CS266062B1

CS266062B1 - Method of polymere carrier production for peptides synthesis

Info

Publication number: CS266062B1
Application number: CS88327A
Authority: CS
Inventors: Karel Ing Csc Jerabek; Karel Ing Csc Setinek; Milan Ing Csc Krojidlo; Vaclav Ing Jares; Jarmila Engstova; Jiri Ing Kolinsky; Petr Ing Csc Simek; Ludek Rndr Lepsa
Original assignee: Jerabek Karel; Setinek Karel; Milan Ing Csc Krojidlo; Jares Vaclav; Jarmila Engstova; Kolinsky Jiri; Petr Ing Csc Simek; Lepsa Ludek
Priority date: 1988-01-18
Filing date: 1988-01-18
Publication date: 1989-11-14
Also published as: CS32788A1

Abstract

Způsob výroby polymerního nosiče pro syntézu peptidů zamezující přítomnost Škodlivého bis(chlormetyl)eteru jak ve výchozích surovinách, tak i jeho tvorbě v reakční směsi během přípravy chlormetylací nerozpustného polymeru obsahujícího benzenová jádra, spočívající v tom, že se reakce provádí v prostředí rozpustidla, ve kterém polymer nebotná, v množství pohybujícím se v rozmezí dvoj- až pětinásobku hmotnosti výchozího polymeru, při teplotě 0 až 50 °C, přičemž je jako chlormetylační. činidlo použito produktu reakce · dimetoxymetanu s chlorderivátem organické nebo anorganické kyseliny v množství od poloviny do trojnásobku výchozí hmotnosti polymeru .A method of making a polymeric carrier for peptide synthesis to prevent the presence of harmful bis (chloromethyl) ether as starting material raw materials and its formation in the reaction mixture during the preparation of chloromethylation insoluble of a polymer containing benzene nuclei in that the reaction is carried out in an environment solvents in which the polymer does not swell in an amount ranging from two to three five times the weight of the starting polymer, at 0 to 50 ° C, being chloromethylating. The reagent used was a reaction product of dimethoxymethane with an organic chloro derivative or inorganic acids in an amount from half up to three times the starting weight of the polymer .

Description

Vynález se týká způsobu výroby polymerního nosiče pro syntézu peptidu v pevné fázi.The invention relates to a process for the preparation of a polymeric support for solid phase peptide synthesis.

Metoda syntézy peptidů v pevné fázi je postup, při kterém je rostoucí peptidický řetězec syntézy vázán na nerozpustný, nnjčastčjj polymerní nosič. To umožňuje snadnou izolaci meziproduktů po jednotlivých krocích syntézy pouhým odfiltrováním a promytím nosiče, ze kterého je I¹·'¹· po skončení nyní úzy konečný produkt vhodnou chemickou reakcí odštěpen. Tento postup J z<' iol.it ivnč snadno .mloitnil lzov.it a potřebné aparalmy jsou I |a umy ti 1 ové vytáhány. |·<>| íž<· při syntéze peptidů v pevné fázi vznikají tím, že do dalšího kroku syntézy jsou přenášeny kromě hlavního meziproduktu i vedlejší meziprodukty vzniklé nedokonalým zreagováním. Jejich přeměna v následujících etapách syntézy již nemůže k žádoucímu konečnému produktu vést. Je tedy zřejmé, že pro úspěch celého procesu syntézy je nezbytně nutné zajistit co nejvyšší selektivitu průběhu jednotlivých kroků. Proto musí být růst peptidických řetězců co nejméně omezován sférickými vlivy jak samotného skeletu nosiče, tak i rostoucích peptidických řetězců navzájem.A method of solid phase peptide synthesis is a process in which a growing peptide chain of synthesis is bound to an insoluble, most often polymeric support. This allows for easy isolation of intermediates after the individual synthesis steps simple filtration and washing the support from which I ¹ · ^-1 · post now Uzza final product suitable chemical cleavage reactions. This process is easy to read and the necessary apparatus is washed and washed. | · <> | In the synthesis of peptides in the solid phase, they are formed by transferring to the next step of the synthesis, in addition to the main intermediate, also the secondary intermediates formed by imperfect reaction. Their conversion in the subsequent stages of the synthesis can no longer lead to the desired final product. It is therefore clear that for the success of the whole synthesis process, it is essential to ensure the highest possible selectivity of the course of individual steps. Therefore, the growth of peptide chains must be limited as little as possible by the spherical effects of both the backbone of the carrier itself and the growing peptide chains relative to each other.

Nejobvyklejším typem nosiče pro syntézu peptidů v pevné fázi jsou chlormetylované kopolymery styrenu a divinylbenzenu. O kopolymerech styrenu a divinylbenzenu je známo, že struktura jejich polymerní hmoty je heterogenní, tj. vyskytují se v ní oblasti lišící se hustotou zesítění polymerních řetězců. Proto je třeba při přípravě polymerních nosičů pro syntézu peptidů zavádět reaktivní chlormetylové skupiny, budoucí kotevní místa peptidických řetězců pouze tam, kde pro růst peptidického řetězce jsou dobré podmínky a oblasti s vyšším zesítěním polymerních řetězců ponechat nefunkcionalizované. Obvykle se vychází z předem připraveného kopolymeru obsahujícího 0,5 až 2 % divinylbenzenu a aktivní skupiny se zavádějí reakcí s chlormety1-metyleterem za katalýzy sloučeninami typu chloridu ciničitého, chloridu zinečnatého, chloridu železitého apod. Optimalizace podmínek této reakce z hlediska dosažení pokud možno vysoké kapacity nosiče při zachování vhodného rozmístění kotevních míst tak, aby jejich reaktivita byla ve všech krocích syntézy rovnocenná je složitým problémem. Další komplikací je použití chlormetyl-metyleteru jako chlormetylačního činidla. Bývá připravován reakcí formaldehydu s chlorovodíkem. Takto vyrobený preparát však vždy· obsahuje příměs bis(chlormetyl)eteru, který je prokázaným karcinogenem. Práce s tímto činidlem je proto zdraví škodlivá a podléhá zvláštním předpisům (Ministerstvo zdravotnictví CSR: Hygienické předpisy, svazek 49, 1980).The most common type of support for solid phase peptide synthesis is chloromethylated copolymers of styrene and divinylbenzene. It is known about copolymers of styrene and divinylbenzene that the structure of their polymer mass is heterogeneous, i.e. there are regions in it which differ in the crosslink density of the polymer chains. Therefore, in the preparation of polymeric carriers for peptide synthesis, it is necessary to introduce reactive chloromethyl groups, future anchor sites of peptide chains only where there are good conditions for peptide chain growth and to leave areas with higher crosslinking of polymer chains non-functionalized. It is usually based on a preformed copolymer containing 0.5 to 2% of divinylbenzene and the active groups are introduced by reaction with chloromethyl methyl ether catalyzed by compounds such as stannous chloride, zinc chloride, ferric chloride, etc. Optimizing the reaction conditions to achieve as high a capacity as possible carriers while maintaining a suitable location of the anchor sites so that their reactivity is equivalent in all steps of the synthesis is a complex problem. Another complication is the use of chloromethyl methyl ether as a chloromethylating agent. It is usually prepared by reacting formaldehyde with hydrogen chloride. However, the preparation thus prepared always contains an admixture of bis (chloromethyl) ether, which is a proven carcinogen. Working with this reagent is therefore harmful to health and subject to special regulations (Ministry of Health CSR: Hygienic Regulations, Volume 49, 1980).

Způsob výroby polymerního nosiče pro syntézu peptidů podle tohoto vynálezu zamezující přítomnosti škodlivého bis(chlormetyl)eteru jak ve výchozích surovinách, tak i jeho tvorbě v reakční směsi během přípravy chlormetylací nerozpustného polymeru obsahujícího benzenová jádra se vyznačuje tím, že se reakce provádí v prostředí rozpustidla, ve kterém polymer nebotná. Množství tohoto rozpustidla se pohybuje v rozmezí dvoj- až pětinásobku hmotnosti výchozího polymeru. Teplota reakce může být v rozmezí O až 50 °C, přičemž jako chlormetylační činidlo je použito produktu reakce dimetoxymetanu s chlorderivátem organické nebo anorganické kyseliny v množství od poloviny do trojnásobku výchozí hmotnosti polymeru. Zabezpečuje selektivní vnášení chlormetylových skupin do míst polymerního skeletu, kde jsou sterické podmínky pro růst polymerních řetězců nejlepší a rovnocenné. Využívá chlormetylačního činidla připraveného postupem popsaným v publikaci: J. S. Amato, S. Karady, M. Sletzinger, L. M. Weinstock: Synthesis (1979) 970. Reakci dimetoxymetanu s acetylchloridem za katalytického působení malé příměsi metanolu při něm vzniká equimolární směs chlormetyl-metyleteru a metylacetátu. Alternativně by bylo možné použít i chlorderivát jiné kyseliny, např. thionylchlorid, sulfurylchlorid apod. Podstatou postupu podle vynálezu je provádění reakce v prostředí rozpustidla, ve kterém výchozí kppolymer nebotná. Po přidání směsi chlormetylačního činidla s katalyzátorem (látkou typu používaného k tomuto účelu pro Friedel-Craftsovy reakce, např. SnCl^, ZnCl₂, FeCl₃ apod.) je pronikání aktivních komponent do nitra polymerní hmoty řízeno permeabilitou polymeru a chlormetylované skupiny jsou přednostně zaváděny do stericky nejvhodnějších míst polymerního skeletu. Zředění chlormetylačního činidla zároveň napomáhá i zamezení tvorby škodlivého bis(chlormetyl)eteru, který by, účinkem použitých katalyzátorů, mohl během reakce disproporcionací chlormetyl-metyleteru vznikat.The process for the preparation of a polymeric support for the synthesis of peptides according to the invention, which prevents the presence of harmful bis (chloromethyl) ether both in the starting materials and its formation in the reaction mixture during the preparation of chloromethylation of insoluble polymer containing benzene nuclei, is characterized in that the reaction is carried out in a solvent medium. in which the polymer does not swell. The amount of this solvent is in the range of two to five times the weight of the starting polymer. The reaction temperature may be in the range of 0 to 50 ° C, with the reaction product of the reaction of dimethoxymethane with a chlorine derivative of an organic or inorganic acid being used in an amount of half to three times the initial weight of the polymer. It ensures the selective introduction of chloromethyl groups into the sites of the polymer skeleton where the steric conditions for the growth of polymer chains are the best and equivalent. It uses a chloromethylating agent prepared according to the procedure described in JS Amato, S. Karady, M. Sletzinger, LM Weinstock: Synthesis (1979) 970. Alternatively, it would be possible to use a chlorine derivative of another acid, e.g. thionyl chloride, sulfuryl chloride, etc. The essence of the process according to the invention is to carry out the reaction in a solvent medium in which the starting polymer does not swell. After adding a mixture of a chloromethylating agent with a catalyst (a substance of the type used for this purpose for Friedel-Crafts reactions, e.g. SnCl 2, ZnCl ₂ , FeCl ₃ etc.) the penetration of active components into the polymer mass is controlled by polymer permeability and chloromethylated groups are preferably introduced. to the sterically most suitable places of the polymer skeleton. Dilution of the chloromethylating agent also helps to prevent the formation of the harmful bis (chloromethyl) ether which, due to the action of the catalysts used, could be formed during the reaction by disproportionation of the chloromethyl methyl ether.

Pro přípravu různých peptidů metodou syntézy v pevné fázi je i různý optimální stupeň chlormetylace polymerního nosiče. Popisovaný způsob přípravy umožňuje velmi dobře regulovat stupeň chlormetylace změnou množství použitého katalyzátoru. Při pečlivém provedení je i málo citlivý na změnu měřítka syntézy.For the preparation of different peptides by solid phase synthesis, there is also a different optimal degree of chloromethylation of the polymeric support. The described method of preparation makes it possible to control the degree of chloromethylation very well by changing the amount of catalyst used. Carefully performed, it is also insensitive to scaling up the synthesis.

Při popisovaném způsobu přípravy nosičů pro syntézu peptidů je vhodné vycházet z kopolymoiii, | <' 1 i >-li.Ilonpon )> iliioil nlořkoi, ),. I Λ I k. i obn.iliu i (<· í benzenově ;.'><!><>, n.ipi'. kopo I ymet y styrenu a divinylbenzenu, styrenu a butadienu apod. Jako reakční prostředí jsou vhodná taková rozpustidla, ve kterých použitý polymer nebotná a která se za podmínek reakce chovají inertně, např. nasycené uhlovodíky. Množství použitého rozpustidla se může pohybovat od dvou- do pětinásobku výchozí hmotnosti použitého polymeru. Množství použitého chlormetylačního činidla (připraveného výše zmíněným postupem) se může pohybovat od poloviny do trojnásobku výchozí hmotnosti polymeru. Množstvím použitého katalyzátoru je možné regulovat požadovaný stupeň chlormetylace. Teplota reakce se může pohybovat od 0 až 50 °C. Při vyšších teplotách je nebezpečí, že vytvořené chlormetylové skupiny budou dále reagovat za vzniku metylenových můstků mezi polymerními řetězci, což by nepříznivě ovlivnilo permeabilitu polymeru.In the described process for the preparation of supports for peptide synthesis, it is suitable to start from a copolymer <'1 i> -li.Ilonpon)> iliioil nlořkoi,) ,. I Λ I k. I obn.iliu i (<· í benzenově;. '> <!> <>, N.ipi'. Copolymers of styrene and divinylbenzene, styrene and butadiene, etc. in which the polymer used does not swell and which behaves inertly under the reaction conditions, e.g. saturated hydrocarbons.The amount of solvent used may range from two to five times the initial weight of the polymer used.The amount of chloromethylating agent used (prepared by the above procedure) may half to three times the initial weight of the polymer.The amount of catalyst used can control the desired degree of chloromethylation.The reaction temperature can range from 0 to 50 ° C. At higher temperatures there is a risk that the chloromethyl groups formed will react further to form methylene bridges between the polymer chains. which would adversely affect the permeability of the polymer.

Příklad 1Example 1

Chlormetylační činidlo bylo připraveno tak, že v baňce opatřené zpětným chladičem a magnetickým míchadlem bylo smíseno 16 g dimetoxymetanu, 0,8 g metanolu a 16 g acetyIchloridu. ΓΟ odeznění varu byla směs ponechána stát 24 hodin.The chloromethylating agent was prepared by mixing 16 g of dimethoxymethane, 0.8 g of methanol and 16 g of acetyl chloride in a flask equipped with a reflux condenser and a magnetic stirrer. ΓΟ After the boiling has subsided, the mixture was allowed to stand for 24 hours.

Příklad 2Example 2

V baňce opatřené magnetickým míchadlem bylo suspendováno 5 g kopolymeru styrenu a divinylbenzenu s obsahem 1 % divinylbenzenu v 25 cm³ n-heptanu a pomocí vodní lázně vyhřáto na teplotu 40 °C. Za intenzivního míchání byla do baňky přilita směs 10 cm³ chlormetylačního činidla připraveného podle příkladu 1 a 1,5 cm bezvodého SnCl^. Reakce byla při 40 °C za neustálého míchání ponechána probíhat 1 h. Pak byl, po odebrání vzorku reakční směsi, průběh reakce přerušen přídavkem směsi dioxanu a vody v poměru 2:1. Kopolymer pak byl stejnou směsí promyt do ztráty reakce na chloridy a poté metanolem a vysušen. Bylo získáno 5,2 g polymeru o obsahu chloru 1,8 mmol/g. Analýza metodou kombinované plynové chromatografie a hmotové spektrometrie prokázala, že ani v chlormetylačním činidle, ani v reakční směsi není přítomen bis(chlormety1)eter.In a flask equipped with a magnetic stirrer, 5 g of a copolymer of styrene and divinylbenzene containing 1% divinylbenzene were suspended in 25 cm ^{3 of} n-heptane and heated to 40 ° C with a water bath. With vigorous stirring, a mixture of 10 cm ^{3 of the} chloromethylating agent prepared according to Example 1 and 1.5 cm 3 of anhydrous SnCl 2 was added to the flask. The reaction was allowed to proceed at 40 ° C with stirring for 1 h. Then, after taking a sample of the reaction mixture, the reaction was stopped by adding a 2: 1 mixture of dioxane and water. The copolymer was then washed with the same mixture until the reaction to chlorides was lost and then with methanol and dried. 5.2 g of polymer with a chlorine content of 1.8 mmol / g were obtained. Analysis by combined gas chromatography and mass spectrometry showed that neither bis (chloromethyl) ether was present in either the chloromethylating agent nor the reaction mixture.

Příklad 1Example 1

Postup práce a podmínky syntézy stejné jako v příkladu 2, s výjimkou množství bezvodého SnCl₄, které činilo pouze 0,9 cm³. Bylo získáno 5,1 g polymerního nosiče o obsahu chloru 1,0 mmol/g.The procedure and conditions of the synthesis were the same as in Example 2, except for the amount of anhydrous SnCl ₄ , which was only 0.9 cm ³ . 5.1 g of a polymeric carrier with a chlorine content of 1.0 mmol / g were obtained.

Nosič připravený postupem podle příkladu 1 až 2 byl použit k syntéze chráněného heptapeptidamidu pro výrobu Carbetocin subst. Při použití 500 g polymerního nosiče s obsahem chloru 1,9 mniol/g bylo metodou syntézy v pevné fázi připraveno 571 g chráněného heptapeptidamidu. Stejným postupem při použití 500 g polymerního nosiče dodávaného firmou FLUKA (obsah chloru 3,4 mmol/g) bylo získáno 330 g chráněného heptapeptidamidu. Oba produkty byly srovnatelné kvality.The support prepared according to Examples 1 to 2 was used to synthesize a protected heptapeptidamide to produce Carbetocin subst. Using 500 g of a polymeric support with a chlorine content of 1.9 mmol / g, 571 g of protected heptapeptidamide was prepared by solid phase synthesis. Following the same procedure using 500 g of a polymeric carrier supplied by FLUKA (chlorine content 3.4 mmol / g), 330 g of protected heptapeptidamide were obtained. Both products were of comparable quality.

Claims

Process for the preparation of a polymeric support for the synthesis of peptides preventing the presence of harmful bis (chloromethyl) ether both in the starting materials and its formation in the reaction mixture during the chlorothylation of an insoluble polymer containing a benzene / nucleus, characterized in that the reaction is carried out in a solvent medium in which the polymer does not swell, in an amount ranging from t <»·. *. The starting polymer of the starting polymer is at a temperature of 0 DEG to 50 DEG C., the product of the reaction of dimethoxymethane with a chlorinated organic or inorganic acid derivative being used as the chloromethylating agent in an amount of half to three times the initial weight of the polymer.