CS265578B1

CS265578B1 - Stabilized substrate for catalytic activity determination of phosphomonoestherase

Info

Publication number: CS265578B1
Application number: CS876784A
Authority: CS
Inventors: Vratislav Ing Csc Chromy; Milan Rndr Maly
Original assignee: Chromy Vratislav; Maly Milan
Priority date: 1987-09-21
Filing date: 1987-09-21
Publication date: 1989-10-13
Also published as: CS678487A1

Abstract

Předmětem řešení je stabilizovaný substrát pro stanovení katalytické aktivity fosfomonoesteras na bázi 4-nitrofenylfosfátu, který je stabilizován fosforečnanovým pufrem o pH 8 až 10 v množství 20 až 97 mmolů na mol 4-nitrofenylfósfátu. Posforečnanový pufr je tvořen sodnými nebo draselnými solemi kyselin hydrogenfosforečné a dihydrogenfosforečnéThe subject of the solution is stabilized substrate for determining catalytic activity 4-nitrophenyl phosphate phosphomonoesterase which is phosphate stabilized buffer of pH 8 to 10 in quantity 20 to 97 mmol per mole of 4-nitrophenylphosphate. The sodium phosphate buffer is sodium or potassium phosphoric acid salts and dihydrogenphosphoric

Description

Vynález se týká stabilizovaného substrátu pro stanoveni katalytické aktivity fosfomonoesteras.The invention relates to a stabilized substrate for determining the catalytic activity of phosphomonoesterases.

Alkalické a kyselé fosfomonoesterasy představují skupinu enzymů významných zejména v klinické enzymologii. Stanovení jejich katalytické koncentrace v krevním séru, plazmě nebo i jiných biologických tekutinách je důležitým diagnostickým prostředkem pro řadu onemocněni. Alkalická fosfatasa pro nemoci jaterního parenchymu, žlučových cest, kostního aparátu a podobně, kyselá fosfatasa hlavně pro maligní onemocnění prostaty, některých chorob kostních a pro hematologická vyšetření.Alkaline and acidic phosphomonoesterases are a group of enzymes important especially in clinical enzymology. Determination of their catalytic concentration in blood serum, plasma or other biological fluids is an important diagnostic tool for many diseases. Alkaline phosphatase for diseases of the liver parenchyma, bile ducts, bone apparatus and the like, acid phosphatase mainly for malignant prostate diseases, some bone diseases and for hematological examinations.

Stanoveni katalytických koncentraci alkalických i kyselých fosfomonoesteras se provádí nejčastěji tak, že sek roztoku substrátu v tlumiči o vhodném pH přidá vzorek biologického materiálu a sleduje se rychlost štěpení substrátu, které je katalyzováno enzymem. Při stanovení kyselé fosfatasy probíhá reakce ve slabě kyselém prostředí při pH kolem 5, stanovení alkalické fosfatasy se provádí ve slabě alkalickém roztoku při pH 9,5 až 10,5 v prostředí transfosforylačních médií, která umožňují přenos fosforečnanu ze substrátu na vhodný akceptor, jimiž jsou aminoalkanoly, které působí současně i jako pufry. Jsou to například diethanolamin, aminomethylpropanol nebo methylglukamin.Determination of the catalytic concentrations of both alkaline and acidic phosphomonoesterases is most often carried out by adding a sample of biological material to the substrate solution in a buffer at a suitable pH and monitoring the rate of enzyme-catalyzed substrate cleavage. In the determination of acid phosphatase, the reaction proceeds in a weakly acidic medium at a pH of about 5, the determination of alkaline phosphatase is carried out in a weakly alkaline solution at pH 9.5 to 10.5 in an environment of transphosphorylation media. aminoalkanols, which also act as buffers. These are, for example, diethanolamine, aminomethylpropanol or methylglucamine.

V poslední době je jako substrát používán téměř výhradně 4-nitrofenylfosfát, který je fosfomonoesterasami štěpen při enzymové reakci na 4'-nitrofenol a fosforečnan. Obsah •4-nitrofenolu, vzniklého při enzymové reakci, který je přímo úměrný katalytické koncentraci enzymu ve vzorku, se měři fotometricky v alkalickém prostředí jako žlutý nitrofenolát. Fotometrické měřeni se provádí v alkalickém prostředí nad pH 9, neboť disociační konstanta 4-nitrofenolu je asi 7,2.Recently, almost exclusively 4-nitrophenyl phosphate has been used as a substrate, which is cleaved by phosphomonoesterases in an enzyme reaction to 4'-nitrophenol and phosphate. The 4-nitrophenol content of the enzyme reaction, which is proportional to the catalytic concentration of the enzyme in the sample, is measured photometrically in alkaline medium as a yellow nitrophenolate. Photometric measurement is performed in an alkaline medium above pH 9 since the dissociation constant of 4-nitrophenol is about 7.2.

Stanovení katalytické koncentrace fosfomonoesteras vyžaduje, aby substrát neobsahoval inhibující látky zpomalující enzymovou reakci, které mohou inhibivat enzym nebo zpomalovat enzymové štěpení substrátu. V případě 4-nitrofenylfosfátu jsou to zejména volný 4-nitrofenol a fosforečnan, které jsou jako nečistoty provázející syntézu v substrátu vždy přítomny. Podle Bowerse (G. N. Bowers, Jr., R. B. McComb, A. Upretti: Clin. Chem. 27, 135 až 143, 1981) může 4-nitrofenylfosfát vysoké čistoty obsahovat nejvýše 10 milimolů volného fosforečnanu a 0,3 milimolů 4-nitrofenolu na jeden mol substrátu.Determination of the catalytic concentration of phosphomonoesterases requires the substrate not to contain enzyme reaction retardants which may inhibit the enzyme or retard enzyme cleavage of the substrate. In the case of 4-nitrophenyl phosphate, it is in particular free 4-nitrophenol and phosphate, which are always present as synthesis impurities in the substrate. According to Bowers (GN Bowers, Jr., RB McComb, A. Upretti: Clin. Chem. 27: 135-143, 1981), high purity 4-nitrophenyl phosphate may contain no more than 10 millimoles of free phosphate and 0.3 millimoles of 4-nitrophenol per capita. mol of substrate.

Substrát 4-nitrofenylfosfát je jak v pevném stavu, tak zejména v roztoku značně nestálý. Spontánně se rozkládá a postupně v něm narůstá obsah obou rozkladných produktů, které inhibují při stanovení fosfomonoesteras enzymový rozklad substrátu, pravděpodobně mechanismem zpětné vazby.The substrate 4-nitrophenyl phosphate is highly volatile both in the solid state and especially in solution. It degrades spontaneously and gradually increases the content of both degradation products, which inhibit the enzyme degradation of the substrate in the determination of fosfomonoesterases, probably by a feedback mechanism.

Rozklad substrátu je katalyzován teplem, světlem, ale i látkami, které působí jako transfosforylační média pro stanovení fosfomonoesteras. Studiem vodných roztoků 4-nitrofenýlfosfátu o různém pH bylo zjištěno, že spontánní rozklad substrátu je katalyzován vodíkovými ionty. V kyselém prostředí probíhá nejrychleji, pomaleji v prostřed! neutrálním a nejpomaleji v prostředí slabě alkalickém. Protože produkty hydrolýzy 4-nitrofenylfosfátu postupně reakční médium okyselují, působí současně jako autokatalyzátory jeho rozkladu. Tak například vodný roztok vysoce čistého 4-nitrofenylfosfátu, jehož pH bylo nastaveno hydroxidem sodným na 8,5 změnil po týdnu pH na 7 a obsah volného 4-nitrofenolu se v roztoku zvýšil čtyřnásobně. Proměnné a postupně se zvyšující množství nečistot ve 4-nitrofenylfosfátu způsobuje změny v enzymové štěpitelnosti substrátu, a tím i změny ve výsledné katalytické aktivitě fosfomonoesteras. Tyto vlivy závažným způsobem snižují spolehlivost a správnost enzymologických vyšetření.The decomposition of the substrate is catalyzed by heat, light, but also by substances that act as transphosphorylation media for the determination of phosphomonoesterases. By studying aqueous solutions of 4-nitrophenyl phosphate of different pH, it was found that spontaneous decomposition of the substrate is catalyzed by hydrogen ions. In acidic environment, it is fastest, slower in environment! neutral and slowest in a weakly alkaline environment. Since the hydrolysis products of 4-nitrophenyl phosphate gradually acidify the reaction medium, they simultaneously act as autocatalysts for its decomposition. For example, an aqueous solution of highly pure 4-nitrophenylphosphate whose pH was adjusted to 8.5 with sodium hydroxide changed the pH to 7 after a week and the content of free 4-nitrophenol increased fourfold in the solution. Variable and gradually increasing amounts of impurities in 4-nitrophenyl phosphate cause changes in the enzymatic cleavage of the substrate and thus changes in the resulting catalytic activity of phosphomonoesterases. These effects seriously reduce the reliability and correctness of enzyme assays.

Uvedené nedostatky do značné míry odstraňuje stabilizovaný substrát na bázi 4-nitrofenylfosfátu. Jeho podstata spočívá v tom, že na 1 mol 4-nitrofenylfosfátu obsahuje 20 až 97 milimolů fosforečnanového pufru. Fosforečnanový pufr je tvořen sodnými nebo draselnými solemi kyselin hydrogenfosforečné a dihydrogenfosforečné. Pokud obsahuje substrát endogenní fosforečnan sodný v množství 20 až 97 milimolů na 1 mol substrátu, což odpovídá obsahu volných anorganických fosforečnanů v substrátu 0,5 až 2,4 % hmot. a pH jeho vodného roztoku o koncentraci 1 % hmot. je mezi 8 a 10, plní funkci fosforečnanového pufru přímo endogenní fosforečnany.These disadvantages are largely eliminated by a stabilized 4-nitrophenyl phosphate substrate. It consists of 20 to 97 millimoles of phosphate buffer per mole of 4-nitrophenyl phosphate. The phosphate buffer consists of sodium or potassium salts of hydrogen phosphoric acid and dihydrogen phosphoric acid. When the substrate comprises endogenous sodium phosphate in an amount of 20 to 97 millimoles per mole of substrate, corresponding to a content of free inorganic phosphates in the substrate of 0.5 to 2.4% by weight. and the pH of its 1% by weight aqueous solution thereof. is between 8 and 10, acting as a phosphate buffer directly endogenous phosphates.

Stabilizace 4-nitrofenylfosfátu fosfórečnanovým pufrem o pH 8 až 10 vychází z překvapivého zjištění, že přesné množství alkalického fosforečnanu mezi 20 až 97 milimoly na 1 mol substrátu již dostatečně 4-nitrofenylfosfát stabilizuje, aniž by fosforečnan ještě působil inhibičně při vlastní enzymové analýze fosfomonoesteras.The stabilization of 4-nitrophenyl phosphate with phosphate buffer at pH 8 to 10 is based on the surprising finding that an accurate amount of alkaline phosphate between 20 and 97 millimoles per mole of substrate already sufficiently stabilizes 4-nitrophenyl phosphate without the phosphate still inhibiting phosphomonoesterases.

Optimální koncentrace fosforečnanového pufru ve 4-nitrofenylfosfátu byla zjištěna experimentálně, na základě stanovení katalytické koncentrace alkalické fosfatasy ve směsném lidském séru se substráty s různým obsahem volných fosforečnanů, kdy byl současně sledován jejich vliv na katalytickou aktivitu séra a na stálost vodných roztoků 4-nitrofenylfosfátu. Bylo zjištěno, že vysoce čistý 4-nitrofenylfosfát s obsahem fosforečnanů nižším než 10 milimolů na·jeden mol, který prakticky není fosforečnanem pufrován, ještě nemůže účinně kompenzovat vliv kysele reagujících složek vznikajících při spontánní hydrolýze substrátu, které autokatalyzují jeho rozklad. Dvojnásobné množství fosforečnanu již vykazuje dostatečný pufrační účinek. Obsah fosforečnanů nad 97 milimolů na mol substrátu již může působit inhibičně př.i enzymové analýze. Podrobněji je vliv obsahu fosforečnanů patrný z tabulky uvedené v příloze.The optimal concentration of phosphate buffer in 4-nitrophenyl phosphate was determined experimentally on the basis of determination of catalytic concentration of alkaline phosphatase in mixed human serum with substrates with different content of free phosphates. It has been found that highly pure 4-nitrophenyl phosphate with a phosphate content of less than 10 millimoles per mole, which is practically not buffered by phosphate, still cannot effectively compensate for the effect of acidic reactants formed by spontaneous substrate hydrolysis that autocatalyze its decomposition. Double the amount of phosphate already shows a sufficient buffering effect. Phosphate contents above 97 millimoles per mole of substrate may already inhibit the enzyme assay. In more detail, the effect of the phosphate content is apparent from the table in the Annex.

Optimální pH fosforečnanového pufru pro stabilizaci 4-nitrofenylfosfátu bylo odvozeno z křivek hydrolýzy pufrovaných roztoků substrátu v závislosti na pH.a čase. Bylo zjištěno, že při pH mezi 8 až 10 jsou pufrované roztoky 4-nitrofenylfosfátu nejstálejší. Při nižším nebo i vyšším pří se zvyšuje rychlost štěpení esterové vazby. Protože se vlastní stanovení katalytické koncentrace fosfomonoesteras provádí vždy v roztoku pufrů o koncentraci 50 až 500 nunol/1 a obsah substrátu v inkubační směsi je obvykle mezi 5 až 20 mmol/1, neruší obsah stabilizujících fosforečnanů vlastní enzymové stanovení ani svým pufračním účinkem, nebot jejich koncentrace v inkubační směsi je proti koncentraci vlastního pufračního média pro fosfomonoesterasy nejméně dvacetpětkrát až dvěstěpadesátkrát nižší.The optimal pH of the phosphate buffer to stabilize the 4-nitrophenyl phosphate was derived from the pH and time hydrolysis curves of the buffered substrate solutions. Buffered 4-nitrophenyl phosphate solutions have been found to be most stable at a pH between 8 and 10. At lower or higher incidence, the rate of cleavage of the ester bond is increased. Since the actual determination of the catalytic concentration of phosphomonoesterases is always carried out in a buffer solution of 50 to 500 nunol / l and the substrate content in the incubation mixture is usually between 5 and 20 mmol / l, the phosphate stabilizing content does not interfere with the enzyme assay itself. the concentration in the incubation mixture is at least twenty-five to two hundred and fifty-fold lower than that of the phosphonone esterase buffer medium itself.

Stabilizace 4-nitrofenylfosfátu pomocí přesného množství fosforečnanového pufru o pH 8 až 10 má několik výhod. Umožňuje stabilizovat jednotným způsobem 4-nitrofenylfosfát jako substrát jak pro kyselé, tak i pro alkalické fosfomonoesterasy, nebot fosforečnan tvoří, na rozdíl od jiných médií, pro 4-nitrofenylfosfát přirozený pufr, který v uvedeném množství při enzymové analýze neinterferuje. Protože endogenní fosforečnan je vždy součástí 4-nitrofenylfosfátu, lze.syntézu nebo čištění substrátu řídit tak, aby obsahoval právě potřebné množství fosforečnanu o pH 8 až 10 nezbytné pro jeho stabilizaci.Stabilization of 4-nitrophenyl phosphate with an exact amount of phosphate buffer pH 8-10 has several advantages. It makes it possible to stabilize 4-nitrophenyl phosphate as a substrate for both acidic and alkaline phosphomonoesterases in a uniform manner, since, unlike other media, the phosphate forms a natural buffer for 4-nitrophenylphosphate, which does not interfere with this amount in enzyme analysis. Since endogenous phosphate is always part of 4-nitrophenyl phosphate, the synthesis or purification of the substrate can be controlled to contain just the necessary amount of phosphate at pH 8-10 necessary for its stabilization.

Příklad 1Example 1

Připraví se vodný roztok 4-nitrofenylfosfátu obsahující 100 mmol/1 substrátu a 2 mmol/1 dihydrogenfosforečnanu draselného. Jeho pH se upraví hydroxidem·draselným na 8 až 10. Roztok se uchovává v-chladu a temnu a je pro stanovení fosfomonoesteras použitelný nejméně dva týdny. Ve zmrazeném stavu je použitelný nejméně 4 měsíce.An aqueous solution of 4-nitrophenyl phosphate containing 100 mmol / l of substrate and 2 mmol / l of potassium dihydrogen phosphate is prepared. Its pH is adjusted to 8-10 with potassium hydroxide. The solution is kept cool and dark and is usable for at least two weeks for the determination of phosphomonoesterase. Shelf life at least 4 months when frozen.

Příklad 2Example 2

Z vysoce čistého 4-nitrofenylfosfátu, který obsahuje méně než 0,1 % hmot. volných fosforečnanových iontů, z chloridu draselného a z bezvodých solí hydrogenfosforečnanu sodného a dihydrogenfosforečnanu draselného se připraví tablety o hmotnosti 500 mg z tabletovací směsi obsahující:Of high purity 4-nitrophenyl phosphate containing less than 0.1 wt. of free phosphate ions, of potassium chloride and of the anhydrous salts of sodium hydrogen phosphate and potassium dihydrogen phosphate, are prepared into tablets of 500 mg in weight from a tabletting mixture containing:

4-nitrofenylfosfát, disodná sůl, hexahydrát Hydrogenfosforečnan disodný mol4-nitrophenyl phosphate, disodium salt, disodium hexahydrate Disodium hydrogen phosphate mol

0,095 molů0.095 moles

0,002 molů 5,3 molů0.002 moles 5.3 moles

Dihydrogenfosforečnan draselný Chlorid draselnýPotassium dihydrogen phosphate Potassium chloride

Tablety se uchovávají v temnu a chladu při teplotě poď +5 °C a jsou pro stanovení fosfomonoesteras použitelné nejméně jeden rok.The tablets should be stored in the dark and cool at a temperature of + 5 ° C for at least one year for the determination of fosfomonoesterases.

Příklad 3Example 3

Substrát pro stanovení fosfomonoesteras se připraví z disodné soli 4-nitrofenylfosfátu, hexahydrátu, který obsahuje na 1 mol substrátu 50 mmolů volných anorganických fosforečnanových iontů a jehož vodný roztok o koncentraci 1 % hmot. má pH 9,2.The substrate for the determination of phosphomonoesterases is prepared from the 4-nitrophenyl phosphate disodium salt, hexahydrate, which contains 50 mmol of free inorganic phosphate ions per 1 mol of substrate and whose aqueous solution at a concentration of 1% by weight. it has a pH of 9.2.

TabulkaTable

Stabilizovaný substrát pro stanovení katalytické aktivity fosfomonoesterasStabilized substrate for determination of catalytic activity of phosphomonoesterases

Vliv fosforečnanů ve 4-nitrofenylfosfátu na stanovení alkalické fosfatasyInfluence of phosphates in 4-nitrophenyl phosphate on determination of alkaline phosphatase

Obsah PO₄ v substrátu (% hmot.)Content of PO ₄ in substrate (% by weight) Stanovená aktivita fosfatasy'³'^ (^jkat/1)Determined phosphatase activity ' ³ ' ^ (^ jkat / 1) 0,20 0.20 5,13 5.13 0,26 0.26 5,06 5.06 1,27 1,27 4,99 4.99 2,08 2.08 5,08 5.08 2,56 2.56 ' 5,03 5.03

^a/ Obsah 0,2 % hmot. PO^ odpovídá obsahu 10 mmol PO^/mol substrátu Reprodukovatel stanovení aktivity asi + 6 % ^and / Content 0.2 wt. PO2 corresponds to a content of 10 mmol PO2 / mol of substrate

Claims

I will invent the object

Stabilized substrate for the determination of the catalytic activity of 4-nitrophenyl phosphate phosphomonoesterases, characterized in that it contains 20 to 97 millimoles of phosphate buffer at pH 8 to 10 per mole of 4-nitrophenyl phosphate, the phosphate buffer consisting of sodium or potassium salts of hydrogenphosphoric acid and dihydrogenphosphoric acid.

Severography, n

Price 2,40 Kčs