CS270637B1 - Analytický prostředek ke stanoveni diagnosticky významných součástí biologických kapalin - Google Patents

Abstract

Řešení se týká analytického prostředku ke stanovení diagnosticky významných součástí biologických kapalin na bázi enzymových reakcí. Prostředek podle řešení obsahuje jako stabilizační a/nebo seperační činidlo propylenglykoléter methylcelulozy obecné struktury I, kde R je H, CH^ nebo CH3CH(OH)CH2-radikál, přičemž methoxyskupiny jsou*substituovány s výhodou v 19 až 32 % a hydroxypropoxyskupiny ve 4 až 15 %. Proti současnému stavu techniky zvyšuje prostředek podle řešení podstatně životnost i kvalitativní parametry

Description

rr-cduičLuui vynálezu jo nnulytlcký prostředek ke stunovoní dlugnoirtlcky významných součástí biologických kapalin na bázi enzymových reakcí. Proti současnému, známému stavu techniky obsohuje tento analytický prostředek nové stabilizační u Bcpnroční činidlo, zvyšující podstatně životnost prostředku i jeho kvalitativní parametry.

V klinicko-biochemické laboratorní diagnostice je v současné době převážná většina testů založena na enzymových metodách. Je tomu tak například, při stanovení glukosy, kyseliny močové, cholesterolu nebo tzv. triglyceridů, kdy příslušné analyty jsou převáděny pomocí specifických enzymů - oxidoreduktas (glukosaoxidásy,· urikasy, cholesteroloxidasy nebo glycerofosfatoxidasy) - na své oxidaxní produkty. Analyticky velmi obtížné stanovení primárních složitých analytů se tímto způsobem-převádí na stanovení nesrovnatelně jednodušší látky - peroxidu vodíku, k jehož stanovení se využívá jeho poměrně silných oxidačních vlastností. Nejvíce užívaným postupem je oxidace vhodné leukobáze redoxindikátoru nebo chromogenního systému na bázi oxidativní kopulace za přítomnosti specifického enzymu peroxidasy na barevné oxidační produkty, jejichž množství je ekvivalentní množství primárního analytu. Speciální progresivní oblast diagnostiky zaujímají v poslední době zejména diagnostické prostředky v suché fázi, jako jsóu práškové směsi, tablety, lyofilizáty a především reagenční proužky, v nichž veškerá činidla potřebná pro průběh pomocných reakcí i koncové barevné reakce chromogenu jsou'obsažena ve vhodném nosiči v pevné, resp. suché fázi. U těchto systémů je nezbytná dokonalá separace jednotlivých inkompatibilních složek, stabilizace labilních součástí a chránění před sorbcí vzdušné vlhkosti, která rekonstituuje reakční systém a startuje nežádoucí reakce, vedoucí k rozložení systému. K separaci a stabilizaci enzymů jsou používány převážně hydrofilní polymerní látky přírodního nebo syntetického původu, jako želatina, agar, arabská guma, dextran, albumin, alginát, polyvinylpyrrolidon nebo polyvinylalkohol, popsané např. v US-patentu č. 3 814 668, US-patentu č. 4 066 403 nebo kopolymer methylvinyléter/maleinanhydrid (US-patent č. 3 453 180). Chránění systémů na bázi tzv. suché chemie před vzdušnou vlhkostí je dosahováno důkladným vysoušením a hermeticky těsnými obaly, příp. opatřenými navíc vysoušedly (silikagel, molek. síta). U reagenčních proužků je popsán rovněž způsob chránění reakčního systému před účinkem vzdušné vlhkosti, spočívající v zatavení reagenčního papíru mezi syntetické fólie takovým způsobem, že vyšetřovaná kapalina může proniknout do reagenční zóny pouze bočními nekrytými okraji (DOS δ. 1 546 307), nebo skrze jemnou polymerní síťku z polyamidu, polyesteru, polyethylenu, polyvinylchloridu nebo polyakrylonitrilu, jak je popaáno v US-patentu č. 3 802 842. US-patent č. 4 046 513 popisuje diagnostický prostředek, kde jednotlivá činidla jsou nanesena (natištěna) ve formě separátních, navzájem se nepřekrývajících teček. Ke vzájemnému promísení reagencií dochází až po namočení proužku do vyšetřované kapaliny. Tento způsob je však technologicky obtížný a v praxi nebyl uplatněn.

Uvedené způsoby chránění systémů vykazují řadu nevýhod, jako je nestejnoměrné vybarvení zón v důsledku difúze kapaliny, nežádoucí tzv. okrajové efekty, nedostatečná stabilizace systému, složitá technologie apod. Při použití klasických ochranných koloidů, např. želatina, agar, zůstává při sušení v matrici vázaná zbytková vlhkost, která snižuje stabilitu reakčního systému a poskytuje rovněž vhodné médium pro nežádoucí růst mikroorganismů. Poněkud výhodnější z tohoto hlediska se jeví použití syntetických hydrofilních polymerů, napr. polyvinylpyrrolidonu nebo polyvinylalkoholu, které vykazují stabilizační účinky enzymů a separují jednotlivé složky reakčního systému. Uvedené polymery však mají i řadu nevýhod, např. obsahují zbytky iniciátorů radikálových polymerací na bázi peroxidů (např. dibenzoylperoxid, kumylhydroperoxid), které mají nepříznivý vliv na stabilitu reakčního systému a rovněž vykazují dost vysokou sorbci vzdušné vlhkosti.

CS 270637 Bl

Uvedené nedostatky odstraňuje předložené řešení, jehož předmětem je analytický prostředek na bázi enzymových reakcí. Jeho podstata spočívá v tom, že jako stabilizační a/nebo separační činidlo obsahuje propylenglykoléter methyleelulózy obecné struktury I

(I), kde R je H-, CH^- nebo CH}CH(OH)CH₂-radikál, přičemž methoxyskupiny jsou substituovány s výhodou v 19 až 32 % a hydroxypropoxyskupiny ve 4 až 15 %. Tento polymer je výborným ochranným koloidem a stabilizačním činidlem s dalšími příznivými vlastnostmi adheziva, plniva a tabletovacího média. Je vysoce-^resistentní vůči bakteriální kontaminaci a inertní vzhledem k enzymům i běžně používaným reagenciím. Vykazuje výbornou a rychlou rozpustnost ve vodě i za normální teploty i v organických rozpouštědlech a poskytuje čiré roztoky. Sorbce vzdušné vlhkosti v závislosti na relativní vlhkosti je 3 až 4krát nižší než vykazuje např. nejčastěji používaný polyvinylpyrrolidon (viz obr. 1)

relativní vlhkost /%/

Při aplikaci u reagenčních proužků dochází rovněž k afinici vzniklého barevného produktu ke gelu za zvýšení brilantnosti, homogenity a stability vzniklého zbarvení indikační zóny, což je významné jak u proužků vizuálních, tak zejména u proužků vyhodnocovaných reflektometricky. Propylenglykoléter methylcelulózy se tedy jeví význačným ochranným a stabilizačním činidlem reakčních systémů, zejména na progresivní bázi tzv. suché chemie, jehož aplikace odstraňuje výše uvedené nevýhody stávajících prostředků, převážně na principu citlivých enzymových reakcí. Prostředek

CS 270637 Bl podle tohoto vynálezu obsahuje vedle chromogenního systému, enzymů a výše uvedeného stabilizátoru další o sobě známé a pro obdobné účely běžně užívané látky, jako jaou tlumiče, akcelerátory, tenzidy a další pomocné látky.

Příklad 1

Reagenční proužky ke stanovení glukosy v moči

Impregnační roztok:

Citrátový tlumič, pH = 6,2	100 ml
Ethanol '	60 ml
Aceton	45 ml
Propylenglykoléter methylcelulosy (Klucel)	4,3 g
Glukosaoxidasa	100 kU
Peroxidasa	15 kU
Želatina	0,2 g
Tartrazin, 1%-ní vodný roztok	6 ml
l-(4-sulfofenyl)-3-methyl-5-pyrazolon	2,5 5
4-aninofenazon	1,6 g
Benzyldimethylhexadecylamonium chlorid	0,8 g

Filtrační papír o plošné hmotnosti 180 g/m se naimpregnuje· roztokem do nasycení, vysuší proudem teplého vzduchu a takto připravený reagenční papír se rozřeže na čtverečky o rozměru 6x6 mm, které se nalepí na podložku z plastické hmoty, V močích obsahujících různé koncentrace glukosy tyto proužky poskytují po namočení barevnou gradaci v rozsahu 0 až 170 mmol/1 glukosy. Na rozdíl od proužků obsahujících např. polyvinylpyrrolidon vykazují proužky cca dvojnásobně vyšší stabilitu při stejných skladovacích podmínkách.

Příklad 2

Diagnostický prostředek ke stanovení glukosy v plazmě Činidlo I: 4-aminoantipyrin	45	mmol
Peroxidasa	25	kU
Glukosaoxidasa	300	kU
Propylenglykoléter methyleelulózy (Pharmacoat 603)	3	g

Reagencie se rozpustí ve 400 ml destilované vody a vzniklý roztok se vysuší lyofilizací. Směs je stabilní min. po dobu 24 měs.

Činidlo II: Citrátový tlumič (pH = 6) 0,2mol

Primachin difosfát 0,01 mol

Laurylsulfát sodný 0,7mmol

Dest. voda 300ml

Při aplikaci se smísí 1 díl rekonstituovaného činidla I se 100 díly činidla II a tato směs činidel se smísí se vzorkem v poměru 100 : 1. Vzniklé zbarvení je přímo úměrné koncentraci glukosy ve vzorku.

CS 270637 Bl

Příklad 3

Diagnostický proužek ke stanovení kyše Impregnační roztok I: Fosfátový tlumič (pH = 7) Urikasa Methylhydroxypropylcelulóza (Metolose) Peroxidasa Methanol Destilovaná voda Impregnační roztok II: Methanol Dest. voda 3-methyl-2-benzthiazolinon hydrazon hydrochlorid 1-(4-sulfofeny1)-3-karboxy-5-pyrazolon benzyldimethyl-n-hexadexylamonium chlorid

Indikační zóny proužku se připraví postupným nanesením a vysušením obou impregnačnich roztoků na filtrační papír o gramáži 120 g/m . Při kontaktu zóny se vzorkem biologické kapaliny obsahujícím kys. močovou vzniká zbarvení úměrné koncentraci analytu ve vzorku.

močové v séru ml

U

1,5 g

V ml ml ml ml

0,35 g

1,2 g

0,2 g

Příklad 4

Reagenční proužky ke stanovení glukosy v krvi

Impregnační roztok I:

3,5,5,5-tetramethylbenzidin dihydrochlorid 12g

Dioktylsulfojantaran sodný 1g

Propylenglykoléter methylcelulózy (Klucel) 23g

Aceton 600ml

Ethanol 450ml

Destilovaná voda 200ml

Impregnační roztok II:

Citrátový pufr (pH = 5,3) 300ml

Glukosaoxidasa 105kU

Peroxidasa 200kU

Propylenglykoléter methyleelulóza (Pharmacoat 606) 25g

Impregnační roztok III.

Ethylcelulóza 7,g

Toluen 200ml

CS 270637 Bl ' 5

Impregnační roztoky I, II a III se postupně nanesou na filtrační papír o plošné hmotnosti 180 g/m s následným vysušením. Potom se reagenční papír rozřeže na čtverečky 6 x 6 mm a nalepí na podložku z umělé hmoty. Stanovení glukosy pomocí těchto proužků se provede tak, že na indikační zónu proužku se nanese kapka krve, která se po uplynutí inkuhační doby odstraní opláchnutím vodou. Vzniklé zbarvení proužku se vyhodnotí buď semikvantitativně srovnáním s barevnou kalibrační stupnicí, nebo reflektometricky. Proužky, uchovávané v dobře těsnicích obalech, jsou stabilní minimálně po dobu tří let. ·

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Analytický prostředek ke stanovení diagnosticky významných součástí biologických kapalin, které se pomocí specifických enzymových reakcí převádějí na své oxidační produkty, vyznačený tím, že jako stabilizační a/nebo separační činidlo obsahuje propylenglykoléter methyleelulózy obecné struktury I

   (i), kde R je H, CH^ nebo CHjCH(OH)CH₂, radikál, přičemž methoxyskupiny jsou substituovány s výhodou v 19 až 32 % a hydroxypropoxyskupiny ve 4 až 15 %.