CS269267B1 - Způsob přípravy celulosových materiálů s imobilizovanou cholinesterasou - Google Patents

Abstract

Řešení patří do oblasti kontroly ži-i votního prostředí, agrochemie a farmaceutické analýzy a týká se přípravy celulosových materiálů s imobilizovanou cholinesterasou, využitelných pro detekci a stanovení inhibitorů acetylcholinesterasy. Podstatou řešení je způsob přípravy celulosových materiálů s imobilizovanou cholinesterasou, který spočívá v zachycení enzymu na surových nebo bělených celulosových vláknech nebo tkanině, celulosovém filtračním papíru nebo mikrokrystalické a perlové celulose sorpcí z pufrovaného vodného roztoku enzymu, obsahujícího neionogenní tenzid pro zvýšení smáčivosti materiálů a sacharidy jako je dextran nebo sacharosa jako stabilizující přísadu sorpčně vázaného enzymu na celulosovém nosiči. Materiály připravené podle vynálezu mohou být využity při konstrukci kontinuálních detektorů, analyzátorů a reaktorů a pro důkaz a stanoveni malých množství a velmi nízkých koncentrací inhibitorů acetylcholinesterasy z vodných roztorků a extraktů, po záchytu ze vzduchu z hlediska potřeb, monitorování životního prostředí a v zemědělství.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy materiálu na bázi celulosy s imobillzovanou cholinesterasou. Tyto filtrační absorpční celulosové materiály s imobilizovanou cholinesterasou řeší řadu problémů spojených převážně se záchytem a stanovením inhibitorů cholinesteras, sloučenin používaných v zemědělství, významných v oblasti průmyslové chemie, při kontrole vody, krmiv, potravin a životního prostředí.

Biochemická cholinesterašová reakce jako velmi citlivá a poměrně selektivní metoda je široce využívána v celé řadě modifikací a aplikací pro detekci a stanovení početného souboru inhibitorů cholinesteras /AMMON, R. - VOSS, G., Pflugers Arch. ges. Physiol., 235 (1935), s. 393; MICHEL, 0., H., J. Lab. clin. Med., 34 (1949), s. 1564/.Na cholinesterasové reakci jsou založeny různé typy technických prostředků k detekci a stanovení inhibitorů cholinesteras, počínaje komplikovanými automatickými analyzátory ovzduší a vody, přes jednodušší provedení, jako jsou trubičkové detektory až po nejjednodušší detekční průkazníkové papíry /FRANKE, S.: Lehrbuch der Militarchemie, Militarverlag DDR, díl II., Berlin 1977, s. 481/. Zásadním problémem použití filtračních nebo sorpčních materiálů včetně papíru je fixace a stabilizace enzymů. Částečným řešením tohoto problému je imobilizace cholinesterasy na nosiči chemickou vazbou. Tento způsob imobilizace je však nevýhodný, něhož je složitý, vyžaduje použití speciálního .derivatizovaného nosiče, drahého vysoce purifikovaného enzymu a je obvykle doprovázen značnou ztrátou aktivity enzymu, přičemž prodloužení exspirace vázaného enzymu není velké /BODOGA, P., BADILESCU, F., CIOBANI, O.: RO č. 82028/. Nejbližším známým řešením způsobu přípravy enzymového průkazníkového papíru je imobilizace na speciálním chromatografickém papíru s iontoměničovou funkcí ve směsi s dextranovým gelem a indikací chromogenním substrátem /DAHLGREN, E., BERGEK, S., MARTENSSON, K.: WO 85-04423/, kdy při prodloužení skladovatelnosti průkazníkových papírů ndoylo dosaženo požadované citlivosti a přitom uvedený postup vyžaduje navíc drahé a obtížně dostupné speciální materiály a chemikálie. Uvedené nedostatky jednotlivých způsobů přípravy materiálů, tj. nedostatečná fixace a stabilizace enzymu na nosiči, krátká exspirace, nízká citlivost, vysoká cena při nedostupnosti speciálních materiálů a purifikovaných enzymů a zejména pak nemožnost opakovaného a dlouhodobého měření, nebo i zpracování velkých objemů vodných vzorků v důsledku i nedostatečné mechanické odolnosti materiálu, jsou odstraněny způsobem přípravy celulosových materiálů s imobilizovanou cholinesterasou podle vynálezu.

Podstatou vynálezu je způsob přípravy celulosových materiálů s imobilizovanou cholinesterasou, který spočívá v zachycení enzymu sorpcí na vláknech celulosových nosičů, jako jsou surová nebo bělená bavlněná vlákna nebo tkanina nebo celulosový filtrační papír nebo mikrokrystalická a perlová celulosa, ponořením celulosového materiálu do pufrovaného roztoku enzymu obsahujícího neionogenní tenzid a sacharidy nebo nanesením roztoku na tenkou vrstvu celulosového materiálu.

Způsobem přípravy celulosových materiálů s imobilizovanou cholinesterasou je dosahováno nového účinku tím, že připravené filtrační a sorpční materiály je možné opakovaně a dlouhodobě používat až do ztráty hydrolytické aktivity bez nutnosti používat reaktivní materiály vyvinuté pro imobilizaci enzymů nebo speciální chromatografické materiály. Vyššího účinku je dosahováno použitím dalších celulosových materiálů vedle papíru, perlové a mikrokrystalické celulosy i bavlněné tkaniny pro imobilizaci cholinesterasy jako filtračního a sorpčního materiálu umožňujícího vysoce selektivně zachycovat i velmi nízké koncetrace inhibitorů cholinesteras z vody, vodných extraktů, roztoků zbarvených nebo zakalených a po zvlhčení celulosového materiálu i ze vzduchu, plně tak využít vysoké citlivosti jednotlivých modifikací cholinesterasové reakce včetně zařízení, reaktorů a detektorů na této reakci založených. Vyššího účinku je rovněž dosaženo v důsledku podstatně zvýšené termické stálosti, dlouhodobě při teplotách do 70°C, což potvrzuje dobu exspirace delší 5 let. Vyšší účinek se výrazně projevuje i použitím dostupných domácích velmi levných surovin, např. použití surového homogenátu

CS 269 267 Bl hovězí mozkové tkáně náhradou za vysoce purifikované a neobyčejně drahé enzymy.

Příklad 1 .

Příprava roztoku acetylchollnesterasy

Podle dalSího předpokládaného použití se hovězí mozková tkáň nucleus caudatús zhoznogenizuje v poměru 1 : 20 nebo 1 : 100 v roztoku 0,2 mol.l^· fosfátového pufru pH 7,4 obsahujícím 5 % dextranu pro infusi, 15 % sacharosy a 0,5 % Slovasolu SF-10.

Příklad 2 · .

Imobilizace acetylchollnesterasy na bavlněné tkanině .

Tkanina se na 30 minut ponoří do roztoku připraveného podle příkladu 1, po vyjmutí z roztoku se tkanina při laboratorní teplotě usuší.

Příklad 3

Imobilizace cholinesterasy na perlové celulose

Suchá perlová celulosa se vloží do roztoku připraveného rozpuštěním lyofilizované plazmové cholinesterasy v roztoku pH 8,0 obsahujícím 0,5 % Slovasolu SF-10, 5 % dextranu pro infusi a směs se 30 minut míchá. Po odfiltrování roztoku se perlová celulosa s imobilizovanou cholinesterasou suší při laboratorní teplotě.

Příklad 4

Použití bavlněné tkaniny sTimobilizovanou acetylcholinestrasou pro detekci inhibitorů cholinesteras ve vodě

Tkanina upravená podle příkladu 2 se vloží na 30 minut do analyzovaného vodného roztoku. Pak se tkanina vyjme a po 10 minutách se na bílou tkaninu přiloží na 1 minutu proužek suchého filtračního papíru nasyceného ethanolovým roztokem s obsahem 0,15 % 5,5'-dithio-bis-2-dinitrobenzoové kyseliny a 0,5 % acetylthiocholinjodidu. Po odstranění papíru se do 1 minuty tkanina zbarví žlutě, za přítomnosti inhibitorů v analyzované vodě zůstane bílá.

Příklad 5

Mez dokazatelnosti mg.l při použití bavlněné tkaniny s imobilizovanou acetylcholinesterasou podle příkladu 4 pro detekci insekticidních přípravků (bez zjištění obsahu aktivní látky) ve vodě a % inhibice acetylchollnesterasy při analýze téhož roztoku spektrofotometrickým postupem dle Ellmana /ELLMAN, G.L., COURTNEY, K.D.,ANDRES, V., FEATHERSTONE, R.M.: Biochem. Pharmacol. 7, 88-95 (1961)/.

	,-1 mg.l	% inhibice
Sevin	1,0	69,7
Pirimacarb	5,0	76,7
Metathion	10,0	46,5
Nuvan	6,0	79,8
Baygon	1,0	38,2
Dimefox	30,0	40,6

Příklad 6

Použití perlové celulosy s imobilizovanou cholinesterasou pro detekci inhibitorů ve vzduchu

Perlová celuldsa upravená podle příkladu 3, objemu 1 ml ve skleněné koloně se zvlhčí 1 ml vody a kolonou se prosává vzduch. Po ukončení prosávání se do uzavřené kolony vnese 1,5 ml roztorku obsahujícího 0,5 mg butyrylthiocholinjodidu a 0,005 mg 5,5' -dithio-bis-2-dinitrobenzoové kyseliny. Roztok v koloně se do 2 minut .zbarví žlutě, za přítomnosti inhibitorů v analyzovaném vzduchu zůstane bezbarvý.

CS 269 267 Bl

Vynálezu může být využito pro přípravu řady typů filtračních a sorpčních materiálů na bázi celuldsy s imobilizovanou cholinesterasou vykazující dlouhodobě hydrolytickou aktivitu vůči substrátům typu acetylcholinu a vysokou afinitu k inhibitorům acetylcholinesterasy. Tyto mohou být využity v řadě odvětví národního hospodářství, farmaceutickém a chemickém průmyslu, v zemědělství, při monitorování životního prostředí, při konstrukci kontinuálních detektorů, analyzátorů a jako náplň reaktorů biotechnických výrob.

pSedmSt vynálezu

Claims (3)

1. Způsob přípravy celulosových materiálů s imobilizovanou cholinesterasou vyznačený tím, že na celulosovém materiálu se imobilizuje cholinesterasa sorpcí z pufrovaného roztoku.

2. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že k imobilizaci se použije na pH 6 až 8 pufrový vodný homogenát mozkové tkáně nebo roztok lyofilizované plazmové cholinesterasy nebo erythrocytární acetylcholinesterasy obsahující 1 až 10 % neionogenního tenzidu a 5 až 30 % sacharidů, s výhodou dextranu nebo sacharosy.

3. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že k imobilizaci se použije surová nebo bělená bavlněná vlákna nebo tkanina nebo mikrokrystalická celulosa nebo perlová celulosa nebo filtrační papír.