CS277303B6

CS277303B6 - Spósob stanovenia bielkovín detekčnou technikou striebrom

Info

Publication number: CS277303B6
Application number: CS886347A
Authority: CS
Inventors: Kamil Ing Csc Marcinka
Original assignee: Virologicky Ustav Sav
Priority date: 1988-09-26
Filing date: 1988-09-26
Publication date: 1993-01-13
Also published as: CS634788A3

Description

Spósob stanovenia bielkovín detekčnou technikou striebrom

Ohlasů techniky

Vynález sa týká spósobu stanovenia bielkovín detekčnou technikou striebrom. '

Doterajší stav techniky

Po tom, čo Merril so spolupracovníkmi publikoval metodu stanovenia bielkovín striebrom, použitím roztoku amoniakálneho strieborného komplexu (Switzer, R.C. , Merril, C.R., Shifrin, S.: Anal. Biochem., 98, 231-237 /1979/) a roztokom dusičnanu strieborného (Merril, C.R., Dunau, M.L., Goldman, D.: Anal. Biochem., 110, 201-207 /1981/) vznikol celý rad róznych metodik, založených na jednom či druhom principe. Tieto metodiky sa vyznačovali postupným zjednodušováním pracovného postupu alebo změnami v predchádzajúcich postupoch, za účelom dosiahnutia lepších výsledkov. Týkalo sa to najma spósobu fixovania bielkovín v géli, spósobu odstraňovania kyseliny octovéj z prostredia před pósobením roztoku striebra, spósobu odstraňovania strieborných solí z gélu, spósobu vyvolávania a spósobu zastavenia vyvolávacieho procesu, avšak i procesu celkového scitlivenia metody. Z velkého množstva róznych metodik sú tu uvedené tie, ktoré sa dodnes najviac používajú a tie, ktoré v niektorom z pracovného postupu priniesli pozoruhodné zlepšenie.

Oakley a spol. (Anal. Biochem., 105, 361-363 /1980/) ako prví použili vodný 10% roztok glutaraldehydu za účelom fixovania bielkovín. To však spósobuje silné žltošedé pozadie. Wray a spol. (Anal. Biochem., 118, 197-203 /1981/) používajú amoniákálny strieborný komplex; podlá ich metodického postupu však gély majú šedé pozadie. Podobné poměrně silné šedé pozadie majú gély farbené striebrom metodou podia Morrisseya a spol. (Anal. Biochem. 117, 307-310 /1981/), ktorí před pósobením 0,1% roztoku dusičnanu strieborného použili roztok ditiotreitolu. Sammons a spol. (Elektrophoresis 2, 135-141 /1981/) publikovali taký metodický postup, pri ktorom sú bielkoviny rožne zafarbené. Gél má však velmi intenzívně oranžové pozadie. Ohsawa a Ebata (Anal. Biochem. 135, 409-415 /1983/) vyvinuli metodu, pri ktorej použitím 70% vodného roztoku polyetylénglykolu 2000 odvodnili gél po elektroforéze a tým odstránili interferujúce látky a súčasne velmi účinné fixovali bielkoviny. Pri reprodukovaní tejto metody vzniklo však také intenzívně šedočierne pozadie, že zóny bielkovín prakticky nebolo možné identifikovat. Biel a spol. (Elektrophoresis, 7, 232-235 /1986/) odporúčajú urýchliů proces farbenia zvýšením teploty roztokov na 60 až 70 °C. Blum a spol. (Elektrophoresis, 8, 93-99 /1987/) používajú redukčně činidlá před pósobením roztoku dusičnanu strieborného na zvýšenie kontrastu a zvýšenie citlivosti metody. Marcinka (CS autorské osvedčenie 259 363) použil fixačno-vymývací roztok s obsahom 0,25 % hmot, glutaraldehydu na zvýšenie citlivosti stanovenia a po roztoku amoniakálneho strieborného komplexu použil poměrně dlhé pranie gélu 0,001 M NaOH na odmytie přebytečných volných iónov striebra z gélu. Tým dosiahol pri vysokej citlivosti stanovenia minimálně pozadie. Všetky opisované metody, ktoré sa zakladajú na použití amoniakálneho strieborného komplexu majú nevýhodu v tom, že sú spojené s vyššou spotřebou striebra a roztok tohoto strieborného komplexu je potenciálně výbušný.

Podstata vynálezu ’

Uvedené nevýhody doterajších metod stanovenia bielkovín detekčnou technikou striebrom, po elektroforetickej frakcionácii bielkovín, praním plátnového gélu po elektroforéze po dobu min. 45 minut fixačno-vymývacím roztokem, odstraňuje spósob stanovenia bielkovín podlá vynálezu. Podstata vynálezu spočívá v tom, že po vypraní fixačno-vymývacím roztokom sa platňový gél premýva aspoň jedenkrát 25 až 50% metanolom alebo etanolom, aspoň jedenkrát vodou a pósobí sa naň roztokom tiosíranu sodného. Potom sa aspoň jedenkrát oplákne vodou a minimálně 15 minut sa naň pósobí farbiacim roztokom obsahujúcim dusičnan strieborný, formaldehyd a například kyselinu citrónovú vo vodě, po ktorom sa premýva vodou jeden až trikrát po dobu 30 až 90 sekúnd a nakoniec sa pósobí vývojkou obsahujúcou vodný roztok formaldehydu, uhličitanu sodného a tiosíranu sodného.

Fixačno-vymývací roztok pozostáva zo zmesi metanolu alebo etanolu, kyseliny octovéj a vody v objemových pomeroch 30 až 50 : 12 : 38 a obsahuje formaldehyd v koncentrácii 0,018 až 0,037 % hmot.

Roztok tiosíranu sodného sa móže použit v koncentrácii 0,8 mM, ako farbiaci roztok sa móže použit dusičnan strieborný o koncentrácii 0,2 % hmot, a formaldehyd o koncentrácii 0,018 % hmot., ktorý móže naviac obsahovat kyselinu citrónovú v koncentrácii 0,02 % hmot. ·

Po farbiacom roztoku sa gél vymývá vodou jedenkrát 1 min. a jedenkrát 1/2 min. Zistilo sa tiež, že je výhodné, ked vyvolávací roztok obsahuje formaldehyd o koncentrácii 0,018 % hmot., uhličitan sodný o koncentrácii 5 až 6 % hmot, a tiosíran sodný o koncentrácii 16 μΜ.

Proces vyvolávania sa zastaví pósobením zastavovacieho kúpela obsahujúceho kyselinu citrónovú o koncentrácii 0,1 % hmot, a metanol alebo etanol o koncentrácii 20 % obj. vo vodě a následné sa perie vodou.

Výhoda uvedeného spósobu stanovenia bielkovín spočívá v tom, že vo fixačno-vymývacom roztoku sa namiesto bifunkčného aldehydu (glutaraldehydu) používá účinnější monofunkčný formaldehyd v rádovo nižšej koncentrácii, dalej že sa před pósobením roztoku striebornej soli pósobí na gél roztokom tiosíranu sodného ako redukčného činidla, čím sa zvýši citlivost stanovenia a ostrost zón. Ako strieborná sol sa použije roztok dusičnanu strieborného, ktorý je účinnější ako amoníakálny strieborný komplex, preto sa použije v nižšej koncentrácii, čím sa zníži spotřeba striebra. Vývojka, ktorá obsahuje velmi nízku koncentráciu tiosíranu sodného, rozpúšta soli striebra v géli a tým bráni vzniku pozadia, preto sa skracuje pranie gélu po opracovaní roztokom striebornej soli na jeden a pol minúty.

Příklady uskutočnenia vynálezu

Příklad 1

Po skončení elektroforézy bielkovín v polyakrylamidovom géle hrůbky 1 mni a plochy 150 cm² sa tento gél vymývá 1 h v 200 ml fixačno-vymývacieho roztoku, pozostávajúceho zo zmesi metanol, kyselina octová a voda v objemovom pomere 50 : 12 :· 38, ktorý obsahoval 0,018 % hmot. formaldehydu (0,5 ml 37% roztoku formaldehydu/1 liter), potom sa premyje jedenkrát 15 min v 100 ml 30% metanolu a dvakrát 15 min 250 ml vody, d’alej 1 min v 100 ml 0,0 mM tiosíranu sodného a oplákne sa trikrát 150 ml vody, na gél sa potom pósobí 20 min 100 ml farbiaceho roztoku pozostávajúceho z 0,2 % hmot.' dusičnanu strieborného, 0,018 % hmot, formaldehydu a 0,02 % hmot, kyseliny citrónovéj, gél sa potom premyje jedenkrát 1 min a jedenkrát pol min 250 ml vody a následuje vyvolávanie v 200 ml roztoku obsahujúcom 0,018 % hmot, formaldehydu, 6 % hmot, uhličitanu sodného a 16 μΜ tiosíranu sodného. Po vizualizácii zón sa proces vyvolávania zastaví 10 minútovým praním v 200 ml roztoku obsahujúcom 20 %. obj. metanolu a 0,1 % hmot, kyseliny citrónovéj a nakoniec sa perie 1 hodinu v 300 ml vody pri jednej výměně vody za čerstvú.

Příklad 2

Postupovalo sa ako v příklade 1 s tým rozdielom, že fixačno-vymývací roztok obsahoval 0,037 % hmot, formaldehydu (1,0 ml 37% roztoku formaldehydu/1 liter), vývojka obsahovala 5 % hmot, uhličitanu sodného. Vyvolávanie sa zastavilo praním dvakrát 5 min v 20% metanole obsahujúcom 0,05 % hmot, kyseliny citrónovej a posledně pranie vodou trvalo 40 minút v 300 ml vody pri jednej výměně vody za čerstvú.

V obidvoch príkladoch je možné namiesto metanolu použit etanol v rovnakých koncentráciách.

Priemvselná využitelnost

Metodu je možné využit na stanovenie malých množstiev bielkovín v géli a to najma v biochemických laboratóriách.

Claims

1. Spósob stanovenia bielkovín detekčnou technikou striebrom po elektroforetickej frakcionácii bielkovín, praním platňového gélu po elektroforéze po dobu min. 45 minút fixačno-vymývacím roztokom, vyznačujúci sa tým, že po vypraní fixačno-vymývacím roztokem sa plátnový gél premýva aspoň jedenkrát 25 až 50% metanolom alebo etanolom, aspoň jedenkrát vodou a pósobí sa naň roztokom tiosíranu sodného, následné sa aspoň jedenkrát oplákne vodou a minimálně 15 minút sa naň pósobí farbiacim roztokom obsahujúcim dusičnan strieborný, formaldehyd a například kyselinu citrónovú vo vodě, po ktorom sa premýva vodou jeden až trikrát po dobu 30 až 90 sekúnd a nakoniec sa pósobí vývojkou obsahujúcou vodný roztok formaldehydu, uhličitanu sodného a tiosíranu sodného.

2. Spósob stanovenia bielkovín podlá bodu 1, vyznačujúci sa tým, že sa perie fixačno-vymývacím roztokom pozostávajúcim zo zmesi metanolu alebo etanolu, kyseliny octovéj a vody v objemových pomeroch 30 až 50 : 12 : 38 a obsahujúcim formaldehyd v koncentrácii 0,018 až 0,037 % hmot.

3. Spósob stanovenia bielkovín podlá bodu 1, vyznačujúci sa tým, že roztok tiosíranu sodného sa použije v koncentrácii 0,8 mM.

4. Spósob stanovenia bielkovín podlá bodu 1, vyznačujúci sa tým, že ako farbiaci roztok sa použije dusičnan strieborný o kon. centrácii 0,2 % hmot, a formaldehyd o koncentrácii 0,018 % hmot. .

5. Spósob stanovenia bielkovín podlá bodu 1 a 4, vyznačujúci sa tým, že farbiaci roztok obsahuje naviac kyselinu citrónovú v koncentrácii 0,02 % hmot.

6. Spósob stanovenia bielkovín podlá bodu 1, vyznačujúci sa tým, že po farbiacom roztoku sa gél vymývá vodou jedenkrát 1 min a jedenkrát pol min.

7. Spósob stanovenia bielkovín podlá bodu 1, vyznačujúci sa tým, že vyvolávací roztok obsahuje formaldehyd o koncentrácii 0,018 % hmot., uhličitan sodný o koncentrácii 5 až 6 % hmot, a tiosíran sodný o koncentrácii 16 μΜ.

8. Spósob stanovenia bielkovín podlá bodu 1, vyznačujúci sa tým, že proces vyvolávania sa zastaví pósobením zastavovacieho kúpela obsahujúceho kyselinu citrónovú o koncentrácii 0,1 % hmot, a metanol alebo etanol o koncentrácii 20 % obj. vo vodě a následné sa perie vodou.