CS269399B1

CS269399B1 - Method of albumin's selective discharge determination standardization from blood serum solution

Info

Publication number: CS269399B1
Application number: CS885051A
Authority: CS
Inventors: Stanislav Mudr Turek; Josef Prof Mudr Drsc Hyanek
Original assignee: Stanislav Mudr Turek; Josef Prof Mudr Drsc Hyanek
Priority date: 1988-07-14
Filing date: 1988-07-14
Publication date: 1990-04-11
Also published as: CS505188A1

Abstract

Způsob standardizace stanovení selektivního vypadávání albuminu z roztoku krevního séra v ústrojném roztoku při pH 3,9 až 4,5 spočívá v tom, že se srážení albuminu provádí v přítomnosti 0,0001 až 0,1 molu sloučeniny dvojmocné mědi na 1000 mlQreakčního roztoku při teplotě 0 až 54UC. Selektivní vypadávání albuminu se používá k laboratornímu vyšetřová ní pacientů, nemocných zánětlivými a degenerativními chorobami, u nichž vypadá vání albuminu probíhá pomaleji a v men ším množství než u zdravých lidí.Method of Standardization of Selective Determination albumin loss from solution blood serum in organic solution at The pH of 3.9 to 4.5 is that of precipitation albumin is performed in the presence of 0.0001 up to 0.1 mole of the divalent copper compound 1000 ml of reaction solution at temperature 0 to 54UC. Selective albumin loss is used for laboratory examination inflammatory and degenerative patients diseases he looks like albumin occurs more slowly and in men more than healthy people.

Description

CS 269 399 B1 1EN 269 399 B1 1

Vynález spadá do oblasti lékařských laboratorních vyšetřování krevního séra. Řešena je standardizace stanovení selektivního vypadáváni albuminu z roztoku krevníhoséra (Turek S.: Schopnost selektivní flokulace albuminu krevního séra u jaterních cho-rob. Čs. Gastroent. Výž., 42, 1988, s. 215 až 216), známé též pod názvy albuminovázákalová a albuminová vločkovací reakce krevního séra (Turek S.: Albumin TurbidityReaction of Blood Sérum. Z. kliň. Chem. kliň. Biochem., 5, 1967, s. 187 až 188. -Turek S.: Albuminová vločkovací reakce krevního séra, Čas. Lék. čs., 118, 1979, s.89až 90). Selektivním vypadáváním albuminu se rozumí flokulace albuminu z roztoku krev-ního séra v ústrojném roztoku s obsahem vsolovací koncentrace sole při pH 3,9 až 4,5,zatímco sérové globuliny zůstávají v roztoku. Tato reakce je urychlována záhřevem roz-toku na teplotu 30 až 54 °C. Rychlost vypadávání albuminu, intenzita zákalu roztokuaž flokulace albuminu, jsou dále závislé na látkovém složení a iontové síle reakčníhoroztoku a nepřímo závislé na stupni zředění séra při reakci. Za stejných reakčníchpodmínek je však selektivní vypadávání albuminu z roztoku séra signifikantně méně in-tenzívní u sér lidí nemocných zánětlivými nebo degenerativními chorobami, a to v závis-losti na intenzitě, případně rozsáhlosti, patologického procesu. Tento jev je proto vy-užitelný v klinické diagnostice a prognostice.The invention is in the field of medical laboratory testing of blood serum. Standardization of the determination of selective albumin elimination from blood-brain solution is solved (Turek S .: Ability to selectively flocculate blood serum albumin in liver tumors. Cs. Gastroent. Ed., 42, 1988, pp. 215-216), also known as albumin and albumin flocculation reaction of blood serum (Turek S .: Albumin TurbidityReaction of Blood Serum Z. Chem. Chem. Biochem., 5, 1967, pp. 187-188. -Turek S .: Albumin Flaking Reaction of Blood, Time Chem., 118, 1979, pp. 89-90). By selective albumin loss is meant flocculation of albumin from a solution of blood serum in a buffer solution containing a salt concentration at pH 3.9 to 4.5, while serum globulins remain in solution. This reaction is accelerated by heating the solution to 30-54 ° C. The rate of albumin decay, turbidity of the albumin flocculation solution, are further dependent on the material composition and ionic strength of the reaction solution and, indirectly, the degree of dilution of the serum in the reaction. However, under the same reaction conditions, the selective albumin solution of serum solution is significantly less intense in sera of people suffering from inflammatory or degenerative diseases, depending on the intensity or extent of the pathological process. This phenomenon is therefore useful in clinical diagnosis and prognosis.

Dosud popsané způsoby tohoto stanovení však nepřihlížejí k rušivým katalytickýmvlivům stopových nečistot kovů, jmenovitě mědi, na výsledky reakce. Obsah těchto stopo-vých nečistot v činidlech kolísá podle různých způsobů přípravy čisté vody, podle použi-tí různých šarží chemikálií a různého materiálu k odběru krevních vzorků. Proto dosudpopsané způsoby stanovení nezaručují dostatečnou míru opakovatelnosti, zejména prosrovnání výsledků, dosažených na různých pracovištích nebo v delších časových odstupechna tomtéž pracovišti.However, the methods of this method described so far do not take into account the disturbing catalytic effects of trace metal impurities, namely copper, on the reaction results. The content of these trace impurities in the reagents varies according to different methods for the preparation of pure water, depending on the use of different lots of chemicals and different blood sampling materials. Therefore, the methods of determination described so far do not guarantee a sufficient degree of repeatability, in particular the comparison of results achieved at different workplaces or at longer time intervals to the same workplace.

Uvedené nevýhody odstraňuje standardizace stanovení selektivního vypadávání albumi-nu z roztoku krevního séra při pH 3,9 až 4,5 podle vynálezu, který spočívá v tom, že sesrážení provádí v přítomnosti 0,0001 až 0,1 molu sloučeniny dvojmocné mědi na 1 000 mlreakčního roztoku, při teplotě 0 až 54 °C.The above drawbacks are overcome by the standardization of the determination of the selective release of albumin from a blood serum solution at pH 3.9 to 4.5 according to the invention, characterized in that the precipitation is carried out in the presence of 0.0001 to 0.1 mole of the divalent copper compound per 1000 ml of the reaction solution, at 0-54 ° C.

Tato koncentrace činí vliv stopových kvant kovových nečistot reakčních roztoků zce-la zanedbatelný. Tím jsou eliminovány možnosti chyb ze stopových katalyticky účinných ne-čistot a je dosaženo dostatečné opakovatelnosti stanovení. Zároveň skýtá přídavek mědnatésole výhody katalyticky řízené reakce. Reakce selektivního vypadávání albuminu z roztokuséra, katalyzovaná přídavkem dvojmocné mědi, probíhá rychleji než bez přídavku. Protoje možno použit i nižších reakčních teplot než dosud použitých, tj. i teplot v rozsahu0 až 30 °C. K měření výsledků stanovení lze používat nejen měřeni zákalu roztoku nebokvantity bílkovinného flokulátu, jako dosud, ale i měření času, potřebného ke tvorběa sedimentaci flokulátu. Katalytické urychlení reakce je přímo úměrné kvantu přidanésloučeniny dvojmocné mědi. Přídavek mědnaté sole do reakčního roztoku umožňuje standar-dizaci metodických postupů. Přídavku mědnaté sole je možno použít v rozsahu koncetrace0,0001 až 0,1 mol/1000 ml reakčního roztoku. Lze použít síran nebo chlorid nebo bro-mid nebo dusičnan nebo octan mědnatý anebo citronan mědnato-amonný nebo vinan mědnato-draselný.This concentration makes the effect of trace amounts of metal impurities in the reaction solutions negligible. This eliminates the possibility of errors from trace catalytically effective impurities and provides sufficient repeatability of the assay. At the same time, the addition of copper (II) provides the benefits of a catalytically controlled reaction. The reaction of selective albumin depletion from solution sera, catalysed by the addition of divalent copper, proceeds faster than without addition. Therefore, lower reaction temperatures than previously used, i.e. temperatures ranging from 0 to 30 ° C, may also be used. Not only can the measurement of the turbidity of the solution or the quality of the protein flocculant be used to measure the assay results, but also the measurement of the time required for the formation and flocculation of the flocculate. The catalytic acceleration of the reaction is directly proportional to the quantity of the added divalent copper compound. The addition of copper salt to the reaction solution allows standardization of methodologies. The addition of the copper salt can be used in a concentration range of 0.0001 to 0.1 mol / 1000 ml of the reaction solution. Sulphate or chloride or copper bromide or nitrate or acetate may be used, or copper ammonium citrate or copper potassium tartrate.

Jako ústrojné roztoky při použití katalýzy sloučeninou dvojmocné mědi jsou vhodnépufry citrátové a octanové pufry. U octanových pufrů je nutná přísada síranu sodnéhonebo síranu amonného ve vsolovací koncentraci. Místo octanových pufrů lze použít ipufry mravenčanové nebo jantaranové. Lze použít koncentrace pufrů v rozsahu 0,025 až0,5 mol/1 000 ml, koncentrace přidávané sole rovněž v rozsahu 0,025 až 0,5 mol/1 000ml. Použitelné rozmezí aktuální koncentrace vodíkových iontů reakčních roztoků je vrozsahu pH 3,9 až 4,2. Poměr zředění séra reakčním roztokem je v rozmezí 1 : 5 až1 : 500. Reakční teplotu lze použit v rozsahu 0 až 54 °C. Doba reakce, potřebná pro 2 CS 269 399 B1 dosažení výsledků, činí podle ostatních reakčních podmínek 5 sec až 24 hod. Měření vý-sledků reakce je možné známými postupy turbidimetrickými nebo nefelometrickými. Při mě-ření výsledků flokulační reakce se měří čas v minutách, za který se vytvoří nepfůhled-ný sediment vyvločkovaného albuminu; přitom se vizuálně hodnotí objem sedimentovanéhoflokulátu anebo lze použít stanoveni bílkoviny v odstředěném sedimentu známými postupy -polarografickým, fotometrickým či kolorimetrickým. Příklad 1 Činidla: X. Citrátový nárazník 0,2 mol/1 000 ml, pH = 4,0 .: 25,010 g kyseliny ci-trónové (monohydrát) p. a. a 23,808 g citronanu sodného normálního (trihydrát) p. a.se rozpustí v destilované a deionizované vodě, doplní se na cca 950 ml, přidá se 0,5 mlchloroformu p. a., dobře se promíchá a za kontroly, případně úpravy pH se doplní na ob-jem 1 000 ml. Roztok se zfiltruje papírovým analytickým filtrem. Připravuje se nejdéleza 1 měsíc čerstvý. II. Mědnaté činidlo: ve 180 ml roztoku I. se rozpustí 0,300 g síranu mědnatého(pentahydrát) p. a. a doplní se na objem 200 ml tímtéž roztokem. Promíchá se.Citric acid and acetate buffers are suitable as buffers using copper (II) catalysis. Acetate buffers require sodium sulfate or ammonium sulfate to be added at the concentration. Formate or succinate ipufra can be used instead of acetate buffers. Buffer concentrations in the range of 0.025 to 0.5 mol / 1000 ml can be used, the concentration of the added salt also in the range of 0.025 to 0.5 mol / 1000 ml. The applicable range of actual hydrogen ion concentration of the reaction solutions is in the range of pH 3.9 to 4.2. The serum dilution ratio of the reaction solution is in the range of 1: 5 to 1: 500. The reaction temperature can be used in the range of 0 to 54 ° C. The reaction time required for the results is, according to the other reaction conditions, 5 sec to 24 h. The reaction results can be measured by known turbidimetric or nephelometric techniques. When measuring the results of the flocculation reaction, the time is measured in minutes, after which an opaque sediment of flocculated albumin is formed; in this case, the volume of the sedimented pellicle is visually evaluated or the determination of the protein in the centrifuged sediment can be used by known procedures - polarographic, photometric or colorimetric. Example 1 Reagents: X. Citrate buffer 0.2 mol / 1000 ml, pH = 4.0: 25.010 g of citric acid (monohydrate) pa and 23.808 g of sodium citrate normal (trihydrate) dissolve in distilled and deionized water, make up to about 950 ml, add 0.5 ml of chloroform pa, mix well and make up to 1000 ml with control and, if necessary, pH adjustment. The solution is filtered through a paper analysis filter. It is prepared for a maximum of 1 month fresh. II. Copper reagent: dissolve 0.300 g of copper (II) sulphate (pentahydrate) p. A in 180 ml of solution I. and make up to 200 ml with the same solution. It mixes.

Provedení: Do zkumavek se odměří po.0,075 ml krevního séra, přidá se po 2,50 mlčinidla I., promíchá se, přidá se po 0,50 ml činidla II. a opět se promíchá. Zkumavkyse postaví do vodní lázně temperované na 37 - 0,1 °C na dobu 60 min. Pak se zkumavkyvyjmou z vodní lázně, zevně se osuší a nechají se stát 15 min. Potom se změří intenzitazákalu roztoku proti slepé zkoušce, obsahující vodu místo séra. Při turbidimetrickémměření v kyvetách 1 cm délky na spektrofotometru při vlnočtu 16 x 1 000 cm je prů-měrná hodnota zdánlivě absorbance u zdravých lidí 0,980 se střední kvadratickou odchyl-kou í 0,180. Séra lidi nemocných dávají hodnoty nižší než 0,450. U nemocných závažnýmichorobami jsou hodnoty nižší než 0,300, v těžkých patologických případech nižší než0,100. Opakovatelnost výsledků, zjištěná výpočtem podle testu párových hodnot z výsled-ku duplicitních vyšetření je v rozmezí - 5 %. Příklad 2 činidla: 1. Octanový nárazník 0,2 mol/1 000 ml podle Walpolea, s obsahem síranusodného v koncentraci 0,3 mol/1 000 ml, pH roztoku = 4,0 : 820 ml 0,2 mol/1 000 mlkyseliny· octové čistoty p. a. se doplní na objem 1 000 ml roztokem 0,2 mol/1 000 mloctanu sodného p. a. Pak se ve 450 ml ro.ztoku rozpustí 21,3062 g síranu sodného bezvo-dého p. a. a za kontroly, případněúpravy pH na 4,0 se doplní na objem 500 ml. Připravujese hejdéle za 1 měsíc čerstvý. 2. Mědnaté činidlo: 5,2 g síranu mědnatého pentahydrátu p.a. se rozpustí v cca90 ml činidla 1 a doplní se tímtéž roztokem na 100 ml a promíchá se.Performance: Measure 0.075 ml of blood serum into the tubes, add 2.50 ml of Reagent I, mix, add 0.50 ml of Reagent II. and mix again. Place the tubes in a water bath at 37 - 0.1 ° C for 60 min. Then they are removed from the water bath by means of a tube, dried externally and left to stand for 15 min. Thereafter, measure the intake of the solution against the blank, containing water instead of serum. In turbidimetric measurements in cells of 1 cm length on a 16 x 1000 cm spectrophotometer, the apparent apparent absorbance in healthy humans is 0.980 with a mean square deviation of 0.180. Sera of people sick give values below 0.450. In patients with severe diseases, the values are less than 0.300, in severe pathological cases less than 100. The repeatability of the results, as calculated by the pairwise test results from duplicate test results, is in the range of - 5%. Example 2 Reagents: 1. 0.2 Mole / 1000 mL Acetate Buffer by Walpolea, with 0.3 M Sodium Sulphate / 1000 mL, Solution pH = 4.0: 820 mL 0.2 M / 1000 mL Acid Of acetic acid AR and make up to 1 000 ml with 0.2 mol / 1000 sodium sodium acetate solution. Then dissolve 21,3062 g of anhydrous sodium sulphate in 450 ml of water and adjust to pH 4, if necessary. 0 is made up to 500 ml. Ready for a month in fresh fresh. 2. Copper reagent: 5.2 g of copper (II) sulfate pentahydrate p.a. Dissolve in approximately 90 ml of Reagent 1 and make up to 100 ml with the same solution and mix.

Provedení: do zkumavek o vnitřním průměru 12 mm se zaobleným dnem se odměří po0,075 ml krevního séra a přidá se po 2,0 ml činidla 1, promíchá se a přidá se po 0,25ml činidla 2. Promíchá se. Zapne se časoměřič a zkumavky se postaví do vodní lázně tem-perované na 37 - 0,1 °C na dobu .20. min.Pak se zkumavky vyjmou z vodní lázně, zevněse osuší a postaví se v jedné řadě do suchého stojanu. Pozoruje se vizuálně tvorbaflokulátu albuminu a sedimentao&flokulátu, průhledem roztoků ve zkumavkách proti oknunebo osvětlovacímu tělesu. Měří se čas v minutách od přidání mědnatého činidla do vy-tvoření neprůsvitné, nahoře zřetelně ohraničené vrstvy sedimentu a posuzuje se téžkvantita sedimentovaného řlokulátu. Séra zdravých lidí vytvoří neprůsvitný sediment,vyplňující celé zaoblené dno zkumavky, nejpozději do 50. min od přidání mědnatého či-nidla. Vytvoří-li se takovýto sediment mezi 50. a 55. minutou od přidání mědnatéhočinidla do reakčního roztoku, dává tento výsledek podezření na onemocnění. Vytvořeníuvedeného sedimentu po 55. min je patologickým příznakem. Séra lidí nemocných závažnouchorobou vytvářejí zákal roztoku s tvorbou sedimentu až po 100 min. U nejtěžších pato-logických případů se vytvoří jen opalescence roztoku, nezakalující se ani během 120 min.Execution: Measures 0.075 ml of blood serum into 12 mm round-bottomed tubes with a round bottom and add 2.0 ml of Reagent 1, mix and add 0.25 ml of Reagent 2. Mix. The timer is turned on and the tubes are placed in a water bath at 37 - 0.1 ° C for a period of .20. Then the tubes are removed from the water bath, dried outside and placed in a row in a dry rack. Visually, the formation of albumin and sedimenta & flocculate flocculants is observed, through the solutions in the tubes against the window or light body. The time in minutes from the addition of the copper reagent to the formation of an opaque, clearly defined layer of sediment is measured, and also the quantum of the sedimented flocculant is assessed. The sera of healthy humans form an opaque sediment, filling the entire rounded bottom of the tube, no later than 50 minutes after the addition of copper oxide. If such a sediment forms between 50 and 55 minutes after the addition of the copper (II) reagent to the reaction solution, this results in suspected disease. Creating sediment after 55 min is a pathological symptom. Sera of people suffering from severe disease create a turbidity of the solution with sediment formation after 100 min. In the most severe pathogenic cases, only opalescence of the solution is formed, not even turbid within 120 minutes.

Claims

The differences in the behavior of sera of healthy and sick people are clear. Also, the formation of a strong entrapment solution that appears to be delayed in the formation of the bounded non-transparent sediment is always a pathological symptom. The reaction solution should be observed mainly for 50 to 60 min. and then in 100 to 120 min. Example 3 Reagents: Reagent 1. and Reagent 2. are the same as in the Example

2. Embodiment: Initially, proceed as in Example 2, except that the tubes are left in a water bath not 20 but 30 min. The tubes are then allowed to stand at room temperature for 15 min. The solutions in the tubes are then centrifuged for 15 min at 1500 x g. The supernatant is discarded and the sediment tubes are left to stand for 15 min on the pulp layer. Then the protein sediment is dissolved in 1.5 ml of 2M ammonia / 1000 ml solution, 3.0 ml of distilled water is added and mixed. From this solution, 0.25 ml is metered into another tube and 4.0 ml of Brdick's cobaltic polar solution is added. The solution is examined by a classical polarographic method from - 0.8 to 1.8V. Brdick's protein polarographic wave is recorded, subtracting the intensity of the catalytic current at the top of the curve and recalculating it to the area of the mercury drop. In this procedure, caustic humans gave values ranging from 10.5 to 17.5 A / m 2. Sera of humans showed patients in the range of 0 to 8.5 A / m 2. Repeatability of the results of the method, calculated by the test of paired values from the results of duplicate examinations, is a sensitive indicator of the pathological process and its intensity in inflammatory diseases of both bactrian and viral origin, in disease-traumatic, in polyserositis , in immune regulation disorders, in inflammatory and degenerative diseases of the liver and gastroenterology, in kidney and urological diseases, in anemia and metabolic diseases, in necrobiotic processes such as cardiac and pulmonary diseases, in malignancy, in thyrotoxicosis, in mucoviscidosis , in multiple sclerosymosomal, inflammatory affections of neurological as well as in various types of organisms, including adverse effects of the living and working environment. Because of its simplicity, the assay is useful as a screening test for various health disorders and, for its susceptibility, is useful as a prognostic tool for monitoring disease progression, progression, or recovery and recovery. This examination will appear more versatile and sensitive than the determination of erythrocyte sedimentation. OBJECT OF THE INVENTION Method for Standardizing Determination of Selective Albumin Release from Blood Solution in Buffer Solution at pH 3.9-4.5, characterized in that albumin precipitation is carried out in the presence of 0.0001-0.1 mol of divalent copper compound, e.g. , chloride, bromide, copper (II) nitrate, copper ammonium citrate or potassium tartrate, per 1000 ml of reaction solution at 0-54 ° C.