CS273452B1

CS273452B1 - Method of pure specific antibodies production for proteins concentration's quick quantitative determination

Info

Publication number: CS273452B1
Application number: CS555888A
Authority: CS
Inventors: Jaroslav Korinek; Lubena Ing Hachova; Milos Tadra
Original assignee: Jaroslav Korinek; Lubena Ing Hachova; Milos Tadra
Priority date: 1988-08-10
Filing date: 1988-08-10
Publication date: 1991-03-12
Also published as: CS555888A1

Abstract

The production method for obtaining selective aggregations of antibody molecules of high purity and specificity, universally usable for a whole range of antibodies against normal proteins as well as pathological, depending on the type of the input material. A human serum, normal or pathological, or 10 percent water solution of lyophilized proteins or 10 percent water solution of lyophilized uric proteins or different substances, are treated by 1/100 to 1/10 of the volume of 25 percent glutaraldehyde water solution at 18 to 28 degrees C for the duration between 1 and 3 hours within the pH range of 8.0 to 9.0, from 1/20 to 1/5 of the volume of 10 percent water solution of potassium aluminium sulphate is added to the solution, and resulting floccules are to be isolated and washed by tap water. Afterwards, the floccules are submerged into three to ten-fold volume of a specific hyperimmune serum. After 1 to 3 days of observing the descent of the antibodies in the liquid the floccules are to be washed with tap water and eluated in 0.2M water solution of acetic acid with 2% of saccharose. Concentrated ammonia water is used to prepare the eluant for a neutral reaction, and the antibodies coagulate by dissolving 350 g of solid ammonium sulphate. After 16 hours of stabilization at 5 degrees C, the pure supernatant decants and the coagulated antibody dissolves in 0.15M of the water solution of sodium chloride, it dialysates and lyophilises. The obtained product is suitable wherever high sensitivity and speed is required for determination of normal and pathologic proteins, e.g. immunofluorescent, immunoadherent, nephelometric, and conjugation methods. As far as immunoprecipitation methods are concerned, it eliminates the elution of proteins from agar gel because it does not distort ballast protein background during the reactions.

Description

Vynález řeší na bázi polymerace bílkovin glutaraldehydem způsob výroby Široké palety diagnostických protilátek k rychlému stanovení koncentrace bílkovin, technicky a ekonomicky vhodný k výrobě čistých specifických protilátek v průmyslovém měřítku.The present invention provides a process for the production of a wide variety of diagnostic antibodies for rapid determination of protein concentrations, technically and economically suitable for the production of pure specific antibodies on an industrial scale, based on glutaraldehyde protein polymerization.

Dosud nejkvalitnější precipitační diagnostické protilátky produkuje firma Oakopatts,Oakopatts produces the highest quality precipitation diagnostic antibodies ever,

Dánsko, v podobě purifikovaného imunoglobulinu s relativně vysokými titry protilátek. Většina ostatních světových výrobců vyrábí obdobná diagnostika v podobě jen částečně purifikovaných imunoglobulinů, nebo jen různým způsobem stabilizovaná zvířecí séra s obsahem specifických protilátek. Přidružené balasty neúčinných bílkovin snižují výrazně hodnotu diagnostika v citlivosti průkazu i rozsahu použití. Toto omezení je výrazné jen zčásti u špičkových produktů firmy Dakopatts, avšak i zde je převážná část imunoglobulinů neúčinná, tj. protilátkovi neaktivní.·Navíc je purifikace těchto imunoglobulinů pracovně a ekonomicky pro výrobce nevýhodná, protože vyžaduje opakovaná přesrážení zvířecího séra síranem amonným při značném objemovém nárůstu. Centrifugace velkých objemů je energetický náročná a také dochází, ke ztrátám imunoglobul^iou v. dalších fázích purifikace na iontoměni-. čích, které jsou pro dočištění produktu nezbytné. Nejzávažnějším nedostatkem je, že k dosažení konkurenceschopného produktu je nutno expedovat purifikovaný imunoglobulin mnohdy až v 5 a 10% vodném roztoku, přičemž obsah účinné protilátky, která je jen částí úhrnného IgG, je vlastně jen zlomkový.-Preparace specifických protilátek v čistém stavu technikami afinitní chromatografie je sice teoreticky známa a technicky dobře propracována, ale její nevýhodou je použitelnost spíše jen v měřítku laboratorním. Rozšířeni výroby v měřítku průmyslovém bráni technická náročnost, pracnost a vysoké náklady spojené s používáním dosti drahých sorbentů, purifikací navázaných imunogénů, uvolňování protilátek elucí v čistém stavu a řada dalších technologických úkonů. Důkazem toho je skutečnost, že preparáty specifických protilátek jsou na.světovém trhu jen omezeně dostupné, některé v podobě monoklonálních protilátek, jejichž využití je například v technikách imunoadherenčních ne však v technikách imunoprecipitačních.Denmark, in the form of purified immunoglobulin with relatively high antibody titers. Most other world manufacturers produce similar diagnostics in the form of only partially purified immunoglobulins or only differently stabilized animal sera containing specific antibodies. Associated ballasts of inactive proteins significantly reduce the diagnostic value in the sensitivity of the license and the range of use. This limitation is only significant in part for Dakopatts' top products, but even here, the majority of immunoglobulins are ineffective, ie inactive. increase. Centrifugation of large volumes is energy intensive and also results in immunoglobulin losses in other phases of ion exchange purification. necessary to complete the product. The most serious drawback is that in order to achieve a competitive product, purified immunoglobulin must be dispensed in up to 5 and 10% aqueous solutions, and the content of active antibody, which is only part of total IgG, is actually only fragmentary. Although chromatography is theoretically known and technically well developed, its disadvantage is its applicability only on a laboratory scale. Expansion of production on an industrial scale is hampered by the technical complexity, laboriousness and high costs associated with the use of fairly expensive sorbents, purification of bound immunogens, release of antibodies by elution in the pure state, and many other technological operations. This is evidenced by the fact that preparations of specific antibodies are limited in the world market, some in the form of monoclonal antibodies, the use of which is, for example, in immunoadherence techniques but not in immunoprecipitation techniques.

Předmětem vynálezu je způsob výroby čistých specifických protilátek určených k rychlému kvantitativnímu stanovení koncentrace bílkovin, založený na principu polymerace bílkovin glutaraldehydem. Postup je vyznačen tim, že na lidské sérum normální, nebo patologické, nebo na 10% vodný roztok lyofilizovaných bílkovin močových, nebo jiných,; se působí v rozmezí pH 8,0 až 9,0 jednou setinou až jednou desetinou objemu 25% vodného rbztoku glutaraldehydu při 18 až 28 °C po dobu jedné až tří hodin, ke směsi se přidá jedna pětina objemu 10% vodného roztoku síranu hlinitodraselného, vzniklé vločky se promyjí, a na sítě se přenesou do troj- až desetinásobného objemu specifického hyperimunního zvířecího séra, případně do 0,01 až 10% vodného roztoku zvířecích protilátek. V době jednoho až tři dnů se na vločky vyváží protilátky, přičemž pokles protilátek se sleduje imunochemickými metodami.The present invention provides a process for the production of pure specific antibodies for the rapid quantitative determination of protein concentration based on the principle of glutaraldehyde protein polymerization. The procedure is characterized in that, for human serum, normal or pathological, or a 10% aqueous solution of lyophilized urinary proteins or others; is applied in the pH range of 8.0 to 9.0 with one hundredth to one tenth of a volume of 25% aqueous glutaraldehyde solution at 18 to 28 ° C for one to three hours, adding to one fifth of the volume of a 10% aqueous potassium aluminum sulphate solution, the resulting flakes are washed, and transferred to sieves into a 3 to 10-fold volume of specific hyperimmune animal serum, optionally into a 0.01 to 10% aqueous solution of animal antibodies. Within one to three days, the antibodies are fed to the flakes, the decrease in antibodies being monitored by immunochemical methods.

Potom se vločky promyjí vodovodní vodou, eluují se v 0,2M vodném roztoku kyseliny octové s 2 % sacharózy, eluát se upraví vodným koncentrovaným roztokem amoniaku na pH 6,5 až 7,5 a získaný roztok protilátky, která je prakticky již v čistém stavu, se srazí přídavkem 350 gramu síranu amonného na litr eluční kapaliny, sraženina se ponechá ustát a po dekantaci čirého supernatantu se sraženina rozpustí v 0,15M vodném roztoku chloridu sodného, dialýzuje se a lyofilizuje.The flakes are then washed with tap water, eluted in a 0.2M aqueous acetic acid solution with 2% sucrose, adjusted to pH 6.5-7.5 with an aqueous concentrated ammonia solution, and the resulting antibody solution, which is practically pure The precipitate was allowed to stand and, after decantation of the clear supernatant, the precipitate was dissolved in 0.15 M aqueous sodium chloride solution, dialyzed and lyophilized.

Novost vynálezu spočívá v tom, že jednotným pracovním postupem (a to bez použití speciálních sorbentů s vázanými izolovanými bílkovinami) umožňuje efektivní výrobu široké palety nejrůznějších specifických diagnostických protilátek v průmyslovém měřítku, normálních i patologických podle výchozího materiálu použitého k výrobě. Nejvhodnějším materiálem je odpadní (tzv. sběrové) lidské sérum, lze však použít i plazmu, nebo nejrůznější 10% vodné roztoky lyofilizovaných bílkovin. Pozaduje-li se výroba specifických čistých protilátek proti bílkovině patologické, například myelomové, je vstupním materiálem sérum patologické, například myelomové, sérum se zvýšeným obsahem beta-2 mikroglobulinu získané plazmaferézou, případně i směs séra s 10 % lyofilizátu moče obsahující požadovanou patologickou složku. V průběhu pracovního procesu vznikají účinkem síranu hlinitodraCS 273 452 Bl selného na polymerovanou bílkovinu vločky s příznivými vlastnostmi, které jsou mnohonásob ně opakovaně použitelné k vychytání protilátek z hyperimunního zvířecího séra obsahujícího specifickou protilátku proti požadované bílkovině. Eluční systém je volen co nejvýhodněji k dosažení co nejvyšších výtěžků čisté protilátky, která je dostatečně stabilní pro komerční využití. Výtěžek čisté protilátky se pohybuje podle druhu hyperimunního séra v rozmezí 75 až 85 % veškeré protilátky obsažené v hyperimunním séru. Zvýšený účinek vynálezu spočívá v příznivé ekonomické efektivnosti výroby, .z velkých objemů hyperimunního séra se zkoncentrují specifické protilátky na relativně malý objem pouhou dekantací, a zároveň odpadá nutnost použití drahých dovozových sorbentů. Centrifugace se pak již omezuje jen na hustou suspenzi síranové sraženiny po dekantací supernatantu. Vynález byl pro zkoušen na více než patnácti druzích specifických hyperimunních sér: alfa-1 antitrypsin, orosomukoid, transferrin, hemopexin, IgG, IgA, Ig komplexní, Gc globulin, alfa- 2 T globulin, F ab fragment, prealbumin, C 3 globulin, a další. Výhody čistých protilátek se projevují všude tam, kde-'se požaduje citlivéra rychlé stanovení' bílkovin bez rušivého pozadí způsobeného bílkovinnými balasty, tedftv metodách imunofluorescenčních, nefelometric kých, imunoadherenčních, konjugačních, atd. V raketkové technice podle Laurella a v jednoduché radiální imunodifúzi odpadá vypírání agarového gelu, vzhledem k nízké koncentraci bílkovin v gelu. K novosti a vysokému účinku vynálezu lzé připsat již i skutečnost, že preparáty této kvality nejsou na světovém trhu běžně dostupné, protože izolace čistých protilátek je v laboratorním měřítku již řadu let využívána. Výrobní náklady při použití uvedeného postupu jsou souměřitelné nebo i nižší, než náklady vynakládané k průmyslové produkci diagnostik typu purifikovaného IgG, přitom však preparáty vyrobené podle vynálezu předstihují světovou špičku, například Dako. Další rozsáhlou možností spojenou s reali žací výroby čistých specifických protilátek podle vynálezu je příprava čistých imunogénů pro výrobu specifických zvířecích antisér. Disociací imunoprecipitátu lze získat imunogény v čistém stavu, což umožňuje eliminovat nákladné a často velmi obtížné postupy izolace a purifikace imunogénů z lidské plazmy a jiných biologických materiálů. Bylo by tak možno snížit výrobní náklady spojené s produkcí specifických hyperimunních sér, a nahradit dosavadní technologie výhodným a jednoduchým postupem.The novelty of the invention is that a uniform process (without the use of special sorbents with bound isolated proteins) enables efficient production of a wide variety of specific diagnostic antibodies on an industrial scale, both normal and pathological, according to the starting material used in the production. The most suitable material is waste (so-called collecting) human serum, but plasma or various 10% aqueous lyophilized protein solutions can be used. If the production of specific pure antibodies against a pathological, e.g. myeloma, protein is desired, the starting material is a pathological, e.g. During the working process, aluminum-sulfate aluminum sulfate 273 452 B1 selective on polymerized protein produces flakes with favorable properties, which are reusable multiple times to capture antibodies from hyperimmune animal serum containing a specific antibody against the desired protein. The elution system is selected as advantageously as possible to obtain the highest yields of pure antibody that is sufficiently stable for commercial use. The yield of pure antibody varies between 75 and 85% of the total antibody contained in the hyperimmune serum, depending on the type of hyperimmune serum. The increased effect of the invention lies in the favorable economic efficiency of production, from large volumes of hyperimmune serum to concentrate specific antibodies to a relatively small volume by mere decantation, while avoiding the use of expensive import sorbents. Centrifugation is then limited to a thick suspension of sulfate precipitate after decantation of the supernatant. The invention has been tested on more than fifteen kinds of specific hyperimmune sera: alpha-1 antitrypsin, orosomucoid, transferrin, hemopexin, IgG, IgA, Ig complex, Gc globulin, alpha-2 T globulin, F ab fragment, prealbumin, C 3 globulin, and more. The benefits of pure antibodies are evident wherever the sensor requires rapid determination of proteins without disturbing background due to protein ballasts, nowadays in immunofluorescence, nephelometric, immunoadherence, conjugation, etc. In Laurell's rocket technique and in simple radial immunodiffusion, scrubbing is no longer necessary agar gel, due to the low protein concentration in the gel. The novelty and high effect of the invention can also be attributed to the fact that preparations of this quality are not commonly available on the world market, since isolation of pure antibodies has been used on a laboratory scale for many years. Manufacturing costs using this process are commensurate with or even lower than those incurred for the industrial production of purified IgG-type diagnostics, but the preparations made according to the invention outperform the world-class, such as Dako. A further extensive possibility associated with the production of pure specific antibodies of the invention is the preparation of pure immunogens for the production of specific animal antisera. By dissociating the immunoprecipitate, immunogens can be obtained in a pure state, which makes it possible to eliminate expensive and often very difficult procedures for isolating and purifying immunogens from human plasma and other biological materials. This would reduce the manufacturing costs associated with the production of specific hyperimmune sera and replace the prior art with a convenient and simple procedure.

Příklad 1Example 1

Ke 3 litrům smíšeného séra dárců krve bylo postupně přidáno 66 ml 25% vodného roztoku glutaraldehydu a za 3 hodiny stání při 21 °C bylo přilito 600 ml 10% vodného.roztoku síranu hlinitodraselného. Směs byla promíchána, vločky zachyceny sítem a v průběhu 24 hodin několikrát promyty nadbytkem vodovodní vody. Vločky byly pak zachyceny sítem a ponořeny do 0,15M vodného roztoku chloridu sodného s 0,1 % azidu sodného.66 ml of a 25% aqueous solution of glutaraldehyde was gradually added to 3 liters of mixed blood donor serum and after 3 hours standing at 21 ° C 600 ml of a 10% aqueous potassium aluminum sulfate solution was added. The mixture was mixed, the flakes collected by sieve and washed several times with excess tap water over 24 hours. The flakes were then sieved and immersed in 0.15 M aqueous sodium chloride solution with 0.1% sodium azide.

Příklad 2Example 2

K 1 kg vlhkých vloček z příkladu 1 byly přidány 4 litry prasečího hyperimunního séra precipitujícího specificky alfa-1 antitrypsin. Směs byla ponechána při +5 °C 72 hodin, přičemž vločky byly občas rozmíchány a denně sledován pokles alfa-1 antitrypsinových protilátek v tekutině nad vločkami. Poté byly vločky zachyceny sítem, promyty několikrát během 24 hodin vodovodní vodou, a izolovány sítem.To 1 kg of the wet flakes of Example 1, 4 liters of porcine hyperimmune serum specifically precipitating alpha-1 antitrypsin was added. The mixture was left at + 5 ° C for 72 hours, with the flakes occasionally agitated and monitored daily for a decrease in alpha-1 antitrypsin antibodies in the supernatant fluid. The flakes were then collected by sieve, washed several times during 24 hours with tap water, and isolated by sieve.

Příklad 3Example 3

Promyté vločky z příkladu 2 byly eluovány 2 hodiny dvěma litry Q,2M vodného roztoku kyseliny octové s 2 % sacharózy a eluát neutralizován koncentrovaným vodným roztokem amoniaku na pH 6,5. Eluované vločky byly pak znovu eluovány opět 2 litry elučního roztoku 24 hodin při +5 θθ, eluát neutralizován, a přilit k eluátu prvnímu.The washed flakes of Example 2 were eluted for 2 hours with two liters of a 2M aqueous 2M acetic acid solution with 2% sucrose and neutralized with concentrated aqueous ammonia solution to pH 6.5. The eluted flakes were then eluted again with 2 liters of elution solution for 24 hours at + 5 ° C, the eluate neutralized, and poured onto the first eluate.

Příklad 4Example 4

Ke změřenému objemu eluátu z příkladu 3 byl přidán pevný síran amonný v množstvíTo the measured volume of the eluate of Example 3 was added solid ammonium sulfate in an amount

CS 273 452 BlCS 273 452 Bl

350 g na litr eluátu, rozpuštěn mícháním, a suspenze ponechána při +5 °C 16 hodin. Čirý supernatant byl dekantován, hustá sraženina odstředěním zbavena přebytečné kapaliny, rozpuštěna v 0,15M vodném roztoku chloridu sodného, dialyzována v nadbytku 0,15M vodném roztoku chloridu sodného a lyofilizována.350 g per liter of eluate, dissolved by stirring, and the suspension left at + 5 ° C for 16 hours. The clear supernatant was decanted, the thick precipitate was centrifuged to remove excess liquid, dissolved in 0.15 M aqueous sodium chloride solution, dialyzed in excess 0.15 M aqueous sodium chloride solution, and lyophilized.

Claims

SUBJECT OF THE INVENTION

Process for the production of pure specific antibodies for the rapid quantitative determination of protein concentration by the principle of glutaraldehyde protein polymerization, characterized in that a human normal or pathological serum or a 10¾ aqueous urinary or other protein solution is treated in the pH range of 8.0 to 9.0 once one-tenth to one-tenth the volume of a 25¾ aqueous glutaraldehyde solution at 18 to 28 ° C for one to three hours, one-tenth to one-fifth the volume of a 10¾ aqueous potassium aluminum sulphate solution is added to the mixture, isolated, washed, transferred up to 10 times the volume of animal hyperimmune serum or into a 0.01¾ to 10¾ aqueous antibody solution, then the flakes are washed, eluting in 0.2M aqueous acetic acid

2 In sucrose, the eluate is adjusted to pH 6.5 to 7.5 with concentrated aqueous ammonia solution, the antibody solution is precipitated with 350 g solid ammonium sulfate per liter eluate, the product is isolated, dialyzed and lyophilized.