CS272959B1 - Method of medium antigen preparation for poultry's mark's disease diagnostics by means of precipitation test - Google Patents

Method of medium antigen preparation for poultry's mark's disease diagnostics by means of precipitation test Download PDF

Info

Publication number
CS272959B1
CS272959B1 CS971286A CS971286A CS272959B1 CS 272959 B1 CS272959 B1 CS 272959B1 CS 971286 A CS971286 A CS 971286A CS 971286 A CS971286 A CS 971286A CS 272959 B1 CS272959 B1 CS 272959B1
Authority
CS
Czechoslovakia
Prior art keywords
medium
antigen
mark
suspension
disease
Prior art date
Application number
CS971286A
Other languages
Czech (cs)
Slovak (sk)
Other versions
CS971286A1 (en
Inventor
Darina Mvdr Pospisilova
Juraj Mvdr Csc Salaj
Tomas Mvdr Zuffa
Original Assignee
Darina Mvdr Pospisilova
Juraj Mvdr Csc Salaj
Zuffa Tomas
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Darina Mvdr Pospisilova, Juraj Mvdr Csc Salaj, Zuffa Tomas filed Critical Darina Mvdr Pospisilova
Priority to CS971286A priority Critical patent/CS272959B1/en
Publication of CS971286A1 publication Critical patent/CS971286A1/en
Publication of CS272959B1 publication Critical patent/CS272959B1/en

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

The antigen is prepared in primary or secondary cell cultures from chicken or duck embryos. The cultures are infected by apathogenic virus of Mark's disease, strain MDV-KOL-A BN-MDV-06-1985 adapted on cell cultures. The virus was isolated from poultry rearing without any visible clinical symptoms of the disease. It proliferates in cell cultures grown on glass, plastic, cultivated by stationary method or in rotating tanks or in suspension on microcarriers. After proliferation of the virus the cultivation medium is strained, cleared and the antigen is separated from the medium by ammonium sulphate precipitation. The precipitated antigen is thickened by centrifugation. The sulphates are removed by dialysis and the antigen concentration is adjusted to reach 25 to centuple of the original volume. It is stored in frozen or lyophilized state.

Description

IAND

CS 272 959 BICS 272,959 BI

Vynález sa týká sposobu přípravy médiového antigénu na diagnostiku Markovej choro-by hydiny precipitačným testom.The present invention relates to a method of preparing a media antigen for diagnosing Mark's disease in poultry by a precipitation assay.

Markova choroba hydiny je virusové lymfoproliferatívne ochorenie kury domácej, cha-rakterizované výskytom nádorov vo viscerálnych orgánoch, svalovine, koži, 3alej lymfoid-nými infiltráciami v periférnych nervoch a vysokou mortalitou, ktorá niekedy dosahuje až50 najčastejšie 10 až 20 %.Mark's disease of poultry is a viral lymphoproliferative disease of the domestic chicken characterized by the appearance of tumors in visceral organs, muscle, skin, 3 further lymphoid infiltrations in the peripheral nerves, and high mortality, sometimes reaching up to 50 most commonly 10-20%.

Kultivačně médium a buňky z kultúr infikovaných vírusom Markovéj choroby obsahujúspecifické antigény označené A, B, C, dokázatel'né precipitačným testom v agarovom géli. V kultivačnom médiu je přítomný najma A antigén, ktorý sa používá na dokaž precipitač-ných protilátok proti virusu Markovej choroby v krvi, ako následok přítomnosti infekciev chove. Okrem toho sa A antigén tvoří aj v buňkách epítelu peřových folikulov kurčiatinfikovaných vírusom Markovej choroby. Na přípravu A antigénu pre diagnostické účely savyužívajú najčastejšie dva sposoby s použitím virulentného virusu Markovej choroby: 1. Antigén sa získává z kultivačného média buňkových kultúr infikovaných virulent-ným vírusom Markovej choroby. 2. Na přípravu antigénu sa používajú koncové časti peria alebo koža zvierat infiko-vaných virulentným vírusom Markovej choroby.Culture medium and cells from cultures infected with Mark's disease virus contain specific antigens designated A, B, C, proven by agar gel precipitation assay. In particular, an A antigen is used in the culture medium, which is used to prove blood antibodies of the Mark's disease virus as a result of the presence of infections in the breed. In addition, A antigen is also produced in the epithelial cells of the follicle follicles of chicken infected with the Mark disease virus. For the preparation of A antigen for diagnostic purposes, the two most commonly used methods are the use of virulent virus of Mark's disease: 1. The antigen is obtained from the culture medium of cell cultures infected with the virulent virus of Mark's disease. 2. For the preparation of the antigen, the feathers or skin of the animals infected with the virulent virus of Mark's disease are used.

Uvedené postupy majú následovně nevýhody. Pri prvom sposobe přípravy virulentný vi-rus pasážovaním v buňkových kultúrach mění svoje vlastnosti tak, že postupné strácaschopností tvorby A antigénu. Při získávání antigénu z koze infikovaných zvierat - tietosú trvalým zdrojom nákazy šířením infekcie do prostredia - čo je nežiadúce z hfadiskatlmenia ophorenia v populácii kury domácej. Okrem toho, antigén připravený z kože obsa-huje mnoho nedefinovaných zložiek a vyžaduje Salši čistenie.These processes have the following disadvantages. In the first process of preparing virulent viruses by passaging in cell cultures, it changes its properties by gradually degrading the A antigen formation. In obtaining antigen from goat-infected animals - a persistent source of infection by spreading infection into the environment - which is undesirable from the view of diminishing the burn in the domestic chicken population. In addition, the skin-prepared antigen contains many undefined components and requires saline purification.

Podlá navrhovaného postupu médiový antigén sa připravuje v buňkových kultúrachz kuřácích alebo kačacích embryonálnych buniek infikovaných apatogénnym vírusom Marko-vej choroby označeným MDV-KOL-A, uloženým v zbierke výrobných kmeňov národného podnikuBioveta v Nitře pod číslom BN-MDV-06-1985. Uvedený virus bol izolovaný z chovu hydinybez zjevných klinických príznakov ochorenia, V buňkových kultúrach sa vel'mi dobré množíbez predchádzajúcej adaptácie. Tvorba antigénu do kultivačného média je stabilně aj popřekonaní 25 sériových pasáží. Sposob přípravy médiového antigénu na diagnostiku Marko-vej choroby hydiny je založený na tom, že kmen MDV-KOL-A virusu Markovej choroby, ktorýje neškodný pre kuru domácu, sa pomnožuje na primárných alebo sekundárných kultúrachkuřácích alebo kačacích embryonálnych buniek narastených na skle, plastickéj hmotě, kul-tivovaných štacionárnym sposobom alebo v otáčaných ffašiach, připadne na mikronosičoch.According to the proposed method, the media antigen is prepared in cell cultures of smokers or duck embryonic cells infected with the apatogenic Marko disease virus designated MDV-KOL-A, deposited in a collection of production strains of a national enterprise of Bioveta in Nitra under the number BN-MDV-06-1985. Said virus has been isolated from poultry breeding with no apparent clinical signs of disease. In cell cultures, it is very good to reproduce without prior adaptation. The production of antigen into the culture medium is steadily overcome by 25 serial passages. The method of preparing the media antigen for diagnosing Marko's disease of poultry is based on the fact that the strain of MDV-KOL-A virus of the Mark's disease, which is harmless to domestic chicken, is propagated on primary or secondary cultures of smokers or duck embryonic cells grown on glass, plastic mass , cultured in a rotary bottle or in a rotary bottle, may be on microcarriers.

Na kultiváciu buniek pre produkciu médiového antigénu sa použijú vhodné živné médiá obo-hatené o kultivačně sérum. Buňkové kultúry sa infikujú vírusom Markovej choroby, ktorýje viazaný na živé buňky. To znamená, že inokulum představuje suspenzia živých buniek,ktoré obsahujú pomnožený produkčný virus. Infikujú sa 24 až 48hodínové kultúry bunieknarastené na kultivačnom povrchu tak, že suspenzia infikovaných buniek sa přidá do ras-tového média. Rovnako je možné suspenziu infikovaných buniek pridať do suspenzie buniekv rastovom médiu a súčasne naliatí do kultivačnej nádoby. Virus sa pomnožuje v bunkovejkultúre a v jednovrstvé buniek vyvolává viditelné změny - rozpad buniek. Tieto změny akpostihnu viac ako polovicu buniek, kultivačně médium sa zleje a vyčíri nízkoobrátkovoucentrifugáciou. Antigén sa připraví vyzrážaním po přidaní krystalického síranu amonného do média pri chladničkovej teplote. Precipitát sa zahustí nízkoobrátkovou centrifugácioua následné dialyzuje proti fosforečnanmi tlmenému fyziologickému roztoku chloridu sodné-ho. Získaný antigén po dialýze sa upraví tak, aby výsledná koncentrácia dosiahla 25 ažlOOnásobok povodného objemu. Antigén sa skladuje pri teplotách nižších ako O °C krátko-dobo, ale je možné ho aj lyofilízovatí po rozplnení do ampuliek. Výhodou uvedeného postupu přípravy médiového antigénu je, že sa používá namiestovirulentného prirodzene apatogénny virus Markovej choroby, ktorý aj po sériovom pasážo- c CS 272 959 Bl 2 vání v buňkových kultúrach si zachovává schopností produkcie médiového antigénu. Ďalej,že na přípravu antigénu nie je potřebné používatí živé zvieratá infikované virulentnýmvírusom Markovej choroby, ktoré sú potom trvalým zdrojom infekcie pre spoluumiestnenévnímavé zvieratá, čo má význam najma z hřadiska tlmenia nákazy. Příprava antigénu z ko-ze a z koncových častí peria je sice nenáročná, ale jednoduchým postupom sa nedosiahnetaká čistota antigénu ako pri přípravě z buňkových kultúr.To cultivate the cells for the production of the media antigen, appropriate nutrient media, encompassed by culture serum, are used. Cell cultures are infected with the Mark's disease virus, which is bound to living cells. That is, the inoculum represents a suspension of living cells that contain an enriched production virus. 24-48 hour cultures of cells grown on the culture surface are infected so that the suspension of infected cells is added to the growth medium. It is also possible to add the suspension of infected cells to the cell suspension in the growth medium and simultaneously pour into the culture vessel. The virus propagates in the cell culture and causes visible changes in the monolayer cells - cell disintegration. These changes affect more than half of the cells, the culture medium is decanted and clarified by low-speed centrifugation. The antigen is prepared by precipitation after addition of crystalline ammonium sulfate to the medium at refrigerator temperature. The precipitate is concentrated by low-speed centrifugation and subsequently dialysed against phosphates buffered with saline. The dialysis antigen obtained is adjusted to give a final concentration of 25-100 times the flood volume. The antigen is stored at temperatures below 0 ° C for a short time, but can also be lyophilized after filling into ampoules. An advantage of said process of preparing a media antigen is that it uses a non-virulent, naturally apatogenic Mark's virus, which retains the ability to produce media antigen even after serial passage of CS 272 959 B1 in cell cultures. Furthermore, it is not necessary to use live animals infected with the virulent virus of the Mark disease, which are then a permanent source of infection for co-incipient animals, which is of particular importance for disease control, for the preparation of antigen. The preparation of the antigen from the cage and the end feather parts is undemanding, but the purity of the antigen as in the preparation from cell cultures is not easy.

Uvedené příklady predmet vynálezu nijako neobmedzujú, ani nevyčerpávajú: 1. Sposob kultivácie:The examples are not intended to limit or limit the invention in any way: 1. Culture method:

Suspenzia buniek, připravená pomocou proteolytických fermentov z lldňových kuřá-cích resp. 13dňových kačacích zárodkov v rastovom médiu s definovaným množstvom solí,aminokyselin a vitamínov s prídavkom 5 % hmot séra určeného pre tkanivové kultúry sakultivuje na skle, plastickej hmotě, štacionárnym sposobom alebo v otáčaných ftíašiach,připadne v suspenzii na mikronosičoch. 2. Sposob infekcie buňkových kultúr produkčným vírusom:Cell suspension prepared by proteolytic ferment from 1 day smokers and 1 day smokers respectively. 13-day duck embryos in a growth medium with a defined amount of salts, amino acids and vitamins with the addition of 5% by weight of the tissue culture serum are cultured on glass, plastic, stationary or rotary pads, optionally in suspension on microcarriers. 2. Cell virus infection method by production virus:

Inokulum představuje suspenzia živých buniek infikovaných produkčným vírusom, kto-ré sa přidávájú do kultivačněj nádoby s buňkami v pomere 1:3 až 1:6 (suspenzia buniekz jednej kultivačněj nádoby sa přidává do 3 až 6 nádob s buňkami). Buňkové kultúry při-pravené a pěstované podtía bodu 1 sa infikujú produkčným vírusom nasledovnými spSsobmi: a. Infekcia narastenej jednovrstvý buniek:The inoculum represents a suspension of live cells infected with the production virus which is added to the cell culture vessel in a ratio of 1: 3 to 1: 6 (cell suspension in one culture vessel is added to 3 to 6 cell containers). The cell cultures prepared and cultured under point 1 are infected with the production virus by the following methods: a.

Do rastového média 24 až 48hodinovej kultúry buniek sa přidá inokulum a buňkové kultúrysa Sálej inkubujú bez výměny média pri teplote 38 °C počas 72 až 120 hodin. b. Buňková suspenzia v rastovom médiu s hustotou asi 10^.ml-·'- buniek sa zmieša s inokulom buniek infikovaných produkčným vírusom a súčasne vleje do kultivačnej nádo-by. Kultivácia sa robí pri 38 °C počas 72 až 120 hodin. 3. Zber média, ktoré obsahuje antigén: 24 připadne 48 hodin po infekcii je možné povodně rastové médium vyměnit za médiumrovnakého zloženia, ale so zníženým obsahom (0,5 až 1,0 % hmot.) kultivačného séra. Vi-rus sa pomnožuje v bunkovej kultúre tak, že dochádza počas 72 až 120 hodin k rozsiahle-mu rozpadu buniek a tým k uvďňovaniu A antigénu do média. Ak změny postihujú viac ako50 % jednovrstvý buniek, médium sa zleje a egalizuje zo všetkých kultivačných nádob. 4. Izolácia médiového antigénu:Inoculum is added to the growth medium of 24-48 hour cell culture and cell cultures are incubated without exchange of medium at 38 ° C for 72-120 hours. b. A cell suspension in growth medium with a density of about 10 µm cells is mixed with the inoculum of cells infected with the production virus and simultaneously fed into the culture vessel. Cultivation is performed at 38 ° C for 72 to 120 hours. 3. Collecting antigen containing antigen: 24 days after infection, it is possible to exchange the growth medium with medium of the same composition but with a reduced content (0.5 to 1.0% by weight) of the culture serum. The virus is propagated in cell culture so that there is extensive cell disintegration within 72 to 120 hours, thereby introducing A antigen into the medium. If the changes affect more than 50% of the monolayer, the medium is decanted and leveled from all culture vessels. 4. Isolation of media antigen:

Egalizované médium sa vyčíri nízkoobrátkovou centrifugáciou. Vyčírené médium sazleje a za stálého miešania sa přidává krystalický síran amonný v množstve 30 g na100 ml média. Miešanie pri laboratórnej teplote sa robí až do rozpustenia celého množ-stva síranu. Precipitácia antigénu z média potom Sálej pokračuje pri teplote 2 až 8 °Cpočas 24 až 72 hodin. Precipitát od média sa oddělí nízkoobrátkovou centrifugáciou adialýzou sa zbaví síranov. Dialýza proti fosforečnanmi tlmenému fyziologickému roztokuchloridu sodného sa robí tak, že precipitát sa nerozpúšťa, ale priamo vkládá do dia-lyzačnej hadice, čím sa dosiahne po dialýze dostatočná koncentrácia - 25 až lOOnásobokpóvodného objemu. Ďalšiu koncentráciu je možné dosiahnuť lyofilizáciou s tým, že lyofi-lizát sa rozpúšťa v menšom množstve destilovanej vody, ako bolo povodně množstvo anti-génu před lyofilizáciou.The medium is clarified by low speed centrifugation. The clarified medium is seeded and crystalline ammonium sulfate (30 g per 100 ml of medium) is added with stirring. Stirring at room temperature is continued until all of the sulfate is dissolved. Antigen precipitation from the medium is then continued at 2-8 ° C for 24-72 hours. The precipitate from the medium is separated by low speed centrifugation by adialysis to remove the sulphates. Dialysis against phosphates buffered with physiological sodium chloride solution is made so that the precipitate does not dissolve but is directly introduced into the diaphragm tube to provide a sufficient concentration of 25-25 times the original volume after dialysis. Further concentration can be achieved by lyophilization, with the lyophilizate being dissolved in a smaller amount of distilled water than the flood of anti-gene prior to lyophilization.

Claims (5)

PREDMET VYNÁLEZUOBJECT OF THE INVENTION 1. Sposob přípravy médiového antigénu na diagnostiku Markovej choroby hydiny precipitačným testom, vyznačujúci sa tým, že apatogénny virus Markovej choroby kmen MDV-KOL-A uložený ve zbíerke výv. kmenů n. p. Bioveta Nitra pod č. BN-MDV-G6-1985, adaptovaný na buňkové kultúry sa pomnožuje na primárných alebo sekundárných buňkových kultúrach připravených z kuřácích alebo kaSacích embryí v rastovom médiu s definovaným množstvom solí, aminokyselin a vitamínov obohatenom o bovinné sérum v množstve 0,5 ažA method for preparing a medium antigen for the diagnosis of Mark's disease in poultry by a precipitation test, characterized in that the apatogenic Mark's disease virus strain MDV-KOL-A deposited in the collection of FIG. strains n. p. Bioveta Nitra under no. BN-MDV-G6-1985, adapted to cell cultures, is propagated on primary or secondary cell cultures prepared from smoking or fermenting embryos in a growth medium with a defined amount of salts, amino acids and vitamins enriched in bovine serum in an amount of 0.5 to 10 % hmot, pri teplote 37 až 39 °C po dobu 72 až 120 hodin, médium s antigénom sa zleje, vyčíri centrifugácíou a precipituje síranom amonným, dialyzuje a uchovává v tekutom alebo lyofilizovanom stave.10% by weight, at 37 to 39 ° C for 72 to 120 hours, the antigen medium is decanted, clarified by centrifugation and precipitated with ammonium sulfate, dialyzed and stored in a liquid or lyophilized state. 2. Sposob podl'a bodu 1, vyznačujúci sa tým, že na přípravu sa použijú buňky z 10 až 11dňových kuřácích alebo 12 až 13dňových kaSacích embryí, narastených na skle, plastickej hmotě, kultivovaných štacionárnym spSsobom alebo v otáčaných flíašiach případné v suspenzi! na mikronosičoch.2. Method according to claim 1, characterized in that cells from 10 to 11-day smokers or 12 to 13-day slurry embryos, grown on glass, plastic, cultured in a stationary manner or in rotated bottles optionally in suspension, are used. on microcarriers. 3. Sposob podTa bodov 1 a 2, vyznačujúci sa tým, že do produkčných buňkových kultúr sa inokuluje suspenzia živých buniek infikovaných produkčným virusovým kmeňom, ktorá sa přidává v pomere 1:3 až 1:6 do rastového média v kultivačnej nádobě s narastenými buňkami, alebo suspenzia neinfikovaných buniek v rastovom médiu s hustotou 400 000 až 800 000 v jednom mililitri sa zmieša so suspenziou infikovaných buniek a vleje do kultivačnej nádoby.3. A method according to claim 1 or 2, characterized in that a production cell culture is inoculated with a suspension of live cells infected with the production virus strain, which is added in a ratio of 1: 3 to 1: 6 into the growth medium in the growth vessel. or a suspension of uninfected cells in growth medium at a density of 400,000 to 800,000 per milliliter is mixed with the suspension of infected cells and poured into a culture vessel. 4. Spísob podl'a bodov 1 až 3, vyznačujúci sa tým, že za 24 až 48 hodin po infekci! sa rastové médium vymění za médium rovnakého zloženia, ale so zníženým obsahom bovinného séra na 0,5 až 1,0 % hmot.4. The method according to claims 1 to 3, characterized in that 24 to 48 hours after infection! the growth medium is replaced with a medium of the same composition but with a reduced bovine serum content of 0.5 to 1.0% by weight. 5. Sposob podTa bodov 1 až 4, vyznačujúci sa tým, že médium s antigénom sa vyčíri nízkoobrátkovou centrifugácíou a za stálého miešania pri laboratórnej teplote sa přidává krystalický síran amonný v množstve 30 g na 100 ml, po jeho rozpuštění precípitácia antigénu pokračuje pri teplote 2 až 8 °C počas 24 až 72 hodin, precipitát od média sa oddělí nízkoobrátkovou centrifugácíou, dialyzuje proti fosforečnanmi tlmenému fyziologickému roztoku chloridu sodného; uchovává sa v zmrazenom alebo lyofilizovanom stave.5. The method of claims 1 to 4, wherein the antigen medium is clarified by low-speed centrifugation and crystalline ammonium sulfate is added at 30 g per 100 ml while stirring at room temperature. to 8 ° C for 24 to 72 hours, the precipitate from the medium is separated by low-speed centrifugation, dialyzed against phosphate buffered saline; it is stored frozen or freeze-dried.
CS971286A 1986-12-22 1986-12-22 Method of medium antigen preparation for poultry's mark's disease diagnostics by means of precipitation test CS272959B1 (en)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS971286A CS272959B1 (en) 1986-12-22 1986-12-22 Method of medium antigen preparation for poultry's mark's disease diagnostics by means of precipitation test

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CS971286A CS272959B1 (en) 1986-12-22 1986-12-22 Method of medium antigen preparation for poultry's mark's disease diagnostics by means of precipitation test

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CS971286A1 CS971286A1 (en) 1990-07-12
CS272959B1 true CS272959B1 (en) 1991-02-12

Family

ID=5446185

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CS971286A CS272959B1 (en) 1986-12-22 1986-12-22 Method of medium antigen preparation for poultry's mark's disease diagnostics by means of precipitation test

Country Status (1)

Country Link
CS (1) CS272959B1 (en)

Also Published As

Publication number Publication date
CS971286A1 (en) 1990-07-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US4071618A (en) Process for preparing virus disease live vaccines
KR0156732B1 (en) IBDV generation in continuous cell lines
Guneratne et al. Some observations on the isolation and cultivation of avian reoviruses
Waterson Measles virus
CA1093995A (en) Rapid propagation of sv3t3 cells for production of mif and taf
Philipson et al. Recovery of a cytopathogenic agent from patients with non-diphtheritic croup and from day-nursery children. I. Properties of the agent
CA1092038A (en) Diploid porcine embryonic cell strains, cultures produced therefrom and use of said cultures for production of vaccines
Hafiz Clostridium difficile and its toxins
EP0011864B1 (en) Attenuated strain of feline infectious peritonitis virus, method for preparing it and vaccine comprising it
Baldwin et al. Tuberculosis, Bacteriology, Pathology and Laboratory Diagnosis: With Sections on Immunology, Epidemiology, Prophylaxis and Experimental Therapy
Calnek et al. Some characteristics of cell-free preparations of Marek's disease virus
US4169761A (en) Process for the cultivation of viruses
CN110747176A (en) Culture method for improving virus titer of porcine epidemic diarrhea viruses
US3585266A (en) Live rabies virus vaccine and method for the production thereof
Parry et al. Evidence for a bovine origin of the polyomaviurs detected in foetal rhesus monkey kidney cells, FRhK-4 and-6
US3625833A (en) Process for producing antiviral substance from staphylococcus organisms
CS272959B1 (en) Method of medium antigen preparation for poultry's mark's disease diagnostics by means of precipitation test
US3470294A (en) Vaccine for immunization of dogs and foxes against distemper,hepatitis contagiosa and leptospirosis and process for preparing it
SU997599A3 (en) Process for preparing heterovaccine for treating trichomonas syndrome
KR900007262B1 (en) Production of hemorr
US3098011A (en) Process of producing a vaccine against distemper
US2513327A (en) Treponema pallidum culture and products thereof
JPS62500001A (en) cell proliferation
Campbell The cultivation of tumours in the fertile egg, with special reference to associated ectodermal lesions of the chorioallantoic membrane
EP0011865A1 (en) Feline infectious peritonitis vaccine and process for its preparation