CS268357B1 - A method for preparing an electrochemical sensor for determining alcohols - Google Patents
A method for preparing an electrochemical sensor for determining alcohols Download PDFInfo
- Publication number
- CS268357B1 CS268357B1 CS88476A CS47688A CS268357B1 CS 268357 B1 CS268357 B1 CS 268357B1 CS 88476 A CS88476 A CS 88476A CS 47688 A CS47688 A CS 47688A CS 268357 B1 CS268357 B1 CS 268357B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- enzyme
- polysaccharide
- alcohols
- electrochemical sensor
- layer
- Prior art date
Links
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Řešení se týká způsobu přípravy enzymového elektrochemického senzoru na stanovení alkoholů. Senzor je tvořen detektorem kyslíku, na němž je fixována vrstva nebo membrána obsahující polysacharid. Enzym alkoholoxidáza se na tuto vrstvu imobilizuje reakci svých aminoskupin s aldehydovými skupinami vytvořenými jodistanovou oxidací vicinálních díolů cukerných jednotek přítomného polysacharídu, alternativně se imobilizuje společně s rozpustným oligosacharidem nebo polysacharidem. Enzymový elektrochemický senzor připravený popsaným způsobem umožňuje rychle a spolehlivě měřit koncentraci alkoholů v technologických vzorcích bez předchozí úpravy analyzované směsi.The solution relates to a method of preparing an enzyme electrochemical sensor for the determination of alcohols. The sensor consists of an oxygen detector on which a layer or membrane containing a polysaccharide is fixed. The enzyme alcohol oxidase is immobilized on this layer by the reaction of its amino groups with aldehyde groups formed by the periodate oxidation of the vicinal moieties of the sugar units of the polysaccharide present, alternatively it is immobilized together with a soluble oligosaccharide or polysaccharide. The enzyme electrochemical sensor prepared in the described manner allows for rapid and reliable measurement of the concentration of alcohols in technological samples without prior treatment of the analyzed mixture.
Description
Vynález se týká způsobu přípravy enzymového elektrochemického senzoru na stanovení alkoholů na principu enzymové reakce oxidace katalyzované imobilizovanou alkoholoxidázou v kombinaci s elektrochemickou detekci ekvivalentní spotřeby kyslíku.The invention relates to a process for the preparation of an enzyme electrochemical sensor for the determination of alcohols on the principle of an enzymatic oxidation reaction catalyzed by immobilized alcohol oxidase in combination with electrochemical detection of equivalent oxygen consumption.
Stanoveni primárních alkoholů, především methanolu a ethanolu, ale i například n-propanolu, n-butanolu a allylalkoholu, je velmi důležité v řadě technologií chemického průmyslu a zvláště v moderních technologiích. V mnoha případech je významné stanovení těchto alkoholů i v surovinách nebo produktech potravinářského průmyslu. Stanovení ethanolu je zvlášt potřebné a velmi časté i v soudních a klinických toxikologických laboratořích, především z důvodu legislativní kontroly při zajištováni bezpečnosti dopravy.The determination of primary alcohols, especially methanol and ethanol, but also, for example, n-propanol, n-butanol and allyl alcohol, is very important in many technologies of the chemical industry and especially in modern technologies. In many cases, the determination of these alcohols in raw materials or products of the food industry is important. The determination of ethanol is particularly necessary and very common in forensic and clinical toxicology laboratories, mainly due to legislative control in ensuring transport safety.
Z uvedených důvodů byla pro stanoveni titulních alkoholů vypracována řada postupů chemických, většinou s fotometrickou detekcí, i fyzikálně chemických, z nichž největšího uplatnění doznala plynová chromatografie.For these reasons, a number of chemical procedures were developed for the determination of the title alcohols, mostly with photometric detection, as well as physicochemical ones, of which gas chromatography was the most widely used.
V souvislosti s rozvojem enzymových analytických postupů vyznačujících se vysokou citlivosti, jednoduchosti a specifitou danou vlastni podstatou enzymové katalýzy, byla věnována pozornost též enzymovému stanovení především ethanolu. Při tomto stanovení se využívá katalytického účinku alkoholdehydrogenázy (E.C.1.1.1.1.), přičemž množství oxidovaného ethylalkoholu je nejběžněji sledováno fotometricky na základě ekvivalentní tvorby redukované formy koenzymu nikotinamidadenindínukleotidu (NAOH).In connection with the development of enzymatic analytical procedures characterized by high sensitivity, simplicity and specificity given by the very nature of enzymatic catalysis, attention was also paid to the enzymatic determination, especially of ethanol. This assay uses the catalytic effect of alcohol dehydrogenase (E.C.1.1.1.1), with the amount of oxidized ethyl alcohol being most commonly monitored photometrically based on the equivalent formation of the reduced form of the coenzyme nicotinamide adenine dinucleotide (NAOH).
K enzymovému stanoveni ethanolu je možno použít též alkoholoxidázu, která katalyzuje oxidaci alkoholu přímo kyslíkem, aniž by byla nutná přítomnost koenzymu NAD. Substrátová speciflta alkoholoxidázy je však širší, zahrnuje i některé další primární alifatické alkoholy, i když jejich relativní rychlost oxidace je ve srovnáni s ethanolem výrazně nižší. Této skutečnosti může být na jedné straně využito pro stanovení těchto jednotlivých alkoholů, na druhé.· straně však může být v některých případech zkreslen výsledek analýzy přítomností kontaminujících alkoholů. Z tohoto hlediska je největší nebezpečí ovlivněni výsledků analýzy přítomnosti ethanolu jako kontaminující složky při stanovení jiných alkoholů. Naopak, při stanovení ethanolu zvláště ve fyziologických tekutinách, nebo jiných vzorcích fyziologického původu, toto nebezpečí prakticky nepřichází v úvahu.Alcohol oxidase can also be used for the enzymatic determination of ethanol, which catalyzes the oxidation of alcohol directly by oxygen without the need for the coenzyme NAD. However, the substrate specificity of alcohol oxidase is broader, including some other primary aliphatic alcohols, although their relative oxidation rate is significantly lower compared to ethanol. This fact can be used on the one hand to determine these individual alcohols, on the other hand, but in some cases the result of the analysis of the presence of contaminating alcohols can be skewed. From this point of view, the greatest danger is influenced by the results of the analysis of the presence of ethanol as a contaminant in the determination of other alcohols. Conversely, in the determination of ethanol, especially in physiological fluids or other samples of physiological origin, this danger is practically out of the question.
Průběh enzymové reakce je možno sledovat přímo na základě tvorby nebo spotřeby určité substance, nebo pomocí následných chemických nebo enzymových reakci vzniklých reakčnich produktů. Vedle velmi často používané fotometrie má velký význam spojení enzymové reakce s elektrochemickými čidly detekujícími substráty, produkty nebo jiné látky ovlivňující průběh enzymové reakce.The course of the enzymatic reaction can be monitored directly on the basis of the formation or consumption of a certain substance, or by means of subsequent chemical or enzymatic reactions of the reaction products formed. In addition to the very often used photometry, the connection of the enzyme reaction with electrochemical sensors detecting substrates, products or other substances influencing the course of the enzyme reaction is of great importance.
Použití volných enzymů je spojeno v některých případech s technickými nebo ekonomickými problémy jejich získávání. Z tohoto důvodu je velmi atraktivní jejich fixace v blizkosti elektrochemického čidla, čímž je vytvořen senzor - enzymová elektroda, opakovaně použitelný pří stovkách analýz bez jakékoliv spotřeby chemikálií, vyjma v některých případech pouze pufru.The use of free enzymes is in some cases associated with technical or economic problems in obtaining them. For this reason, their fixation near the electrochemical sensor is very attractive, creating a sensor - enzyme electrode, reusable in hundreds of analyzes without any consumption of chemicals, except in some cases only buffer.
Pro stanovení alkoholů byla vypracována příprava enzymové elektrody spočívající v imobilizaci enzymu alkoholoxidázy ve spojeni buď s elektrochemickou detekci vznikajícího peroxidu vodíku, nebo s elektrochemickým stanovením spotřeby kyslíku kyslíkovým článkem Clarkova typu.For the determination of alcohols, the preparation of an enzyme electrode was prepared, consisting in the immobilization of the alcohol oxidase enzyme in conjunction with either the electrochemical detection of hydrogen peroxide formed or the electrochemical determination of oxygen consumption by a Clark-type oxygen cell.
S ohledem na stabilitu vytvoření enzymové elektrody je výhodná imobilizace enzymu kovalentní vazbou. Pro přípravu enzymových elektrod je nejčastěji používanou technikou imobilizace prokříženi molekul pomocí glutaraldehydu, v některých případech v kom binaci s jinými enzymy či přidanou bílkovinou.In view of the stability of the formation of the enzyme electrode, immobilization of the enzyme by covalent bonding is preferred. For the preparation of enzyme electrodes, the most commonly used technique is immobilization of molecules by cross-linking with glutaraldehyde, in some cases in combination with other enzymes or added protein.
Tento problém řeší způsob přípravy elektrochemického senzoru na stanoveni alkoholu podle vynálezu, jehož podstatou je, že na vrstvu nebo membránu tvořenou materiálemThis problem is solved by the method of preparing an electrochemical sensor for the determination of alcohol according to the invention, the essence of which is that the layer or membrane formed by the material
CS 268357 81 obsahujícím polysacharid se alkoholoxidáza imobilizuje reakci svých aminoskupin s aldehydovými skupinami tvořenými jodistanovou oxidaci vicinálnich diolů cukerných jednotek přítomného polysacharidu. Alternativní se enzym alkoholoxidáza imobilizuje na vrstvu nebo membránu společně s rozpustným oligosacharidem nebo polysacharidem.CS 268357 81 containing a polysaccharide, the alcohol oxidase is immobilized by reacting its amino groups with aldehyde groups formed by the periodate oxidation of the vicinal diols of the sugar units of the polysaccharide present. Alternatively, the alcohol oxidase enzyme is immobilized on the layer or membrane together with a soluble oligosaccharide or polysaccharide.
Výhodou enzymového elektrochemického senzoru'vytvořeného způsobem podle vynálezu je zvýšeni jeho stability. Pro některé aplikace senzoru s ohledem na další zvýšení jeho stability je výhodné překrýt vrstvu s imobilizovaným enzymem další membránou propustnou pouze pro nizkomolekulárni látky.The advantage of the enzyme electrochemical sensor produced by the method of the invention is the increase in its stability. For some sensor applications, in order to further increase its stability, it is advantageous to cover the layer with immobilized enzyme with another membrane permeable only to low molecular weight substances.
Enzymový elektrochemický senzor na stanoveni alkoholů připravený podle vynálezu umožňuje rychle a spolehlivě měřit koncentrací alkoholů v technologických vzorcích bez předchozí úpravy analyzované směsi, zvláště výhodný je pro stanovení βthalalkoholu ve fyziologických tekutinách, především plazmě a v dechu intoxikovaných probantů v rozsahu desetin až stovek promile.The enzyme electrochemical sensor for the determination of alcohols prepared according to the invention makes it possible to quickly and reliably measure the concentration of alcohols in technological samples without prior treatment of the analyzed mixture.
Předmět vynálezu je dokumentován na následujících příkladech, aniž by se jimi omezoval.The subject matter of the invention is documented by the following examples without being limited thereto.
Přiklad 1Example 1
Celulózový terčík byl ponořen do roztoku jodistanu sodného (0,1 mol.dm-3), po dvou hodinách stání za občasného promícháni byl vyjmut a promyt destilovanou vodou. Na takto aktivovaný terčík obsahující aldehydové skupiny bylo aplikováno 150 ul alkoholoxidázy v 0,1 mol/dm fosfátovém pufru pH 7,5. Po šesti hodinách byl terčík s navázanou alkoholoxidázou fixován na detektor kyslíku a dále překryt membránou z acetátu propouštějící pouze nizkomolekulárni látky. Pomoci takto připraveného enzymového elektrochemického senzoru byl stanoven ethylalkohol na základě úbytku kyslíku v reakčni směsi s lineární -7 -4 3 odezvou v rozsahu 5.10 až 5.10 molů ethylalkoholu v dm .The cellulose target was immersed in a solution of sodium periodate (0.1 mol.dm -3 ), after standing for two hours with occasional stirring, it was removed and washed with distilled water. 150 [mu] l of alcohol oxidase in 0.1 mol / dm phosphate buffer pH 7.5 were applied to the thus activated target containing aldehyde groups. After six hours, the alcohol oxidase-bound target was fixed on an oxygen detector and further covered with an acetate membrane permeable to low molecular weight substances only. Using the enzyme electrochemical sensor thus prepared, ethyl alcohol was determined based on the loss of oxygen in the reaction mixture with a linear -7-3 response in the range of 5.10 to 5.10 moles of ethyl alcohol per dm.
Přiklad 2 ,Na celulózový terčík aktivovaný podle přikladu 1 byly aplikovány 2 ,ul kyseliny octové (0,5 ml.dm 3), 1 pl cyklohexylisokyanidu a 150 pl alkoholoxidázy v 0,1 mol/dm3 fosfátovém pufru pH 7,5. Po šesti hodinách byl terčík s navázanou alkoholoxidázou důkladně promyt 0,1 mol/dm3 fosfátovým pufrem pH 7,5 a potom byl fixován na detektor kyslíku. Pomoci takto připraveného enzymového elektrochemického senzoru byl stanoven n-butanol s lineární odezvou v koncentračním rozsahu 10 až 10-3 molů v dm3.Example 2 2 [mu] l of acetic acid (0.5 ml.dm 3 ), 1 [mu] l of cyclohexyl isocyanide and 150 [mu] l of alcohol oxidase in 0.1 mol / dm 3 phosphate buffer pH 7.5 were applied to the cellulose target activated according to Example 1. After six hours, the alcohol oxidase-bound target was washed thoroughly with 0.1 mol / dm 3 phosphate buffer pH 7.5 and then fixed on an oxygen detector. Using the enzyme electrochemical sensor thus prepared, n-butanol with a linear response in the concentration range of 10 to 10 -3 moles in dm 3 was determined .
Přiklad 3 Oxidace dextranuExample 3 Oxidation of dextran
Ke 2 g dextranu bylo přidáno 50 ml 0,25 mol/dm3 jodistanu sodného ve 0,05 mol/dm3 fosfátovém pufru pH 6. Po třech hodinách míchání za nepřístupu světla při 20 °C byla reakční směs dialyzována proti vodě při 4 °C po dobu 48 hodin.To 2 g of dextran was added 50 ml of 0.25 mol / dm 3 sodium periodate in 0.05 mol / dm 3 phosphate buffer pH 6. After stirring for three hours in the absence of light at 20 ° C, the reaction mixture was dialyzed against water at 4 ° C. C for 48 hours.
Aktivace skleněné porézní vrstvyActivation of the glass porous layer
Tenký terčík ze síntrového skla byl v 10ti procentním gama-aminopropyltriethoxysilanu v toluenu zahříván k refluxu po dobu dvanácti hodin. Potom byl promyt toluenem a vysušen.A thin sintered glass target was heated to reflux in 10 percent gamma-aminopropyltriethoxysilane in toluene for twelve hours. It was then washed with toluene and dried.
Imobilizace alkoholoxidázyImmobilization of alcohol oxidase
Směs alkoholoxidázy a aktivovaného dextranu v poměru 1 : 2 (obj. jed.) byla aplikována na terčík z porézního skla modifikovaného gama-aminopropyltriethoxysílaném. Terčík byl fixován na detektor kyslíku a dále překryt membránou z acetátu celulosy propouštějící pouze nizkomolekulárni látky. Pomoci takto připraveného enzymového elektrochemického senzoru byl stanoven methylalkohol ve vodných roztocích s lineární odezvou v rozsahu koncentrací 5.10 2 až 4.10”4 mol.dm-3.A 1: 2 mixture of alcohol oxidase and activated dextran (v / v) was applied to a gamma-aminopropyltriethoxysilane-modified porous glass target. The target was fixed to an oxygen detector and further covered with a cellulose acetate membrane permeable to only low molecular weight substances. Using the enzyme electrochemical sensor thus prepared, methyl alcohol was determined in aqueous solutions with a linear response in the concentration range of 5.10 2 to 4.10 " 4 mol.dm -3 .
Přiklad 4Example 4
Ke směsi alkoholoxidázy a aktivovaného dextranu připraveného podle příkladu 3 byl přidán bezprostředně před aplikací na modifikované porézní sklo obsahující amino % CS 268357 Bl 3 skupiny cyklohexylisokyanid v poměru 150 : 300 : 1. Po šesti hodinách byl terčík s imobilizovanou alkoholoxidázou a dextranem promyt 0,1 mol/dm fosfátovým pufrem pH 7,5 a potom byl fixován na detektor kyslíku a překryt membránou z acetátu celulózy. Pomoci takto připraveného enzymového clektrochemického senzoru byl stanoven ethylalkohol s lineární odezvou v rozsahu 5. 10 až 5. 10 mol . dm \To the mixture of alcohol oxidase and activated dextran prepared according to Example 3, cyclohexyl isocyanide in a ratio of 150: 300: 1 was added immediately before application to a modified porous glass containing amino% CS 268357 B1 3 in a ratio of 150: 300: 1. mol / dm phosphate buffer pH 7.5 and then fixed on an oxygen detector and covered with a cellulose acetate membrane. Ethyl alcohol with a linear response in the range of 5. 10 to 5. 10 mol was determined using the enzyme spectrochemical sensor thus prepared. dm \
Claims (2)
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS88476A CS268357B1 (en) | 1986-03-11 | 1988-01-26 | A method for preparing an electrochemical sensor for determining alcohols |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS861637A CS263606B1 (en) | 1986-03-11 | 1986-03-11 | Enzyme electrochemical sensor for determination of alcohols and method of its preparation |
| CS88476A CS268357B1 (en) | 1986-03-11 | 1988-01-26 | A method for preparing an electrochemical sensor for determining alcohols |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS47688A1 CS47688A1 (en) | 1989-08-14 |
| CS268357B1 true CS268357B1 (en) | 1990-03-14 |
Family
ID=5351216
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS861637A CS263606B1 (en) | 1986-03-11 | 1986-03-11 | Enzyme electrochemical sensor for determination of alcohols and method of its preparation |
| CS88476A CS268357B1 (en) | 1986-03-11 | 1988-01-26 | A method for preparing an electrochemical sensor for determining alcohols |
Family Applications Before (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS861637A CS263606B1 (en) | 1986-03-11 | 1986-03-11 | Enzyme electrochemical sensor for determination of alcohols and method of its preparation |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (2) | CS263606B1 (en) |
-
1986
- 1986-03-11 CS CS861637A patent/CS263606B1/en unknown
-
1988
- 1988-01-26 CS CS88476A patent/CS268357B1/en unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS263606B1 (en) | 1989-04-14 |
| CS47688A1 (en) | 1989-08-14 |
| CS163786A1 (en) | 1988-09-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US6051389A (en) | Enzyme sensor | |
| US4240889A (en) | Enzyme electrode provided with immobilized enzyme membrane | |
| Conrath et al. | A novel enzyme sensor for the determination of inorganic phosphate | |
| Zhu et al. | A novel flow through optical fiber biosensor for glucose based on luminol electrochemiluminescence | |
| Marazuela et al. | Free cholesterol fiber-optic biosensor for serum samples with simplex optimization | |
| EP0261591A2 (en) | Method for assaying 1,5-anhydroglucitol and kit therefor | |
| Tsuchida et al. | Immobilization of D-glucose oxidase onto a hydrogen peroxide permselective membrane and application for an enzyme electrode | |
| US4234681A (en) | Immobolized light emitting systems | |
| Barlikova et al. | Hybrid biosensor for the determination of sucrose | |
| JPH01206238A (en) | Digital colorimetry determination system measuring system | |
| Guémas et al. | Biosensor for determination of glucose and sucrose in fruit juices by flow injection analysis | |
| Guilbault et al. | Preparation and analytical uses of immobilized enzymes | |
| Krysteva et al. | Multienzyme membranes for biosensors | |
| Zhang et al. | Simultaneous determination of glucose and sucrose by a dual‐working electrode multienzyme sensor flow‐injection system | |
| Vidal et al. | Study of an enzyme coupled system for the development of fibre optical bilirubin sensors | |
| CS268357B1 (en) | A method for preparing an electrochemical sensor for determining alcohols | |
| Campanella et al. | Determination of inorganic phosphate in drug formulations and biological fluids using a plant tissue electrode | |
| Tsiafoulis et al. | Development of an amperometric biosensing method for the determination of L-fucose in pretreated urine | |
| JP6459400B2 (en) | Enzyme immobilized body, analyzer equipped with the same, and method for measuring L-threonine | |
| Sibirnyj et al. | The use of enzymes for ethanol, methanol and formaldehyde determination in food products | |
| Schwedt et al. | Immobilized enzymes as tools in food analysis | |
| JP2648361B2 (en) | Permselective membrane and electrode using the same | |
| JP4622836B2 (en) | Analysis equipment | |
| Kiba et al. | Chemiluminometric determination of uric acid in plasma by closed-loop FIA with a coimmobilized enzyme flow cell | |
| Murachi et al. | [23] Use of immobilized enzyme column reactors in clinical analysis |