CS277617B6

CS277617B6 - Process for isolating various application forms of tylosine

Info

Publication number: CS277617B6
Application number: CS90802A
Authority: CS
Inventors: Viktor Rndr Csc Malanik; Vladimir Ing Kristan; Petr Ing Stary; Tomas Ing Csc Kutal; Bohumil Prof Mvdr Drsc Sevcik; Stefan Rndr Mazan
Original assignee: Vu Pro Biofaktory A Veterinarn
Priority date: 1990-02-19
Filing date: 1990-02-19
Publication date: 1993-03-17
Also published as: CS9000802A2

Abstract

Způsob získávání různých forem antibiotika tylozinu z fermentačních procesů při výrobě ve větších objemech, kdy se před další separací antibiotika tylozinu zařadí mikrofiltrace nebo ultraflltrace či případně i diafiltrace nativní nebo upravené fermentační půdy. Získaný filtrát obsahující tylozln Je posléze zahuštěn a případně i částečně odsolen na membráně nepropouštějící 2Í Izolované antibiotikum. Získaný koncentrát W zbavený nežádoucích příměsí se použije přímo pro přípravu konečného produktu pro použití v živočišné výroběA method for obtaining various forms of tylosin antibiotic from fermentation processes in the production process larger volumes, when before the next separation tylosin antibiotics classify microfiltration or ultrafiltration or, optionally, native or diafiltration treated fermentation broth. The filtrate obtained contains tylozln It is then thickened and possibly even partially desalinated on membrane impermeable Isolated antibiotic. Concentrate obtained W free of undesirable impurities is used directly for preparing the final product for use in livestock production

Description

Vynález se týká způsobu izolace různých aplikačních forem antibiotika tylozinu připravovaného biotechnologickým fermentačním postupem.The invention relates to a process for the isolation of various dosage forms of the antibiotic tylosin prepared by a biotechnological fermentation process.

Tylozin je 16tičlenné makrolidové antibiotikum často používané ve veterinární praxi. Vyrábí se submerzní kultivací mikrobiálního kmene Streptomyces fradiae. V praxi jsou používány různé aplikační formy tohoto antibiotika, počínaje technickými a konče čistými formami.Tylosin is a 16-membered macrolide antibiotic often used in veterinary practice. It is produced by submerged cultivation of a microbial strain of Streptomyces fradiae. In practice, various application forms of this antibiotic are used, starting with technical and ending with pure forms.

Izolační postupy umožňující získat požadované formy lze rozdělit zhruba do tří kategorií. V případě výroby technického tylozinu je izolační postup založen na sušení fermentační půdy obsahující tylozin na rozprašovací sušárně (čs. AO 270 801). Výhodou této bezodpadové technologie je jednoduchost, nevýhodou je omezená použitelnost získaného preparátu a vzhledem k přítomným balastním látkám i možnost ztrát antibiotické aktivity během dalšího skladování.Isolation procedures to obtain the required molds can be roughly divided into three categories. In the case of the production of technical tylosin, the isolation procedure is based on drying the fermentation broth containing tylosin in a spray dryer (MS AO 270 801). The advantage of this waste-free technology is simplicity, the disadvantage is the limited applicability of the obtained preparation and, due to the ballast substances present, the possibility of loss of antibiotic activity during further storage.

Modifikací tohoto postupu lze dosáhnout přípravy vodorozpustného technického tylozinu. Vhodným způsobem upravená fermentační půda obsahující antibiotikum tylozin je zfiltrována nebo zcentrifugována a čirý roztok je usušen na rozprašovací sušárně. Výsledný produkt se oproti technické formě vyznačuje vyšším obsahem tylozinu a někdy i výrazně lepší stabilitou antibiotické aktivity. Částečná nevýhoda tohoto postupu spočívá v tom, že při filtraci nebo odstředění fermentační půdy se odseparují pouze nerozpustné látky, zatímco makromolekulám! látky typu bílkovin a podobně přecházejí do roztoku. Při sušení na rozprašovací sušárně jsou některé látky hlavně bílkovinného charakteru tepelně denaturovány, což má za následek, že výsledný produkt při aplikaci, kdy je rozpouštěn ve vodě, poskytuje zakalené roztoky. Další nevýhodou tohoto postupu je omezená možnost způsobu aplikace vodorozpustné technické formy.By modifying this procedure, the preparation of water-soluble technical tylosin can be achieved. A suitably treated fermentation broth containing the antibiotic tylosin is filtered or centrifuged and the clear solution is spray-dried. Compared to the technical form, the resulting product is characterized by a higher content of tylosin and sometimes significantly better stability of antibiotic activity. A partial disadvantage of this process is that only insoluble substances are separated during filtration or centrifugation of the fermentation broth, while macromolecules are separated! protein-type substances and the like pass into solution. When spray-dried, some substances, mainly of a proteinaceous nature, are thermally denatured, with the result that the final product, when dissolved in water, gives turbid solutions. Another disadvantage of this procedure is the limited possibility of applying the water-soluble technical form.

Třetí způsob izolace tylozinu je založen na klasických postupech chemického a farmaceutického průmyslu a bývá používán pro získání jeho čistých forem. Izolační postup bývá většinou realizován podle následujícího schématu: filtrace nebo odstředění fermentační půdy, extrakce filtrátu do organické fáze, reextrakce do vodné fáze při pH 4,5 - 6,5 a zpracování extraktu na požadovanou čistou formu tj. bázi nebo příslušnou sůl (Hamill R.L. a spol. Antibiotic Chemotherapy 11, (5) 328 - 334 (1961), Čs. AO 197600).The third method of isolating tylosin is based on classical procedures of the chemical and pharmaceutical industries and is used to obtain its pure forms. The isolation procedure is usually carried out according to the following scheme: filtration or centrifugation of the fermentation broth, extraction of the filtrate into the organic phase, re-extraction into the aqueous phase at pH 4.5 - 6.5 and processing the extract to the desired pure form, ie base or appropriate salt (Hamill RL et al., Antibiotic Chemotherapy 11, (5) 328-334 (1961), Czechoslovak AO 197600).

Hlavní nevýhodou při realizaci výroby čistých forem tylozinu je práce s velkým objemem organického extrakčního rozpouštědla vyplývající z dodržení nutného poměru vodné a organické fáze 5:1. Používání velkého množství organického extrakčního činidla vyžaduje jak zavedení jeho regenerace, tak i odstranění jeho zbytků z vyextrahované vodné fáze, a to s ohledem na další likvidaci odpadních vod. Tyto operace prováděné s relativně velkými objemy jsou při dodržování všech hygienických a ekologických hledisek ekonomicky a technologicky velmi náročné.The main disadvantage in the production of pure forms of tylosin is the work with a large volume of organic extraction solvent resulting from maintaining the necessary ratio of aqueous and organic phase 5: 1. The use of a large amount of organic extractant requires both the introduction of its regeneration and the removal of its residues from the extracted aqueous phase, with a view to further disposal of the waste water. These operations carried out with relatively large volumes are economically and technologically very demanding while complying with all hygienic and ecological aspects.

Jednou z možností, jak některé uvedené nedostatky objevující se při izolaci vodorozpustného technického tylozinu a čistých forem tylozinu odstranit, je zařazení membránových separačních procesů do jednotlivých izolačních postupů. V současné době jsou mikrofiltrace, ultrafiltrace a reverzní osmóza běžnými separačnímí postupy používanými v mnoha oborech, zejména ve spojení se separací látek ionogenní a neionogenní povahy jako jsou koloidy, polymery, makromolekuly a rozpustné nízkomolekulární látky nacházející se převážně ve vodném prostředí (Souvivajan S.: Reverse Osmosis, Logos, London 1971; Belford G.: Syntetic Membrane Processes, Academie Press lne. 1984). Jsou použitelné jak v kontinuálním, tak i diskontinuálním uspořádání. Účinnost separace je závislá na typu použitých separačních membrán, jejich' dělicích hranicích, hydrodynamických poměrech v separačním zařízení a na použitém tlaku a teplotě. Aplikací těchto technik je dosahováno buď zvýšení koncentrace žádaných látek anebo naopak získávání upravených vodných roztoků bez přítomnosti nežádoucích příměsí (Delyannis A., Delyannis E.-E.: Seawater and Desalting, Vol. 1., Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York 1980).One of the ways to eliminate some of the mentioned shortcomings appearing in the isolation of water-soluble technical tylosin and pure forms of tylosin is to include membrane separation processes in individual isolation processes. At present, microfiltration, ultrafiltration and reverse osmosis are common separation procedures used in many fields, especially in connection with the separation of ionic and non-ionic substances such as colloids, polymers, macromolecules and soluble low molecular weight substances predominantly in aqueous media (Souvivajan S .: Reverse Osmosis, Logos, London 1971; Belford G .: Synthetic Membrane Processes, Academie Press lne. 1984). They can be used in both continuous and discontinuous configurations. The separation efficiency depends on the type of separation membranes used, their separation limits, the hydrodynamic conditions in the separation device and on the pressure and temperature used. The application of these techniques achieves either an increase in the concentration of the desired substances or, conversely, obtaining treated aqueous solutions without the presence of undesirable impurities (Delyannis A., Delyannis E.-E .: Seawater and Desalting, Vol. 1, Springer Verlag, Berlin, Heidelberg, New York 1980).

Některé nedostatky spojené s izolací vodorozpustného technického tylozinu anebo čistých forem tylozinu odstraňuje způsob podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že fermentovaná půda nativní nebo modifikovaná, její filtrát či supernatant s obsahem sušiny od 0,15 do 15 % hmot, a obsahem tylozinu od 0,05 do 30 % hmot, v sušině se případně mikrofiltrují nebo ultrafiltrují, a i případně diafiltrují. Výběr vhodné porozity a typu mikrofiltračních a ultrafiltračních membrán umožňuje zajistit, aby tylozin se nacházel převážně v permeátu, oddělen od většiny doprovázejících balastních makromolekulárních látek. Zařazením diafiltračního kroku s Ó,1 až 10 násobným množstvím diafiltrační vody vzhledem k původnímu objemu zpracovávané fermentační půdy lze zajistit až 98 % výtěžnost celého procesu. Permeát obsahující antibiotikum tylozin je pak dále zpracováván buď koncentrací na reverzně-osmotických membránách zajišťujících odstranění části rozpouštědla a případně i rozpuštěných nízkomolekulárních látek, nebo jinými vhodnými izolačními postupy.Some of the disadvantages associated with the isolation of water-soluble technical tylosin or pure forms of tylosin are eliminated by the process according to the invention, which consists in native or modified fermented soil, its filtrate or supernatant with a dry matter content of 0.15 to 15% by weight and a tylosin content of 0.05 to 30% by weight, optionally microfiltered or ultrafiltered in the dry matter, and optionally diafiltered. The choice of the appropriate porosity and type of microfiltration and ultrafiltration membranes makes it possible to ensure that tylosin is predominantly present in the permeate, separated from most of the accompanying ballast macromolecular substances. By including a diafiltration step with 0.1 to 10 times the amount of diafiltration water relative to the original volume of the fermentation broth to be processed, up to 98% yield of the whole process can be ensured. The permeate containing the antibiotic tylosin is then further processed either by concentration on reverse-osmotic membranes to remove part of the solvent and possibly also dissolved low molecular weight substances, or by other suitable isolation methods.

Způsobem podle vynálezu dochází k podstatné ekonomižací výroby různých forem tylozinu, neboť se pracuje s menšími objemy roztoků a organických rozpouštědel, zlepší se hygienické a ekologické poměry při výrobě a uspoří se různé formy energie. Zároveň zařazením metod membránové separace do izolačních postupů se zvyšuje výtěžek izolovaného tylozinu a snižuje možnost jeho případné inaktivace. Způsobem podle vynálezu se dále umožní získat stabilní vodorozpustný technický tylozin, což současné metody přípravy zatím neumožňují.The process according to the invention results in a substantial economization of the production of the various forms of tylosin, since smaller volumes of solutions and organic solvents are used, the hygienic and ecological conditions of the production are improved and various forms of energy are saved. At the same time, the inclusion of membrane separation methods in isolation procedures increases the yield of isolated tylosin and reduces the possibility of its possible inactivation. The process according to the invention also makes it possible to obtain stable water-soluble technical tylosin, which is not yet possible with the current preparation methods.

V dalším je vynález blíže objasněn v příkladech provedení, aniž by se jimi omezoval.In the following, the invention is further elucidated in the exemplary embodiments without being limited thereto.

Příklad 1Example 1

Fermentační půda obsahující antibiotikum tylozin o aktivitě 7 650 m.j./ml byla upravena formalínem tak, aby jeho výsledná koncentrace v půdě byla 0,5 % objemových a byla zahřáta po dobu 3 minut při teplotě 70 °C. Po ochlazení a koagulaci byla suspenze zfiltrována přes křemelinový filtr a 20 litrů čirého filtrátu o pH - 6,8 bylo podrobeno ultrafiltraci na ultrafiltračních membránách (např. FS61PP) zadržujících vysokomolekulární látky o molekulové hmotnosti větší než 20 000. Permeát byl podroben reverzní osmóze na membránách (např. HC-50) zadržujících látky o relativní molekulové hmotnosti větší než 300. Koncentrát o objemu 3,5 1 obsahující antibiotikum tylozin o koncentraci 41 000 m.j./ml byl pak dále zpracován extrakcí do 1,5 1 organického rozpouštědla a dalšími izolačními postupy na čistou formu tylozinu base. Ztráty antibiotické aktivity při membránových separačních procesech nepřesáhly hodnotu 6,2 % a dosažení koncentrační faktor byl 5,7.The fermentation broth containing the antibiotic tylosin with an activity of 7,650 IU / ml was treated with formalin so that its final concentration in the soil was 0.5% by volume and was heated for 3 minutes at 70 ° C. After cooling and coagulation, the suspension was filtered through a pad of diatomaceous earth and 20 liters of clear filtrate of pH 6.8 was ultrafiltrated on ultrafiltration membranes (eg FS61PP) retaining high molecular weight substances with a molecular weight greater than 20,000. The permeate was subjected to reverse osmosis on membranes. (eg HC-50) retention substances with a relative molecular weight greater than 300. The 3.5 L concentrate containing the antibiotic tylosin at a concentration of 41,000 IU / ml was then further processed by extraction into 1.5 L of organic solvent and other isolation procedures. to the pure form of tylosin base. Losses of antibiotic activity in membrane separation processes did not exceed 6.2% and the concentration factor reached was 5.7.

Příklad 2Example 2

Fermentační půda o aktivitě 6 200 m.j./ml byla zfiltrována podle bodu 1 a čirý filtrát o objemu 15 1 byl koncentrován a částečně odsolen filtrací přes reverzně-osmotické membrány zadržující molekuly o relativní molekulové hmotnosti větší než 300. Koncentrát o objemu 1,7 1 a aktivitě 53 000 m.j./ml byl zasušen na rozprašovací sušárně za vzniku technického vodorozpustného tylozinu. Ztráty antibiotické aktivity během reverzní osmózy dosáhly 3,1 % a dosažený koncentrační faktor byl 8,8.The fermentation broth with an activity of 6,200 IU / ml was filtered according to point 1 and the clear filtrate with a volume of 15 l was concentrated and partially desalted by filtration through reverse-osmotic membranes retaining molecules with a relative molecular weight greater than 300. Concentrate with a volume of 1.7 l and activity of 53,000 IU / ml was dried in a spray dryer to give technical water-soluble tylosin. Losses of antibiotic activity during reverse osmosis reached 3.1% and the achieved concentration factor was 8.8.

Příklad 3Example 3

Tylozinová fermentační půda o aktivitě 6 500 m.j./ml byla zahřáta po dobu 3 minut na 70 ^eC. Po ochlazení na teplotu 20 °C bylo 15 1 fermentační půdy ultrafiltrováno přes ultrafiltrační membrány, které zadržovaly částice a molekuly o větší relativní molekulové hmotnosti než 50 000. Po získání 5 1 ultrafiltrátu a současném poklesu rychlosti průtoku permeátu přes ultrafiltrační membránu pod hodnotu 25 l.hod.^-1.m~² byla k fermentační půdě přidávána diafiltrační voda rychlostí odpovídající rychlosti ultrafiltrace. Diafiltrace byla ukončena po přidání 17 1 diafiltrační vody a bylo získáno 23 1 permeátu obsahujícího tylozin o koncentraci 3 850 m.j./ml. Permeát byl poté zakoncentrován a částečně odsolen reverzní osmózou jako v příkladu 1 na konečný obj em 4,1 1. Koncentrace antibiotika v koncentrátu byla 20 500 m.j./ml. Koncentrát byl dále zpracován extrakcí do 1,8 1 organického rozpouštědla a dalšími izolačními postupy na čistou formu tylozin tartarátu. Ztráty antibiotické aktivity během membránových separací dosáhly 14 % a dosažený koncentrační faktor byl 3,7.Tylozinová fermentation broth activity 6,500 IU / mL was heated for 3 minutes at 70 ^E C. After cooling to 20 ° C, 15 1 of fermentation broth ultrafiltered through an ultrafiltration membrane which retained particles and molecules of greater molecular weight than 50 000. After obtaining 5 l of ultrafiltrate and at the same time the rate of permeate flow through the ultrafiltration membrane drops below 25 l.h. ^-1 .m ~ ² , diafiltration water was added to the fermentation broth at a rate corresponding to the ultrafiltration rate. Diafiltration was terminated after the addition of 17 L of diafiltration water to obtain 23 L of a permeate containing tylosin at a concentration of 3,850 IU / ml. The permeate was then concentrated and partially desalted by reverse osmosis as in Example 1 to a final volume of 4.1 l. The antibiotic concentration in the concentrate was 20,500 IU / ml. The concentrate was further processed by extraction into 1.8 L of organic solvent and other isolation procedures to give the pure form of tylosin tartrate. Losses of antibiotic activity during membrane separations reached 14% and the achieved concentration factor was 3.7.

Claims

PATENT CLAIMS

Method for isolating various application forms of the antibiotic tylosin prepared by a biotechnological fermentation process before its further separation, for example into an organic solvent or processing into a technical water-soluble form, characterized in that the fermented soil is native or modified, its filtrate or supernatant with dry matter content of 0.25 to 15% mass, and with a tylosin content of 0.05 to 30% by weight, is microfiltered or ultrafiltered in the dry matter, or even diafiltered, the fraction passed through microfiltration or ultrafiltration membranes or the original filtrate or supernatant being concentrated and partially desalted on a membrane impermeable to the antibiotic tylosin.