CS268012B1

CS268012B1 - Způsob konzervace luminiscentnich baktérii lyofilizaci

Info

Publication number: CS268012B1
Application number: CS874608A
Authority: CS
Inventors: Miroslava Rndr Csc Opekarova; Ivan Rndr Csc Janda
Original assignee: Miroslava Rndr Csc Opekarova; Ivan Rndr Csc Janda
Priority date: 1987-06-22
Filing date: 1987-06-22
Publication date: 1990-03-14
Also published as: CS460887A1

Abstract

Konzervace luminiscentnich baktérií zahrnuje lyofilizaci v kryoprotektivnim médiu s nižší iontovou silou-(l % NaCl), které obsahuje 15 % laktosu a 5 % rozpustný škrob. Oehydratované kultury se uchovávají v evakuovaném stavu v chladu a před použitím se rekonstituují přídavkem původního objemu 2 % NaCl.

Description

Vynález se týká způscrbu koncentrace luminiscentních bakterii lyofilizaci pro potřeby mikrobiálního testu toxicity nebo dlouhodobého uchováváni ve sbírkách.

Některé mořské baktérie (např. z rodů Photobacterium a Vibrip) se vyznačují intenzívní bioluminiscencí, tj. produkcí viditelného světla. S bioluminiscencí interferují nejrůznějši toxické látky, např. ionty těžkých kovů, pesticidy, organická rozpouštědla, syntetická hnojivá aj., které mohou z vnějšího prostředí pronikat dovnitř buněk l.uminiscentních bakterií. Ze změn intenzity bioluminiscence je možno usuzovat na toxicitu neznámých vzorků, popřípadě u známých toxikantů stanovit jejich koncentraci. Rutinně se mikrobiální te t toxicity provádí pomoci luminiscenčního fotometru a speciálně připravených dehydratovaných luminiscentních baktérií, jejichž luminiscence se měří v přítomnosti a nepřítomnosti potenciálního toxikantů (tzv. Microtox test: Bulich A. A., Process Biochem. 17, 45 až 47, 1982). Metoda k je vhodná jako primární screening při kontrole čistoty životního prostředí.

V literatuře byly popsány metody, jimiž je údajně možné buňky fotobaktérií lyofilizovat tak, aby nejen přežily ve vysušeném stavu několik měsíců, ale byly i okamžitě po rehydrataci schopné bioluminiscence. Podle jedné metody (Nealson Κ. H., Methoda Enzymol. 57, 153 až 166, 1978k) se buňky luminiscentních baktérií resuspendují v médiu s nižší iontovou silou, která obsahuje cca 0,75% hmot. NaCl, další anorganické solí, 0,5 % hmot, pepton a 0,5 % fjmot. kvasničný extrakt, zmrazí se a lyofilizují. Druhý způsob (patentový spis NSR č. 28 41 8964) používá před lyofilizaci suspendováni fotobakterií v 2 % hmot, roztoku NaCl obsahujícím 20 % hmot, odtučnělého mléka. '

Nevýhodou těchto metod je, že neposkytují reprodukovatelné výsledky pro široké spektrum druhů luminiscentních baktérií, zásadním nedostatkem je, že stupeň přežití a intenzita bioluminiscenzé konzervovaných buněk jsou nízké. Komerčně vyráběné konzervy fotobaktérií pro Microtax test jsou velmi drahé. V zemích RVHP nebyla technologie sériové výroby dehydratovaných fotobaktérií dosud zavedpna.

Fakt, že luminiscentní baktérie se nedají běžnými způsoby spolehlivě lyofilizovat, je také velkým problémem pro sbírky mikroorganismů. Dosud používané způsoby dlouhodobé konzervace těchto baktérií jsou bu3 nákladné (uchovávání v kapalném dusíku), nebo pracné a nepohodlné (uchovávání na agarových půdách v chladničce a časté přeočkováváni).

Tyto nevýhody odstraňuje způsob konzervace luminiscentních baktérií podle vynálezu, jehož podstatou je, že bakteriální buňky se lyofilizují v lyofilním médiu, které obsahuje jako kryoprotektivní látku laktó v koncentraci 10 až 25 % hmot, a jako látku usnadňující rehydrataci rozpustný škrob v koncentraci 1 až 10 % hmot, a před použitím se rehydratují roztokem uni-onlvaletního elektrolytu, s výhodou NaCl, jehož koncentrace před lyofilizaci je 0,8 až 1,2 % hmot., přičemž rehydratace se provádí doplněním do původního objemu přídavkem 2% roztoku NaCl. Buňky luminiscentních baktérií narostlé v kapalném médiu nebo na pevné půdě se resuspendují v lyofilním médiu s nižší koncentrací NaCl (např. 1 %), které obsahuje laktozu jako kryoprotektivní látku a šroub jako látku, jež usnadňuje pozdější rehydraci; tato suspenze se dále lyofilizuje obvyklým způsobem. Lyofilizát se uloží v evakuované nádobce v chladu (kolem 4 °C). Před použitím se lyofilizovaná kultura rekonstituuje do původního objemu přídavkem roztoku NaCl tak, aby výsledná koncentrace NaCl byla optimální pro bioluminiscencí (kolem 3 %). Za těchto podmínek vykazují rehydratované buňky intenzívní a stabilní bioluminiscencí, takže jich lze použít pro Microtox test. Resuscitace sbírkových kmenů se provádí obvyklým způsobem, např. suspendováním v růstovém m= médiu.

Způsob konzervace luminiscentních baktérií podle vynálezu zajištuje: 1. vysoký stupeň přežití bakteriálních buněk i po několika měsících skladováni; 2. jednoduchou skladovatelnost konzervovaných kultur, což umožňuje provádět testy toxicity v terénu;

3. snadnou rehydrataci vysušeného materiálu, která je podmínkou reprodukovatelného

CS 268012 81 a správného rozdělováni luminiskujici kultury na alikvotni části na začátku testu; 4. dostatečně silnou a stálou luminiscenci konzervovaných buněk po rehydrataci.

Dále je uveden přiklad použiti metody podle vynálezu. Je popsána jen jedna z možnosti provedeni - konkrétním hodnotám koncentraci, teploty, tlaku a jiných veličin nelze přičítat omezující význam vzhledem k ochraně vynálezu.

Přiklad 1

Luminiscentni baktérie Photobacterium lelognathi LN-la, byly kultivovány na rotační třepačce při 22 °C v živném médiu obsahujícím (g/L) tKHgPO^, 2,5 ^: NaCl, 30,0 ^: NH^Cl, 0,3 : MgSO^. 7 HgO, 0,4 : FeCl^, 0,005 : glycerol, 5,0 : kvasničný extrakt (SERVA, NSR) 1,0 : trypcon (0X010, Velká Británie) 15,0 (pH 7,1). Kultura v pozdní logaritmické fázi byla ochlazena v ledu, buňky byly odděleny centrifugací a resuspendovány v 3 % hmot. NaCl na koncentraci 1,4 x lO^^L^-^. Alikvotni části (0,04 ml) byly přidávány k 0,5 mL lyofilního média obsahujícího ve 100 mL : 1 g NaCl, 23 mg pyrofosforečnanu sodného (dekahydrátů), 0,5 mg kvasničného extraktu (SERVA), 15 g laktozy a 5 g rozpustného škrobu (podle Louliera; LACHEMA).

Část této suspenze byla použita pro zjištěni intenzity bioluminiscence a koncentrace živých buněk. Počet buněk schopných tvořit kolonie byl zjištěn výsevem ředěné suspenze na Petriho misky obsahující 2 % hmot, agar v živném médiu výše uvedeného složeni a inkubací pří 22 °C. Luminiscence bakteriální suspenze byla měřena při 15 °C v luminiscenčním fotometru Microtox model 2055 (BECKMAN, USA) při nastaveni zi_tsku fotonásobíče 4,00 až 0 9,50 x 1 (Bulich A. A., Process Biochem. 17, 45 až 47, 1982).

Ostatní vzorky byly ihned po suspendování zmrazený ve směsi led/etylalkohol a lyofilizovány v lyofilizátoru (HETOSICC CO 52-1; HETO, Dánsko) při vakuu 7 Pa po dobu 3,5 h. Vysušené preparáty byly v evakuovaném stavu zataveny do skloněných zkumavek a uloženy při 2 až 4 °C.

Po 90 dnech skladováni v chladu byly konzervované kultury resuscitovány přidáním 0,5 mL a 2 % hmot. NaCl (takže výsledná koncentrace NaCl byla 3 %). Bioluminiscence a životaschopnost rehydratovaných buněk byla testována stejnými metodami jako před lyofilizaci. Naměřené hodnoty jsou uvedeny v tabulce.

Přiklad 2

Stejně jako v přikladu 1 bylo postupováno při konzervaci luminíscentnich baktérií Photobacterium phosphoreum MVI 02.

Přiklad 3

Stejně jako v přikladu 1 bylo postupováno při konzervaci luminiscentnich baktérií Vibrio fischer! MO-1.

Z tabulky je zřejmé, že u všech studovaných mikroorganismů je lyofilizaci podle vynálezu schopnost tvorby kolonii redukována na hodnoty, které Jsou pro sbírkové účely zcela dostatečné. Celková bioluminiscence kultur Je snížena na 1/10 až 1/4 původní hodnoty před lyofilizaci, což velmi dobře vyhovuje potřebám mikrobiálního textu toxicity.

Tabulka

Vliv konzervační metody podle vynálezu na životaschopnost a bioluminiscenci fotobaktérií

Mikroorganismus Schopnost tvorby kolonii³ Bioluminiscence⁸

	před	lyof.	90 dnů	po lyof.	před lyof.	90 dnů po fyof .
P. phosphoreum MVI 02	4,28	x 10⁹	1,48 x	10⁸	695	65
P. leiognathi LN - la	2,04	x 10⁹	5,70 x	io⁸	191	48 .
V. fiocheri MO-1	4,40	x 10	6,81 x	10⁸	944	243

= přepočteno na koncentraci životaschopných buněk v 1 mL suspenze (průměr z 5 hodnot) = V arbitrácních jednotkách displeje luminometru Microtox 2055. Měřena byla vždy luminiscence 0,01 mL bakteriální suspenze v 0,5 mL 3 % hmot. NaCl (průměr ze 3 hodnot).

Claims

PŘEDMĚT VYNÁLEZU

Způsob konzervace luminiscentnich bakterii lyofilisací, vyznačující se tím, že bakteriální buňky se lyofilizuji v lyofilním médiu, které obsahuje kryoprotektivní látku laktozu v koncentraci 10 až 25 % hmot a jako látku usnadňující rehydrataci rozpustný škrob v koncentraci 1 až 10 % hmot, a před použitím se rehydratují roztokem uni-univalentního elektrolytu, s výhodou NaCl, jehož koncentrace před lyofilizací je 0,8 až 1,2 % hmot., přičemž rehydratace se provádí doplněním do původního objemu přídavkem 2 % roztoku NaCl.