CS269551B1 - Spósob izolécie urikézy z biologických ; materiálov - Google Patents

Description

CS 269551 B1 1

Vynález sa týká nového eposobu izoláclo a člstenla enzýnu urlkázy (EC 1.7d&3.)v priomyselnej výroba, ktorý využívá existanclu lzoalaktrlckáho bodu tohoto enzýoufíakokritéria jeho čletoty.

Podle doterajálch postupov ea urlkáza čistila nlekolkýal pochodni, zahrňujáclaizrážanle slrenoa amonným, etanolon, acetónom, Sálej roznyal systémem! gélovej e ionto-nenlčovej chronatografle ČI elektroforázou v rázných ueporladaniach. Ich společnou ne-výhodou bola prácnost, náročnost na vybavenle, prlčon čistota enzýnu bola na úrovni zne-sl bielkovin přibližné rovnakej nolekulovej hnetnoati, kde podstatná část tvořil enzýa,ala obsah přinesl bol + 5 až '10%. Tleto balastnó bielkoviny znižujú mernú aktivitu asposobujú aj iná vedloJíle efekty, ako postupnú degradáciu lzolátu. V našich vynálezoch CS AO 211 856 a 234 801 sa chrání principiálně nový apósobdelenia a člstenla látok na základe ich izoelektrickáho bodu spósobon sanočinnej lzo-elektrickej fokusácle pósobenlm jednosměrného elektrického prúdu v rovnorodou roztokudelsnej látky, ktorý je mechanicky stabilizovaný, ako sj jednoduché zarladenle nauskutočňovanle tohoto spósobu.

Vyšáie oplsané nedostatky doterajálch člatlaclch a lzolačných postupov v podstst-nej nlere odstraňuje vynález, kterého podstata spočívá v ton, že vodivost biologickéhoaaterlálu, ktorý obsahuje urlkázovú aktivitu, ultrafiltráciou, alebo dlalýzou upravína hodnoty 100 až eOO^S.cn"^ a obsah blelkovln sa uprav! na.hodnoty 1 až 30 g.l-1.Roztok sa potom autofokusuja Jednosměrným elektrickým prúdom prl napatí 200 až 1 000 Ve příkone 3 W a roztok e nejvyááou aktivitou, s výhodou prl pH 10,3 až 11,1 sa izolu-je a podrobí deliacaj techniko využlvajúcej ako kritérium rozdlelnu molekulová hmot-nost dělených látok, s výhodou gálovú chronatografiu, prlčon v závislosti na požadova-naj čistoto sa Jedna alebo obe dellace techniky opakujů aspoň Jedenkrát.

Vynález ja vhodný pra zlskavania superčistej urlkázy v technologicko» meradleprl výrobo tohoto enzýnu pre potřeby klinickaj biochénia a iné odvetvia. Přiklad č. 1

Kultúra kvaeinlek Candia utllls sa podrobí odstredenlu pri 0°C a získaná bloaasasa homogenlzuje sonlkáciou. Honoganát sa znova odstředí a supernatant homogenátu buniek.C. utilis sa narledl borátevým tlmivýa roztokou pH 8,5 a iontovéj sily 0,01 nol.l“^obsahujúcin sodná a borátové ionty stabilizujůco aktivitu urlkázy tak, aby vodivostroztoku po nariedenl na objen autofokusačnej aparatúry bola v rozmadzl 100 až 800cn-\ Hrubé množstvo blelkovln v tomto roztoku má byt v roznedzi 1 až 30 g.l“^. Tentoroztok surového enzýnu ea aplikuje do autofokusačnej aparatúry, ktorá sa napojí nazdroj jednosaorného prúdu tak, aby súčln prddu a napatla neprsslahol 3 W pri 4°C.

Proces autofokusácla js ukončený, ked prúd klesne prl napatí 1 000 v na nulu. V auto-fokusačnej aparatúre sa vytvoří stupajúco rozhranle pH v každej pracovnej komorke odanody ku katoda. Urlkáza ea nachádza vo frakclách s pH medzi 10,3 až 11,1. Obsah koaó-rok a uvedeným pH sa zjednoti a podrob! gélovej chronatografli na štipci molekulovéhosíta Spheron P-40 roznerov 80 x 5 cm, ekvilibrovanú tlnlvým roztokom oplssným vyáále.Chromatogrefia sa uskutečňuje pri prietoku 120 nl.h“^ a 10 nllltrové frakcle sa zhro-mažSujú automatickým zberačom frakcll. Čistá urlkáza sa nachádza ve frakcll spomedzidvoch vrcholov v tom, ktorý má nižáiu molekulová hmotnost. Oednotllvé kroky člstenlamožu byt opakované podlá potřeby stupňa čistoty. Přiklad č. 2

Kultúra baktérii Aaperglllue nlger sa podrobí odstredenlu a získaná biomasa sahoaogenizuje dezlntegráciou balotlnou. Získaný homogenát sa znovu odstředí a supernatanthomogenátu buniek A. nlger obeahujúci urlkázovú aktivitu sa nariedi Britton-Robineono-

Claims (1)

1. 2 CS 269551 ΒΓ vým unlverzálnya tlaivýa roztoko» iontovej olly Ο',,ΟΙ mol.l-^ a pH 8,69 tak, aby vodi-voaf zriodeného hoeogonétu po nariodenl na objea autofokusačnej aparatury bolav roz-medzi 100 až 800 a*S.cb-^ a obeah blalkovln v rozaedzl 1 až 30 g.l”\ Ďaléie čiatonlaautofokueúciou aa daje podlá přikladu &. 1. Oelenie gólovou chroaatograflou aa uaku-točňuje na atlpci aolekulového eita Sephadex 6.100 rozaerov 42 x 2 ca totožnýn tlalvýaroztokoa pri prietoku 100 al.h-^ a odoberajú aa 5 al frakcia. Slátá urikáza aa opat nachádza vo frakcli a nižáou aolekulovou haotnoafou apoaadzi dvoch vrcholov. Přiklad i. 3 Kultura aikrobiálnaho kaoňa Alternarla species sa podrobí odstredeniu a získanábioaaaa sa dezintegruje aatódou prudkého ochladenia spojeného a vysoký* tlakoa v za-riedenl pósobenia střižných sil (X-prese). Hoaogenát aa znova odstředí a ilry auperna-tant hoaogenátu bunlek A. species aa narledl Kolthoff-Vleeschouverovýa tlalvýa rozto-koo lontovej atly 0,015 aol.l-1 a pH 8,4, ktorého aodná, draselná borátová e fosfátovéionty prlepievajú k stabilizácii enzýau. Úprava vodivosti, autofokusácia a oatatnékroky člatenla aa opakujú ako v bode 1. Přiklad č. 4 Kultúra kvaelnlek Candida albicans aa podrobí odatredovanlu a oatatnýa procedu-rám po autofokuaáciu ako v přiklade δ. 1. Po zjednotenl obsahu koaorok a pH 10,3 až11,1 sa roztok podrobí ultrafiltrácil ayatéaoa AM1C0N tak, aby bolí všetky zložkys aolekulovou haotnoatou cez 30 000 koncentrované. Potoa sa koncentrát podrobí daláejultrafiltrácil usporiadanej tak, že filtre prlsluSnej kvality eliminuje do filtrátuváetky zložky a molekulovou haotnoafou pod 40 OOO. K«3že urikáza z kvaelnlek C. albi-cans aá molekuloví} hmotnosf 34 000 týa dochádza k jej vyčisteniu. PREDMET VYNÁLEZU Spoaob izolécia urikézy z biologických aateriélov vyznačujúcl sa týa, ža sadlalýzou, alebo ultraflltréciou upraví vodlvoaf biologického materiálu na 100 až800 /iS.cn"1 a obaah blalkovln na 1 až 30 g.l"1 a roztok s enzymatickou aktivitou sapotoa autofokuauje Jednosaernýa elektrický* prúdoa pri napětí 200 až 1 000 V, pokialprúd neklesne na nilu a raztok s najvySSou enzymatickou aktivitou, a výhodou pri pH10,3 až 11,1 aa izoluje a podrobí dellacej techniko využivajúcej rozdielnu aolekulovúhaotnoaf dělených látok, s výhodou gálovú chroaatografiu, pričoa v závislosti na poža-dovanej čistotě aa Jedna alebo obe deliace techniky opakujú aspoň Jedenkrát.