CS265578B1 - Stabilizovaný substrát pro stanovení katalytické aktivity fosfomonoesteras - Google Patents

Description

Vynález se týká stabilizovaného substrátu pro stanoveni katalytické aktivity fosfomonoesteras.

Alkalické a kyselé fosfomonoesterasy představují skupinu enzymů významných zejména v klinické enzymologii. Stanovení jejich katalytické koncentrace v krevním séru, plazmě nebo i jiných biologických tekutinách je důležitým diagnostickým prostředkem pro řadu onemocněni. Alkalická fosfatasa pro nemoci jaterního parenchymu, žlučových cest, kostního aparátu a podobně, kyselá fosfatasa hlavně pro maligní onemocnění prostaty, některých chorob kostních a pro hematologická vyšetření.

Stanoveni katalytických koncentraci alkalických i kyselých fosfomonoesteras se provádí nejčastěji tak, že sek roztoku substrátu v tlumiči o vhodném pH přidá vzorek biologického materiálu a sleduje se rychlost štěpení substrátu, které je katalyzováno enzymem. Při stanovení kyselé fosfatasy probíhá reakce ve slabě kyselém prostředí při pH kolem 5, stanovení alkalické fosfatasy se provádí ve slabě alkalickém roztoku při pH 9,5 až 10,5 v prostředí transfosforylačních médií, která umožňují přenos fosforečnanu ze substrátu na vhodný akceptor, jimiž jsou aminoalkanoly, které působí současně i jako pufry. Jsou to například diethanolamin, aminomethylpropanol nebo methylglukamin.

V poslední době je jako substrát používán téměř výhradně 4-nitrofenylfosfát, který je fosfomonoesterasami štěpen při enzymové reakci na 4'-nitrofenol a fosforečnan. Obsah •4-nitrofenolu, vzniklého při enzymové reakci, který je přímo úměrný katalytické koncentraci enzymu ve vzorku, se měři fotometricky v alkalickém prostředí jako žlutý nitrofenolát. Fotometrické měřeni se provádí v alkalickém prostředí nad pH 9, neboť disociační konstanta 4-nitrofenolu je asi 7,2.

Stanovení katalytické koncentrace fosfomonoesteras vyžaduje, aby substrát neobsahoval inhibující látky zpomalující enzymovou reakci, které mohou inhibivat enzym nebo zpomalovat enzymové štěpení substrátu. V případě 4-nitrofenylfosfátu jsou to zejména volný 4-nitrofenol a fosforečnan, které jsou jako nečistoty provázející syntézu v substrátu vždy přítomny. Podle Bowerse (G. N. Bowers, Jr., R. B. McComb, A. Upretti: Clin. Chem. 27, 135 až 143, 1981) může 4-nitrofenylfosfát vysoké čistoty obsahovat nejvýše 10 milimolů volného fosforečnanu a 0,3 milimolů 4-nitrofenolu na jeden mol substrátu.

Substrát 4-nitrofenylfosfát je jak v pevném stavu, tak zejména v roztoku značně nestálý. Spontánně se rozkládá a postupně v něm narůstá obsah obou rozkladných produktů, které inhibují při stanovení fosfomonoesteras enzymový rozklad substrátu, pravděpodobně mechanismem zpětné vazby.

Rozklad substrátu je katalyzován teplem, světlem, ale i látkami, které působí jako transfosforylační média pro stanovení fosfomonoesteras. Studiem vodných roztoků 4-nitrofenýlfosfátu o různém pH bylo zjištěno, že spontánní rozklad substrátu je katalyzován vodíkovými ionty. V kyselém prostředí probíhá nejrychleji, pomaleji v prostřed! neutrálním a nejpomaleji v prostředí slabě alkalickém. Protože produkty hydrolýzy 4-nitrofenylfosfátu postupně reakční médium okyselují, působí současně jako autokatalyzátory jeho rozkladu. Tak například vodný roztok vysoce čistého 4-nitrofenylfosfátu, jehož pH bylo nastaveno hydroxidem sodným na 8,5 změnil po týdnu pH na 7 a obsah volného 4-nitrofenolu se v roztoku zvýšil čtyřnásobně. Proměnné a postupně se zvyšující množství nečistot ve 4-nitrofenylfosfátu způsobuje změny v enzymové štěpitelnosti substrátu, a tím i změny ve výsledné katalytické aktivitě fosfomonoesteras. Tyto vlivy závažným způsobem snižují spolehlivost a správnost enzymologických vyšetření.

Uvedené nedostatky do značné míry odstraňuje stabilizovaný substrát na bázi 4-nitrofenylfosfátu. Jeho podstata spočívá v tom, že na 1 mol 4-nitrofenylfosfátu obsahuje 20 až 97 milimolů fosforečnanového pufru. Fosforečnanový pufr je tvořen sodnými nebo draselnými solemi kyselin hydrogenfosforečné a dihydrogenfosforečné. Pokud obsahuje substrát endogenní fosforečnan sodný v množství 20 až 97 milimolů na 1 mol substrátu, což odpovídá obsahu volných anorganických fosforečnanů v substrátu 0,5 až 2,4 % hmot. a pH jeho vodného roztoku o koncentraci 1 % hmot. je mezi 8 a 10, plní funkci fosforečnanového pufru přímo endogenní fosforečnany.

Stabilizace 4-nitrofenylfosfátu fosfórečnanovým pufrem o pH 8 až 10 vychází z překvapivého zjištění, že přesné množství alkalického fosforečnanu mezi 20 až 97 milimoly na 1 mol substrátu již dostatečně 4-nitrofenylfosfát stabilizuje, aniž by fosforečnan ještě působil inhibičně při vlastní enzymové analýze fosfomonoesteras.

Optimální koncentrace fosforečnanového pufru ve 4-nitrofenylfosfátu byla zjištěna experimentálně, na základě stanovení katalytické koncentrace alkalické fosfatasy ve směsném lidském séru se substráty s různým obsahem volných fosforečnanů, kdy byl současně sledován jejich vliv na katalytickou aktivitu séra a na stálost vodných roztoků 4-nitrofenylfosfátu. Bylo zjištěno, že vysoce čistý 4-nitrofenylfosfát s obsahem fosforečnanů nižším než 10 milimolů na·jeden mol, který prakticky není fosforečnanem pufrován, ještě nemůže účinně kompenzovat vliv kysele reagujících složek vznikajících při spontánní hydrolýze substrátu, které autokatalyzují jeho rozklad. Dvojnásobné množství fosforečnanu již vykazuje dostatečný pufrační účinek. Obsah fosforečnanů nad 97 milimolů na mol substrátu již může působit inhibičně př.i enzymové analýze. Podrobněji je vliv obsahu fosforečnanů patrný z tabulky uvedené v příloze.

Optimální pH fosforečnanového pufru pro stabilizaci 4-nitrofenylfosfátu bylo odvozeno z křivek hydrolýzy pufrovaných roztoků substrátu v závislosti na pH.a čase. Bylo zjištěno, že při pH mezi 8 až 10 jsou pufrované roztoky 4-nitrofenylfosfátu nejstálejší. Při nižším nebo i vyšším pří se zvyšuje rychlost štěpení esterové vazby. Protože se vlastní stanovení katalytické koncentrace fosfomonoesteras provádí vždy v roztoku pufrů o koncentraci 50 až 500 nunol/1 a obsah substrátu v inkubační směsi je obvykle mezi 5 až 20 mmol/1, neruší obsah stabilizujících fosforečnanů vlastní enzymové stanovení ani svým pufračním účinkem, nebot jejich koncentrace v inkubační směsi je proti koncentraci vlastního pufračního média pro fosfomonoesterasy nejméně dvacetpětkrát až dvěstěpadesátkrát nižší.

Stabilizace 4-nitrofenylfosfátu pomocí přesného množství fosforečnanového pufru o pH 8 až 10 má několik výhod. Umožňuje stabilizovat jednotným způsobem 4-nitrofenylfosfát jako substrát jak pro kyselé, tak i pro alkalické fosfomonoesterasy, nebot fosforečnan tvoří, na rozdíl od jiných médií, pro 4-nitrofenylfosfát přirozený pufr, který v uvedeném množství při enzymové analýze neinterferuje. Protože endogenní fosforečnan je vždy součástí 4-nitrofenylfosfátu, lze.syntézu nebo čištění substrátu řídit tak, aby obsahoval právě potřebné množství fosforečnanu o pH 8 až 10 nezbytné pro jeho stabilizaci.

Příklad 1

Připraví se vodný roztok 4-nitrofenylfosfátu obsahující 100 mmol/1 substrátu a 2 mmol/1 dihydrogenfosforečnanu draselného. Jeho pH se upraví hydroxidem·draselným na 8 až 10. Roztok se uchovává v-chladu a temnu a je pro stanovení fosfomonoesteras použitelný nejméně dva týdny. Ve zmrazeném stavu je použitelný nejméně 4 měsíce.

Příklad 2

Z vysoce čistého 4-nitrofenylfosfátu, který obsahuje méně než 0,1 % hmot. volných fosforečnanových iontů, z chloridu draselného a z bezvodých solí hydrogenfosforečnanu sodného a dihydrogenfosforečnanu draselného se připraví tablety o hmotnosti 500 mg z tabletovací směsi obsahující:

4-nitrofenylfosfát, disodná sůl, hexahydrát Hydrogenfosforečnan disodný mol

0,095 molů

0,002 molů 5,3 molů

Dihydrogenfosforečnan draselný Chlorid draselný

Tablety se uchovávají v temnu a chladu při teplotě poď +5 °C a jsou pro stanovení fosfomonoesteras použitelné nejméně jeden rok.

Příklad 3

Substrát pro stanovení fosfomonoesteras se připraví z disodné soli 4-nitrofenylfosfátu, hexahydrátu, který obsahuje na 1 mol substrátu 50 mmolů volných anorganických fosforečnanových iontů a jehož vodný roztok o koncentraci 1 % hmot. má pH 9,2.

Tabulka

Stabilizovaný substrát pro stanovení katalytické aktivity fosfomonoesteras

Vliv fosforečnanů ve 4-nitrofenylfosfátu na stanovení alkalické fosfatasy

Obsah PO4 v substrátu (% hmot.)	Stanovená aktivita fosfatasy'3'^ (^jkat/1)
0,20	5,13
0,26	5,06
1,27	4,99
2,08	5,08
2,56	' 5,03

^a/ Obsah 0,2 % hmot. PO^ odpovídá obsahu 10 mmol PO^/mol substrátu Reprodukovatel stanovení aktivity asi + 6 %

Claims (1)

1. předmEt vynalezu

   Stabilizovaný substrát pro stanovení katalytické aktivity fosfomonoesteras na bázi 4-nitrofenylfosfátu, vyznačený tím, že na 1 mol 4-nitrofenylfosfátu obsahuje 20 až 97 milimolů fosforečnanového pufru o pH 8 až 10, přičemž fosforečnanový pufr je tvořen sodnými nebo draselnými solemi kyselin hydrogenfosforečné a dihydrogenfosforečné.

   Severografia, n. p„ MOST

   Cena 2,40 Kčs