CS269184B1 - Rekombinovaný plasmid pFM882 - Google Patents
Rekombinovaný plasmid pFM882 Download PDFInfo
- Publication number
- CS269184B1 CS269184B1 CS882839A CS283988A CS269184B1 CS 269184 B1 CS269184 B1 CS 269184B1 CS 882839 A CS882839 A CS 882839A CS 283988 A CS283988 A CS 283988A CS 269184 B1 CS269184 B1 CS 269184B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- plasmid
- ppm882
- recombinant plasmid
- streptomycete
- coli
- Prior art date
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Description
Vynález se týká nového rekombinovaného plasmidu pPM882 o velikosti 11,3 kb s obsahem genetické informace, kódující resistenci k neomycinu a thiostreptonu v buňkách streptomycet.
Rozvojem genetického inženýrství vznikla rozsáhlá potřeba vyčlenit genetickou informaci na snadno manipulovatelný extrachromosomový replikon, který potom slouží jako vektorová molekula pro přenos genetické informace do zvolené hostitelské buňky nebo jako snadný sdroj genetické informace při rekonbinačních pokusech in vitro. Nejvhodnější extrachronosómovými molekulami DNA pro genetické inženýrství ve streptomycetách jsou ve streptomycetových buňkách přirozeně se vyskytující molekuly plasmidů. V letech 1980 až 1986 byla z různých streptomycetových kmenů isolována řada plasmidů a i když tyto plasnidy neobsahovaly žádné snadno detekovatelné geny, byla většina z nich okamžitě patentově chráněna. Namátkou uvádíme kryptické streptomycetové plasmidy patentované v letech >983 až 1985. Plasmid pOA29 ze Streptonyces griseus-japonský patent 59'4593, plasnid pOA19 ze S. griseus-japonský patent 59'43588, plasmid pSJ2 ze S. jumonjinensis-Japonský patent 592'339', plasmid pSJ' ze S. jumonjinensis-japonský patent 59220'88, plasmid pSAN'8' ze S. fulvoviridis-US patent 45'7300, plasmid pATM3 ze S. castaneoglobisporus-US patent 45'8698.
K účinnému genetickému inženýrství ve streptomycetách Je však bezpodmínečně nutné provést označení kryptických plasmidů snadno selektovatelnými znaky. Takovými znaky mohou být i geny kódující resistenci k antibiotikům thiostreptonu (tsr gen) a neomycinu (aph gen). Tyto geny byly v John Innes Institute v Anglii vyčleněny z chromosomu Streptomyces antibioticus a Streptomyces fradiae na několik streptomycetových plasmidů (Hopwood et al. Genetic Manipulation of Streptomyces, Laboratory Manual. John Innes Foundation, Norwich '985), z kterých jsou však manipulací in vitro těžko vyčlenitelné a isolované plasmidové DNA při isolaci často kontaminovány chromosomovou DNA streptomycet.
Pokusy o klonování celého streptomycetového plasmidu v E. coli konstruováním tzv. shuttle vektoru vedou při přenosech do streptomycet k značnému poškození shuttle vektoru způsobeného rozsáhlými délecemi, majícími počátek v plasmidu pBR322, který zajišťuje replikace shuttle vektoru v buňkách E. coli.
. Klonování aph a tsr genů kódujících syntézu enzymů aminoglykosidofosfotransferázy a lósRNA metylázy, (jejichž produkce streptomycetovou buňkou zajišťuje resistenci streptomycetové buňky k antibiotiku neomycinu a thiostreptonu) v plasmidovém vektoru pBR322, podle vynálezu umožňuje bezpečné uchování aph a tsr genu v rekombinačně deficientním hostiteli E. coli. Odtud lze oba geny snadno přenést na streptomycetové replikony a přenesení podstatně kratších úseků DNA, navíc streptomycetového původu, překonává problém delecí nalezených při použití shuttle vektorů.
Rekombinovaný plasmid pPM882 je množen a uchováván v buňkách kmene Escherichia coli HB101, kde vykazuje vysokou stabilitu. Přítomnost rekombinovaného plasmidu v buňkách E. coli HB101 je snadno detekovatelná resistenci kmene k ampicilinu a jeho citlivostí k tetracyklinu.
Kmen E. coli HB101, ve kterém je rekombinovaný plasmid uchováván je uložen v československé sbírce mikroorganismů University J. E. Purkyně v Brně pod číslem CCM 4007.
Charakteristickým znakem rekombinovaného plasmidu pPM882 je molekulová hmotnost 11,3 kb a přítomnost 6 925 bp velkého HindlII restrikčního fragmentu isolovaného ze streptomycetového plasmidu pIJ61 (Thompson et al. J. Bacteriol. 15':668, 1982), který obsahuje geny determinující resistenci k neomycinu a thiostreptonu v buňkách streptomycet a dále zachovává schopnost plasmidů zvyšovat Jeho počet kopií v hostitelské buňce E. coli po přidání chloramfenikolu. Zvýšení počtu kopií rekombinovaného plasmidu pPM882 výrazně zjednoduší proces isolace úseků deoxyribonukleové kyseliny (DNA), která kóduje resistenci k neomycinu a thiostreptonu v buňkách streptomycet, a tím umožňuje rychlé a spolehlivé značení konstruovaných extrachromosómových vektorů používaných pro genové manipulace v široké škále průmyslově významných streptomycet. Rekombinovaný plasmid byl získán násleCS 269 184 Bl dujícím postupem: z kmene E. coli byla isolována plasmidová DNA mnohokopiového plasmidu pBR322 (Bolivar et al., Gene 2:95, >977) o velikosti 4 363 bp (Pofen, Gene 22:277, ’978} kódující resistenci k antibiotikům nmpicilinu a tetrncyklinu. DNA plnsmidu pBRJ22 byln štěpena restrikční endonukleázou HindlII, pro kterou Je její jediné zásahové místo v molekule DNA plasmidu pBR322 situováno v oblasti kódující resistenci k antibiotiku tetracyklinu. Do tohoto HindlII restrikčního místa byl vpraven ligací in vitro pomocí enzymu T4-DNA ligázy 6 935 bp velký HindlII fragment, isolovaný z molekuly DNA plasmidu pIJ6‘, jehož přirozeným hostitelem jsou buňky kmene Streptomyces lividans.
Po vytvoření rekombinovaných molekul plasmidu p?M882 byly tyto molekuly transformovány do kompetentních buněk kmene E. coli HB101 a buňky obsahující rekombinovaný plasmid byly detekovány na základě své citlivosti k antibiotikům ampicilinu a tetracyklinu. Buňky kmene E. coli HB101 transformované plasmidem pPM882 byly detekovány jako ampicilin resistentní a tetracyklin senzitivní. Takto připravený rekombinovaný plasmid si uchoval schopnost vektorové molekuly plasmidu pBR322 zvyšovat svůj počet kopií v hostitelské buňce E. coli, jestliže byl přidán chloramfenikol k exponenciálně rostoucím kulturám hostitele.
K ověření celistvosti klonované genetické informace byly z klonů E. coli ΗΒΌ1 obsahujících rekombinovaný plasmid pPM882 isolovány DNA rekombinovaného plasmidu a podrobeny restrikční analýze. Restrikční analýza prokázala, že rekombinované plasmidové DNA pPM882 isiované ze sledovaných klonů, obsahují 6 925 bp velký HindlII restrikční fragment.
Ligace 6 925 bp velkého plasmidu pIJ61 do vektorové molekuly pBR322 dává možnost použít zvýšený počet restrikčních. endonukleáz k vyštěpení restrikčních fragmentů s genetickou informací pro syntézu neomycinfosfotransferázy a 16sRNA metylázy, jejichž syntéza ve streptomycetové buňce determinuje resistenci k neomycinu a thiostreptonu. Restrikční fragmenty získané štěpením rekombinované plasmidové molekuly pPM882 vhodné k zavedení genu kódujícího resistenci k neomycinu do streptomycetových replikonů Jsou uvedeny v tabulce I a k zavedení genu kódujícího resistenci thiostreptonu do streptomycetových replikonů v tabulce 2. ·
Rekombinovaný plasmid pPM882 působí jako zdroj snadno isiovatelných selekčních znaků pro označení plasmidových a fágovýoh vektorů používaných jako vektorů k přenosu genetické informace ve streptomycetách. Další možnost využití rekombinovaného plasmidu pPM882 je při konstrukci shuttle vektorů pro přenos genetické informace z E, coli do streptomycetové buňky a vice versa.
Tabulka 1
| Restrikční fragment | Inserce | Velikost v bp |
| Šatil - SstlI | + ' | 1 564 |
| Clal - Xhol | + | 3 >06 |
| Clal - KpnI | 4- | 3 026 |
| Clal - HindlII | + | 3 756 |
| Clal - EcoRI | 4- | 3 785 |
| Clal - Pstl | + | 4 506 |
| Clal - BamHI | - | 4 >02 |
| EcoRV - Xhol | + | 2 833 |
| EcoRI - Sphl | + | 2 753 |
| EcoRV - KpnI | 4· | 2 273 |
| EcoRV - HindlII | . 4- | 3 483 |
| EcoRV - EcoRI | 4- | 3 512 |
| EcoRV - Pstl | 4- | 4 262 |
| EcoRV - BamHI | - | • 3 829 |
| HindlII - HindlII | + | 6 925 |
CS 269 184 Bl
| HindlII - BglII | 4 | 4 925 |
| HindlII - Xhol | + | 6 275 |
| HindlII - Sphl | + | ’ 6 195 |
| Xhol - Bglll | ' + | |
| SpH - BglII | ||
| Sphl - Sphl | 6 572 | |
| Pstl - BglII | + | 5 374 |
| ScoRI - BglII | + | 4 324 |
| EcoRI - Xhol | ·· , | 6 304 |
| EcoRI - Sphl | - | 6 224 |
| Tabulka 2 | ||
| Restrikční fragment | Inserce | Velikost v bp |
| BglII - BamHI | + | 2 420 |
| HindlII - BamHI | + | 5 050 |
| BamHI - BamHI | + | 5 396 |
| SpHI - BamHI | + | 5 587 |
| EcoRI -’ BamHI | - | 5 079 |
| Pátí - BamHI | - | 5 800 |
| BglII - Sáti | +· | 2 32 6 |
| HindlII - Sstl | + | 4 956 |
| Sphl - Sstl | + | 5 307 |
| EcoRI - Sstl | - | 4 985 |
| Pstl - Sstl | - | 5 706 |
| BglII - Pstl | + | 2 677 |
| HindlII - Pstl | + | 5 307 |
| SpHI - Pstl | + | 5 844 |
| EcoRI - Pstl | - | 5 336 |
| Pstl - Pstl | - | 6 057 |
PŘEDMĚT VYNÁLEZU
Claims (1)
- PŘEDMĚT VYNÁLEZURekombinovaný plasmid pPM882 8 obsahem genetické informace, kódující resistenci k neomycinu a thiostreptonu, charakterizovaný uvedenou restrikční enzymovou mapou, mající molekulovou hmotnost 11,3 kb a uchovávaný v kmenu Escherichia coli HB1Q1 CCM 4007.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS882839A CS269184B1 (sk) | 1988-04-27 | 1988-04-27 | Rekombinovaný plasmid pFM882 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS882839A CS269184B1 (sk) | 1988-04-27 | 1988-04-27 | Rekombinovaný plasmid pFM882 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS283988A1 CS283988A1 (en) | 1989-09-12 |
| CS269184B1 true CS269184B1 (sk) | 1990-04-11 |
Family
ID=5366660
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS882839A CS269184B1 (sk) | 1988-04-27 | 1988-04-27 | Rekombinovaný plasmid pFM882 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS269184B1 (cs) |
-
1988
- 1988-04-27 CS CS882839A patent/CS269184B1/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS283988A1 (en) | 1989-09-12 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Gryczan et al. | Molecular cloning of heterologous chromosomal DNA by recombination between a plasmid vector and a homologous resident plasmid in Bacillus subtilis | |
| Szekeres et al. | Chromosomal toxin–antitoxin loci can diminish large‐scale genome reductions in the absence of selection | |
| Hopwood et al. | Streptomycetes | |
| Kostriken et al. | Transposon Tn3 encodes a site-specific recombination system: identification of essential sequences, genes, and actual site of recombination. | |
| Schweizer | Applications of the Saccharomyces cerevisiae Flp-FRT system in bacterial genetics | |
| Dordet Frisoni et al. | ICEA of M ycoplasma agalactiae: a new family of self‐transmissible integrative elements that confers conjugative properties to the recipient strain | |
| US4760022A (en) | Stabilized plasmids | |
| Ghigo et al. | Cell division in Escherichia coli: role of FtsL domains in septal localization, function, and oligomerization | |
| Hopwood et al. | Genetics of bacterial diversity | |
| Selvaraj et al. | Transposon Tn5 specifies streptomycin resistance in Rhizobium spp | |
| Dempwolff et al. | Tn FLX: a third-generation mariner-based transposon system for Bacillus subtilis | |
| Garcia | Burkholderia thailandensis: genetic manipulation | |
| Miyazaki et al. | A dual functional origin of transfer in the ICEclc genomic island of Pseudomonas knackmussii B13 | |
| Bruton et al. | Phage vectors that allow monitoring of transcription of secondary metabolism genes in Streptomyces | |
| Owen et al. | Physical structure, genetic content and expression of the alkBAC operon | |
| JPS59169496A (ja) | ｒＤＮＡクロ−ニング用ベクタ−ｐＶＥ１，欠失および雑種変異体、およびその組換え誘導体、生産物および方法 | |
| Bernales et al. | Intramolecular transposition of insertion sequence IS91 results in second‐site simple insertions | |
| O'CONNELL¹ | 1.1 Genetic Transfer in Prokaryotes: Transformation, Transduction, and Conjugation | |
| Sherratt et al. | Site-specific recombination in transposition and plasmid stability | |
| Roberts et al. | IS10 promotes adjacent deletions at low frequency | |
| Julien | Characterization of the integrase gene and attachment site for the Myxococcus xanthus bacteriophage Mx9 | |
| CS269184B1 (sk) | Rekombinovaný plasmid pFM882 | |
| Wilson et al. | VEX-capture: a new technique that allows in vivo excision, cloning, and broad-host-range transfer of large bacterial genomic DNA segments | |
| Ball | Gentics and Breeding of Industrial Microorganisms | |
| Aymeric et al. | Mapping and regulation of the cel genes in Erwinia chrysanthemi |