CS276913B6

CS276913B6 - Mutation strain of streptococcus zooepidemicus frost and englebrecher (syn.streptococcus equi sand and jansen) bacterium

Info

Publication number: CS276913B6
Application number: CS894068A
Authority: CS
Inventors: Ludmila Doc Ing Csc Silhankova; Katerina Doc Ing Csc Demnerova; Blanka Ing Csc Kralova; Tomas Ing Csc Ruml; Martina Ing Brunnerova
Original assignee: Vysoka Skola Chem Tech
Priority date: 1989-07-03
Filing date: 1989-07-03
Publication date: 1992-09-16
Also published as: CS406889A3

Abstract

Mutantní kmen Sstreptococcus zooepidemicus Frost a Englebrecht (syn. Streptococcus equi Sand a Jensen) DBM 1079 nehemolyzující a intensivně produkující hyaluronovou kyselinu.Mutant strain Sstreptococcus zooepidemicus Frost and Englebrecht (son. Streptococcus equi Sand and Jensen) DBM 1079 non-haemolyzing and intensively producing hyaluronic acid.

Description

Vynález se týká nového mutantního kmenu bakterie Streptococcus zooepidemicus Frost a Englebrecht (syn. Streptococcus egui Sand a Jensen) vhodného pro výrobu hyaluronové kyseliny fermentačním postupem.The present invention relates to a novel mutant strain of Streptococcus zooepidemicus Frost and Englebrecht (syn. Streptococcus egui Sand and Jensen) suitable for the production of hyaluronic acid by a fermentation process.

Kyselina hyalurónová, tj. mukózní glykosaminoglykan s lineární polymerni molekulou o molekulové hmotnosti 2xl0⁴ až l,3xl0⁷ daltonů, nachází stále širší uplatnění v humánní i veterinární medicíně a v kosmetice. Její přirozené živočišné zdroje, například kohoutí hřebínky, nestačí krýt tuto potřebu, a proto se začala připravovat fermentačním postupem, většinou za použití různých kmenů bakterií náležejících k Lancefieldově skupině A nebo C rodu Streptococcus. Silnou tvorbu hyaluronové kyseliny u Streptococcus pyogenes v živém bujónu s glukosou zjistili již Pierce W.A.Jr. a White A.G.C. (Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 87, 50-54, 1954 a Faber V. a Rosendal K. (Acta Pathol. Microbiol.Hyaluronic acid, ie a mucosal glycosaminoglycan with a linear polymer molecule with a molecular weight of 2x10 ⁴ to 1.3x10 ⁷ daltons, is increasingly used in human and veterinary medicine and cosmetics. Its natural animal resources, such as rooster combs, are not sufficient to cover this need, and it has begun to be prepared by a fermentation process, mostly using various strains of bacteria belonging to the Lancefield group A or C of the genus Streptococcus. Pierce WAJr has already found strong hyaluronic acid production in Streptococcus pyogenes in live glucose broth. and White AGC (Proc. Soc. Exptl. Biol. Med. 87, 50-54, 1954 and Faber V. and Rosendal K. (Acta Pathol. Microbiol.

Scand. 35, 159-164, 1954). První fermentační produkci této kyseliny pomocí hemolytického streptokoku skupiny A uvádí Holmstrom B. a Řičica J. (Appl. Microbiol. 15, 1409-13, 1967), avšak výtěžek v médiu z telecí infuze s přídavkem 1,1 % glukosy činil pouze 0,4 g hyaluronové kyseliny/1 média. Postupy uvedené v řadě patentů a patentových přihlášek používají jako produkční mikroorganismus hemolytické kmeny druhů Streptococcus pyogenes, Streptococcus efui nebo Streptococcus zooepidemicus, přičemž současní taxonomové pokládají posledně jmenovaný druh za identický s druhem Streptococcus egui. Patentová přihláška firmy Shiseido Co. Ltd. (Offenlegungschr. DE 3 517 629 A 1) popisuje použití nehemolytického mutantu Streptococcus zooepidemicus. Všechny kmeny a mutanty rodu Streptococcus používané při postupech uvedených v patentové i jiné literatuře vyžadují pro dosažení výtěžku 3 až 6 g hyaluronové kyseliny na litr fermentačního média velmi bohaté fermentační médium obsahující vedle 3 až 8 % glukosy ještě 0,5 až 3 % kvasničného autolyzátoru spolu s 2 % hydrolyzátu kaseinu (Nimrod A. a sp. W 086/04355) nebo s 1 až 3 % peptonu (Shiseido Co. Ltd.Scand. 35, 159-164, 1954). The first fermentation production of this acid by hemolytic streptococcus of group A is reported by Holmstrom B. and Řičica J. (Appl. Microbiol. 15, 1409-13, 1967), but the yield in calf infusion medium with the addition of 1.1% glucose was only 0. 4 g hyaluronic acid / 1 medium. The methods described in a number of patents and patent applications use hemolytic strains of Streptococcus pyogenes, Streptococcus efui or Streptococcus zooepidemicus as the production microorganism, with the current taxonomists considering the latter species to be identical to Streptococcus egui. Shiseido Co. patent application Ltd. (Offenlegungschr. DE 3 517 629 A 1) describes the use of a non-hemolytic mutant of Streptococcus zooepidemicus. All strains and mutants of the genus Streptococcus used in the processes described in the patent and other literature require to obtain a yield of 3 to 6 g of hyaluronic acid per liter of fermentation medium very rich fermentation medium containing 0.5 to 3% yeast autolyser together with 3 to 8% glucose with 2% casein hydrolyzate (Nimrod A. et al. W 086/04355) or with 1 to 3% peptone (Shiseido Co. Ltd.

J.P. 58-56692, Akasaka a sp. Offenlegungsschrift DE 35 17 629, Hosoya Η., E.P. 0244754, Murata H., J.P. 62-289197, Myamori T., E.P. 0266578, Akasaka H., J.P. 61-219394, Karato a sp., J.P. 62-51999) nebo dokonce s 1,5 až 2,5 % obj. telecího séra (Morita Y. a sp., J.P. 61-63294, Offenlegungsschr. DE 35 31 612) a navíc ještě s některými aminokyselinami a/nebo s kukuřičnou máčecí vodou (Murata H., J.P. 62-289197, Takayama K., J.P. 62-32893, Karato a sp., J.P. 62-51999, Miyazaki T., J.P. 62-289198). Kromě toho vyžadují použité kmeny ještě poměrně dlouhou fermentační dobu, tj.2 až 5 dnů za nepřetržitého upravování p^H na 7,0. V případě, že se pro produkci hyaluronové kyseliny používá promytých buněk rodu Streptococcus (Morita Y. a sp., J.P. 61-15698, Miyamori T. a sp., E.P. Appl. 0266578 A2) je nutno použít tyto velmi bohaté živné půdy pro získání produkčních buněk.JP 58-56692, Akasaka et al. Offenlegungsschrift DE 35 17 629, Hosoya Η., EP 0244754, Murata H., JP 62-289197, Myamori T., EP 0266578, Akasaka H., JP 61-219394, Karato et al., JP 62-51999) or even with 1.5 to 2.5% by volume of calf serum (Morita Y. et al., JP 61-63294, Offenlegungsschr. DE 35 31 612) and in addition with certain amino acids and / or with corn steeping water (Murata H. , JP 62-289197, Takayama K., JP 62-32893, Karato et al., JP 62-51999, Miyazaki T., JP 62-289198). In addition, the strains used still require a relatively long fermentation time, i.e. 2 to 5 days with continuous adjustment of p ^H to 7.0. If washed Streptococcus cells (Morita Y. et al., JP 61-15698, Miyamori T. et al., EP Appl. 0266578 A2) are used for the production of hyaluronic acid, it is necessary to use these very rich nutrient media to obtain production cells.

Tyto nedostatky odstraňuje mutantní kmen Streptococcus zooepidemicus Frost a Englebrecht - syn. Streptococcus egui Sand a Jensen - DBM 1079, který je uložen ve sbírce mikroorganismů katedry biochemie a mikrokrobiologie Vysoké školy chemicko-technologické v Praze pod číslem DBM 1079.These deficiencies are eliminated by the mutant strain Streptococcus zooepidemicus Frost and Englebrecht - son. Streptococcus egui Sand and Jensen - DBM 1079, which is stored in the collection of microorganisms of the Department of Biochemistry and Microcrobiology of the University of Chemical Technology in Prague under the number DBM 1079.

Tento nehemolytický kmen vyžaduje pro fermentační produkci hyaluronové kyseliny podstatně chudší půdu a dobu fermentace 22This non-hemolytic strain requires significantly poorer soil and fermentation time for the fermentation production of hyaluronic acid 22

CS 276913 B6 2 až 26 h, což značně zlevňuje výrobu a zvyšuje kapacitu drahého fermentačního zařízení.CS 276913 B6 2 to 26 h, which significantly reduces the cost of production and increases the capacity of expensive fermentation equipment.

Tento nový kmen podle vynálezu byl získán dvoustupňovou mutagonezí spočívající v působení ultrafialového záření na promyté buňky hemolytického kmenu Streptococcus zooepidemicus 4/49 (syn. Streptococcus equi) a v následujícím působení nitrosoguanidinu za růstových podmínek na mutant se sníženou hemolytickou aktivitou, vybraný z populace vyrostlé po působení ultrafialového záření. Takto získaný kmen DBM 1079 má zachovány morfologické, asimilační i fermentační vlastnosti původního kmenu, avšak nemá hemolytickou aktivitu a velmi rychle se rozmnožujev živných médiích obsahujících podstatně snížené množství růstových látek, přičemž velmi intenzivně produkuje hyaluronovou kyselinu. Pro produkci této kyseliny potřebuje kmen DBM 1079 zkvasitelný sacharid, nejlépe glukosu nebo její vhodný zdroj jako škrobový sirup, hydrolizát dřeva nebo jiného celulosového materiálu a podobně, zdroj dusíku a růstových látek ve formě 0,1 až 0,30 % hmot./obj.kvasničného autolyzátu a 0,10 až 0,50 % hmot./ obj.peptonu, polypeptonu, sojového peptonu nebo hydrolyzátu kaseinu, zdroj fosforu, například fosforečnan draselný a některé minoritní ionty, například hořečnaté a železnaté, popřípadě ještě malé množství glutamátu nebo argininu pro stimulaci produkce. Kvašení probíhá 22 až 26 h za míchání a mírného provzdušňování při 34 až 37°C, přičemž vznikající kyseliny je nutno průběžně neutralizovat přidávaným roztokem hydroxidu sodného nebo draselného. Koncentraci sacharidu je vhodné během fermentace udržovat v rozmezí 0,5 až 3,5 % hmot./obj., za celkového množství sacharidu 3 až 6 g/1 fermentační kapaliny. Po proběhnutí kvašení se fermentační kapalina zbaví bakteriálních buněk, nejlépe centrifugací a z čiré kapaliny se izoluje hyaluronová kyselina některým ze známých, postupů, napřéklad srážením ethanolem s následným přečištěním získané sraženiny. · .....This new strain according to the invention was obtained by two-step mutagonesis consisting of the action of ultraviolet radiation on washed cells of the hemolytic strain Streptococcus zooepidemicus 4/49 (syn. Streptococcus equi) and subsequent treatment of nitrosoguanidine under growth conditions on a mutant with reduced hemolytic activity. exposure to ultraviolet radiation. The DBM 1079 strain thus obtained retains the morphological, assimilation and fermentation properties of the original strain, but has no hemolytic activity and multiplies very rapidly in nutrient media containing substantially reduced amounts of growth substances, while producing very intensive hyaluronic acid. To produce this acid, strain DBM 1079 needs a fermentable saccharide, preferably glucose or a suitable source thereof such as starch syrup, hydrolyzate of wood or other cellulosic material and the like, a source of nitrogen and growth substances in the form of 0.1 to 0.30% w / v. yeast autolysate and 0.10 to 0.50% w / v of peptone, polypepton, soy peptone or casein hydrolyzate, a source of phosphorus, for example potassium phosphate, and some minor ions, for example magnesium and iron, or even a small amount of glutamate or arginine for stimulation of production. The fermentation takes place for 22 to 26 hours with stirring and gentle aeration at 34 to 37 ° C, the acids formed being continuously neutralized by the addition of sodium or potassium hydroxide solution. It is suitable to keep the saccharide concentration during the fermentation in the range of 0.5 to 3.5% w / v, with a total saccharide amount of 3 to 6 g / l of fermentation broth. After the fermentation, the fermentation broth is freed of bacterial cells, preferably by centrifugation, and the hyaluronic acid is isolated from the clear liquid by any of the known methods, for example by ethanol precipitation followed by purification of the precipitate obtained. · .....

Vynález je blíže objasněn na konkrétním příkladu fermentační produkce hyaluronové kyseliny, který však v žádném případě neznamená omezení způsobu použití mutantního kmenu DBM 1079 pro přípravu této kyseliny. · ·The invention is further elucidated on the basis of a specific example of the fermentation production of hyaluronic acid, which, however, does not in any way limit the method of using the mutant strain DBM 1079 for the preparation of this acid. · ·

PříkladExample

Sterilní fermentační médium obsahující v 1 litru 20 g glukosy, 5,0 g peptonu, 2,5 g kvasničného autolyzátu, 5,0 g K₂HPO₄, 0,1 g Na₂SnO-j, 1,5 g MgSO₄.7H₂0, 0,01 g FeS0.7H₂0 a 1,5 ml Tweenu 80 se zaočkuje 120 ml lOh kultury Streptococcus zooepidemicus DBM 1079 v půdě stejného složení jako má fermentační médium, jež byla inkubována za mírného třepání při 37°C. Fermentace probíhá opět při 37°C za mírného míchání a provzdušňování (0,5 1 vzduchu/min), přičemž p^H je udržováno na hodnotě 7,0 pomocí automatické kontroly dávkování přidávaného roztoku NaOH o koncentraci 3 mol/litr. Po 6 h kvašení se přidá 40 ml sterilního 30% hmot./obj. roztoku glukosy a pokračuje se v kvašení. Dalších 40 ml sterilního 30% roztoku glukosy se přidá až po poklesu koncentrace glukosy ve fermentační kapalině na 1,0 až 1,7 % hmot./obj. Kvašení se potom ukončí při dosažení koncentrace glukosy 0,5 % hmot./obj., čehož se dosáhne během 25 h celkového kvašení. Fermentační kapalina se odstředí ve chlazené odstředivce (30 min při /Sterile fermentation medium containing in 1 liter 20 g of glucose, 5.0 g of peptone, 2.5 g of yeast autolysate, 5.0 g of K ₂ HPO ₄ , 0.1 g of Na ₂ SnO-j, 1.5 g of MgSO ₄ . 7H ₂₀ , 0.01 g of FeSO 0.7 H ₂₀ and 1.5 ml of Tween 80 are inoculated with 120 ml of a 10 h culture of Streptococcus zooepidemicus DBM 1079 in soil of the same composition as the fermentation medium, which was incubated with gentle shaking at 37 ° C. Fermentation takes place again at 37 ° C under gentle stirring and aeration (0.5 1 / min air), wherein ^H p is maintained at 7.0 by automatic controlled dispensing of the added NaOH concentration of 3 mol / liter. After 6 h of fermentation, 40 ml of sterile 30% w / v is added. glucose solution and fermentation is continued. An additional 40 ml of sterile 30% glucose solution is added only after the glucose concentration in the fermentation broth has dropped to 1.0 to 1.7% w / v. The fermentation is then terminated when the glucose concentration reaches 0.5% w / v, which is achieved within 25 hours of total fermentation. The fermentation broth is centrifuged in a refrigerated centrifuge (30 min at

//

000 g). Supernatant obsahuje 4,7 g hyaluronátu sodného.000 g). The supernatant contains 4.7 g of sodium hyaluronate.

Claims

PATENT CLAIMS

Mutant strain of Streptococcus zooepidemicus Frost and Englebrecht (syn. Streptococcus equi Sand and Jensen) DBM 1079 non-hemolyzing and intensively producing hyaluronic acid.

End of document