CS276340B6

CS276340B6 - A method for preparing rabbit antimeningococcal sera, in particular for the determination of sero-logical groups by slide agglutination

Info

Publication number: CS276340B6
Application number: CS855069A
Authority: CS
Inventors: Pavla Mudr Csc Kuzemenska; Milena Myskova
Original assignee: Pavla Mudr Csc Kuzemenska
Priority date: 1985-07-08
Filing date: 1985-07-08
Publication date: 1992-05-13
Also published as: CS506985A3

Abstract

Antimeningokoková véna imunizací králíků národních referenčních séra jsou připraza použití mezikmenů mikroorganismů Neisseria meningitidis sérologických skupin A, B, 0, D, X, Y, Z, W135 a 29E. Imunizace se provádí 8 dávkami živého kmene v přesně určených intervalech po dobu 35 dnů. Po 42. dnu se z králičí krve oddělí sérum, které se testuje na přítomnost specifických a nespecifických protilátek. V sérech získaných způsobem podle vynálezu každé serologické skupiny nebyly přítomny nespecifické aglutinace a specifické aglutinace byly v ředěních 1:16 až 1:64 v intenzitě ++.Antimeningococcal vein immunization of rabbits with national reference sera is carried out using interstrains of microorganisms Neisseria meningitidis serogroups A, B, 0, D, X, Y, Z, W135 and 29E. Immunization is carried out with 8 doses of a live strain at precisely defined intervals for 35 days. After the 42nd day, serum is separated from the rabbit blood and tested for the presence of specific and non-specific antibodies. In the sera obtained by the method according to the invention of each serological group, non-specific agglutinations were absent, and specific agglutinations were in dilutions of 1:16 to 1:64 with intensity ++.

Description

Vynález řeší způsob přípravy králičích antimeningokokových sér k určení sérologických skupin metodou sklíčkové aglutinace.The invention relates to a process for the preparation of rabbit antimeningococcal sera for the determination of serological groups by slide agglutination.

V současné době se připravují různá séra k určování sérologických skupin kmenů mikroorganismů Neisseria meningitidis, izolovaných z klinického materiálu. Způsob přípravy sér i postup imunizace je výrobci utajován. Některé séra, která byla zejména zahraničními výrobci označena jako kvalitní séra se ukázala po ověřování prakticky nepoužitelná, protože nebyla jednotná a kvalitní. Navíc se zatím nepodařilo uspokojivě zajistit výrobu všech potřebných sér, a to i v jejich požadovaném množství.Various sera are currently being prepared to determine the serological groups of Neisseria meningitidis strains isolated from clinical material. The method of preparation of sera and the procedure of immunization are kept secret by the manufacturer. Some sera, which were mainly marked by quality producers as foreign sera, proved to be practically unusable after verification, because they were not uniform and of high quality. In addition, it has not yet been possible to satisfactorily ensure the production of all the necessary sera, even in the required quantities.

Na základě vývoje současné epidemiologické situace lze očekávat vzestup výskytu meningokokové meningitidy, celkově velmi závažného onemocnění s vysokou úmrtností, protože je dnešní celosvětová situace hodnocena odborníky jako závažná a zvláště u nás jako predepidemická. Za současné situace jsou antimeningokoková séra dostupná jen málo laboratořím, čímž je určen jen malý počet kmenů Neisseria meningitidis izolovaných od pacientů. Tímto je ztíženo určení původce nemoci. Čím později se identifikuje původce nemoci a později se nasadí účinná léčba, tím je pravděpodobnost vyléčení horší.Based on the development of the current epidemiological situation, an increase in the incidence of meningococcal meningitis, an overall very serious disease with a high mortality rate, can be expected, because today's global situation is assessed by experts as serious and especially in our country as pre-epidemic. In the current situation, antimeningococcal sera are available to few laboratories, targeting only a small number of Neisseria meningitidis strains isolated from patients. This makes it difficult to identify the causative agent. The later the pathogen is identified and the more effective treatment is instituted, the worse the cure is.

Uvedené nevýhody řeší způsob přípravy králičích antimeningokokových sér k určení sérologických skupin metodou sklíčkové aglutinace podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že se mezinárodními referenčními kmeny mikroorganismů Neisseria meningitidis sérologických skupin A, B, C, D, X, Y, Z, W135 a 29E imunizují králíci suspenzí živého kmene Neisseria meningitidis ve fyziologickém roztoku.These disadvantages are solved by a method for the preparation of rabbit antimeningococcal sera for the determination of serological groups by the glass agglutination method according to the invention, which consists in the fact that the international reference strains of Neisseria meningitidis serological groups 29E immunize rabbits with a suspension of live strain of Neisseria meningitidis in saline.

Způsob podle vynálezu se dále vyznačuje tím, že se imunizace králíků provádí dvoufázově v 8 vzestupných dávkách v přesně určených intervalech po dobu 35 dnů, přičemž se první tři dávky aplikují intraperitoneálně a ostatní dávky intravenozně. Potom se 42. den kardiální punkcí odebere veškerá králičí krev a z ní získané sérum se testuje na přítomnost specifických a nespecifických protilátek. Séra musí obsahovat specifické protilátky v ředění nejméně 1:16 až 1:64 (intenzita aglutinace ++), aniž by ovšem obsahovala nespecifické protilátky v tomto ředění.The method of the invention is further characterized in that the immunization of the rabbits is performed in two phases in 8 ascending doses at precisely defined intervals for 35 days, the first three doses being administered intraperitoneally and the other doses intravenously. Then, on day 42, all rabbit blood was collected by cardiac puncture, and the serum obtained therefrom was tested for the presence of specific and non-specific antibodies. Sera must contain specific antibodies at a dilution of at least 1:16 to 1:64 (agglutination intensity ++), without, however, containing non-specific antibodies at this dilution.

V referenční laboratoři pro výzkum meningokokových nákaz byl autorkami vynálezu vyvinut originální způsob přípravy antimeningokokových sér imunizací králíků, za použití mezinárodních standardních kmenů mikroorganismu Neisseria meningitidis a jejich kvalita byla porovnávána s některými zahraničními séry. Při všech testech způsob přípravy sér podle vynálezu plně vyhovoval ve všech požadavcích a dosavadní séra předčil svou kvalitou, protože některá současná séra skupiny B neaglutinovala s referenčními kmeny N. meningitidis skupiny B a některá séra skupiny A aglutinovala s referenčními kmeny N. meningitidis skupiny A jen velmi slabě (intenzita aglutinace +). Antimeningokoková séra připravená podle vynálezu vykazovala v ředění 1:16 až 1:64 pouze specifické aglutinace v intenzitě ++ až +++ a nevykazovala nespecifické aglutinace. Intenzita aglutinace je hodnocena v souladu s předpisy S.Z.O. a označena symboly + až +++ podle velikosti aglutinátů, jejich ohraničenosti a projasnění okolní tekutiny.In the reference laboratory for meningococcal disease research, the inventors developed an original method for the preparation of antimeningococcal sera by immunization of rabbits, using international standard strains of the microorganism Neisseria meningitidis, and their quality was compared with some foreign sera. In all tests, the method for preparing sera according to the invention fully met all requirements and exceeded the previous sera in quality, because some current sera of group B did not agglutinate with reference strains of N. meningitidis group B and some sera of group A agglutinated with reference strains of N. meningitidis group A only very weak (agglutination intensity +). The antimeningococcal sera prepared according to the invention showed only specific agglutinations in an intensity of ++ to +++ at a dilution of 1:16 to 1:64 and did not show non-specific agglutinations. The intensity of agglutination is assessed in accordance with S.Z.O. and marked with the symbols + to +++ according to the size of the agglutinates, their boundaries and the clarification of the surrounding fluid.

Největší přínos způsobu podle vynálezu spočívá v rychlé přípravě všech požadovaných antimeningokokových sér v dostatečném množství a kvalitě pro terénní mikrobiologické laboratoře, kde vzrůstá požadavek na co nejpřesnější a rychlé určování sérologických skupin mikroorganismů Neisseria meningitidis izolovaných z klinického materiálu nemocných. Zavedení způsobu přípravy sér do výroby by ušetřilo devizové prostředky vynakládané na dovoz sér, která někdy bývají nekvalitní, - · ..The greatest benefit of the method according to the invention lies in the rapid preparation of all required antimeningococcal sera in sufficient quantity and quality for field microbiological laboratories, where there is a growing demand for the most accurate and rapid determination of serological groups of Neisseria meningitidis microorganisms isolated from patients' clinical material. The introduction of a method of preparing sera into production would save the foreign exchange resources spent on the import of sera, which are sometimes of poor quality, - · ..

V současnosti, kdy není určováno tolik kmenů N. meningitidis, kolik se očekává v budoucnosti při nárůstu jejich izolací, jsou díky nedostatku antimeningokokových sér v praxi identifikovány sérologické skupiny jen u části kmenů N. meningitidis. To zdaleka henf příznivý stav a proto byl vyvinut způsob přípravy antimeningokokových sér podle vynálezu, k_terým lze plně_pokrýt vzrůstající poptávku po kvalitních antimeningokokových sérech a v dostatečném množství z vlastních zdrojů. Zásobení terénních mikrobiologických laboratoří kvaCS 276 340 B6 2 litními antimeningokokovými séry je nezbytné pro sledování dalšího vývoje výskytu meningokokové meningitidy, která má u nás v posledních letech stoupající trend. Znalost převládající sérologické skupiny u kmenů mikroorganismů Neisseria meningitidis izolovaných od nemocných, má přímý dopad na eventuelní .rychlé očkování populace vhodnou meningokokovou vakcinou.At present, when as many N. meningitidis strains are not identified as are expected in the future with an increase in their isolation, due to the lack of antimeningococcal sera, serological groups are identified in practice only in a part of N. meningitidis strains. This is by no means a favorable condition and therefore a method has been developed for the preparation of antimeningococcal sera according to the invention, which can fully meet the growing demand for high-quality antimeningococcal sera and in sufficient quantities from its own resources. The supply of field microbiological laboratories kvaCS 276 340 B6 with 2 lithium antimeningococcal sera is necessary for monitoring the further development of the occurrence of meningococcal meningitis, which has been on the rise in our country in recent years. Knowledge of the predominant serological group in strains of the microorganism Neisseria meningitidis isolated from patients has a direct impact on the possible rapid vaccination of the population with a suitable meningococcal vaccine.

Novost způsobu přípravy antimeningokokových sér podle vynálezu spočívá v krátkodobosti imunizačního schéma, výše imunizačních dávek a používání živého kmene mikroorganismu k imunizaci. Tímto je zajištěno dosažení antimeningokokových sér s dostatečně vysokými titry specifických protilátek a s minimálními nespecifickými reakcemi.The novelty of the method for the preparation of antimeningococcal sera according to the invention consists in the short-term immunization schedule, the level of immunization doses and the use of a live strain of the microorganism for immunization. This ensures that antimeningococcal sera are obtained with sufficiently high titers of specific antibodies and with minimal non-specific reactions.

Následující příklad provedení způsobu podle vynálezu pouze dokládá, ale neomezuje.The following example of an embodiment of the method according to the invention only illustrates, but does not limit.

K imunizaci živých šedých králíků (činčila, 2 až 3 kg, před imunizací vždy 2 až 3 týdny v karanténě) se použily živé kmeny mikroorganismu Neisseria meningitidis, suspendo' Q váné ve fyziologickém roztoku v densitě 10 CFll/1 ml (CFU = colony forming unit = jeden mikroorganismus tvořící jednu kolonii). Kmeny Neisseria meningitidis byly získány z mezinárodní sbírky S.Z.O. Institutu Pasteur ve Francii (dr. 3. Y. Rieu) a jsou uloženy také ve Státní sbírce kultur Institutu hygieny a epidemiologie v Praze (Dr. 3. Šourek). Suspenze mikroorganismu se připravovaly z čerstvých kultur Neisseria meningitidis (18 h), kultivovaných na pevném agarovém médiu (Mueller-Hinton), u nichž byly zkontrolovány antigenní . i biochemické vlastnosti. Suspenze k imunizaci se připravily najednou, rozdělily se do příslušných imunizačních dávek a udržovaly se po celou dobu imunizace v -20 °C. Těsně před imunizací se příslušná dávka nechá rozmrazit a ihned po rozmražení se imunizuje. Zároveň byla zkoušena životnost mikroorganismu (tj. po naočkování králíka toutéž injekční stříkačkou kápnout na kultivační médium). Antimeningokoková séra byla získána podle následujícího imunizačního schéma:Live strains of Neisseria meningitidis suspended in saline at a density of 10 CF11 / 1 ml (CFU = colony forming) were used to immunize live gray rabbits (chinchilla, 2 to 3 kg, quarantined for 2 to 3 weeks before immunization). unit = one microorganism forming one colony). Neisseria meningitidis strains were obtained from the S.Z.O. Pasteur Institute in France (Dr. 3. Y. Rieu) and are also stored in the State Culture Collection of the Institute of Hygiene and Epidemiology in Prague (Dr. 3. Šourek). Microorganism suspensions were prepared from fresh cultures of Neisseria meningitidis (18 h) grown on solid agar medium (Mueller-Hinton) and checked for antigen. and biochemical properties. Immunization suspensions were prepared all at once, divided into appropriate immunization doses, and kept at -20 ° C throughout the immunization. Immediately before immunization, the appropriate dose is allowed to thaw and is immunized immediately after thawing. At the same time, the viability of the microorganism was tested (ie, after inoculating the rabbit with the same syringe, drip onto the culture medium). Antimeningococcal sera were obtained according to the following immunization schedule:

Pořadí dávky Den Dávka suspenze (ml) AplikaceDose order Day Dose of suspension (ml) Application

1. 1. 1. 1. 0,5 Ί 0.5 Ί 2. 2. 9. 9. 1,0 1.0 y intraperitoneálně y intraperitoneally 3. 3. 15. 15. 2,0 2.0 4. 4. 20. 20. 0,5 ” 0.5 ” 5. 5. 23. 23. 0,75 0.75 6. 6. 28. 28. ' i,o 'i, o intravenozně intravenously 7. 7. 30. 30. 2,0 2.0 8. 8. 35. 35. 2,0^. 2.0 ^. 42. 42. vykrvácení králíka kardiální punkcí bleeding of a rabbit by cardiac puncture

Týden po poslední imunizační dávce se králík vykrvácel kardiální punkcí, krev se zcentrifugovala (2 500 otáček/min, 15 min) a získané sérum se testovalo na přítomnost specifických a nespecifických protilátek referenčními kmeny mikroorganismu Neisseria meningitidis všech serologických skupin (v koncentrovaném séru a v ředění od 1:2 geometrickou řadou). Na základě tohoto testování se určilo ředění každého séra. Kvalitní sérum musí obsahovat specifické protilátky v ředění nejméně 1:16 až 1:64 (intenzita aglutinace ++), aniž by obsahovalo nespecifické protilátky. Séra, která nedosahují uvedený titr specifických protilátek, nebo mají nespecifické protilátky ve vysokém titru, jsou hodnocena jako nekvalitní. U antimeningokokových sér se neprovádí doimunizování králíka (po předběžném otestování séra), protože tímto ještě více stoupají hladiny nespecifických protilátek.One week after the last immunization dose, the rabbit was bled by cardiac puncture, the blood was centrifuged (2,500 rpm, 15 min) and the obtained serum was tested for the presence of specific and non-specific antibodies by Neisseria meningitidis reference strains of all serological groups (concentrated serum and dilution). from 1: 2 geometric series). Based on this testing, the dilution of each serum was determined. Quality serum must contain specific antibodies at a dilution of at least 1:16 to 1:64 (agglutination intensity ++), without non-specific antibodies. Sera that do not reach the specified titer of specific antibodies, or have non-specific antibodies in high titer, are considered poor quality. In antimeningococcal sera, rabbit immunization is not performed (after preliminary testing of the serum), as this increases the levels of non-specific antibodies even more.

Při několikanásobném ověřování způsobu přípravy antimeningokokových sér podle vynálezu bylo zjištěno a potvrzeno, že séra získaná způsobem podle vynálezu vykazovala dostatečně vysokou hladinu specifických protilátek^ většinou až do ředění 1:64 je u nich aglutinace v intenzitě ++', jen u antisér skupiny B je titr nižší (1:16). Nespecifické protilátky ' se vyskytovaly jen zřídka a v nízkém titru. ~Upon repeated verification of the method for the preparation of antimeningococcal sera according to the invention, it was found and confirmed that the sera obtained by the method according to the invention showed sufficiently high levels of specific antibodies. lower titer (1:16). Non-specific antibodies were rare and low in titers. ~

CS 276 340 B6CS 276 340 B6

Metodou sklíčkové aglutinace byla srovnávána antimeningokoková séra v pracovních ředěních, vyrobená způsobem podle vynálezu, se séry zahraničních firem, která jsou někdy v malém množství dodávána do některých laboratoří. V některých zahraničních soupravách byla nalezena séra skupiny B, která neaglutinovala s referenčními kmeny N. meningitidis skupiny B a séra skupiny A, která aglutinovala s referenčními kmeny N. meningitidis skupiny A jen velmi slabě (intenzita aglutinace + ).The method of slide agglutination compared the antimeningococcal sera in working dilutions produced by the method according to the invention with the sera of foreign companies, which are sometimes supplied in small quantities to some laboratories. In some foreign kits, sera of group B were found, which did not agglutinate with reference strains of N. meningitidis group B and sera of group A, which agglutinated with reference strains of N. meningitidis group A only very weakly (intensity of agglutination +).

Claims

PATENT CLAIMS

A process for the preparation of rabbit antimeningococcal sera for the determination of serological groups of microorganisms by the method of slide agglutination, characterized in that rabbits are immunized with international reference strains of the microorganism Neisseria meningitidis of serological groups A, B, C, 0, X, Y, Z, W135 and 29E. using suspensions of live Neisseria meningitidis strain in saline.

2. The method of claim 1, wherein the immunization of the rabbits is performed in two phases in 8 ascending doses at intervals of 35 days, the first three doses being administered intraperitoneally and the other doses intravenously, then all blood is collected by cardiac puncture on day 42. and the serum obtained therefrom is tested for the presence of specific and non-specific antibodies, wherein the serum must contain specific antibodies in a dilution of at least 1:16 to 1:64, without containing non-specific antibodies in this dilution.