CS270617B1

CS270617B1 - Analogy enkefalinu á způsob jejich přípravy

Info

Publication number: CS270617B1
Application number: CS88778A
Authority: CS
Inventors: Jan Ing Csc Pospisek; Tomislav Rndr Drsc Barth; Hana-Patricia Rndr Csc Maskova; Eva Rndr Anzenbacherova; Zanna D Dr Bespalova; Michail I Prof Dr Titov
Original assignee: Pospisek Jan; Barth Tomislav; Maskova Hana Patricia Rndr Csc; Eva Rndr Anzenbacherova; Zanna D Dr Bespalova; Michail I Prof Dr Titov
Priority date: 1988-02-08
Filing date: 1988-02-08
Publication date: 1990-07-12
Also published as: CS77888A1

Abstract

Předmětem řešení jsou nové analogy enkefalinu - odvozené od Dalarginu, s nekodovou aminokyselinou se stericky náročným po-; stranním řetězcem vzorce I L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-X-L-Arg (I), kde X = L-neopentylglycin (L-Neo) nebo X = D-neopentylglycin (D-Neo) a způsob přípravy těchto látek. Ten spočívá v tom, že koncový chráněný tripreptid se kondenzuje s C-koncovým tripeptidem obsahujícím D, L nepřirozenou aminokyselinu.. Hexapeptid se po odstranění chránící skupiny rozdělí vysokoúčinnou chromatografií na své diastereoizomery. Tyto látky-mají vyšší' opioidní účinky než Dalargin a derivát s D-Neo v pozici 5 má protrahovaný účinek.

Description

Řešehí pe týká syntetických analogů enkefalinu, opioidního pentapeptidu, který byl poprvé izolován a charakterizován Hugesem v roce 1975 (Huges J. et al., Nature 258, 577, 1975).

Oo současné doby byly připraveny řádově tisíce analogů enkefalinu. Řada syntéz byla motivována přípravou analogů se- zvýšenou afinitou -k různým populacím receptorů, zvýšenou selektivitou účinku a větší metabolickou stabilitou.'

Jedním z přístupů k syntéze je záměna přirozených aminokyselin stericky náročnými aminokyselinami, aí již 0- nebo L-formy, jež má za následek snížení počtu konfermeeí připravovaného peptidu.

V rámci tohoto výzkumu byly připraveny také analogy enkefalinu modifikované ·ν poloze 5. Do polohy 5 byl zaveden L-terc-leucin, který má objemový terč, butýlový postranní řetězec (Pospíšek J. a kol., Collection Czechoslov. Chem. Commun. 52, 1867, 1987).

Použití této nekódové aminokyseliny mělo za následek vyšší stabilitu k enzymovému ' 2 5 štěpení a 2 až 3x vyšší aktivitu při sledování opiátové aktivity než měl D-Ala · , Leu -enkefalin (Fauchere J.L., Petermann C., Chim. Acta 63, 824; 1980).

Práce byla zaměřena na obměnu pozice 5 ve známém účinném analogu enkefalinu Dalarginu, L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-L-Leu-L-Arg (Titov M.L. et al., Bull. Vsesoyuz. kardiolog. nauch. tsentr. AMN SSSR 2, 72, 1985). V této práci je přinášena syntéza analogu Dalarginu, (L-Neo$)Dalarginu a (D-Neo^)Dalarginu s uvedením struktury, ve kterých byl L-leucin nahrazen L-či D-neopentylglyclnem.

Předmětem vynálezu jsou nové analogy enkefalinu odvozené od Dalarginu s nekódovou aminokyselinou se sféricky náročným postranním řetězcem vzorce I L-Tyr-D-Ala-Gly-L-Phe-X-L-Arg, (I) kde X = D-neopentylglycin nebo L-neopentylglycin, a dále způsob výroby analogů enkefalinu odvozených od Dalarginu obecného vzorce 1, vyznačující se tím, že N-koncový tripeptid L-tyrosyl-D-alanyl-glycin chráněný tercbutyloxykarbonylovou skupinou se kondenzuje s C-koncovým tripeptidem L-fenylalanyl-D, L-neopentylglycyl-L-arginrinem a chráněný hexapeptid se po odštěpení chránící skupiny trifluoroctovou kyselinou rozdělí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na své diastereoizomery.

Látky připravené fragmentovou kondenzací tripeptidú byly nejprve čištěny chromatograf ií přes kolonu silikagelu. Po odštěpení chránící skupiny pomocí TFA byl výsledný produkt rozdělen preparativní chromatografií na C-18 na své diastereoizomery. Obě látky jsou □pioidně potentnější než Oalargin, přičemž D-forma vykazuje protrahovaný účinek.

Příklad 1 5 5 (L-Neo )-Dalargin a (D-Neo )-Dalargin

K roztoku 0,72 g (l,13mmol) p-nitrofenylesteru (o-tercbutyloxykarbonyl)-L-tyrosyl-D-alanyl-glycinu v 10 ml dimetylformamidu bylo za míchání přidáno 0,48 g (1,13 mmol) L-fenylalanyl-D, L-neopentylglycyl-L-argininu. Reakční směs byla míchána 24 hodin při laboratorní teplotě. Potom byl dimetylformamid odpařen ve vakuu a zbytek byl rozpuštěn v chloroformu a chromatografován přes kolonu silikagelu v soustavě chloroform-metanol (7:3).

CS 270617 Bl

Hlavní frakce byla odpařena ve vakuu k suchu a pevná látka byla překrystalována ze směsi etanol-eter·; Získáno bylo 0,86 g látky, tj. 73 %, b.t. 180 - 182 °C. Aminokyselinová analýza: Tyr: 1,06; Ala: 1,07; Gly: 1,06; Phe: 1,01; Neo: 1,00; Arg: 0,98.

Tercbutylozykarbonylová skupina byla odštěpfen^ obvyklým způsobem pomocí trifluoroctové kyseliny a po vyizolování bylo získáno 0,.6 g; tj. 96 % látky, která byla preparativní chromatografií (HPLC) na koloně silasorbu C-Í8 za využití gradientu (0 - 100%) metanol-voda rozdělena na dvě diastereoizomerní látky: (L-Neo³)-0alargin a (D-Neo³)-0alargin. ' .

• Aminokyselinové analýzy: ' (L-Neo^-Dalargin: Tyr: 1,00; Ala: 1,10; Gly: 1,19;

Phe: 0,99; Neo: 1,00; Arg: 0,92.

(D-Neo⁵)-0alargin: Tyr: 1,01; Ala: 1,02; Gly: 1,02;'

Phe: 1,01; Neo: 1,00; Arg: 0,98..

Příklad 2.

K testování derivátů Dalarginu byli použiti samci morčat o hmotnosti 200 - 300 g. Ze zvířat omráčených a zabitých zlomením vazu bylo ve vzdálenosti asi 7 cm od slepého střeva vyoperováno asi 8 cm ilea. Ze střeva byla opatrně oddělena vrchní mukózní vrstva a upevněna do testovací nádobky se živným roztokem provzdušňovaným pneumoxidem, který obsahoval v 1 litru: 120 mmol/1 NaCl, 5,9 mmpl/1 KC1, 15,4 mmol/1 NaHCOj, 1,2 mmol/1 NaH₂P0₄, 2,5 mmol/1 CaCl₂, 1,2 mmol/1 MgCl? a 2-g glukózy. Teplota média byla udržována na 33 °C. Mukózní vrstva ilea byla připevněna chirurgickou nití k magnetoelektrickému snímači kontrakcí, který byl připojen k registračnímu zařízení. Po 20 minutách bylo na platinové elektrody v nádobce přivedeno napětí o frekvenci 1 puls/10 s a amplitudě 8 V/l cm vzdálenosti mezi elektrodami .

Při testování (L-neopentylglycin³)-Dalarginu a (D-neopentylglycin³)-Dalarginu byl jako standard použit Dalargin. Z roztoku 1 mg/ml byly ředěním živným médiem připraveny řady ředění 10^ až 10^-3 mg/ml. Zmenšení kontrakcí ilea bylo měřeno v takovém rozmezí dávek, aby alespoň jedna dávka odpovídala větší a jedna menší inhibici než 50 %. Po každé dávce byla nádobka 3x vypláchnuta živným roztokem a další dávka byla podána až po ustálení kontrakcí na původní hladině před dávkou. Z vynesení závislosti velikosti kontrakcí na log dávky (mg) byla zjištěna dávka odpovídající 50 % inhibici, která byla přepočtena na příslušnou koncentraci látky označovanou jako IC^g (mol/1). Následující Tabulka I shrnuje IC₅₀ zjištěné pro Dalargin a jeho neopentylglycinové deriváty ze 6 nezávislých měření.

Tabu lkal

Hodnoty lO^g-pro Dalargin, (L-Neo³)-Oalargin a (D-Neo³)-Dalargin

Látka ' IC^g

Dalargin · ' 380 í 30 (L-Neo³)-0alargin ’ 20 i 7 (D-Neob-0alargin 85 - 10

CS 270617 Bl

Výsledky.ukazují na asi 4násobně vyšší biologickou aktivitu (D-Neo⁵)-Dalarginu a 20 x vyšší aktivitu (L-Neo^j-Dalarginu oproti Dalarginu. Kromě toho se při testování (D-Neo^)-Dalarginu projevil protrahovaný účinek látky. Při stejné dávce 2 x 10'^ mg byla doba odeznívání účinku D-formy dvojnásobná oproti L-formš.

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

1. Analogy enkefalinu odvozené od Dalarginu s nekódovou aminokyselinou se stéricky náročným postranním, řetězcem vzorce I ,

L-Tyr-D-Al-a-Gly-L-Phe-X-L-Arg, (I) kde X = D-neopentylglycin nebo L-neopentýlglycin
2. Způsob výroby analogů obecného vzorce I, podle* bodu 1, vyznačující se tím, že N-koncový tripeptid L-tyrosyl-D-alanyl-glycin· chráněný tercbutyloxykarbónylovou skupinou se kondenzuje s C-koncovým tripeptidem L-fenylalanyl-D, L-neopentylglycyl-L-argininem a chráněný hexapeptid se po odštěpení chránící skupiny trifluoroctovou kyselinou rozdělí vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií na své diastereoizomery.