CS272748B1 - Method of d-mannose and d-arabinose - Google Patents

Description

1 CS 272 748 Bl <w

Vynález ea týká sposobu přípravy D-manózy a Ď-arabinózy z D-glukózy. D-Manóza ako aj D-arabinóza patria medzí vzácná sacharidy aldozy, ktoré sa nachád-zajú v příroda ojediněle. D-Manóza sa moža připravit hydrolýzou mananov zo seraien palmy Phytalephas macro-carpa /R.Riese:Ber.22,609 (1889)/, z riasy Porthyra umbilicalis /C.S.Hudson, E.L.Oack-son:Ara.Chem.Soc.56,958 (1944)/ a buněčných stien kvasiniek Saccharomycss carevieiae/3.§andula,A.Vojteková: Folia Microbiol.:19/94((1974)/. Přípravu D-manózy z epimerizač-nej zotaei pomoct/ fenylhydrazinu, anilinu alebo delením na kolona naplnenej ionomeničoms funkčnými sulfoskupinami vo vópenatej formě popisujú /V.Bilik AO. 149 051; O.Kubala,V.Bilik,'3.Caplovič,F.Rendoš,K.Repáš AO. 214 431; 3.Kubala»3.Rosik AO. 233 220/. D-Arabínóza nacbádzajúca sa v příroda najčastéjšie vo formě glykozidov tropickýchlaliovitých rastlín Aloe berbadensis /rt.E.Légar: Am.Chim.phys. 8,265 (1917); C.tf.Gib-3on, O.L.Simonson: J.Chem.Soc. 553 (1930)/ v niektorých prípadoch zo zmesi polysacha-ridov obsahujúcich D-arabinózu/W.N.Hawerth, P.W.Kent, M Staey: □.Chem.Soc. 1211,1220(1948)/, z ktorých sa připravuje po izolácii kyslou a enzymatickou hydrolýzou. Taktiežsa raože připravit sulfonovou degradáciou disulfonu 0-manitolu /Donald, L.MacOonald:Methods in Cartohyd.Chem. Vol. 1.73 (1962)/. Qxidáciou O-glukázy pomocou chlornanu sod-ného /R.L.Whistler, R.Schwoiger: 3.Am.Chem.Soc. 81/5190 (1959)j R.L.Whistler,3.N.BeMiller: Msthods ín Carbohyd.Chem.Vol.I. 71 (1952)/, alebo rozkládám glukonanu vápena-tého s peroxidem vodíka za přítomnosti železitých iónov a me3natých iónov /O.Ruff,G.Ollendorf: Ber.33,1798 (1S00); R.C.Hockeet, C.S.Hudson: O.Am.Chem.Soc.‘56,1632 (1934);G.Fletcber,3.H.W.Dichts/ C.S.Hudson: 3.Am.Chem.Soc. 72,4546 (1950); V.Bilik AO. 232 647)/.Příprava D-arabinózy sa uskutečňuje z glukonanu vápenatého elektrolytickou oxidáciouza katalytického účinku ceričitýoh iónov /3.Kubala,š.Kučár,K.Linek AO. 225 576/. Oxidá-cia O-glukózy na kyselinu O-glukonovú biochemickými postupmi je popísaná v prácach/S.Oga.K.Sate: Oapan pat. 7451 384 (1974); T.Sonoyama,H.Tapi,s.Kagayama,K.Kobayami,r-»Honjo,S.Yagi: US. pat. 3 998697 (1976)j A.Gruager.W.Grueger: In. Bíotechnology,Vol,69,Verlag Chemie Wainheie (1984); MiRosenberg, E.Sturdik,3.Gornory.S.Stanek,R.Kacina.B.Skár-ka AO. 262 877/.

Uvedené metody přípravy D-manózy a D-arabinózy malí nedostatky v tom, že ích pří-prava vzhíadom na spracovanie roznych východzich-surovin bola dlhá,' dochádzalo k nebez-pečnému zamorovaniu prostredia/ výtažok medziproduktu bol nízký, čím příprava bola ná-kladná a konečné produkty nedosahovali požadovaná čistotu.

Uvedené nevýhody v podstatnej miere odstraňuje spósob přípravy O-manózy a D-arabi-nózy podlá vynálezu takj že sa použije ako východzia surovina zmes vodných roztokovD-glukózy a O-manózy. 3a známa/ že keá ea vodný alebo vodnoatanolický roztok aldózyD-glukózy podrobí- zahríevaniu v kyslom prostředí za přítomnosti molabdenanových iónovdochádza k epimerizácii na D-manózu /V.Bilik: Chem.Zvssti 26/372 (1972); M.L.Hayes,N.L.Pennige/ A.S.Sarianni, R.Barker: 3.Am.Chem.Soc. 104,6764 (1982); E.L.Clark Or,M.L.Hayes; R.Barker: Carbohyd.Res. 153/263 (1986); O.Kubala: Závěrečná správa 1985,Chemický ústav CCHV SAV/ Bratislava/.

Autoři skúmali možnost přípravy D-manózy a O-arabinozy zo zmesi D-glukozy a D-ma-nózy a dospěli k tomuto vynálezu/ ked zistili lepšie zúžitkovanie východzej- látky apřípravu O-manózy a O-arabinózy v jednom 3tupni kombinovanou metodou biochemicky akoaj chemicky. Ako producent bol vytipovaný kmsň mikroorganizmu Aspergillus niger CCM 8004schopný vysoko selektivně oxidovat D-glukózu na kyselinu D-glukonovú.

Sposob podlá vynálezu spočívá v tom, že sa 10 až 60 % vodný roztok zmesi O-glukó-zy a 0-manozy zmieča so zložkami fermentačného média obvyklými pre pestovanio mikro--organizmu rodu Aspergillus,’ zmes sa zaočkuje mikroorgsnizmom Aspergillus niger, s vý-hodou kmena CCM 8004. Fermentačná zmes sa submarzne kultivuje při teplota 25 až 35 °C/pri pH 3,0 až 7/5, za mieáania pří 200 až 500 ot/min./ pri prevzdušneni 0,2 až 1,5 ob- CS 272 748 Bl 2 jemu vzduchu na objem fermentačného média,’ pri tlaku 0,05 až 0,2 MPa,7 po dobu 20 až72 hodin. Po skončeni fermentácie a po eeparácii bunečnej hmoty mikroorganizmu,’ sa k.y-'selina glukonová oddeli kryštalizáciou od D-manozy vo formě odpovedajúcej 9oli s alka-lickým kovom alebo kovom alkalickej zeminy, z ktorej sa peroxidem vodiks za pritomnostiželezitých iónov,; s výhodou síranu železitoamónneho, uvolni D-arabinóza. Matečný lúhobsahujúci O-manózu po separácil 0-glukonanovej soli sa přečisti pomocou vymieňača ke·*tiónov a aniónov·. Očkovanie fermentačného média mikroorganizmem Aepergillus niger CCM8004 sa vykoná tak,' že sa spórová suspenzia mutantu tohto kmeňa použije priamo na ino-kuláciu fermentačného média alebo sa z nej priravi vegetačně inokulum, kterým sa naoč-kuje fermantačné médium· Separované buněčné hmota mikroorganizmu sa 0 výhodou opakovanépoužije ňá iconverziu vodného roztoku D-glukózy a D-manozyo Základné morfologickó o fyziologické charakteristiky mutantu Aepergillus niger N-XI,ktorá Je uložené v Ceskoslovenskej zbierke mikroorganizmov Univerzity □·£. Purkynž v Brnopod označením CCM 8004; sú podrobné uvedené AO, 262 877« Pre zaočkovaníe forsientačnýchnádob je možné použiť spórové alebo vegetativně inokulum mikroorganizmu· Výhodou navrhovaného sposobu přípravy D-manózy a D-arabinózy oproti doterajšim epo-sobom pripravy je, že předmětný sposob je hospodárnější. Technologické operácie sú Jedno-duché, nenáročné na energiu. Velmi dobré nahradzuje doterajšie sposoby ízolácía D-ma-nózy z epimorizačnej zmesi pomocou aromatických aininov,’ anilinu,v fÓnylhydrazinu,1 ktoréeú nebezpečnými jedmi, reep. karcinogénnymi látkami; odstraňuje možnost rizika vznikuchoroby z povolania, nedochádza k zamorovaniu prostredia. 2 komerčně dcstupnsj D-glukó-zy sa vyrobia velmi vzácné dva monosacharidy O-manóza a D-arabinóza o vysokaj čistotě·

Vynález ilustruje nasledujúce příklady pravedeňia, pričom sa" však rozsah vynálezuv žiadnom smere neomedzuje. Přiklad 1 Připraví sa sterilné fermantačné médium, ktoré obsahuje 5 % hmot· D-danózy a 15 %hmot. D-glukózy a dalšie chemikálie: 0,11 % hmot. dusičnanu vápenatého tstrahydráťu, 0;07 % hmot.· síranu amonného, 0,03 % hmot. dihydrogénfosforečnanu draselného;’ 0,025 %hmot, síranu horečnatého haptahydrátu, 0,025 % hmot. chloridu draselného. Do média sapřidá 3 % hmot, uhličitanu vápenatého,’ ktorý je sterilizovaný oddelene. Fermsntáciaprebieha v 5 dm3 nerezovom fermentore s centrálně umiestneným miošadiom. Ako inokulumsa použije suspenzia spór plesne Aspergillus niger CCM 8004; kultivovanej 10 dni ďasladinovom agare, pri 30 °C, ktorú připravíme spláchnutím spór příslušným množstvem0,1 % roztoku povrchovo aktivnej látky odpeňovača polyoxyetylén sorbitan monooleátu(Tween 80). Takto připravenou suspenziou spór sa zaočkuje 3 dm3 fermentačného média tak t* aby počiatočná koncentrécia spór bola 10 až 10 1 cm média, V prvej fáze fermentácie kličia spáry pri toplote 32 °C> miešani 200 ot/min.? vzdušněni 0?2 objemu vzduchu naobjem fermentačného média a pri tlaku 0,05 MPa. Po 12 hodinách dochádza k vlastnej fer-mentácii,' miešanie sa zvýši na 400 otáčok/min., vzdušnenie na 1 objem vzduchu/objemfermentačného média; teplota sa v priebehu fermentácie udržuje na 30 °C; vo fermentoreje přetlak 0,15 MPa. Hodnota pH fermentačného média udržované uhličitanem vápenatým sarneni z pH 7,3 z<o začiatku fermentácie až na pH 3,J7 na Jej konci. Celková doba fermen-tácie je 30 až 35 hodin. Fermentačné médium obsahujúce kyseliny D-glukonovú a O-manóžu,je po ekončeni fermentácie zbavené mikroorganizmu filtráciou a kyselina D-glukonovó· jepo neutralizácii média uhličitanom vápenatým odeeparovaná od D-manózy vo forma vápena-tej soli kryštalizáciou. Matečný lúh sa perkoláciou deioňizuje cez· kolonu vymieňačakatiónov Ostion KS v M+ formě a vymieňača aniónov Wofatit SBW v OH" formo. Roztok pritlaku lOO kPa a teplota 40 °C sa zahusti na sirup; za horúca rozpustí v 90 % hmot. eta-nole v pomere 1:3a vykryštallzuje. Vzhladom na použité množstvo sacharidov vo fer-mentačnom médiu je výťažnosť D-manozy 92 %; /oc/30 + M° (co5 voda), teplota topenia130 až 132 °C. . - 3 CS 272 748 Bl

Do 50 litrového skleněného reakčného kotlika opatřeného miešadlom, ohrevom a chladenimea pripravi vodný roztok 8/8 % hmot* glukonanu vápenatého/ 0/5 % hmot· síranu železi-toamónneho/ ktorý sa vyhraje na teplotu 80 °C a postupným přidáváním 10 % hmot· peroxi-du vodíka reakcia prebieha pri teplote 48 °C po dobu 4 hod. Reakčná zmes sa' neutrali-zuje 25 % hmot. kyselinou -sírovou na pH 7 a nerozpustné soli ea odfiltrujú a premyjúvodou. Filtrát sa deionizuje perkoláoiou cez kolonu vymienača katónov Ostion KS v H*formě a vymieňača‘'aníónov Wofatit SBIV v Ac" formě. Roztok pri tlaku 100 kPa a teplote40 °C zahusti na sirup/ rozpustí v horúcom 36 % hmot. etanole a vykrystalizuje. D-Ara-binóza /oc/Š° 7 104° (c»5 voda)! teplota topenia ISO až 15.1 °C sa. získá v 45 % výtažku. Přiklad z Připraví sa inokulačné médijjm/ ktoré obsahuje 13 % hmot. D-manozy a 13 % hmot.D-glukózy a daléie chemikálie: 0/19 % hmot. dusičnanu vápenatého tetrahydrátu/ 0/11 %hmot. síranu amonného/ 0/025 % hmot. dihydrogénfosforečnanu draselného/ 0,025 % hmot.síranu horečnatého heptahydrátu/ 0/025 % hmot. chloridu draselného. Do média sa přidá3/0 jé hmot. uhličitan vápenatý/ ktorý sa sterilizuje oddálená. Sterilně inokulačné mé-dium o objeme 3 dm3 je naočkované spárami suspenzie mikroorganizmu Aspergillus nigerCCM 8004 tak/ ako je to popisané v příklade Ϊ. Kultiváqia prebieha v 5 dm3 fermentorepri 32 °C,5 miaSania 200 ot/min·/ vzdušnenie 0/2 objeme vzduchu/objem fermentačného mé-dia/ pri tlaku 0/05 MPa. Po 20 hodinovej kultivácii sa příslušný diel fermentačnéhotanku, ktorý obsahuje 12 dm3 produkčného média/ obsahujúceho 13 % hmot. D-glukózy a13 % hmot. D-manózy a dalčie minerálie ako Je uvedené v přiklade 1. Do fermentačnóhomédia je přidávaný 3/0 % hmot. uhličitan vápenatý/ ktorý udržuje pH 3/5 až 7. Fsrmsn-tácia prebieha při 30 °C/ miešani 400 ot./min./ vzdušněni 1/0 objemu vzduchu/objem fer-mentačného média, přetlaku 0/Ί5 MPa po dobu 20 až 22 hodin, Salšie spracovanie ako vpřiklade 1. Výtažnost kyseliny D-glukonovej je 94 %. D-Manoza + 13/8° (c»5 voda)/ teplota topenia 130 až 132 °C. Výtažnost 90 %, Q-Arabinóza /0</^θ - 103/8° (ca5 voda), teplota .topenia 161 až 162 °c. Výtažnost 44 %. Přiklad 3 3 Připraví sa inokulačné médium/ jeho zloženie Je'uvedené v příklade 2. V 20 dmfermentore je 12 dm inokulačného média zaočkované spořovou suspenziou mikroorganizmuAspergillus niger CCM 8004 tak," ako je to v přiklade 1. Kultivácia prebieha pri 30 °Cvzdušněni 0/5 objem vzduchu/objem fermentačného média/ miešani 300 ot./min./ pH je udr-žiavané pridavkom 15 mol/dm hydroxidu sodného na hodnotu 6/2, Po' 20 hodinovéj kultivá-cii sa příslušný podiel takto připravovaného inokula; postačuje k dosiahnutiu 10 % ob-jemu inokula/ vnesie do 100 dm3 fermentačného média/ ktoré obsahuje 25 % hmot. D-glu-kózy/ 25 % hmot. D-manozy a 3alšie minerálně soli ako je uvedené v přiklade 1. Fermen-tácia prebieha pri teplote 30 °C/ miešani 450 ot./min./ vzdušněni 1/2 objem vzduchu/objemfermentačného média/ při tlaku 0/15 MPa. Hodnota pH je údržiavaná· pridavkom 15 mol./dm3hydroxidu sodného na hodnotu pH 5/6, Doba fermentácie nepřesahuje 28 až 32 hodin. Po ee-parácii mycélia a filtrácii Je kyselina D-glukónová odeeparovaná od O-manázy kryštali-záciou vo formě sodných soli. Výfažok kyselinyD-glukonovej je 94 %. Matečný lúh po od-stránení glukonátu sodného sa perkoláoiou deionizuje cez kolonu vymienača kationovOstion KS v H+ formě a vymienača anižnov Ostion AO v OH" formě. Roztok pri tlaku 100 kPaa teplote 40 °C zahustí na sirup; za-horúca rozpustí v 90 % etanole v pomere 1:3avykrystalizuje. O-Manóza + 14° (c«5 voda)/ teplota topenia 130 až 132 °C a ziska sa v 88 % výtažku.

Do 50 litrového skleněného reakčného kotlika opatřeného miešanim a chladenim sa přidá vodný roztok 8,8 hmot. glukonanu sodného/ 0/5 % hmot. síranu železitoamonneho a za intenzívneho miešania postupné sa přidává 10 % hmot, peroxid vodíka pri tep-lote

Claims (4)

1. CS 272 748 81 4 48 °C po dobu 4 hod, Reakčná zmes sa delonizuje perkoláciou caz kolonu vymieřiača katió-nov Wofatit KPS v H+ forma a vymieřiača aniónov Wofatit SBVv Ao” forma, Pri tlaku100 kPa a teplota 40 °C sa roztok zahusti na sirup,, rozpustí v horúcom 96 % hmot, stano-le v pomars 1:4a krystalizuje, D-Arablnóza /tX./g° - 104)6° (c«5 voda); teplota to-ponia 160 až 162 °C sa získala v 43 % výtažku, D-Manóza sa dá získat i tamar 100 % vý-tažku ak sa pracuje vo fermontora s objamom cca 10 litrov. Straty do 10 % sú sposobenóstratami výroby v priamysalnom moritku o objeme cca 1500 litrov. D-Manóza ako aj D-arabinoza majú použitie v chémii a biochémii sacharidový medi-cíno, potravinárskom a farmaceutickom priamysla. PREOMET VYNÁLEZU

   1. Sposob pripravy o-manózy a D-arabinázy z D-glukózyý spočivajúci v tom, že sa roztokD-glukózy podrobí zahriavaniu v kys-lom proetradi, pričom sa časl D-glukózy epimari-zuje na o-manózu, vyznačujúci sa tým, že sa 10 až 60 % hmot, roztok zmasi D-glukózya O-manózy zmieša so zložkami fermentačného média obvyklými pra pestovanie mikroor-ganizmu- rodu Aspergillus) zmes sa zaočkuja mikroorganizmom Aspergillus niger) násled-né sa aubmorzne kultivuje pri teploto 25 až 35 °C) pri pH 3)0 až 7)5ý za miešaniapri 200 až 500 otáčok/min,,' pri vzdušněni 0)2 až 1/5 objama vzduchu na objem ferman-točného média,' pri tlaku O,Ό5 až O,'2 MPa, po dobu 20 až 72 hodin; pričom po skončenifermentócie a po saparácii bunečnaj hmoty mikroorganizmu) sa kyselina glukonovó odda-li kryštalizáciou od O-manózy vo forma odpovedajúcej soli s alkalickým kovom alabokovom alkalickaj zeminy; z-ktorej sa peroxidem vodika za přítomnosti želazitých ió-nov s výhodou síranu železitoamónneho uvolni D-arabinóza a matečný lúh obsahujúci·D-manozu po ssparácii D-giukonanovej soli sa přečisti· pomocou vymieňača katiónov aaniónov,
2. 2. Sposob pripravy podlá bodu 1, vyznačujúci 3a tým) že sa použije mikroorganizmus As-pergillue niger CCM 8004,
3. 3. Sposob pripravy podlá bodu 1) vyznačujúci sa tým) že sa očkovanis fermentačného médiamikroorganizmom Aspergillus niger vykoná tak) že sa spórová suspenzia mutantu tohtokmería použije priamo na inokuláciu fermentačného média- alebo sa z nej připraví vege-tačně inokulum) ktorým sa naočkuje fermontačné médium,
4. 4. Sposob pripravy podlá bodu 1; vyznačujúci sa tým, že sa separovaná buněčná hmoto mi-kroorganizmu opakované použije na konverziu vodného roztoku D-glukózy a D-manóžy,