CS269750B1 - Způsob imobilizace· proteinů - Google Patents

Abstract

Způsob imobilizace proteinů, například; enzymů a protilátek pro přípravu hetsrogen-j nich biokatalyzátorů, imunochemická stáno- i vení a afinitní chromatografií na organické! i anorganické nosiče obsahující hydroxylo- ’ vé, amino- nebo sulfhydrylové skupiny, vyznačující se tím, te se nosič aktivuje I působením perfluorovaného oleflnu, napří9' klad perfluorpropenu nebo perfluorcyklobutenu nebo fluorovaného dienu nebo polyénu např. perfluor-1, 3-butadienu nebo per1 fluorhexatrienu nebo 3-chlpr-nonafluor- -1,5-hexadienu, popřípadě za přítomnosti fluoridu draselného á na takto aktivovaný nosič se proteiny váží kovalentnl vazbou vytvořenou nukleofilní adicí svých skupin například sulfhydrylových nebo hydroxylových nebo aminoskupin a perfluorovanou dvojnou vazbu přítomnou na povrchů aktivovaného nosiče.

Description

Vynález se týká způsobu imobilizace proteinů, například enzymů a protilátek pro přípravu heterogenních biokatalyzátorů, imunochemická stanovení na pevné fázi a afinitní chromatografii.

Pro přípravu imobilizovaných proteinů pro uvedené účely byla vypracována řada postupů, založených převážná na různých formách fixace bílkovin na vhodných nosičích. Problematika imobilizace enzymů obecné použitelná i pro jiné bílkoviny je podrobně popsána v mnoha monografiích a přehledných článcích, například Chibata I.: Imobilized Enzymes. Research and Development, Kodansha, Tokyo (1978), Goldstein L., Manecke G.: The chemistry at enzyme Immobilization, Applied Biochemistry and Bioengineering, Academic Press, New I

York (1976), Wiseman A.: Handbock of enzyme biotechnology. Ellis Horwood, Chichester (1975), Káš J., Marek M., Valentová O.s Imobilizované enzymy. (Principy imobilizace, vlastnosti a použití imobilizovaných enzymů), Mikrobiální technologie, Academia Praha * (1988), Marek M., Káš 3.: Techniky imobilizace enzymů kovalentní vazbou, Chem. průmysl 34, 337 (1984). .

Nejjednodušším způsobem imobilizace bílkovin je jejich sorpce na různé druhy nosičů. Sorpční síly, které drží bílkovinu na povrchu nosiče jsou však v mnoha případech poměrné slabé a imobilizace je proto mnohdy nedostatečná. Z těchto důvodů se velmi často kombinuje sorpce s následným překřížením bílkovin na povrchu nosiče pomocí bifunkčních činidel.

Nejvíce propracovanou technikou imobilizace bílkovin je jejich navázání kovalentní vazbou na aktivovaný nosič obsahující reaktivní skupiny^ které vytvářejí kovalentní vázby s vhodnými skupinami imobilizované bílkoviny. K chemické vazbš enzymů nebo i jiných bílkovin na nerozpustné nosiče lze využít celé řady funkčních skupin obsažených v bílkovinné části molekuly enzymu, tj.t Λ- a č-aminoskupiny, áG,/)-karboxylové skupiny, sulfhydrylové skupiny cysteinu, aromatické kruhy tyrosinu a tryptofanu, imidazolové skupiny histidinu a hydroxylové skupiny šeřinu, threoninu a především tyrosinu.

K základním typům reakcí využívajících uvedených funkčních skupin k imobilizaci bílkovin patří tvorba amidové vazby, alkylační metoda, diazotační metoda, substituční reakce thiol - disulfid, tvorba Schiffových basí, využití reaktivních isonitrilů především ve spojení s Ugiho reakcí atd.

Výběr imobilizační techniky úzce souvisí s vlastnostmi použitého nosiče a s účelem, pro který má být ímobllizovaný enzym nebo jiná nevázaná bílkovina použita. Obecně proto nelze určitý způsob imobilizace označit jako nejvhodnější a jiné jako nevyhovující. Volba druhu nosiče i způsobu imobilizace je v rozhodující míře determinována způsobem apli- ^x kace, pro který jsou enzymy nebo jiné bílkoviny imobilizovány.

Další navržený způsob imobilizace proteinů, například enzymů a protilátek podle vynálezu spočívá v tom, že se nosič obsahující hydroxylové, amino- neboósulfhydrylové skupiny aktivuje působením perfluorovaných olefinů, například perfluorpropenu, perfluorbutadienu, perfluorcyklobutadienu, popřípadě za přítomnosti fluoridu draselného. Na takto aktivovaný nosič se potom neváže bílkovina kovalentní vazbou prostřednictvím svých skupin schopných nuklsofilní adice na perfluorovaný olefin navázaný na nosič.

Výhoda způsobu imobilizace enzymů, protilátek a jiných bílkovin podle vynálezu spočívá především v pevnosti vytvořené kovalentní vazby a v možnosti imobilizace bílkovin na nosiče, které nevykazují výrazné sorpční vlastnosti, například na vnitřní stěnu skleněných kapilár nebo trubiček a podobně.

Vynález je dokumentován příklady, aniž by se jimi omezoval.

CS 269 750 81

Příklad 1

K 1 g porézního skla umístěného v skleněné ampuli byly přidány 3 ml nasyceného roztoku bezvodého fluoridu draselného v acetonu a po odplynění na vakuové lince bylo přidáno 0,44 g hexafluor-l,3-butadienu. Ampule byla zatavena a ponechána intenzívně třepat 50 h. Po otevření a odpaření nezreagovaného dienu bylo modifikované sklo zdekantováno v acetonu a zbytky acetonu byly odstraněny na vakuové odparce.

K 200 mg aktivovaného porézního skla bylo přidáno 10 mg -chymotrypsinu v 5 ml 0.1 M Tris-HCl pufru pH 7,8 obsahujícím 60 % dimethylsulfoxidu. Po 16 h třepání při 4 °C byl konjugát s imobilizovaným -chymotripsinem odsát, promyt střídavě tímto pufrem a 1 M NaCl v tomtéž pufru. Získaný konjugát vykazoval aktivitu 1 ^ukat na 1 g vlhkého nosiče (jako substrát byl použit methylester N-acetyl-L-phenylalaninu).

*

Příklad 2

Směs 3,8 g polysacharidu Sephadexu §-200, 4 g perfluorcyklobutanu a 0,3 g fluoridu draselného v 8 ml absolutního acetonitrilu byla zpracována shodným postupem jako v příkladu 1.

K 200 mg aktivovaného nosiče v 5 ml 0.1 M fosfátovém pufru pH 7,2 bylo přidáno 10 mg glukosooxidasy a 5 yul katalasy a směs byla třepána 16 h při 4 °C. Potom byla směs zfiltrována. Získaný heterogenní biokatalyzátor po důkladném promytí střídavě 0.1 M fosfátovým pufrem pH 7,2 a 1 M NaCl v tcmto pufru vykazoval glukosooxidasovou aktivitu 0,341 yukat/l g vlhkého konjugátu.

Příklad 3

Směs 1 g glycidylmethakrylátového polymeru nodifikovaného 1,6-diaminohexanem a 0,6 g perfluorhexatrilenu v 3 ml absolutního acetonitrilu byla zpracována shodným způsobem jako v příkladu 1.

K 200 mg aktivovaného nosiče v 5 ml 0,1 M fosfátovém pufru pH 7,2 bylo přidáno 5 yul katalasy a směs byla třepána 16 h při 4 °C. Shodným postupem jako v příkladu 2 byl získán konjugát vykazující katalasovou aktivitu 5 /Ukat/g vlhkého nosiče.

J Příklad 4

Vnitřní stěna skleněných trubiček, respektive kapilár byla aktivována protékajícím i roztokem 3-chlor-nonafluor-l,5-hexadienu v acetonu nasyceném bezvodým fluoridem draselným. Po promytí acetonem s 0,1 M fosfátovým pufrem pH 7,2 byla na vnitřní stěnu imobilizována glukosooxidasa protékající trubičkou, respektive kapilárou v koncentraci 400 mg enzymu v 10 ml 0,1 M fosfátového pufru pH 7,2. Po promytí shodným pufrem byly trubičky, respektive kapiláry s navázanou glukosooxidasou použity pro stanovení glukosy ve formě průtokové reakční elektrody ve spojení s kyslíkovým článkem Clarkova typu.

Claims (1)

1. Způsob imobilizace proteinů, například enzymů a protilátek pro přípravu heterogenních biokatalyzátorů, imunochemická stanovení a afinitní chromatografii na organické i anorganické nosiče, obsahující hydroxylové amino nebo sulihydrylové skupiny, vyznačující se tím, že se nosič aktivuje působením perfluorovaného olefinu, například perfluorpropenu nebo perfluorcyklobutanu nebo fluorovaného dienu něco polyenu například perfluor-1,3-butadienu nebo perfluorhexatrienu neoo 3-chlor-nonafluor-1,5-hexadienu, popřípadě za přítomnosti fluoridu draselného, a na takto akt lvova-’v nosič se enzymy,

   CS 269 750 Bl protilátky nebo jiná bílkoviny imobilizují kovalentní vazbou vytvořenou nukleofilní' adicí svých skupin například sulfhydrylových nebo hydroxylových nebo aminoskupin, na perfluorovanou dvojnou vazbu přítomnou na povrchu aktivovaného nosiče.