CS268738B1 - Způsob kvantitativního fluorimetrického stanovení peroxidu vodíku a substrátů oxidáz - Google Patents

Abstract

ŘeSení se týká způsobu kvantitativního fluorimetrického stanovení peroxidu vodíku a substrátů oxidáz. Tento způsob spočívá v injekci vzorku substrátu do kontinuálního proudu média. Stykem média s imobilizovaným enzymem odpovádajícím přislužnému substrátu vzniká při enzymatické oxidaci substrátu peroxid vodíku. Ten přichází dále do styku s lmohllizovanou peroxidázou. Médium obsahuje chemickou látku, která v přítomnosti peroxidu vodíku a peroxidázy je schopna vytvořit fluorescenční produkt. Vykazovaná fluorescence Je měřena fluorimetrem. Samotná kvantifikace se provádí na základě porovnáni íluorimetřické odezvy na stanovený vzorek substrátu a odezvy na známá standardní množství zkoumané látky.

Description

Vynález se týká způsobu kvantitativního fluorimetrického stanovení peroxidu vodíku a substrátů oxidáz.

Vytvoření analytických metod umožňujícfcii kvantitativní stanoveni biologicky významných látek s vysokou citlivostí je velkým problémem v biochemických laboratořích. Pro měření některých látek, které je možno působením oxidáz přeměnit na peroxid vodíku, je používáno fluorlmetrie, při které je do kyvety fluorimetru napipetován příslušný stanovený substrát, jemu odpovídající oxldáza, peroxidáza a chemická látka, která po enzymatické reakci katalyzované peroxidázou vykazuje fluorescenci. Oxldáza převede substrát na peroxid vodíku, který v přítomnosti peroxidázy oxiduje látku schopnou fluorescence. Velikost fluorescenčního efektu odpovídá množství stanoveného substrátu. Metody tohoto typu jsou popsány v knize M.A.Detuca (ed.), Methods in Enzymology, vol. 57, Bioluminlscence and Chemiluminiscence (Academic Press, New York, 1978). Tato metoda, přestože je citlivá, má své nevýhody. Nutnost přidání nového množství enzymů pro každé jednotlivé měření znamená vysokou spotřebu specifických enzymů. Měření samotné je pomalé a pracné.

Tyto nevýhody odstraňuje způsob měření podle vynálezu. Jsou v něm uplatněny dva základní prvky novosti. Injekce měřených vzorků se provádí přímo do kontinuálního proudu média, čímž odpadá přidávání jednotlivých enzymů ke každému vzorku a použité enzymy jsou navíc imobilizovány na vhodném nosiči, se kterým proudící medium přichází do styku.

Způsob kvantitativního stanovení peroxidu vodíku a substrátů oxidáz spočívá tedy v injekci vzorku substrátu do kontinuálního proudu média. Stykem média s imobilizovaným enzymem odpovídajícím příslušnému substrátu vzniká při enzymatické oxidaci substrátu peroxid vodíku. Vzniklý peroxid vodíku prochází pak s médiem kolonkou s imobilizovanou peroxidázou. Médium obsahuje chemickou látku, která v přítomnosti peroxidu vodíku a peroxidázy je schopna vytvořit fluorescenční produkt, nejlépe 3-/p.hydroxyfenyl/ propionovou kyselinu, komovanilinovou kyselinu případně hydrofenyloctovou kyselinu. Tato látka je akceptorem elektronů při enzymatické redukci peroxidu vodíku katalyzované peroxidázou. Fluorescenci je při vhodné kombinaci vlnových délek pro excitaci a emisi možno kvantitativně měřit na připojeném fluorimetru. Jeho signál je přímo úměrný koncentraci peroxidu vodíku a tedy i původnímu vzorku substrátu pro danou imobilizovanou oxidázu. Samotná kvantifikace se provádí na základě porovnání fluorimetrické odezvy na stanovený vzorek substrátu a odezvy na známé standardní množství zkoumané látky.

Princlptohoto způsobu stanovení je možno využít v oblasti biochemie, lékařské biochemie, fyziologického a farmakologického výzkumu. Charakteristickým příkladem látek, které mohou být tímto způsobem stanoveny, jsou glukosa, cholln a cholesterol.

Příklad

Popsaný způsob byl použit ke stanovení množství acetylcholinu /ACh/ v extraktech z mozkové tkáně. K tomuto účelu byla použita kombinace tří imobilizovaných enzymů na třech za sebou následujících kolonách: acetylcholinesteráza /vytváří z acetylcholinu cholin/, cholinoxidáza /vytváří z cholinu peroxid vodíku / a peroxidáza /vytváří fluorescentní produkt interakci mezi peroxidem vodíku a 3-/p_Thydroxyfenyl/-propionovou kyselinou, jež byla přítomna v proudícím médiu/· Do kontinuálního proudu média byla ve dvouminutových intervalech vstřikovány jednak vzorky známých množství Ach /20 pmol, 40 pmol, 100 pmol atd/, jednak 20 ul množství tkáňových extraktů. Odpoví! fluorimetru na standartní množství ACh v průběhu pokusu neměnila. Porovnáním mezi odpovědí na známá množství ACh a na tkáňové extrakty bylo možno vypočítat koncentraci ACh v jednotlivých extraktech.

Claims (1)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   Způsob kvantitativního fluorimetnického stanovení peroxidu vodíku a substrátů oxidáz v médiu obsahujícím chemickou látku schopnou v přítomnosti peroxidu vodíku a peroxidázy vytvořit fluorescenční efekt, vyznačený tím, že substrát oxidáz se injekuje do kontinuálního proudu média, se kterým se přivede do styku s imobilizovaným enzyhem, odpovídajícím příslušnému substrátu, převede se kvantitativné na peroxid vodíku, který dále prochází kolonkou s imobilizovanou peroxidázou a fluorimetrem, přičemž signály fluorimetru odpovídají přímo úměrně množství stanoveného substrátu případně peroxidu vodíku.