fosforečnanu vápenatého (Graham a Van der Eb, Virology, 52, 456 (1973) ) . Ke korekci rozdílů v účinnosti transfekce, mohou být buňky současně ko-transfekovány referenčním plazmidem exprimujícím β-galaktosidázovou aktivitu. Po určité době od provedení transfekce (12 až 24 hodin) jsou buňky ošetřeny sloučeninou v rozdílných koncentracích, poté odebrány a lyžovány. V lyzátech je stanovena aktivita luciferázy a případně i β-galaktosidázy. Enzymatická aktivita antagonisty a luciferázy může být stanovena jak je popsáno výše.

Příklad 5

BetaTC-3 buňky insulinomu (T.J. Keiffer a kol., Biochem. and Biophys. Res. Comm., 224, 552 (1996)) jsou transfekovány reportérovm plazmidem, pGL2-základním vektorem nesoucím gen pro luciferázu (Promega), který obsahuje oligonukieotidový insert odpovídající čtyřikrát se opakujícímu tandemu STÁT elementu zprostředkujícího odpověď DNA, TTCCCGGAA, proti směru od genu minimálního promotoru thymidinkinázy viru herpes simplex (-35 až +10), použitím běžných postupů, například způsobem fosforečnanu vápenatého (Graham a Van Der Eb, Virology, 52, 456 (1973)) . Za účelem korekce rozdílů v účinnosti transfekce mohou být buňky kotransfekovány referenčním plazmidem exprimujícím β-galaktosidázovou aktivitu. Po určité době od transfekce (12 až 24 hodin) jsou buňky ošetřeny sloučeninou v různých koncentracích, a poté odebrány a lyžovány. V lyzátech je stanovena aktivita luciferázy a případně i β-galaktosidázy.

·♦ ···· • ·

• * · · is .:..:..

Enzymatická aktivita antagonisty a luciferázy může být stanovena tak, jak je probíráno výše.

Příklad 6

30A5 buňky odvozené od preadipocytů (Y. Bai a kol., J. Biol. Chem., 271(24), 13939 (1996)) jsou třánsfékóvány reportérovým plazmidem, pGL2-základním vektorem nesoucím gen pro luciferázu (Promega), který obsahuje oligonukleotidový insert odpovídající čtyřikrát se opakujícímu tandemu STÁT elementu zprostředkujícího odpověď DNA, TTCCCGGAA, proti směru od genu minimálního promotoru thymidinkinázy viru herpes simplex (-35 až +10), použitím standardních postupů, například způsobem fosforečnanu vápenatého (Graham a Van Der Eb, Virology, 52, 456 (1973)). Za účelem korekce rozdílů v účinnosti transfekce mohou být buňky ko-transfekovány referenčním plazmidem exprimujícím β-galaktosidázovou aktivitu. Po určité době od transfekce (12 až 24 hodin) jsou buňky ošetřeny sloučeninou v různých koncentracích, poté odebrány a lyžovány. V lyzátech je stanovena aktivita luciferázy a případně také β-galaktosidázy. Enzymatická aktivita antagonisty a luciferázy může být stanovena tak, jak je probráno výše.

Příklad 7

Buňky myší myotuby C2 C12 (Nátuře, 270, 725 (1977) ) jsou třánsfékóvány reportérovým plazmidem, pGL2-základním vektorem nesoucím gen pro luciferázu (Promega), který obsahuje oligonukleotidový insert odpovídající čtyřikrát se opakujícímu tandemu STÁT elementu zprostředkujícího odpověď DNA, TTCCCGGAA, proti směru od genu minimálního promotoru thymidinkinázy viru herpes simplex (-35 až +10), použitím

99 • 9 9 9 • 9 · · _#· · ···

9

99 standardních postupů, například způsobem fosforečnanu vápenatého (Graham a Van Der Eb, Virology, 52, 456 (1973)). Za účelem korekce rozdílů v účinnosti transfekce mohou být buňky současně ko-transfekovány referenčním plazmidem exprimujícím β-galaktosidázovou aktivitu. Po určité době od transfekce (12 až 24 hodin) jsou buňky ošetřeny sloučeninou v různých koncentracích, poté odebrány a lyžovány.

V lyzátech je stanovena aktivita luciferázy, případně βgalaktozidázy. Enzymatická aktivita antagonisty a luciferázy může být stanovena, jak je probráno výše.

Příklad 8

Ovariální buňky SK-OV-3, ATCC číslo HTB77 (J. Fogh a G. Trempe, Human Turaour Cells In Vitro, J. Fogh (vyd.) Plenům Press, New York, str. 155 až 159 (1975); J. Fogh a G. Trempe, J. Nati. Cancer Inst. Bethesda, 587, 209-214 (1977)) jsou transfekovány reportérovým plazmidem, pGL2základním vektorem nesoucím gen pro luciferázu (Promega), který obsahuje oligonukleotidový insert odpovídající čtyřikrát se opakujícímu tandemu STÁT elementu zprostředkujícího odpověď DNA, TTCCCGGAA, proti směru od genu minimálního promotoru thymidinkinázy viru herpes simplex (-35 až +10), použitím běžných postupů, například způsobem fosforečnanu vápenatého (Graham a Van Der Eb, Virology, 52, 456 (1973)). Za účelem korekce rozdílů v účinnosti transfekce mohou být buňky ko-transfekovány referenčním plazmidem exprimujícím β-galaktosidázovou aktivitu. Po určité době od transfekce (12 až 24 hodin) jsou buňky ošetřeny sloučeninou v různých koncentracích, poté odebrány a lyžovány. V lyzátu je stanovena aktivita luciferázy, případně i β-galaktosídázy. Enzymatická aktivita ···· ···

.. . . : :

• · · · * · · · ·

’.· antagonisty a luciferázy může být stanovena, jak je probráno výše.

Příklad 9

Buněčná linie odvozená od hepatomových buněk, které byly transfekovány funkční formou leptinového receptoru (Baumann a kol., Proč. Nat. Acad. Sci., 93, 8374-8378 (1996)), je transfekována reportérovým plazmidem, pGL2základním vektorem nesoucím gen pro luciferázu (Promega), který obsahuje oligonukleotidový insert odpovídající čtyřikrát se opakujícímu tandemu STÁT elementu zprostředkujícího odpověď DNA, TTCCCGGAA, proti směru od genu minimálního promotoru thymidinkinázy viru herpes simplex (-35 až +10), použitím běžných postupů, například způsobem fosforečnanu vápenatého (Graham a Van Der Eb, Virology, 52., 456 (1973)). Ke korekci rozdílů v účinnosti transfekce mohou být buňky ko-transfekovány referenčním plazmidem exprimujícím β-galaktosidázovou aktivitu. Po určité době od transfekce (12 až 24 hodin) jsou buňky ošetřeny sloučeninou v různých koncentracích, poté odebrány a lyžovány. V lyzátech je stanovena aktivita luciferázy, případně i β-galaktosidázy. Enzymatická aktivita antagonisty a luciferázy může být stanovena tak, jak je probráno výše.

Příklad 10

Buňky WRL68 byly kultivovány v jejich běžném kultivačním médiu, při současné přítomnosti 10% fetálního telecího séra, až do momentu, kdy začalo docházet k jejich splývání. V tomto momentu byly buňky přeneseny do média, které toto sérum neobsahovalo, a tam ponechány minimálně 18 • · <· · .ϊ........ ·· ·* hodin (snížení koncentrace séra v kultivačním médiu může také mít stejné výsledky). Po séru hladovějící buňky byly následně ošetřeny leptinem nebo sérem (jako pozitivní kontrola c-fos up-regulace), po různě dlouhou dobu, od 5 minut po 2 hodiny. Z buněk byla extrahována RNA a podrobena gelové elektroforéze a Nothern blotu. Blotovaná RNA byla následně zkoušena sondou značenou c-fos, za účelem analýzy exprese c-fos, přičemž data jsou normalizována analýzou exprese β-aktinu. Léčba leptinem významně zvýšila expresi c-fos ve WRL68 buňkách (viz tabulka 1), stejně tak by fungovalo sérum při pozitivní kontrole sérem. Proto se předpokládá, že leptin aktivuje STÁT proteiny. Také se předpokládá, že WRL68 buňky jsou vhodné pro identifikaci látek napodobujících účinky leptinu. Analýzou exprese c-fos mohou být i jiné buněčné linie identifikovány jako citlivé na leptin.

Claims

1. Způsob detekce sloučeniny, která napodobuje, potencuje nebo inhibuje fyziologické účinky ob-proteinu, vyznačující se tím, že zahrnuje:

a) pro sloučeninu, která napodobuje fyziologický účinek obproteinu, stanovení účinku sloučeniny na ob-proteinem aktivovaný signálový převaděč a aktivátor transkripce (STÁT) elementu zprostředkujícího odpověď DNA, který je kondenzován s reportérovým genem; nebo

b) pro sloučeninu, která potencuje nebo inhibuje fyziologické účinky ob-proteinu, stanovení účinku sloučeniny na odpověď zprostředkovanou ob-proteinem na jím aktivovaný STÁT element zprostředkující odpověď DNA kondenzovaný k reportérovému genu;

kde, element zprostředkující odpověď DNA a reportér jsou exprimovány v ob-protein responsivní buněčné linii, jejíž buňky jsou vybrány z následujícího seznamu:

buněčná linie odvozená od hypothalamu; buněčná linie odvozená od feochromocytomu; buněčná linie odvozená od buněk hematopoetických; buněčná linie odvozená od pankreatických buněk; buněčná linie odvozená od buněk jater; buněčná linie odvozená od preadipocytů; buněčná linie odvozená od buněk příčně pruhovaného svalu; buněčná linie odvozená od ovaria; nebo

• fc ···· ·· ··. • · · * « · · · ··* ♦ *· ···· element zprostředkující odpověď DNA a reportér jsou exprimovány v buněčné linii, jejíž linie buněk (buněčná linie vyrobená metodami genového inženýrství) jsou také transfekovány polypeptidem, který je schopný stimulovat obproteinem-aktivovaný STÁT element zprostředkující odpověď DNA a obsahuje příslušné STÁT proteiny.

2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že buněčná linie odvozená od hypothalamu je neuronální GT1-7 buněčná linie.

3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že buňky odvozené od feochromocytomu jsou PC12 buňky feochromocytomu krysí nadledviny.

4. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že buněčná linie odvozená od hematopoetických buněk je HEL 92.1.7. (ATCC TIB 180) buněčná linie odvozená od lidské erytroleukémie, nebo buněčná linie K562 (ATCC CCL243) odvozená od lidské chronické myeloidní leukémie.

5. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že buněčná linie odvozená od pankreatu je buněčná linie BetaTC-3 nebo buňky RIN5mF.

6. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že buněčná linie odvozená od preadipocytů je 30A5 buněčná linie nebo dediferencované buněčné linie 3T3-L1 nebo 3T3-F442A.

7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že buněčná linie odvozená od jaterních buněk je HepG2 buněčná linie nebo buňky WRL68 a Change liver cells.

• · ·4 • 4 4 • 4 ·

4 4 4 • 44 · · ·

8. Způsob podle nároku 1, vyznačující se t í m, že buněčná linie odvozená od příčně pruhovaného svalu je buněčná linie C2 C12 myší myotuby.

9. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že buněčná linie odvozená od ovaria je SK-OV-3 buněčná linie, ATCC číslo HTB77.

10. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že polypeptid schopný stimulovat ob-proteinemaktivovaný STÁT element zprostředkující odpověď DNA je funkční izoforma receptorů pro leptin.

11. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že element zprostředkující odpověď DNA je kondenzován s genem promotoru, s výhodou minimálního promotoru.

12. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že element zprostředkující odpověď DNA je nukleotid o složení TT(N)_nAA, kde N je jakýkoliv nukleotid a n je 4,

5 nebo 6.

13. Způsob podle nároku 12, vyznačující se tím, že element zprostředkující odpověď DNA je TTCCCGGAA.