CZ115792A3

CZ115792A3 - Mixture of micro-organisms capable of biological degradation of hydrocarbons and method of application such micro-organisms

Info

Publication number: CZ115792A3
Application number: CS921157A
Authority: CZ
Inventors: Danuska Horakova; Miroslav Nemec
Original assignee: Felber Josef Bfb Tech Anstalt
Priority date: 1992-04-15
Filing date: 1992-04-15
Publication date: 1993-11-17
Also published as: US5575998A; ATE182181T1; DE59309696D1; SK115792A3; SK280063B6; CH685246A5; EP0637343A1; AU4039793A; CZ279021B6; WO1993021348A1; EP0637343B1

Description

(57) Směs mikroorganizmů schopných zejména biodegradace ropy a ropných produktů obsahuje Pseudomonás putida a Geotrichum candidum v poměru počtu buněk 5:1 až 1:1. Tato směs se indikuje kultivací v přítomnosti mastných kyselin a poté se s ní působí na uhlovodíky za přístupu kyslíku, v přítomnosti stimulátorů při pH 5,0 až 6,5 a při teplotě 15 až 30 ⁰ C.

ropy a ropných produktů.

Dosavadní stav technik'.

využívajících alifatické organismy byly izolovány z

Zájsm o využití mikroorganismů při degradaci ropných produktů v zahraničí začal již v 80 lstech, třebaže již v roce 1903 byly popsány první organismy využívající uhlovodíky jako zdroj uhlíku a energie. V současné době je 'známo více než 40 rodů mikroorganismů nebo aromatické uhlovodíky. Tyto mořské i sladké vody a půdy.

Počet baktérií a hub schopných degradace ropných uhlovodíků prudce stoupá po ropných haváriích. Tyto látky do značné míry vystupují jako selekční agens.

Z genetického hlediska je zřejmé, že schopnost většiny mikroorganismů degradovat ropné uhlovodíky je kontrolována plasmidem. Přenosem plasmidu bylo možné také vysvětlit prudké zvýšení počtu degradujících organismů.

Popa jaxo substrát pro mikroorganismy představuje' extrémně komplexní směs uhlovodíků. Saturovaná frakce ropy zahrnuje n-alkany, rozvětvené alkany a cykloalkaňy. Biodegradace n-alkanů až po je nejčastěji uskutečňována monoterminálním atakem za vzniku karbonových kyselin, které jsou dále odbourávány β - oxidací. Tento proces však může vést k akumulaci některých více či méně toxických mastných kyselin.

Rozvětvené izoprenoidní alkany jsou odbouráványčú-oxidací za tvorby dikarbonových kyselin. K biodegradaci jsou velni odolné terminálně rozvětvené alkany, které bloku jí^-oxidaci amají tendenci se v prostředí kumulovat. Po dači ropného znečištění vznikají často sloučeniny, které v prostředí persistují. Z toho vyplývá, že kvalitativní složení ropy a ropných produktů významným způsobem ovlivňuje jejich degradabilitu.

Při metabolismu ropných uhlovodíků hraji významnou úlohu další dva procesy - kooxidace a zdržení. Některé složky ropy, které nejsou běžně odbourateIné, mohou být mikroorganismy degradovány za přítomnosti jiných uhlovodíků, umožňujících rů.3t mikroorganismů. Proces degradace směsi uhlovodíků podmíněný procesy kooxidace není v žádném případě srovnatelný se schopností čistých kultur degradovat jednotlivé uhlovodíky.

Rychlost mikrobiální degradace ropných uhlovodíků je ovlivňována řadou faktorů, které přímo nebo nepřímo působí na růst a metabolismus mikrobiální populace. Významným se ukazuje fyzikální stav uhlovodíků, protože uhlovodíky jsou nejvíce degradovány na rospraní voda - uhlovodík. fázi další abiotické faktory náleží teplota a živiny. Většina heterotrofnich mikroorganismů je schopna degradovat uhlovodíky v širokém teplotním rozmezí 0 až 70° C. Teplota především ovlivňuje nejen rychlost, s jakou degradace probíhá, ale i fyzikální stav uhlovodíků, což úzce souvisí se selekpontánni degratripentaoyklioké tivním tlakem tenlotv na mikrobiální společenstva.

'10 1 komplexní:', hodnocení teuiota iými faktory a nemusí vystupovat jaxo faxto rychlost degradace ropných produktů j novena oritomnosti ou^ixn ru limitu jící. jě významně oviiv<teré jsou stolu s uhlíkatými štěpy zabudovávány do bioma; uhlíku : dusíku a uhlíku a fosforu za v iloženi rary či rooných oroduktů a abiotických faktorech oros trs 11 jHOU

4s obwklou složkou stimuiátorů stimulujících biodegradační pochody.

Ks zvýšení rychlostí degradace ropných látek přiro i společenstvy jo -nožná inkor morovat do tohoto pros = po lečens tva umělá, která mají zvýšenou afinitu k daným,<ám. Preparáty, které jsou aplikovány různými fir-iar-i v sahují c je výh o Γ05 ti'3 ií ory'2 ni srny jednono lne pro čerstvá znečištění, kdy ječ' řitomnš látky - produkty metabolismu nejsou v vy tvořené přirozeně se zde vy skytujícími organismy.

Výhodnější se jeví aplikace uměle vytvořených společenstev majících schopnost ve větší míře využívat procesů koordinace, které významným způsobem zrychlují a zkvalitňují procesy degradace.

Podstata vynálezu

Vychází z poznetku efektivnějšího využívání substrátu ropných lezen konzoreiem mikroorganismu. Podstatou vynálezu je směs mikroorganismů, která obsahuje mikroorganismus Pseudomonas putida a Seotrichum candidum v poměru počtu buněk 5:1 až 1:1. Oba mikroorganismy byly izolováx.y z prostředí kolem ropných vrtů Hodonín. Po izolaci nebyly mikroorganismy dále geneticky upravovány.

Pseuiomonas putida je běžný koutaminst půdy, vody, rostlin, nemocničního prostředí, z vzorků jako orortunnš rato••enní .

i... a _ o v an

- τ e o t r i c n u >

vodv. 7ř ů i d ar še vyskytuje < 12. Π1 3 !< 3 Γ. ί T 2. t 5 Γ1 S 1U ^Ί 3. k O kaoe ani ovocínu tout;

da a Geotrichum candidum spočívá v tom, žs sa tato směs namnoží a indikuj a na syntetickém mediu v přítomnosti mastných kyselin a potě sa s ní působí na uhlovodíky za přístupu kyslíku, v přítomnosti stimulstorň, zejména dusíku, fosforu, popřípadě stopových prvků, přičemž poměr uhlíku a dusílu se běhám působení směsi vrředu uváděných mikroorganizmů ad.

:u ,··:

v rozmázl hmotnostních poměří Optimální prostředí pr: dl;

a o p. ' η n . i ' — z. Iv '_> . 1 .

liodemradaci uhlovodíků mikroorganismu podlá vynálezu je prostředí o pH 5,0 až teplota. 15 až 30 oC.

Pro přípravu a indukci směsi mikroorganismů podlá vynálezu ja vhodné použít syntetická médium obsahující pouze fosfor a du_sík v rozpustné formě a kyselinu olejovou. Výchozí pK kultivačního media je vhodné volit v rozmezí 5,0 až 5,5. Za intenzivního provzdusňování při teplotě 20 až 25 °C je doba kultivace á až 10 dní podle požadavku na hustotu bakteriální suspenze.· Preparát je možné potom lyofilizovat nebo po odvodnění zakotvit do gelu.

Preparát lze aplikovat metodou ex šitu nebo in sítu postřikem na kontaminovanou půdu nebo inokulací do kontaminovaného vodného zdroje či odpadních vod kontaminovanými ropnými látkami za současného přidáváni metabolického stim.ulátoru. Metoda umožňuje i- využití fe rme n to ru, který je plněn syntetickým prostředím, stimulátorem a kontaminovanou vodou. Mikrobiální směs je přidávána v množství, odpovídajícím hodnotě optické dentity při 620 nm (OB^gC·) ^v rozmezí 0 , UO až 'ze v I 'i » i ' ‘ - )

Begradačni prooes probíhá za aerobních podmínek.

Pokud je mikrobiální směs ar linován? nástřik;

fi .H.

;onoii ex šitu rouši ²e

0,1 až 1 1 směsné kultury o η o o. n o t e o n z i c k s o ttiZity pr i na Ím-· zeminy, v závislosti x 4. a ť. x. ix x. a - u vcj ,r. _V’J -4 ^r.< n ikosmi a 1 ’ i = zn

X4Í .. , •uk ture cultury na ~ . V obou případech je nutná ze.minu před vlastni anlikaoí nakypřit pro > a j i á t ě n i vhodní ii·:-.;

. :?mesna zul tu•a při aplikaci obsahuje současně stimulátory.

aniikaoe zoňsobu podle vynáleze převážné části rovných látek cřítemnech v nrostředí, které z části jsou převedeny na kysličník uhliči' z abudovánv do buněčného materiálu , rřira.h;

V v .7. ) z části vvloučenv d.

tr

Výhodou, navržené aplikace je především to, í metaboli ty nejsou toxické.

Při arlikaci navrhované směsi mikroor-.anismů j v'··* znám — ná také velká počáteční rychlost degradace kontaminujíoíoh 1 át ak.

Další výhodou je, že aplikací preparátu se významnou měrou zvýší počet mikroorganismů v prostředí, což .je výhodné především- ke zlepšení struktury zeminy a k navození téměř původního stavu.

Vzhledem k tomu, že aplikované organismy byly izolovány z přirozeného prostředí a geneticky· nebyly manipulovány, nevzniká, nebezpečí jejich negativního vlivu na biosféru.

Příklady provedení

Příklad 1

1000 ml syntetického media s počátečním poměrem uhlík : dusík : fosfor = 800 až kQO : 6 : 1 se zaočkuje připravenou indukovanou kulturou (HO 1) je j íi onziCKa =0,6p0, při poměru počtu burn eotri· chum candidum = 3 : 1. Výchozí hodnota pH=6,0. Kultivace probíhá při 20 .až 25 ³ 0 za provziušnováni. Stimulátor byl přidán na počátku kultivace a dále vždy po 5 až 10 dnech v takovém množství, aby poměr mezi uhlíkem a dusíkem byl 60 až

100:1.Obsah ropných látek ss stanovil pomocí infračervené li spektroskopie porovnáním transmitanoe vzorku a standardu, při vlnočtu 2920 cm^-1.

Obsah rouny3h látek /g.l */

Vzorek PO 1	stimulátor	0 dnů	10 drnů	2T dnů	38 d n ů
Surová ropa -		16,3	IP	18,4	18,2
+	-	34,1	22,1	15 π	6,1
+	+	34,0	1 P p	11,7	1,2
Vyjetý
automobil. +	+	18,0	7,8	1,6	0,23
le j
		t
Vyjetý olej
+ surová +	+	18,3	8,2	3,0	0,62

ropa /1:1/

Příklad 2 :

1000 ml syntetického media se zaočkuje připravenou indukovanou kulturou PC 1 tak, aby OD^jq =0,650, při poměru počtu buněk Pseudomonas : Oeotriohum = 3:1 . Testované ropné produkty se přidají ke směsi na koncentraci 10 g.l . Kultivace probíhá při teplote 20 až 25^JC za crovzdušňování. Stimulátor je přidáván vždy po 7 dnech podle podmínek v příkladu 1. Obsah ropných látek se stanoví pomocí infračervené spektroskopie.· Byla pozorována transmitanoe vzorku a standar

u při vlnočtu 2220 Vzorek

-1.

v) Γ’ £ m. Γ. í* O ·

L-tek /.·

	IC X · / i . .	OL	3° dr·’	Kd i
Ώ -	t r o 1 e j	pT	G) Γ ' i	p d íi ) -	C 1 . _} <—	·*>	? 1 ) '·
			s·
’ U	torovy	olej	r-·,·· i		'· ) - -	' ·
	—
- *'	j’
« v					— -		’\
d ? .	i ' — íi		íi tf '· ) — -	— i	) - —	v..'	, r-,
TJ ._r	d r a u i i c	.< 3- í^r 3. 3. —
ii	na ANG	1 0	2,12	0,60	0,2^	0	,20
Pe	nzin B-3	tj	3,63	2,07	0,80	0	,26
Pe	trolej	PN-3	2,9á	1,60	0,25	0	,22
Pe	trolej	PN-3	2,86	1,52	0,32	0	>^2

s antioxidantem Příklad 3 :

Na 1000 g zeminy kontaminované ropnými produkty po havárii 32 aplikovalo 1000 ml směsné indukované kultury PC 1/OD 620 = 0,600, při poměru počtu buněk Pseudomonas : Geotrichum = 1:1. Kultivace probíhala při 20 až 25°0 ve skleněných vanách. Každý druhý den byla zemina provzdušnována .několikerým převrácením. Stimulátor b.yi přidáván vždy po 8 až 10 dnech podle podmínek v příkladu 1. Obsah ropných látek byl po extrakci do tetrachloru stanoven infračervenou spek:roskopií při vlnočtu 2520 cm

Claims

Kontaminace zeminy byla poměrně nízká a tudíž bylí kultura PC1 aplikována pouze na začátku procesu biodegradaoe. V případě vyššího znečištění lze prooes urychlit přídavkem směsné kultury v průběhu biodegradace.

3ΙΠ3 3Π:

Průmyslová využitelnost

Uměle připravená směs mikroorganismů že stabilní v rozených podmínkách, je aktivní v širokém rozmezí pn=á, , ,0 a t_ploty 1 > až 2.· Fodmínkou k dosažení maximální fyziologické aktivity je optimální přísun kyslíku /pro oxidaci 3,5 g surové ropy je potřebný nejméně 1 g 0₂/ _a p_ří_torn_ nost stimulátoru. Připravené konzorcium je schopné degradovat ropné uhlovodíky jak při vysokém zatížení /nad 10 g/1/ tak i při relativně nízkém zatížení /kolem 1 g/1/. V obou případech po provedené degradaci je možné detekovat koncentrace ropných látek’přípustné normou.

pri j až

Směr mikroorganismů podle vynálezu je schopna likvidovat odpady obsahující uhlovodíky, zejména ropu a její nroduRty, eventuálně ekologické katastrofy, při nichž dojde ke kontaminaci půdy či vody ropnými látkami.

j urŮměru bur.e-··
2. Způsob hioailraiscž uř. 1 o '.’3 anu áaesi podie roou .. v y z Π 2 Č Ll jící 53 tím, Ss 2 2 n ' j P 1 O V O 2 1 <7 isiáooi směsí siferoDi^aniscú podle bodu i, Která ss indukuje zuiíi— Vrl 3 ί V pŤ^ítOGiXlOStí Π13 S t fiV 3 h k V 3 3 1 ϊ Π , 22 ΟΓ i 3 t U Oli Ky S 1 lk U , V přítomnosti 3timulátorů, zejména dusíku a fosforu, stopových prvků, přičemž poměr uhlíku a dusíku působení směsi mikroorganizmů podle bodu 1 udržuje 60 až 100:1.

po ori pa oe ss během v rozrazí

Způsob podle bodu 2 v y a n a č u j i 3 že se na uhlovodíky ousobi směsi mixroorzanizanu po^u;

oo du