CS274401B2 - Method of polypetide production with sequence of animal interferon's amino acids - Google Patents

Description

Tento vynález se obecně týká oblasti technologie rekombinantní DNA, prostředků a způsobů využívajících takovou technologii při objevu rozsáhlé třídy zvířecích interferonů, jejich výroby, různých produktů takové výroby a jejich použití.

Detailněji se tento vynález týká isolace a identifikace DNA sekvencí kódujících zvířecí interferony a konstrukce expresních vektorů rekombinantní DNA obsahujících DNA sekvence funkčně navázané na promotorové sekvence uskutečňující expresi a takto konstruoxaných expresních vektorů. Z jiného pohledu se tento vynález týká hostitelských kultivačních systémů, jako jsou různé mikroorganismy a buněčné kultury obratlovců transformované takovými expresními vektory a řídící tak expresi shora uvedených DNA sekvencí. Z jiného pohledu se tento vynález týká prostředků a způsobů převedení nových konečných produktů takové exprese například farmaceutické prostředky, které jsou užitečné při profylaktickém a terapeutickém léčení zvířat. Vedle toho se tento vynález týká různých postupů užitečných při výrobě shora uvedených DNA sekvencí, expresních vektorů, hostitelských kultivačních systémů, konečných produktů a jejich součástí a jejich uspořádání.

Tento vynález vznikl na základě objevu DNA sekvencí a odvozených aminokyselinových sekvencí kódujících řadu hovězích alfa interferonů včetně jejich 3 - a 5 - sousedících sekvencí, což usnadňuje jejich in vitro navázání do expresních vektorů. Tyto objevy dále umožnily vývoj prostředků a způsobů produkce dostatečných množství zvířecích interferonů technologií rekombinantní DNA. To pak dále umožnilo stanovit jejich biochemické vlastnosti a jejich biologickou účinnost, takže je možná jejich efektivní produkce pro komerční/biologické použití.

A. Zvířecí interferony

Inteřferonové složky byly isolovány z tkání různých fylogenetických druhů nižších než člověk. Studie účinnosti těchto interferonů ukázaly, že tyto interferony vykazují různé stupně protivirových účinků v příslušném hostitelském zvířeti. Bylo také ukázáno, že účinek těchto interferonů není vždycky specifický. Například přípravky hovězích interferonů isolovaných z tkání měly antivirovou účinnost-na opičí a lidské buňky. Podobně bylo nalezeno, že lidské interferony jsou účinné na různé buňky fylogeneticky nižších druhů.

Tato druhová interaktivita je nepochybně důsledek vysokého stupně homologního zachování interferonů jak pokud jde o složení tak i o sekvenování aminokyselin. Až dosud však toto vysvětlení zůstávalo teoretické, protože množství a čistota zvířecích interferonů, které bylo možno získat, byly nedostatečné pro to, aby bylo možno provést jednoznačné pokusy jejich charakterizace a pokusy týkající se biologických vlastností vyčištěných složek a také jejich srovnání s některými z jejich lidských protějšků.

Navzdory těmto nízkým množstvím a nízkým čistotám byla nalezena příčinná spojitost mezi interferonem a protivirovou účinností u příslušného hostitelského zvířete. Byla tedy žádoucí výroba zvířecích interferonů ve vysokých výtěžcích a čistotách, aby bylo možno začít a úspěšně provádět pokusné biotesty na zvířatech, které by vedly ke komerčnímu využití při léčení zvířat na virové infekce a na maligní, imunosupresivní a imunodepresivní stavy. Navíc by pak produkce isolovaných zvířecích interferonů umožnila jejich fyzikální i biologickou charakterizaci. Tím by byl položen základ kategorizace a následných srovnávacích studií s lidskými protějšky interferonových částic.

Studie, které byly až dosud se zvířecími interferony podle tohoto vynálezu dělány, jsou omezeny na použití spíše surových preparátů vzhledem k jejich malé dostupnosti, nicméně ukazují na jejich velmi důležité biologické funkce. Třída zvířecích interferonů nemá jenom therapeutickou protivirovou účinnost, ale jsou účinné jako profylaktický přídavek při léčení vakcinami a/nebo antibiotiky. Jak po klinické, tak komerční stránce jsou tedy velmi slibné.

Vypadá, že by aplikace technologie rekoi-hinantní DNA mohla být nejúčinnější cestou získávání patřičně velkých množství zvířecích interferonů, potřebných pro to, aby mohlo dojít k jejich klinickému a obchodnímu využívání. At budou či nebudou takto vyrobené materiály zahrnovat glykosylaci, která je považována za charakteristickou pro přírodní materiál, budou pravděpodobně vykazovat bioaktivitu připouštějící jejich klinické použití při léčení virových, neoplastických a imunosupresivních stavů nebo nemocí zvířat.

B. Technologie rekombinantní DNA

Technologie rekombinantní ONA dosáhla v poslední době jistého stupně vývoje. Molekulární biologové jsou schopni poměrně snadno rekombinovat různé DNA sekvence. Vytváří se tak nové DNA entity schopné produkovat hojná množství exogenních proteinových produktů v transformovaných mikrobech. Existují obecné prostředky a způsoby pro in vitro ligaci různých fragmentů DNA (které mohou být zarovnány nebo jedno vlákno může přečnívat). Získávají se tak potenciální expresní vektory užitečné pro transformaci konkrétních organismů. Tíin so ovlivní syntéza žádaných exogenních produktů takovými organismy. Na základě individuálního produktu zůstává však tato cesta značně nedokončená. Věda ještě nedosáhla stupně, ve kterém by bylo možno pravidelně předpovídat, že lze dosáhnout úspěch. Ti, kteří dosáhli úspěšných výsledků, dosáhli toho bez patřičných experimentálních základů a se značným risikem.

Plasmid, extrachromosomální smyčka dvouvláknové DNA nalezené v bakteriích a dalších mikrobech, často se vyskytující v buňce v mnoha kopiích, zůstává základním elementem technologie rekombinantní DNA. Informace, které jsou zakódovány v plasmidové DNA, jsou ty informace, které jsou potřebné pro reprodukci plasmidu v dcerinných buňkách (tj. počátek replikace) a dále obvykle takové informace, jako jedna nebo více fenotypických selekčních charakteristik jako je například v případě bakterií resistence na antibiotika. Získají se tak klony hostitelské buňky, která obsahuje příslušný plasmid. Ty se pak preferenčně kultivují v selektivním médiu. Využijí plasmidů spočívá na skutečnosti, že mohou být štěpeny tou či onou restrikční endonukleasou nebo restrikčním enzymem, při čemž příslušné restrikční endonukleasy nebo restrikční enzymy rozeznávají různá místa na plasmidové DNA.

Tímto způsobem je možné vložit heterologní geny nebo fragmenty genů do plasmidu tak, že se napojí do rozštěpeného místa na rekonstruované konce přiléhající k místu rozštěpení. Vytvoří se tak zvané replikační expresní vektory. K rekombinaci DNA dochází vně buněk. Výsledný rekombinantní replikační expresní vektor nebo plasmid však může být vložen do buněk postupem, který je znám jako transformace. Kultivací transformantu se pak získávají velká množství rekombinantních vektorů. Navíc, jestliže je patřičně vložen gen do těch částí plasmidu, které ovládají transkripci a translaci kódované v informační DNA, lze výsledný expresní vektor použít ke skutečné výrobě polypeptidové sekvence, která je kódovaná vloženým genem. Tento proces se nazývá exprese.

Exprese začíná v oblasti, která je známa jako promotor. Ten je rozeznáván a vázán RNA polymerasou. V transkripční fázi exprese se DNA rozvine; funguje jako templat při iniciační syntéze informační RNA (mRNA) z DNA sekvence. Informační RNA se pak translací převede na polyppetid, který má takovou aminokyselinovou sekvenci, která je zakódovaná v mRNA. Každá aminokyselina je zakódovaná nukletidovým tripletem kodonem. Ty pak souhrnně představují strukturní gen, tj. Část, která kóduje eminokyselinovou sekvenci polypeptidového produktu, který expresí vzniká. Translace začíná v místě startovního signálu (obvykle ATG, který se ve výsledné informační RNA stává AUG). Tak zvané stop-kodony definují konec translace a tím výrobu další aminokyselinové jednotky. Tento výsledný produkt může být získán rozkladem (jestliže je to nutné) hostitelské buňky v mikrobiálních systémech a Isolací produktu od ostatních proteinů příslušnými čistícími postupy.

Při praktickém využití technologie rekombinantní DNA může dojít k expresi úplně heterologního polypeptidu (tak zvaná přímá exprese) nebo k expresi heterologního polypeptidu, který je napojen na část aminokyselinové sekvence homologního polypeptidu. V druhém případě je někdy předpokládaný bioaktivní produkt bioneaktivní, dokud se v extracelulárním prostředí neodštěpí napojený homologni /heterologní polypeptid.

C. Technologie kultivace buněk

Kultivace buněk nebo tkání pro studium genetiky a buněčné fysiologie je odborníkům dobře známa. Existují prostředky a způsoby pro uchovávání permanentních buněčných linií připravených úspěšnými seriálovými transfery z isolovaných normálních buněk. Pro použití ve výzkumu se takové buněčné linie uchovávají na pevném podkladu v kapalném médiu nebo kultivací v suspenzi s obsahem živin. Práci ve velkém měřítku vadí nyní pouze mechanické problémy.

Tento vynález je založen na objevu, že technologie rekombinantní ONA lze použít k úspěšné výrobě zvířecích interferonů s výhodou přímo a v dostatečných množstvích pro to, aby bylo možné provádět klinické testy, které jsou potřebnou nutností předcházející jejich obchodní schválení. Produkt je ve všech svých formách vhodný pro profylaktické nebo therapeutické léčení zvířat, zvláště virových infekcí a maligních, imunosupresivních nebo imunodeficitních stavů. Formami produktu jsou různé oligomerní formy, které mohou zahrnovat glykosylaci, a také alelické variace jednotlivých členů nebo skupin. Tyto produkty jsou vyráběny systémy mikroorganismů nebo buněčných kultur, které jsou řízeny metodami genetického inženýrství. Existují tedy nyní možnosti isolovat a vyřábět zvířecí interferony účinněji než to kdy bylo možné. Jedním významným faktorem tohoto vynálezu, podle jeho nejvýhodnějšího uspořádání, je schopnost geneticky řídit mikroorganismus nebo buněčnou strukturu tak, aby produkovala representativní zvířecí interferon, hovězí interferon, v isolovatelných množstvích produkovaných hostitelskými buňkami v maturační formě.

Tento vynález zahrnuje takto vyráběné zvířecí interferony a prostředky a způsoby jejich výroby. Tento vynález se týká také expresních vektorů replikativní DNA nesoucích genové sekvence, které kódují zvířecí interferony ve formě schopné exprese. Dále se pak tento vynález týká kmenů mikroorganismů nebo buněčných kultur, které jsou transformovány shora popsanými expresními vektory, a fermentačních médií obsahujících takovéto transformované kmeny nebo kultury schopné produkovat zvířecí interferony.

Podle dalšího aspektu se tento vynález týká různých procesů použitelných pro přípravu shora uvedených interferonových genových sekvencí, ONA expresních vektorů, kmenů mikroorganismů, kultur buněk a jejich specifických uspořádání. Tento vynález se týká také přípravy fermentačních médií shora uvedených mikroorganismů a buněčných kultur. V jistých hostitelských systémech mohou být odvozeny takové vektory, aby produkovaly žádaný zvířecí interferon, který je z hostitelské buňky sekretován v maturační formě. Interferon, který obsahuje signální sekvenci odvozenou od 5 -sousedící oblasti příslušného genu, se zdá být transportován do buněčné stěny hostitelského organismu, kde se signální část během sekrece maturačního interferonového produktu odštěpí. Toto uspořádání umožňuje isolaci a čištění žádaného maturačního interferonu bez potřeby postupů, které eliminují znečištěniny intracelulárního hostitelského proteinu nebo zbytku buňky.

Navíc se tento vynález specificky týká výroby hovězího interferonu, který zde representuje skupinu zvířecích interferonů produkovaných přímou expresí v maturační formě.

Pojem exprese maturačního zvířecího interferonu znamená produkci zvířecího interferonu buď mikrobiálně nebo buněčnou kulturou. Tento zvířecí interferon není doprovázen signálním peptidem nebo peptidovou sekvencí, která bezprostředně doprovází translaci zvířecí interferonové mRNA. Podle tohoto vynálezu se tedy získává maturační zvířecí interferon, který má jako první aminokyselinu methionin (díky inserci ATG iniciačního signálního kodonu do čela strukturního genu) nebo je methionin, jako první aminokyselina, intracelulárně nebo extracelulárně štěpen. Maturační zvířecí interferon může být podle tohoto vynálezu produkován také spolu s konjugovaným proteinem jiným než konvenčním signálním polypeptidem. Konjugát je specificky štěpen v intracelulárním nebo v extracelulárním prostředí.

A konečně, maturační zvířecí interferon může být produkován přímou expresí bez nutnosti odštěpení nějakého vnějšího nadbytečného polypeptidu. To je zvláště důležité tehdy, když daný hostitel neodstraní nebo neúčinně odstraní signální peptid, v němž je expresní vektor pro expresi maturačního interferonu spolu se signálním peptidem. Takto vyrobený matečný interferon se isoluje a vyčistí tak, aby byl vhodný pro léčení virových, maligních, imunosupresivních nebo imunodeficitních stavů.

Zvířecí inteřferony podle tohoto vynálezu jsou inteřferony, které jsou endogenní pro zvířecí organismy. Patří sem (podle nomenklatury analogické lidským interferonům) zvířecí alfa (leukocytový), beta (fibroblastový) a gama (imunní) inteřferony. Všechny tři řady byly ve zvířecích modelech identifikovány. Podle příkladu hovězího interferonu se zvířecí alfa řada skládá ze skupiny proteinů jako u člověka. Tyto inteřferony jsou méně homologické s odpovídajícími lidskými alfa inteřferony než kterékoliv z těchto zvířecích interferonů mezi sebou nebo kterékoliv z lidských alfa interferonů mezi sebou. Hovězí beta rada se skládá ze skupiny proteinů, které se od lidských liší. Podle tohoto vynálezu se získávají částice a skupinové hybridní inteřferony využitím výhody obvyklých restrikčních míst v genech různých zvířecích interferonů a rekombinací odpovídajících částí známými způsobv.

Zvířecí inteřferony podle tohoto vynálezu jsou inteřferony, které jsou normálně endogenní pro následující skupiny zvířat: ptáci, psi, skot, koně, kočky, kozy, ovce, ryby a prasata. Zvláště se podle tohoto vynálezu získávají inteřferony sudokopytníků, jako jsou telata, ovce a kozy. Inteřferony podle tohoto vynálezu se používají jako protivirová a protinádorová činidla v příslušném hostitelském zvířeti. Například hovězí inteřferony by mohly mít praktické uplatnění při léčení dýchacích cest telat a to buď ve spojení s (o sobě známými) antibiotiky jako terapeutickou složkou nebo s vakcinami jako profylaktickou složkou. Použití pro třídy, jak je shora pop®áno, by bylo možno rozšířit na další skot, na kozy, ovce, prasata, koně, psy, kočky, ptáky a ryby. U koňů, psů, koček a ptáků lze oče kávat, že protinádorový účinek ďdpovídajících interferonů by byl komerčně zvláště důležitý.

Následujícího principu, který je popsán vzhledem k hovězímu interferonu jako reprezentantu třídy, lze použít při získávání zvířecích interferonů podle tohoto vynálezu.

1. Hovězí tkán, například tkán hovězí slinivky břišní, byla převedena na mrazový prášek; ten byl zpracován tak, aby se po rozštěpení RNA a proteinových materiálů získala po vysrážení hovězí ONA (o vysoké molekulové hmotnosti).

2. DNA o vysoké molekulové hmotnosti se částečně nahodile rozštěpí vzhledem k umístění genů.

3. Výsledné DNA fragmenty se frakcionují podle velikosti. Získají se tak fragmenty, které obsahují od 15 000 do 20 000 bp (= párů bází, lépe párů nukleotidů).

4. Výsledné fragmenty ze stupně 3 se klonují s použitím /t Charon 30 fágového vektoru.

5. Takto připravené vektory se in vitro vbalí do infekčních fágových částic obsahujících rDNA. Získá se tak fágová banka. Ta se rozmnožením bakteriálních buněk zvýší na asi 10^ násobek. Fág se vysévá do konfluence na trávník bakterií. Hybridizace se testuje sondou radioaktivního lidského interferonu.

6. Z příslušných klonů se isoluje odpovídající DNA, sestaví se její restrikční mapa a analysuje se Southernhybridizací. Restrikční fragmenty, které obsahují geny hovězího interferonu, se subklonují na plasmidové vektory. Pak se sekvenují.

7. Sekvenovaná DNA se pak upraví pro in vitro vložení (inserci) do příslušného expres ního vektoru, který se použije pro transformaci příslušné hostitelské buňky. Ta se pak nechá růst v kultivačním médiu, při čemž dochází k expresi žádaného produktu - hovězího interferonu .

8. Takto vyrobený hovězí interferon obsahuje ve zralé (maturační formě) 166 aminokyselin a 23 aminokyselin v presekvenci. Má velice hydrofobni charakter. Jeho molekulová hmotnost byla vypočtena na asi 21 409. Má podobné charakteristiky jako lidské leukocytové interferony. Bylo zjištěno, že je asi z 60 % homologní vzhledem k lidskému leukocytovárnu interferonu.

Podstata způsobu výroby polypeptidů se sekvencí aminokyselin zvířecího interferonů spočívá tedy podle vynálezu v tom, že se kultivuje mikroorganismus typu E.coli nebo kvasinek nebo buněčná kultura typu CHO buněčná linie. Mikroorganismus nebo buněčná linie jsou transformovány replikabilním vektorem schopným exprese DNA sekvence kódující uvedený polypeptid. Vznilý polypeptid se pak izoluje.

Popis výhodných uspořádání. A. Mikroorganismy/buněčné kultury

1. Bakteriální kmeny/promotory

Tato práce používá mimo jiné mikroorganismus E.coli K-12 kmen 294 (konec A, thi , hsr , _khsm⁺) (25). Tento kmen je uložen v americké sbírce typů kultur - American Type Culture Collection, ATCC č. 31 446. Jsou však použitelné i různé jiné mikrobiální kmeny včetně známých kmenů E.coli, jako je například E. coli 8, E .coli X 1776 (ATCC č. 31 537), E.coli W 3110 (F~, ^-, prototrofní) (ATCC č. 27 325), E.coli DP 50 SuPF (ATCC č. 39 061, uloženo

5. března 1982), E.coli JM83 (ATCC č. 39 062, uloženo 5. března 1982) nebo jiný mikrobiální systém. Mnohé z nich jsou uloženy a (potenciálně) jsou dostupné z uznávaných institucí skladujících mikroorganismy, jako je například American Type Culture Collection (ATCC) - viz katalogový seznam ATCC. Mezityto další mikroorganismy patří například Bacilli, jako je například Bacillus subtilis a jiné enterobakterie. Z nich lze uvést například Salmonella typhimurium a Serratia marcesans, které využívají plasmidy, které mohou poskytovat replikaci a expresi heterologních genových sekvencí.

Jako příklady výhodného použití pro započetí a udržení mikrobiální produkce heterologních polyppeptidů lze uvést beta laktamasový a laktosový promotorový systém. Nedávno byl vyvinut systém založený na tryptofanovém operonu, tak zvaný trp promotorový systém. Podrobnosti týkající se vytvoření a konstrukce tohoto systému byly publikovány Goeddelem a spol. a Kleidem a spol. Bylo publikováno objevení a využívání četných dalších mikrobiálních promotorů a podrobnosti týkající se jejich nukleotidových sekvencí. To umožňuje zručným pracovníkům funkčně je ligovat s plasmidovými vektory.

2. Kvasinkové kmeny/kvasinkové promotory

Pro expresní systém podle tohoto vynálezu lze využít také plasmid YRp7, který je schopen selekce a replikace jak v E. coli tak v kvasinkách Saccharomyces cerevisiae. Pro selekci v kvasinkách obsahuje plasmid TRPÍ gen (gen pro tryptofan - 1), který komplementuje (dovoluje růst za nepřítomnosti tryptofanu) kvasinky obsahující mutace v tomto genu, které byly nalezeny na chromosomu IV kvasinek. Jedním z použitelných kmenů je kmen RH218, uložený v American Type Culture Collection (ATCC č. 44 076). Tomu je však nutno rozumět tak, že jakýkoliv kmen Saccharomyces cerevisiae , který obsahuje mutaci, která poskytuje konečný trp!, by mohl být účinným prostředím pro expresi plasmidu obsahujícího expresní systém. Příkladem dalšího kmene, který může být použit, je pep4-l. Tento tryptoíánový auxotrofní kmen má také mutaci v TRPÍ genu.

Jestliže se na 5’-stranu nekvasinkovéhogenu umístí 5 -sousedící DNA sekvence (promotor) z kvasinkového genu (pro alkohol-dehydrogenasu 1), pak může podporovat expresi cizího genu v kvasinkách (po umístěni do plasmidu, který je použit k transformaci kvasinek). Kromě toho promotor příslušné exprese nekvasinkovým genem v kvasinkách vyžaduje, aby druhá kvasinková sekvence byla umístěna na 3 -konci nekvasinkového genu na plasmidu. To dovoluje příslušnou polyadenylaci a terminaci transkripce v kvasinkách. Tento promotor stejně jako jiné se s výhodou mohou použít v tomto vynálezu - viz výše. Ve výhodném uspořádání se 5 -sousedící sekvence kvasnicového PGK (3-fosfoglycerát kinasa) genu umístí proti strukturálnímu

CS 274401 D2 genu následována opět DNA, která obsahuje terminační - polyadenylační signály, například TRPÍ gen nebo PGK gen.

Protože kvasinková 5 -sousedící sekvence (spolu s 3 -kvasinkovou terminační DNA) (viz výše) může podporovat expresi cizích genů v kvasinkách, zdá se pravděpodobné, že by 5 -sousedící sekvence kteréhokoliv kvasinkového genu s vysokou expresí mohla být použita pro expresi důležitých genových produktů. Jelikož za některých okolností dochází k expresi až 65 % jejich rozpustného proteinu jako glykolytické enzymy a jelikož tato vysoká hladina se zdá být důsledkem produkce vysokých hladin individuálních mRNA kyselin, bylo by možné pro účely exprese použít 5’-sousedící sekvence kteréhokoliv jiného glykolytického genu - např. enolasy, glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenasy, hexokinasy, pyruvát-dekarboxylásy, fosfofruktokinasy, glukoso-6-fosfát-isomerasy, 3-fosfoglycerát-mutasy, pyruvát-kinasy, triosofosfát-isomerasy, fosfoglukoisomerasy a glukokinasy. Pro příslušnou terminaci a mRNA polyadenylaci v takovém expresním systému lze použít kterékoliv 3-sousedící sekvence těchto genů - viz níže. Některé jiné geny, které vykazují vysokou expresi, jsou geny pro produkci kyselých fosfatas a dále ty geny, které vykazují vysoké hladiny produktů exprese díky mutaci v 5 -sousedících oblastech (mutanty, které zvyšují expresi) - obvykle díky přítomnosti TY1 transportovatelného prvku.

Všechny shora uvedené geny jsou transkribovány kvasinkovou RNA polymerásou II. Je možné, že promotory RNA polymerasy I a III, které trnaskribují geny pro ribosomální RNA, 5S RNA a tRNA kyseliny mohou být při takových expresních konstrukcích také užitečné.

Konečně, mnoho kvasinkových promotorů obsahuje také kontrolu transkripce, takže mohou být vypnuty nebo zapnuty změnou podmínek kultivace. Některými příklady takových kvasinkových promotorů jsou geny, které produkují následující proteiny: alkohol-dehydrogenasa II, isocytochrom-c, kyselinová fosfatasa, degradativní enzymy spojené s metabolismem dusíku, glyceraldehyd-3-fosfát-dehydrogenasa a enzymy, které jsou zodpovědné za využití meltosy a galaktosy. Taková kontrolní o6last by byla velice užitečná při řízení exprese proteinového produktu - zvláště tehdy, je-li produkt pro kvasinky toxický. Také by bylo možné vložit kontrolní oblast jedné 5’-sousedící sekvence s 5'-sousedící sekvencí, která obsahuje promotor z genu, který vykazuje vysokou expresi. Výsledkem by byl hybridní promotor. To by bylo možné, protože kontrolní oblast a promotor jsou zřejmě fysikálně rozdílné DNA sekvence .

3. Systémy buněčných kultur/vektory buněčných kultur

V posledních letech se množení buněk obratlovců stalo rutinní záležitostí. Jako hostitel pro produkci zvířecích interferonů se mohou použít COS-7 linie fibroblastů ledvin opic. Experimetny, které jsou zde podrobně popsány, se vsak mohou provádět v kterékoliv buněčné linii, která je schopna replikace a exprese slučitelného (kompatibilního) vektoru, např.

WI38, ΒΗΚ, 3T3, CHO, VĚRO a HeLa buněčné linie. Pro expresní vektor je dále potřeba, aby počátek replikace a promotor byly umístěny do čela genu (u kterého má dojít k expresi) spolu s nutnými ribosomálními vazebnými místy, RNA splicing místy, polyadenylačním místem a terminačními sekvencemi transkripce. Ačkoliv zde budou používány tyto podstatné prvky SV40, je tomu nutno rozumět tak, že i když je zde tento vynález popsán v termínech výhodného uspořádání, není toto výhodné uspořádání konstruováno tak, aby bylo omezeno na uvedené sekvence. Například lze použít počátků replikace jiných virových vektorů (např. Polyoma, Adeno, VSV, BPV atd.) a rovněž buněčných počátků DNA replikace, které mohou fungovat v neintegrovaném stavu.

B. Vektorové systémy. 1. Přímá exprese maturačního hovězího interferonu v E.coli

Postup, který se používá pro získání přímé exprese hovězího interferonu v E.coli jako maturačního interferonového polypeptidů (minus signální sekvence), zahrnuje kombinaci plasmidu, který obsahuje promotorový fragment a iniciační signál translace, s upraveným fragmentem zvířecí genomové DNA obsahující kódovací oblast pro maturační interferon.

Ί

CS 274401 Β2

2. Exprese v kvasinkách

Pro to, aby došlo k expresi genu, jako je DNA zvířecího interferonu, v kvasinkách, je nutné zkonstruovat plasmidový vektor, který obsahuje čtyři složky. První složkou je část, která umožňuje transformaci jak E.coli tak kvasinkami. Tato část musí tedy obsahovat selektovatelný gen z každého organismu, jako je například gen ampicilinové resistence z E.coli a gen TRPÍ z kvasinek, je také potřeba, aby tato složka udržovala počátek replikace z obou organismů jako plasmidovou DNA v obou organismech, jako je například E.coli počátek z pBR322 a arsl počátek z chromosomu III kvasinek.

Druhou složkou plasmidu je 5 -sousedící sekvence z kvasinkového genu, výkazujícícho vysokou expresi, která uvádí transkripci dolního strukturního genu, jako je například 5’-sousedící sekvence z kvasnicového PGK (3 ”-fosfoglycerátkinasa) genu.

Třetí složkou tohoto systému je strukturní gen, který je konstruován tak, že obsahuje jak ATG iniciační tak i končící (terminační) signály translace. Isolace a konstrukce takového genu je zde popsána výše.

Čtvrtou složkou je kvasnicová DNA sekvence obsahující 3 -sousedící sekvenci z kvasnicového genu, která obsahuje příslušné signály pro terminaci transkripce a pro adenylaci.

3. Exprese kulturou savčích buněk

Strategie syntézy imunního interferonu kulturou savčích buněk je založena na vývoji vektoru, který je schopen jak autonomní replikace tak exprese cizího genu za kontroly heO v terologní transkripční jednotkou. Replikace tohoto vektoru tkáňovou kulturou lze dosáhnout tak, že se získá počátek replikace DNA a dále pomocná funkce (T antigen) zavedením vektoru do buněčné linie, u které dochází k endogenní expresi tohoto antigenů. Promotor viru SV40 předchází strukturní gen interferonu a zajištuje transkripci genu.

Užitečný vektor pro získání exprese sestává z pBR322 sekvence. Představuje selektovatelný markér pro selekci v E.coli (ampicilinová resistence) a také E.coli počátek DNA replikace. Tyto sekvence jsou odvozeny od plasmidu pML-1 a zahrnují oblast EcoRI a BamHI restrikčních míst. SV40 počátek je odvozen od 342 bp PvuII - HindlII fragmentu zahrnující tuto oblast (oba konce jsou převedeny na EcoRI konce). Tyto sekvence vedle toho, že obsahují virový počátek ONA replikace, kódují promotor jak pro dřívější tak pro pozdější transkripční jednotku. Orientace oblasti SV40 počátku je taková, že promotor pozdější transkripční jednotky je uložen v sousedství genu kódujícího interferon.

Vynález je ilustrován připojenými výkresy, na nichž:

obr. 1 ukazuje jižní (Southern) hybridizaci a) lidské, b) hovězí a c) vepřové genomové

DNA štěpené EcoRI a hybridizované při různých koncentracích formamidu 570 bp EcoRI frag3 2 mentem (značený p) obsahujícím kódovací oblast A/D hybridu lidského leukocytového interferonu. Hybridizaci ve 20 procentním formamidu se získá nejjasnější vzorek multigenu skupiny hovězích a vepřových leukocytových interferonů.

Obr. 2 ukazuje jižní (Southern) hybridizaci čtyř různých fágových rekombinantů hově3 2 zí genomové DNA štěpených EcoRI, BamHI a HindlII a hybridizovaných sondou P- značeného lidského leukocytového genu. Klon 83 poskytuje dva hybridizační fragmenty, každý s restrikčním enzymem.

Obr. 3a ukazuje část nukleotidové sekvence z plasmidového subklonu p83BamHIl,9 kb a odvozenou aminokyselinovou sekvenci tam zakódovaného hovězího leukocytového interferonu. Signálním peptidem je aminokyselinový zbytek od Sl až k S23.

Obr. 3b ukazuje nukleotidovou sekvenci a odvozenou aminokyselinovou sekvenci druhého hovězího leukocytového interferonu (o(2) plasmidového subklonu p67EcoRI3,2 kb.

Obr. 3c ukazuje kompletní maturační nukleotidovou sekvenci a odvozenou aminokyselinovou sekvenci třetího hovězího leukocytového interferonu (oů3) z plasmidového subklonu p35EcoRI-BamHI3,5 kb.

CS 274401 82

Obr. 3d ukazuje nukleotidovou sekvenci a odvozenou aminokyselinovou sekvenci čtvrtého hovězího leukocytového interferonu z plasmidového subklonu p83EcoRI-BamHI2,9 kb.

Signálem je aminokyselinový zbytek Sl až S23. Maturační protein sestává ze 172 aminokyselinových zbytků. Je třeba poznamenat, že poslední prodloužení šesti aminokyselinových zbytků se připisuje změně nukleotidové báze v poloze 511. To umožňuje 6 dalších translačních kodonů před terminačním signálem.

Obr. 4a, 4b a 4c srovnávají aminokyselinové sekvence BoIFN-<Z1, <Z2, o£3 a <Z4 se sekvencemi 11 známých lidských interferonů.Jsou také uvedeny aminokyseliny, které jsou zachovány u všech lidských leukocytových interferonů, u všech hovězích leukocytových interferonů a polohy u většiny lidských leukocytových interferonů vzhledem k hovězím oči a<<4.

Obr. 5 je schematický diagram konstrukce expresního plasmidu hovězího leukocytového interferonu pBoIFN- X.ltrp55. Výchozími materiály jsou trp expresní vektor pdeltaRIsrc a BamHI fragment z plasmidového subklonu p83BamHIl,9 kb.

Obr. 6 ukazuje jižní (Southern) hybridizaci hovězí DNA štěpené buď účinkem EcoRI nebo KindlII, BamHI, BglII čí PvuII s radioaktivní sondou odvozenou od BoIFN-Zl nebo BoIFN-<Z4 genových fragmentů. Každý IFN se preferenčně hybridizuje různými podskupinami BoIFN genů.

Obr. 7 ukazuje restrikční mapu insertů genomových hovězích DNA ze tří fágových rekombinantů, které hybridizují lidský fibroblast sondou lidského interferonového genu. Umístění a orientace hovězího IFN-/3 je označeno černým obdélníkem. Restrikční místa, která jsou označena hvězdičkou, znamenají, že jde o částečnou informaci v restrikční mapě.

Obr. 8 ukazuje podrobnou restrikční mapu tří genů, které jsou uvedeny na obrázku 7; šrafovaná část znamená signální sekvenci, stínovaná (tečkovaná) část znamená maturační sekvenci.

Obr. 9a, 9b a 9c popisují nukleotid a odvozené aminokyselinové sekvence pro BoIFN- /31, 2 a 3 geny.

Obr. 10 srovnává aminokyselinové sekvence tří BoIFN- ft genů s lidským IFN-/3.

Obr. 11 je jižní (Southern) blot z obr. 2 hybridisovaný sondou BoIFN- /31 genu za podmínek, při nichž by byl obecně zřejmý pouze jeden hybridizační fragment, provádí-li se analogické experimenty s lidskou genomovou DNA a lidským IFN-/3 genem.

Obr. 12 schematicky popisuje strategii, která byla použita pro expresi všech tří BoIFN-/3 genů za kontroly trp operonu z E.coli.

Obr. 13 uvádí srovnání odvozených aminokyselinových sekvencí BoIFN-/¹, HuIFN- a myšího IFN-/⁴. u

Následující podrobný popis ilustruje vynález pokud jde o přípravu různých zvířecích interferonů technologií rekombinantní DNA a uvádí obecně aplikovatelné způsoby přípravy zvláště hovězích leukocytových interferonů. Způsob přípravy je popsán na bakteriálním systému .

A. Isolace hovězí DNA

Pro účel konstrukce banky zvířecích genů se ze zvířecí tkáně modifikací postupu podle Blina a Stafforda isoluje DNA s vysokou molekulovou hmotností. Tato DNA je nahodile frag.

montována pokud jde o umístění genu a je frakcionována podle velikosti, takže se získají fragmenty s 10 000 až 20 000 bázemi (nukleotidy) pro klonování na lambda fágový vektor.

Zmrazená tkáň, například hovězí slinivka břišní, se v kapalném dusíku rozemele na jemmý prášek. Pak se převádí do roztoku (solubilizace) obsahující 0,25M EDTA, 1% Sarkosyl a 0,1 mg/ml proteinasy K (25 ml/gram tkáně) tři hodiny při 50 °C. Ze získaného viskozního roztoku se odstraní proteiny třemi extrakcemi fenolem a jednou extrakcí chloroformem. Zbytek se dialysuje v 50mM Tris-HCl (pH = 8), lOmM EDTA a lOmM chloridu sodném a pak se dvě hodiny při 37 °C štěpí účinkem tepelně zpracované pankreatické ribonukleasy (0,1 mg/ml).

Po extrakci fenolem a etherem se DNA vysráží dvěma objemy ethanolu, promyje se 95¾ ethanolem, lyofilizuje se a přes noc při 4 °C se znovu rozpustí v TE pufru (lmM Tris-HCl (pH = 7,5), lmM EDTA) na konečnou koncentraci 1 až 2 mg/ml. Podle elektroforézy na 0,5¾ neutrálním agarovém gelu měla konečná DNA délku více než 100 kilobází (kb; kilonukleotidů)

0. Částečné endonukleasové štěpení hovězí DNA a frakcionace podle velikosti

0,1 mg hovězí DNA se při 37 °C 60 minut štěpí působením 1,25, 2,5, 5 a 10 jednotek Sau3A v reakci (1 ml), která obsahuje lOmM Tris-HCl (pH - 7,5), lOmM chlorid hořečnatý a 2mM dithiothreitol. Inkubace se zastaví přidáním EDTA na 25mM koncentraci. Následuje extrakce fenolem, extrakce etherem, přidání octanu sodného na 0,3M koncentraci (pH = 5,2) a vysrážení třemi objemy ethanolu. DNA se znovu rozpustí v TE pufru při 68 °C a sedimentuje se 10 až 40¾ lineárním sacharosovým gradientem v Beckmanově rotoru SW 27 při 27 000 otáčkách 22 hodin při 20 °C. Frakce (o objemu 0,5 ml) se analyzují na 0,5¾ gelu za použití Eco Rl rozštěpené Charon 4A DNA jako standardu molekulové hmotnosti. Ty frakce, které obsahují 15 až 20 kb DNA fragmenty, se spojí, vysráží se ethanolem a znovu se rozpustí v TE pufru.

C. Konstrukce banky hovězí genomové DNA

Klonováním 15 až 20kb hovězí DNA se získá lambda Charon 30 A vektor s G-A-T-C nezarovnanými konci, které se získají odstraněním dvou vnitrních Bam HI fragmentů z fága.

Chron 30 A se kultivuje v E. coli kmen DP 50 SupF (ATCC č. 39061, uloženo 5. března 1902) v médiu NZYDT, zkoncentruje se vysrážením s polyethylenglykolem a vyčistí se gradientovou centrifugaci. Fágová DNA se připraví z vyčištěného fága dvojnásobnou extrakcí fenolem a pak jednou extrakcí fenolem a etherem. ONA se zkoncentruje vysrážením s ethanolem.

Pro přípravu koncových fragmentů Charonu 30A se 50 ^ug fágové DNA aneluje 2 hodiny při 42 °C v 0,25 ml 50mM Tris-HCl (pH 8), lOmM chloridu horečnatém a 0,15M chloridu sodném, úplně se rozštěpí působením Bam HI, extrahuje se fenolem a etherem a sedimentuje se v 10 až 40¾ sacharosovém gradientu jak shora popsáno. Frakce, které obsahují 32 kb anelované části fága, se spojí a vysrážejí se ethanolem.

Vyčištěné Charon 30 A části (6 mikrogramů) se znovu anelují dvě hodiny při 42 °C, spojí se s 0,3 /ug 15 až 20 kb hovězí DNA a 400 jednotkami polynukleotidové ligasy fága T4 a inkubují se přes noc při 12 °C v 0,07 ml reakční směsí, která obsahuje 50mM Tris-HCl (pH = 7,5), lOmM chlorid hořečnatý, 20mM dithiothreitol a 50 mikroorganismů/ml hovězího serumalbuminu. Ligovaná DNA se pak vbalí (pakážuje) do maturačních lambda fágových částic pomocí in vitro lambda vbalovacího systému.

Složky tohoto systému - sonikový extrakt (SE), mrazový lyzát (FTL), protein A s pufry A a Ml - se připraví popsaným způsobem. Podíly ligované DNA směsi o objemu tři mikrolitry se inkubují s 15 mikrolitry pufru A, 2 ,ul pufru Ml, 10 ,ul SE a 1 ,ul proteinu A O lil minut při 27 C. Během 45 minut FTL v ledu roztaje, spojí se s 0,1 objemu pufru Ml a centrifuguje se při 35 000 otáčkách za minutu při 4 °C 25 minut. Ke shora uvedené reakční směsi se přidá 0,075 ml supernatantu. Po dalších dvou hodinách inkubace při 27 °C se malá část vbalovací reakce titruje na kmen DP 50 SupF - viz níže. Podle tohoto postupu se získá celkem asi 1,1.1(/ nezávislých hovězích DNA rekombinantů. Zbytek vbalovací směsi se rozmnoží plate-lysate metodou vyséváním rekombinantů na DP 50 SupF přr hustotě 10 000 PFU (jed notek tvořících plak) na 15 cm NZYDT agarové desky.

D. Screening fágové banky genů hovězích interferonů

Strategie, která se používá k identifikaci fágových rekombinantů nesoucích geny hovězího interferonu spočívá v detekci homologie nukleotidů radioaktivními sondami připravenými z klonovaných genů lidských leukocytových, fibroblastových a imunních interferonů. Podmínky hybridizace jsou dány Southern bloty genomové zvířecí DNA. Pět mikrogramů každé z vysokomolekulárních DNA (připravených jak shora uvedeno) z lidské placenty, hovězí slinivky břišní a vepřových submaxilárních žláz se úplně štěpí působením EcoRI, pak se elektro32 ferezují na 0,5% agarovém gelu a přenesou se na nitrocelulosový papír. P-značená ONA sonda se připraví z 570 bp EcoRI fragmentu obsahujícího protein s kódovací oblastí maturačního leukocytového interferonu (A/D hybridu) na Bgl II restrikčnim místě podle standardních postupů, které jsou uvedeny v odborné literatuře. Každý nitrocelulosový filtr se prehybridizuje při 42 °C přes noc v 5 x SSC (citran sodný ve fyziologickém roztoku), 50mM fosforečnanu sodném (pH = 6,5), 0,1 mg/ml sonikované lososové spermální DNA, 5 x Denhardtovým roztokem, 0,1% dodecylsulfátem sodným, 0,1% fosforečnanem sodným, který obsahuje buď 10, 20 nebo 30 % formamidu a pak se hybridizuje značenou sondou s 100.10^ impulsy za minutu ve stejném roztoku s obsahem 10 % dextransulfátu sodného. Po inkubaci přes noc při 42 °C se filtry promyji čtyřikrát ve 2 x SSC, 0,1% SDS (dodecylsuf át sodný) za teploty místnosti, jednou ve 2 x SSC a pak se pres noc exponuji na rtg film Kodak XR-5 s kontrastním filtrem Dupont Cronex. Nejvyšší počet hybridizovaných vazeb byl detegován ve štěpech hovězí a vepřové DNA a to tehdy, když byla hybridizace prováděna s 20 % formamidu. Tento výsledek prokazuje multigennost genů leukocytových interferonů u krav a prasat analogicky jako to bylo dříve v literatuře popsáno u člověka. Stejné hybridizační podmínky byly použity při vyhledávání interferonových genů v bance hovězích DNA.

500 000 Fágových rekombinantů bylo vyseto na desku DP 50 SupF při hustotě 10 000 PFU/15 cm desky. Kopie každé desky na nitrocelulosový papír byly připraveny způsobem podle Bentona a Davise. Filtry byly hybridizovány lidskou LelF genovou sondou jak shora popsáno. Bylo získáno devadesát šest hybridizovaných plaků, které při opakovaném sresningu dávaly silné signály.

V hovězí bance byly dále vyhledávány fibroblastové a imunní interferonové geny. Sondy byly dělány s 502 bp Xba I - Bgl III fragmentem, který obsahuje úplný maturační lidský fibroblastový interferonový gen, 318 bp Alu I fragment (obsahující aminokyseliny 12 až 116) a 190 bp Mbo II fragment (obsahující aminokyseliny 99 až 162) z maturační kódovací oblasti genu lidského imunního interferonu. Hybridizace 1,2 . 10° fágových rekombinantů poskytla celkem 26 hovězích fibroblastů a 10 klonů hovězího imunního interferonu.

E. Charakterizace fágových rekombinantů.

Fágová DNA byla připravena shora popsaným způsobem z 12 rekombinantů, které byly hybridizovány sondou lidského leukocytového interferonu. Každá DNA byla štěpena samostatně a v kombinaci s EcoRI, Bam HI a Hind III; produkt byl podroben elektroforese na 0,5% íl agarovém gelu. Hybridizační sekvence byly zmapovány Southern metodou. Srovnání samostatně rozštěpených DNA z klonů 10, 35, 78 a 83 je uvedeno na obrázku 2. U každého fága bylo zjištěno, že pozorované velikosti restrikčních fragmentů a odpovídající hybridizační matrice jsou rozdílné a nepřekrývají se. To znamená, že každý z těchto čtyř fágů nese gen jiného hovězího interferonu. Vedle toho bylo zjištěno, že štěpení klonu 83 každým ze třech výše uvedených enzymů poskytuje v každém případě dva diskrétní hybridizační pásy; to znamená, že tento rekombinant může nést dva blízko sebe napojené interferonové geny.

F. Subklonování genů hovězího leukocytového interferonu.

Restrikční fragmenty ze tří fágových rekombinantů, které jsou hybridizovány lidskou leukocytovou genovou sondou byly subklonovány v klonovacím místě multirestrikčního enzymu pBR322 derivátu, pUC9. Plasmid pUC9 byl odvozen od pBR322 tak, že se nejdříve odstraní 2067 bp EcoRI-PvuII fragment, který obsahuje tetracyklinový resistenční gen, pak se vloží 425 bp Haell fragment a fága M13mP9 do Haell místa výsledného plasmidů v poloze 2352 (vzhle dem k p8R322 notaci). Haell fragment z fága mp9 obsahuje N-terminální kódovací oblast E.coli lacZ genu, do níž bylo mezi 4. a 5. aminokyselinový zbytek /3-galaktosidasy vloženo klonovací místo multirestrikčního enzymu o sekvenci CCA AGC TTG GCT GCA GGT CGA CGG ATC CCC GGG. Vložením (insercí) fragmentu cizí DNA do těchto klonovacích míst se přerušuje konti11

CS 274401 Bl nuita mezi lac promotorem a lacZ genem. Dochází tak ke změně fenotypu JM83 transformovaného plasmidu z lac⁺ na lac .

Shora uvedené fragmenty jsou: a) 1,9 kb Bam HI fragment a 3,7 kb EcoRl fragment z klo nu 83 (který odpovídá nepřekrývajícím se segmentům téhož rekombinantů), b) 3,5 kb BamHI - EcoRl fragment z klonu 35 a c) 3,2 EcoRl fragment z klonu 67. Ve všech případech se 0,1 yug příslušně štěpeného vektoru liguje s desetinásobným molárním nadbytkem vyčištěného fragmentu, transformuje se do E.coli kmen 3M83 (ATCC č. 39 062, uloženo 5. března 1982) a vysévá se na M9 desky, které obsahují 0,04 mg/ml 5-brom-4-chlor-3-indolyl-β-D-galaktosidu a 0,2 mg/ml ampicilinu. Bílé kolonie, které domněle nesou DNA insert v restrikčním místě přerušující kódovací oblast lacZ genu v pllC9, byly přeneseny do 5 ml LB (kultivační prostředí) s 0,02 mg/ml ampicilinu, kultivovány několik hodin při 37 °C a pak testovány na vložený fragment minipreparačním postupem plasmidové DNA.

G. DNA sekvence genu hovězího leukocytového interferonu na klonu 83.

ONA sekvence od Bam HI místa plasmidu p83BamHIl,9 kb (l,9kb fragmentový subklon klonu 83) byla stanovena Maxam-Gilbertovým chemickým postupem, jak je známo z literatury.

Tato sekvence je uvedena na obrázku 3. Nejdelší otevřená čtecí oblast kóduje polypeptid o 189 aminokyselinách s významnou homologií k lidským leukocytovým interferonúm (obr. 4). Analogicky jako lidské proteiny, sestává hovězí leukocytový interferon z hydrofobního signálního peptidů o 23 aminokyselinách, který předchází maturační protein o 166 aminon ' kyselinách identickou sekvencí: ser - leu - gly - cys. Čtyři cysteinové zbytky v polohách 1, 29, 99 a 139 jsou u těchto částí přesně zachovány. Homologie hovězího a lidského interferonu je srovnávána v tabulce 1. Jak lze očekávat, hovězí protein je podstatně méně homologní (přibližně ze 60 O s kterýmkoliv lidským proteinem na rozdíl od vzájemné homologie lidských proteinů mezi sebou (větší než 80 %).

ONA sekvence a odvozené aminokyselinové sekvence dalších třech genů hovězích leukocytových interferonů, které se vyskytují na plasmidových subklonech p67EcoRI3,2 kb, p35EcoRI-BamHI3,5 kb a p83EcoRI3,7 kb, jsou uvedeny na obr. 3b, 3c, respektive 3d.

Z tabulky 1 je vidět, že zatímco BoIFN-oí2 a BOIFN-oC3 geny kódují peptidy s pouze malými zřetelnými rozdíly vzhledem k BoIFN-cO, BOIFN-c<4 se od kteréhokoliv jiného hovězího peptidů liší stejně jako se liší kterýkoliv hovězí leukocytový interferon od lidského leukocytového interferonu.

Abychom se ujistili, že oč 4 gen je odvozen od stejně obsáhlé třídy buněčných proteinů jako jiné BoIFN-oč-geny, byla genomová hovězí DNA štěpena několika restrikčními endonukleasami a hybridizovana radioaktivními DNA fragmenty representujícími kódovací oblasti proteinů o/ 1 (612 bp Avall fragment) a oó 4 (Eco-RI-XmnI fragment pBoIFN-o64trpl5) genů v 50¾ formamidu, který nedovoluje vzájemnou hybridizaci dvou genů. Každý gen s výhodou hybridizuje jinou řadu fragmentů hovězí DNA. Tyto výsledky zřetelně demonstrují existenci dvou různých skupin hovězích leukocytových interferonů, kde oč 1 a oí 4 proteiny mohou být považovány za jejich representanty.

Tabulka 1

Srovnání rozdílů kódovacích sekvencí hovězích a lidských interferonů oč

	etl	o62	</3	J.4	cíA	<ZB	e£C	oíD	oíF	<<H	dl	CÍJ	<ZK
BoIFN- cíl		94	92	54	61	62	63	64	61	64	63	61	65
BoIFN- oí 2	96		91	53	61	61	64	63	62	63	63	64	64

T a h u 1 k a 1 - pokračování

	Zl	Z2	Z3	Z4	ZA	ZB	zc	ZD	ZF	ZH	Zl	Z3	ZK
BoIFN- Z3	100	96		45
BoIFN- Z 4	52	50	52		54	54	58	55	56	58	56	54	54
HuIFN- ZA	56	52		39		81	81	83	82	83	81	80	86
HuIFN- ,/B	43	39		48	70		81	77	81	80	79	79	81
HuIFN- J.C	61	57		52	70	65		81	89	86	94	92	83
HuIFN- cí D	52	48		48	74	61	65		83	81	80	78	84
HuIFN- ZF	61	57		52 n	70	65	100	65		83	89	86	83
HuIFN-ZH	56	52		52	74	74	74	83	74		84	84	84
HuIFN- Zl	61	57		52	70	65	100	65	100	74		91	81
HuIFN-Z J	56	52		40	61	57	91	70	91	65	91		80
HuIFN- ZK	52	48		48	83	70	74	91	74	91	74	65

Čísla znamenají procenta homologie.

Dolní levá polovina se týká presekvence o 23 aminokyselinách.

Horní pravá polovina se týká maturačního proteinu o 166 aminoaminokyselinach.

A, 0, C atd. znamenají lidské leukocytové interferony A, B, C atd.

H. Přímá exprese maturačního BoIFN-Zl v E.coli.

Konstrukce 'přímého expresního plasmidů je souhrnně uvedena na obr. 5. Plasmidový subklon p83BamHIl,9 kb se úplně rozštěpí působením Ava II. 612 bp fragment obsahující gen hovězího leukocytového interferonů se isoluje elektroforesou na 6% polyakrylamidovém gelu a elektroelucí. Přibližně 1,5 /ug tohoto fragmentu se štěpí působením Fnu4H, extrahuje se fenolem a etherem a vysráží se ethanolem. Výsledné Fnu4H přečnívající konce se doplní na zarovnané konce šesti jednotkami DNA polymerasy I (Klenowův fragment) při 12 °C během 30 minut ve 20 mikrolitrech, které obsahují 20mM Tris-HCl (pH = 7,5), lOmM chloridu horečnatém, 4mM dithiothreitolu a 0,lmM dATP, dGTP, dCTP i dTTP. Po extrakci fenolem a etherem se DNA štěpí působením Pstl a pak se podrobí elektroforese na 6% gelu. Z gelu se elektroeluuje výsledný Pstl fragment se zarovnanými konci obsahující 92 párů nukleotidů (bp), který začíná u prvního nukleotidu kódovací oblasti maturačního hovězího leukocytového interferonu.

Zbytek maturační kódovací oblasti se isoluje následujícím způsobem. Tři mikrogramy Bam HI insertu z pO3BamHI 1,9 kb se částečně štěpí 14 jednotkami Pstl 10 minut při 37 °C ve 45 mikrolitrové reakci, která obsahuje lOmM Tris-HCl (pH = 7,5), lOmM chlorid horečnatý a 2mM dithiothreitol, mačež se extrahuje fenolem a etherem. Žádaný 1440 bp částečný Pstl - BamHI fragment, počínající u nukleotidu 93 maturační kódovací obasti, se isoluje na 6¾ polyakrylamidovém gelu.

Plasmid pdeltaRIsrc je derivát plasmidů pSRCexl6, ve kterém se místo EcoRI vedle trp promotoru a vzdálené od src genu odstraní DNA polymerasou I a doplní se oligonukleotidem AATTATGAATTCAT (syntetizovaným fosfotriesterovou metodou jak je uvedeno v odborné literatuře) do zbývajícího EcoRI místa bezprostředně sousedícího s Xbal místem. Dvacet mikrogramů pdeltaRIsrc se úplně rozštěpí působením EcoRI, extrahuje se fenolem a etherem a vysráží se ethanolem. Plasmid se pak štěpí 100 jednotkami nukleasy Sl při 16 °C 30 minut ve 25mM octanu sodném (pH = 4,6), lmM chloridu zinečnatém a 0,3M chloridu sodném. Vytvoří

CS 274401 02 se tak zarovnané konce se sekvencí ATG. Po extrakci fenolem a etherem a po vysráženi ethanolem se DNA rozštěpí Bam HI, podrobí se elektroforese na 6% polyakrylamidovém gelu a elektroelucí se isoluje velký vektorový fragment (o 4300 bp).

Expresní plasmid byl připraven ligací 0,2 /Ug vektoru, 0,02 yug 92 bp Pstl fragmentu se zarovnanými konci a 0,25 mikrogramů 1 400 bp částečného Pstl-BamHI fragmentu spolu se 400 jednotkami T4 DNA ligásy přes noc při 12 °C. Tento plasmid byl použit pro transformaci E.coli kmene 294 (ATCC č. 31446) na ampicilinovou resistenci. Plasmidové DNA se připraví z 96 kolonií a štěpí se účinkem XBA I a Pst I. Devadesát z těchto plasmidu obsahuje žádané 103 bp Xbal-Pstl a 1050 bp Pst I fragmenty. Sekvenční analýza DNA potvrdila, že některé z těchto plasmídů mají ATG iniciační kodon správně umístěn na počátku kódovací oblasti hovězího interferonu. Pro další studii byl vybrán jeden z těchto plasmidu - pBoIFN- cCltrp55.

I. Přímá exprese druhé třídy maturačního hovězího leukocytového interferonu (<Z4) v E.coli

ATG iniciační kodon se umístí do čela maturační kódovací oblasti enzymatickým rozšířením priméru syntetické DNA, CATGTGTGACTTGTCT. Tento heptadekameree fosforyluje T4 póly32 nukleotid - kinasou a /· - P ATP jak bylo dříve v literatuře popsáno. 250 pikomolú příměru se spojí s přibližně 1 mikrogramem 319 bp HindlI fragmentu, který obsahuje aminokyselinové zbytky S20 až 102, ve 30 mikrolitrech vody, vaří se pět minut a pak se 3 hodiny při 37 °C nastavuje 25 jednotkami E.coli DNA polymerasy I (Klenowův fragment). Produkt této reakce se štěpí působením HgiAI. Výsledný 101 bp zarovnaný HgiAI fragment se isoluje ze 6¾ polyakrylamidového gelu.

Celý gen pro maturační peptid byl sestaven za trp promotorem enzymatickou ligací shora uvedeného fragmentu s 508 bp HgiA-Pstl fragmentem obsahujícím koncovou karboxy-část peptidu a HuIFN- expresním plasmidem, pIFN-/<trp-13, který byl štěpen EcoRI, na koncích nastaven Klenowovou DNA polymerásou, rozštěpen Pstl a konečně isolován na 6¾ polyakrylamidovém gelu. Po transformaci výsledné směsi do E. coli 294 bylo identifikováno několik klonů, které mezi oblastí s trp promotor-ribosomovým vazebným místem původního expresního vektoru a kompletní kódovací oblastí maturačního hovězího interferonu pBoIFN- <<4trpl5 měly obnovené EcoRI rozpoznávací místo.

0. Subklonování genů hovězího fibroblastového inteferonu.

u

Šest fágových rekombinantů, které se hybridizují lidskou IFN-/3 DNA sondou, se vyčistí. Jejich DNA se isoluje jak shora popsáno pro další analýzu. Restrikční mapování spolu s Southern-hybridizační analýzou ukazují, že 6 isolovaných rekombinantů obsahuje tři různé oblasti hovězího genomu, takže v sobě zahrnují multigen (mnohagen) BoINF-/) seskupaní.· Tyto výsledky jsou sumarizovány restrikčními mapami, které jsou uvedeny na obr. 7. Aby se získala podrobnější restrikční mapa a sekvence nukleotidů pro každé další třídy rekombinantů, byly hybridizační fragmenty subklonovány na plasmidové vektory. Tak 5kb BglII fragment fága A/31 a 5kb BamHI fragment \/i2 byly individuálně klonovány na pBR322 v BamHI místě; překrývající 4,5 kb EcoRI-Xhoi a 1,4 kb Pstl-Hpal fragmenty fága /)/? 3 byly vloženy do pUC9, respektive do pLeIF87.

K. DNA sekvence genů tří různých hovězích fibroblastů.

Na obr.8 jsou uvedeny restrikční mapy všech tří typů genů hovězích IFN-/3, které byly subklonovány. Lze je snadno rozlišit podle unikátních míst štěpení. Peptidové kódovací oblasti a sekvence v dolním i horním vláknu každého genomu byly stanoveny Maxam-Gilbertovým chemickým postupem a jsou uvedeny v obr. 9a, 9b a 9c. Nukleotidová homologie se sekvencí určenou pro gen lidského fibroblastového inteferonu předpovídá správnou čtecí formu a úplnou aminokyselinovou sekvenci produktu každého hovězího genu; zahrnuje hydrofóbní signální peptid 21 aminokyseliny následovaný maturačním proteinem se 185 zbytky. Hovězí proteiny se navzájem liší (tabulka 2, obr. 10), ale ještě větší jsou rozdíly mezi hovězími a lidskými peptidy (přibližně 60 ·<).

Multigenní (mnohagenní) povaha hovězího fibroblastového inteferonu byla dále demonstrována rehybridižací Southern -blotu, radioaktivní sondou připravenou ze 415 bp EcoRI-Pvul fragmentu odvozeného od pBoIFN- /3ltrp (který je popsán níže). Tento experiment pro kazuje existenci dalších homologních IFN- fi genů. Méně hybridizované pásy mohou ve skutečnosti představovat vzdáleněji související geny, které by pak dále kódovaly vzálenější /3 -interferony.

Tabulka 2

Srovnání homologie kódovacích sekvencí hovězích /3-interferonů (IFN-/3) a lidského /3-interferonu (HuIFN-/?)

	/91	/12		Hu/?
/31		138 (03)	138 (83)	84 (51)
/32	20(95)		146 (88)	92 (55)
	20(95)	19 (90)		87 (52)
Hu/4	16(76)	17 (01)	16 (76)

V tabulce je pro každý pár kódovacích sekvencí uveden počet stejných aminokyselin. Signální peptidy o 21 aminokyselinách jsou srovnávány v dolní levé části tabulky, maturač ní INF-/3 interferony o 166 aminokyselinách jsou srovnávány v horní pravé části tabulky. Prvé číslo znamená celkový počet shodných aminokyselin příslušného páru, v závorce je uve děno procento homologie. '

L. Přímá express tří hovězích IFN-β v E . coli

Jelikož geny tří hovězích IFN-/3 mají mnoho společných DNA sekvencí a restrikčních míst (viz obr. 0), je možné schéma pro expresi všech tří genů. Jelikož DNA sekvence kódující prvních pět minokyselin, která obsahuje dvě Alul místa, jsou ve všech přípa.dech iden tické, byly navrženy dva komplementární syntetické oligonukleotidy, které zahrnují ATG translační iniciační kodon, restaurují kodony prvních čtyř aminokyselin maturačního hovězího IFN-/3 a vytvářejí EcoRI přečnívající konce pro inserci za trp promotorovou sekvenci Konstrukce expresních plasmidů je schematicky uvedena na obr. 12. Ligací syntetických oligomerů na B5 bp Alul-Xhol fragment, který je odvozen od BoIFN-/3 subklonovaných plasmi dů, a následujícím odštěpením působením EcoRI a Xhol vznikne 104 bp fragment obklopený přečnívajícími EcoRI a Xhol konci. Úplný kod se pak vnese do trp expresního vektoru ligací 104 bp fragmentu s přibližně 700 bp Xhol-Pst fragmentem kódujícím zbytek BoIFN-/3 proteinu a plasmidu pIFN-^ίΓ48-13, ze kterého byl vnitřní EcoRI-Pstl fragment odstraněn. Všechny výsledné plasmidy, pBoIFN-/31trp, pBoIFN- /42trp a pBoIFN-/53trp , provádějí příslušné transkripce a translace IFN-/3 genů pod kontrolu E .coli trp operonu.

M. Charakterizace a subklonování genu' hovězího imunního interferonu (BoIFN-^¹)

Deset fágových rekombinantů, které byly hybridizovány sondou lidského IFN-J7*, se vyčistí. DNA se připraví jak shora popsáno. Všech deset DNA vzorků dává Southern blotovou analýzou specifické hybridizační pásy. Pro další analýzu se vyberou klony Afi a λ f-Ί, protože se liší vzorem hybridizačních pásů. Restrikční zmapování těchto dvou klonů ukazuje, že se jejich DNA sekvence navzájem překrývají. Překrývající oblasti obsahují restrikč ní místa Xbal, EcoRV a Ncol. DNA sekvenční analýza těchto dvou klonů ukazuje, že genová strukLura je celkově podobná genu lidského imunního interferonu a dále že /1^7 obsahuje sekvenci kódující čtvrtý exon a 2/4 obsahuje sekvenci kódující prvé tři exony genu hovězího IFN- / ve vztahu k homologii ONA sekvence s genem lidského IFN-/. V obr. 15 je aminokyselinová sekvence odvozená pro BoIFN-/ srovnávána s aminokyselinovou sekvencí HuIFN-/ a myšího IFN-/.

Pro sestavení úplného genu hovězího IFN-/ na kontinuálním segmentu DNA byly isolovány: 3000 bp BamHI-NcoI fragment přemosťující prvé tři exony genu hovězího IFN-/ odvozené od 2/4 a 2500 bp NcoI-HindlII fragment přemosťující poslední exon odvozený od . Tyto dva fragmenty byly pak klonovány na BamHI-HindlΠ vektor odvozený od plasmidů pBR322 ligací tří částí.

N. Pro získáni bezintronové verse BoIFN-/, aby tak docházelo k expresi tohoto genu v prokaryotickém systému jako je E. coli, byl připraven gen pro expresi (ve vysokých hladinách) v expresním systému zvířecí buňky tak, aby se získala dostatečná množství specifické mRNA.

5500 bp BamHI-HindlII fragment přemosťující gen úplného hovězího IFN-/ byl vložen do SV40 vektoru pro expresi v COS (buňky opičí ledviny produkující SV-40⁺ antigen) buňkách. Genový fragment BamHI-HindlII hovězího IFN-/ byl klonován na 2800 bp SV40 plasmidový vektor pOLdeltaRl((odvozený od HBV antigenového expresního plasmidů pHBs34B-L enzymatickým vynecháním EcoRI místa horního řetězce od SV40 počátku replikace selektivně ve směru pozdější transkripce. Expresní plasmid pHBs348-L byl konstruoxán klonováním 1986 bp fragmentu získaného štěpením HBv působením EcoRI a BglII (HBv přemosťuje gen kódující HBsAg) na plasmid pML v EcoRI a BamHI místech (pML je derivát p8R322, který má vynechány eliminační sekvence, které jsou inhibitorem replikace plasmidů v buňkách opic). Výsledný plasmid (pRI-Bgl) byl pak linearisován působením EcoRI. 348 bp fragment, který představuje oblast SV40 počátku, byl vložen do EcoRI místa pRI-Egl. Fragment počátku se může vložit s libovolnou orientací, jelikož fragment kóduje jak dřívější tak pozdější SV40 promotory vedle počátku replikace, mohlo by dojít k expresi HBV genů pod kontrolou kteréhokoliv promotoru závisejícího na této orientaci (k expresi pHBs34B-L representující HBs dochází pod kontrolou pozdějšího promotoru) mezi BamHI a Sáli místem ligací tří částí za přítomnosti 600 bp HindlII-SalI fragmentu konvertoru odvozeného od pBR322.

Trasfekce výsledného plasmidů do COS buněk vede k efektivní expresi hovězího IFN-/¹ pod kontrolou SV-40 pozdějšího promotoru.

Póly A plus mRNA byla připravena z trasfektovaných COS buněk a použita pro přípravu cDNA standardními postupy, které jsou v odborné literatuře uvedeny. Byly isolovány cDNA klony hybridizované sondou genu hovězího IFN-/. Pro další gnalýzu byl vybrán cDNA klon s nejdelším Pstl insertem. DNA sekvenční analýza tohoto cDNA klonu ukazuje, že všechny intronové sekvence genomov.ého klonu hovězího IFN-/ jsou správně odstraněny.

Pro expresi v Ecoli byla připravena shora popsanou metodou závislou na primeru cONA.

O. Příprava bakteriálních extraktů.

Kultury vyrostlé přes noc v LB půdě obsahující buď 0,02 mg/ml ampicilinu nebo 0,005 mg/ml tetracyklinu se naočkuje ve zředění 1 : 100 do 50 ml média M9, které obsahuje 0,2 procenta glukosy, 0,5 % kasaminokyselin a příslušnou sloučeninu, a kultivují se při 37 °C za třepání do Α^θ = 1,0. Deset mililitrů vzorku se odcentrifuguje a ihned se nechá rychle zmrazit v lázni se suchým ledem a ethanolem. Zmrazené pelety se resuspendují v 1 ml 7M guanidinu, inkubují se 5 minut v ledu a pro testování se zředí PBS (fosfátový pufr ve fyziologickém roztoku). Nebo se zmrazené pelety rozloží přidáním 0,2 ml 20¾ sacharosy, lOOmM Tris-HCl (pH = 8,0), 20mM EDTA a 5 mg/ml lysozomu. Po dvaceti minutách v ledu se přidá 0,8 ml 0,3¾ Tritonu (reionogenní detergent) X-100, 0,15M Tris-HCl (pH = 0,0), 0,2M EDTA a 0,lmM PMSF (fenylmethylsulfonylfluorid). Lysat se vyčistí 15 minutovou centrifugací při 19 000 otáčkách za minutu. Supernatant se testuje po zředění PBS.

P. Interferonové testy; účinnost hovězího interferonu se testuje testem inhibice cytopathického efektu (CPE) v mikrotitrovacích destičkách s 96 jamkami následujícím způsobem:

1. Oo každé jamky desky (B řad x 12 sloupců) se dá 100 ^ul suspenze buněk v mediu, které obsahuje 10 procent plodového séra telat. Koncentrace buněk se upraví tak, aby se další den získala jedna tekutá vrstva.

2. Desky se deset minut mírně třepou. Dojde tak ke stejnoměrné distribuci buněk.

Další den:

3. Oo každé jamky prvého sloupce se přidá 80 /ul dalšího mědia.

4. Do jamek prvého sloupce se přidá 20 /ul vzorku, který se testuje na interferonovou účinnost.

5. Vzorek a médium v jamce se promíchá tak, že se 100 ^ul pipetou několkrát odebere z obsahu jamky a opět se do jamky přidá.

6. Z jamky v prvém'sloupci se odebere 100 ^ul obsahu a přenese se horizontálně do jamky ve druhém sloupci.

7. Pokračuje se jako (ve třetím sloupci) ve stupni tri.

0. Takto se pokračuje v přemistování 100 ^ul obsahů jamek do následujících sloupců, dokud se nezaplní všechny sloupce (tj. dojde k jedenácti přemístěním).

9. Z jamky ve dvanácté koloně se odstraní 100 mikrolitrů obsahu. Tímto postupem se získala rada dvojnásobných zředění.

10. Každá testovaná deska obsahuje příslušné NIH standardy.

11. Desky se inkubují 24 hodin při 37 °C v CO2.

12. Každá testovaná deska obsahuje jamky se 100 yUl buněčné suspenze a 100 ^ul média (kontrola růstu buněk) a jamky se 100 yul buněčné suspenze, 100 yUl média a 50 yul virové suspenze (virem indikovaná cytopathogenní kontrola).

13. Do všech jamek s výjimkou jamek s kontrolními buňkami se přidá 50 mikrolitrů virové suspenze. Multiplicita infekce je dána množstvím viru, které způsobí 100¾ cytopathický efekt příslušné buněčné linie během 24 hodin.

14. Desky se reinkubují 24 hodin při 37 °C v

15. Kapalina se s desek odstraní a buňky se obarví 0,5¾ krystalovou violetí. Buňky se barví dvě až pět minut.

16. Jamky desek se propláchnou vodou a vysuší se.

17. Titr interferonu ve vzorku je převratnou hodnotou zředění pro ten případ, kdy zůstává 50 “-í živých buněk.

18. Aktivita všech vzorků se normalizuje konversním faktorem referenčních jednotek, který se počítá takto:

skutečený titr NIH standardu

- = konversní faktor ref. jednot.

pozorovaný titr v testu (NIH - národní ústav zdraví)

Extrakty připravené z E.coli kmen 294 (ATCC č. 31446) transformované pBoIFN-(K,ltrp55 vykazovaly významnou aktivitu na buněčné linie hovězích ledvin (MDBK) s VS virem (kmen

Indiana), ale nikoliv na buněčné linie opičích ledvin (VĚRO), lidského cervikálního karcinomu (HeLa), králičích ledvin (RK-13) nebo myší (1929). Kontrolní extrakty připravené z kmene 294 transformované pBR322 nevykazovaly aktivitu na MDBK buňky. V tabulce 3 jsou souhrnně uvedeny ln vitro antivirové aktivity BoIFN-<4l pro různé testované zvířecí a lidské buněčné linie. BoIFN-oC/1 je snadno odlišitelný od lidských leukocytových IFN tím, že je v lidských buňkách zřetelně protivirově inaktivní ve srovnání s jeho protivirovou účinností v hovězích buňkách (byl použit virus VS). V tabulce 4 jsou uvedeny hladiny interfero nové aktivity získané v extraktech, které byly připraveny z E.coli W3110 transformované expresními plasmidy pBoIFN-oMtrpl5 , pBoIFN-/3 ltrp, pBoIFN-/4 2trp a pBoIFN-/?3trp. Zvláště významné je pozorování, že hovězí fibroblastové interferony jsou přibližně třicetkrát účin nější na buněčné linie hovězích ledvin než na buněčné linie lidského anionu, zatímco pro lidský fibroblastový IFN byl nalezen převrácený vztah.

Tabulka 3

buněčná linie	připravený IFN	titr (jednotky/ml)
VSV	EMCV
MDBK	LelF A standard	640	NA
	hovězí leukocytový IFN	300 000	NA
	kontrolní extrakt	440	NA
HeLa	LeiF A standard	650	1 500
	hovězí leukocytový IFN	Z 40	4 23
	kontrolní extrakt	4 40	4 23
L-929	myší IFN standard	640	1 000
	hovězí leukocytový IFN	4 20	431
	kontrolní extrakt	4 20	4 31
RK-13	králičí IFN standard	1 000	NA
	hovězí leukocytový IFN	< 60	NA
	kontrolní extrakt	4 60	NA
VĚRO	LelF A standard		1 500
	hovězí leukocytový IFN		4 12
	kontrolní extrakt		4 12

MDBK - buňky hovězích ledvin

VĚRO - buňky ledvin afrických zelených opic (Afričan green) HeLa = buňky lidského cervikálního karcinomu RK-13 = buňky králičích ledvin

Na = neaplikovatelné, nebot nedochází k dobré replikaci viru v příslušných buňkách

Tabulka 4

Interferonové účinnost v extraktech E.coli

E.coli 294 transformované účinkem:	IFN- aktivita (jednotky/litr kultury) MDBK-VSV	IFN-/J aktivita (jednotky/1 kultury) WISH-VSV
pIFN-<Zl	1,0 . 108	u nestanoveno
pIFN-/i 1	2,2 . 108	6,5 . 10é
pIFN-/>2	1,1 . 108	3,5 . 106
PIFN-/J 3	6,0 . 108	2,0 . 107

Bakteriální extrakty byly připraveny a testovány na interferonovou účinnost použitím buněčných linií hovězích ledvin (MDBK) a buněčných linií lidského amnionu (WISH) proti VSV podle dříve publikovaného postupu (Wech a spol.1981).

Sloučeniny podle tohoto vynálezu lze formulovat známými způsoby. Vyrábějí se tak farmaceuticky užitečné prostředky, které obsahují zvířecí interferonové produkty podle vynálezu ve směsi s přijatelným (přijatelnými) nosičem (nosiči). Vhodná pojivá a jejich formulace byly již dříve v literatuře popsány. Takové prostředky obsahují efektivní množství interferonového proteinu podle vynálezu spolu s vhodným pojivém. Vyrábí se tak přijatelné prostředky, které jsou vhodné pro efektivní podávání známými způsoby, například parenterálně, hostiteli.

Tomu je třeba rozumět tak, že zvířecí interferony, které jsou zahrnuty v rozsahu tohoto vynálezu, existují v přirozených alelických variacích. Tyto variace mohou představovat rozdíl(y) v aminokyselině (aminokyselinách) v sekvenci nebo vynechání, susbstituci, inserci, inversi nebo adici aminokyselin(y) v sekvenci. V rozsahu tohoto vynálezu jsou všechny takové alelické variace zahrnuty.

Je třeba připomenout, že tento vynález není konstruován tak, aby byl uvedenými zvláště vhodnými uspořádáními omezen, ale je omezen pouze rozsahem připojeného předmětu vynálezu .

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob výroby polypeptidů se sekvencí aminokyselin zvířecího interferonu, vyznačující se tím, že se kultivuje mikroorganismus typu E.coli nebo kvasinek nebo buněčná kultura typu CHO buněčná linie, transformované replikabilním vektorem schopným exprese DNA sekvence kódující uvedený polypeptid a vzniklý polypeptid se izoluje.

   2. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se izoluje polypeptid glykosylace. 3. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se izoluje polypeptid 4. Způsob podle bodu 1, vyznačující se tím, že se izoluje polypeptid

   bez přirozené ve zralé formě.

   typu hovězího interferonu.

   10% 20% 30% abc abc abc