CS265179B1 - Způsob přípravy des-alanin 830 — vepřového insulinu - Google Patents

Abstract

Řešení se týká způsobu přípravy des-alanin B30 - vepřového insulinu enzymově katalyzovaným štěpením přirozeného vepřového insulinu s obsahem 0,3 až 0,6 % hmot. zinku. Des-alanin-B30-insulin je základním substrátem pro kondenzační reakce směřující k přípravě lidského insulinu a jeho derivátů.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy desalanin B30-vepřového insulinu enzymově katalyzovaným štěpením přirozeného vepřového insulinu.

Insulin, peptidový hormon, zasahující do řady životních funkcí, nemá totožnou primární strukturu u jednotlivých živočišných druhů. Lidskému insulinu je nejblíže z prakticky využívaných vepřový insulin, jenž se liší přítomností jediné aminokyseliny v poloze 30 B-řetězce, kde se nachází v případě lidského insulinu threonin, v případě vepřového alanin. Po řadu let rozvíjená metodika semisyntézy, využívající katalytické aktivity enzymů, v případě tvorby peptidové vazby hydrolytíckých enzymů z řady endopeptidas, našla bohaté uplatnění v obměnách přirozených insulinů. Semisyntetický převod přirozených zvířecích insulinů na lidský má řadu metodických přístupů, jež využívají specifické enzymy jak k fragmentaci a následné resyntéze, tak k transpeptidačním reakcím. Vepřový insulin je v této souvislosti nejen vhodným modelem, ale i prakticky využívaným substrátem. Nejčastěji využívanými enzymy jsou trypsin se speoifitou štěpení za bázickými aminokyselinami a karboxypeptidasy se secifitou karboxypeptidasy A. Fragmentace není u žádného z obou enzymů jednoznačnou záležitostí. Trypsin atakuje dvě místa v B-řetězci: vazbu tvořenou argininem v pozici 22 a glycidem v pozici 23, a lysinem v pozici 29 a alaninem v pozici 30. Karboxypeptldasa A odštěpuje koncové terminální aminokyseliny Asn²^ z řetězce A a alanin²^ z řetězce B. Cílem těchto enzymových přístupů je příprava des Ala B 30-insulinu, tj. fragmentu, modifikovaného pouze v jediné peptidové vazbě a to mezi lysinem v pozici 29 a alaninem v pozici 30 řetězce B.

Vepřový insulin je komplexován zinečnatými ionty v obsahu 0,3 až 0,6 i hmot., jež přispívají při vyšších koncentracích peptidu k jeho agregaci (dimer, tetramer až hexamer), jejich přítomnost však s biologickou aktivitou není svázána (J. Goldman, F. H. Carpenter, Biochemistry 13, 4 566, 1974). Vyšší stupeň agregace kineticky vede k znesnadnění přístupnosti enzymů k potenciálně štěpitelným vazbám, a proto se k přípravě insulinových fragmentů dosud vždy používal vepřový insulin, u něhož byl snížen obsah zinku na 0,035 až 0,06 % hmot. vysrážením nebo dialýzou insulinu v kyselém prostředí (S. S Wang, F. H. Carpenter, J. Biol. Chem. 244, 5 537, 1969, W. W. Bromer, R. E. Chance, Biochim. Biophys. Acta, 133, 219, 1967,

L. I. Slobin, F. II. Carpenter, Biochemistry 5 , 499, 1966 , F. H. Carpenter, W. E. Baum,

J. Biol. Chem. 237, 409, 1962, E. W. Schmitt, H. G. Gattner, Hope-Seylers Z. Physiol. Chem. 359, 799, 1978, K. Rose, H. dePury, R. E. Offord, Biochem. J. 211, 671, 1983, K. Inoye et al. v Peptide Chemistry 1978, str. 141, Protein Res. Foundation, Osaka, 1979).

Uvedené způsoby přípravy des-alanin B 30 insulinu, při nichž se snižuje obsah zinku, mají své velké nevýhody. Při snižování obsahu zinku dochází ke ztrátám materiálu, které mohou dosahovat až 30 až 35 % hmot., čímž je výrazně snížena ekonomika celého procesu. Výsledný proces je náročný i na čas a.práci potřebnou k odstranění zinečnatých iontů.

Způsob přípravy des-alanin B 30-vepřového insulinu podle vynálezu odstraňuje tyto nevýhody, nebot vychází přímo z vepřového insulinu, u něhož nebyl obsah zinku snížen. Je tak zmenšena pracnost i časová náročnost celé přípravy, především ale nedochází k velkým ztrátám, což podstatně zvýhodňuje ekonomickou bilanci procesu.

Jeho příprava spočívá ve specifickém enzymově katalyzovaném štěpení přirozeného vepřového insulinu s nesníženým obsahem zinku tj. 0,3 až 0,6 i hmot. karboxypeptidazou A při laboratorní teplotě v prostředí bazického pufru, s výhodou hydrogenuhličitanu amonného v rozmezí pH 8,1 až 8,5 (přítomnost NH^ iontů téměř eliminuje působení enzymu v řetězci A - Schmitt E. W., Gattner H. G., Hoppe - Seylérs Z. Physiols. Chem. 359, 799, 1978) po 20 až 24 h. Koncentrace insulinu s nesníženým obsahem zinku se pohybuje mezi 1 až 25 mg/ml, s výhodou 10 mg/ml a hmotnostní poměr insulinu k enzymu mezi 50 až 500:1 s výhodou 100:1. Produkt enzymové reakce - des-alanin B30-insulin je z reakční směsi izolován permeační a ionexovou chromatografií, která poskytne des-alanin B 30 insulin v homogenní formě.

Kvalitu karboxypeptidasy A je nutné kontrolovat s ohledem aktivit endopeptidasového charakteru. Des-alanin B 30-insulin byl s uplatněním dvou purifikačních principů získán ve výtěžku vyšším jak 60 * hmot. Nebylo kvalitativních ani kvantitativních rozdílů v prepa3 rátech des-alanin B 30-insulinu připravených jak z vepřového insulinu se sníženým obsahem 0,035 až 0,06 % hmot. tak s normálním obsahem zinku 0,3 až 0,6 % hmot.

Des-alanin B 30-insulin je základním substrátem pro kondenzační reakce směřující k přípravě lidského insulinu a jeho derivátů (Morihara K., Oka T., Tsuzuki H., Nátuře 280, 412, 1979, Rose, K. DePury H., Offord R. E., Biochem. J. 211, 671, 1983, Jonczyk A., Gattner H. G., Hoppe-Seylér s Z. Physiol. Chem. 362, 1 591, 1981}.

Příklad 1

Stanovení aktivity karboxypeptidasy A dle metody Slobina a Carpentera (Biochemistry 5, 499 (1966}).

Pro stanovení byly připraveny následující roztoky: A-2,03.10 mol/1 roztok enzymu r* 4 v 10 % hmot, chloridu draselného (molární extinkční koeficient pro enzym = 6,41.10

-1-1 2/8

l.mol .cm ); B-50 mmol/1 Tris/HCl pufr, pH 7,5, 1 mol/1 chloridu sodného; C-roztok substrá tu 10 mmol/1 Z-Gly~D,L~Phe v 0,02 mmol/1 hydroxidu sodného. Reakční směs byla připravena smícháním 1,5 ml roztoku B, 0,3 ml roztoku C a 1,1 ml destilované vody. Přidáním 0,1 ml roztoku A byla zahájena vlastní reakce, která byla provedena při teplotě 24 °C. Rychlost reakce byla stanovena ze změn absorbance při 225 nm v třicetisekundových intervalech po dobu tří minut. Specifická aktivita enzymu se pohybovala kolem 0,5 ^ikat/mg.

Příklad 2

Stanovení potenciální kontaminující tryptické a chymotryptické aktivity karboxypeptidasy A.

Pro stanovení byly připraveny následující roztoky: A - 1 mmol/1 roztok enzymu v 10 % hmot. chloridu draselného? B-50 mmol/1 Tris/HCl pufr pH 7,5 v 1 mol/1 chloridu sodného;

C - roztoky substrátů - 0,92 mmol/1 benzoyl-L-arginy1-p-nitroanilidu v 5 % hmot. dimethylformamidu (roztok Cp a 1 mmol/1 glutaryl-L-phenylalanyl-p-nitroanilid (roztok C2). Tryptická aktivita byla stanovena pomocí roztoku v následném uspořádání: k 3 ml roztoku B byl přidán 1 ml roztoku a reakce byla zahájena přidáním 0,1 ml roztoku A. Reakční směs byla ponechána při teplotě 24 °C 0 až 24 h, kdy v průběhu 24 h byla sledována případná hydrolýza benzoyl-L-alrginy1-p-nitroanilidu měřením absorbace při 406 nm. Chymotryptická aktivita byla sledována obdobným způsobem s výjimkou náhrady roztoku roztokem C^.

Příklad 3

Příprava insulinu se sníženým obsahem zinku.

Při odstraňování zinku ze vzorku vepřového insulinu bylo postupováno dle metody Carpentera (Arch. Biochem. Biophys. - 78, 539, (1958)). 150 mg insulinu bylo rozpuštěno v 10 ml

0,2 mol/1 kyseliny chlorovodíkové. Insulin byl potě vysrážen přidáním 180 ml vychlazeného acetonu (4 °C). Suspenze ponechaná přes noc při 4 °C byla odstředěna, sediment opakovaně promyt vychlazeným acetonem, odstředěn a po odsátí acetonu rozpuštěn v 0,5 mol/1 kyselině octové. Insulin byl isolován lyofilizací, jeho výtěžek byl 76 % hmot. (průměr z 5 pokusů). Obsah zinku v preparátu byl stanoven titrací chelatonem III v amoniakálním prostředí, kdy bylo nalezeno, že ve srovnání s původním preparátem (obsah zinku 0,4 % hmot.) dochází ke snížení obsahu na 0,05 % hmot.

Příklad 4

B 3 0

Příprava des-Ala -insulinu z vepřového insulinu se sníženým obsahem zinku.

400 mg vepřového insulinu se sníženým obsahem zinku bylo rozpuštěno v 40 ml 0,1 mol/1 hydrogenuhličitanu amonného pH 8,3. Bylo přidáno 0,2 ml 1 mmol/1 roztoku karboxypeptidasy A.

Hydrolitická reakce probíhala při teplotě 22 až 24 °C po dobu 22 hodin, v průběhu inkubace byly odebírány vzorky za účelem stanovení dosaženého stupně hydrolýzy. Po 22 hodinách byla reakční směs lyofilizována, sole a enzym byly odstraněny gelovou chromatografií na koloně Sephadexu G-25 fine (3,5x30 cm) v 1 mol/1 kyselině octové. Frakce obsahující des-Ala-insulin byly spojeny a lyofilizovány. Získaný produkt (339 mg, 85 % hmot. výtěžek) byl přečištěn ionexovou chromatografií na koloně DEAE-Sephadexu A-25 (3x20 cm) v 50 mmol/1 Tris/HCl pH 8,1 v přítomnosti 7 mol/1 močoviny, jak je ukázáno na obrázku 1. Vrchol označený X odpovídá des-Ala-insulinu, vrchol označený II odpovídá des-amidoA21-des-AlaB30-insulinu, A - elučni objem (ml), B - absorbance při 276 nm, C - koncentrace NaCl v elučnim pufru (mol/1). Frakce odpoB3 0 vídající vrcholu des-Ala -insulinu byly spojeny a lyofilisovány, získaný preparát byl odsolen gelovou chromatografií na koloně Sephadexu G-10 f (3,5x50 cm) v 1 mol/1 octové kyselině a zlyofilizován. Bylo získáno 244 mg des-Ala-insulinu, což představuje 61 % hmot. vzhledem k výchozímu množství vepřového insulinu. Produkt byl shledán homogenním při elektroforéze v polyakrylamidovém gelu. Získaný preparát byl dále podroben aminokyselinové analýze, jak je uvedeno v tab. I.

Tabulka 1

Výsledek aminokyselinové analýzy.

a) des-Ala-insulin, připravený ze zinku prostého vepřového insulinu;

b) des-Ala-insulin, připravený z vepřového Zn-insulinu;

c) vepřový Zn-insulin výchozí materiál.

	a)	b) Nalezeno	Vypočteno	c) Nalezeno	Vypočteno
Nalezeno	Vypočteno
Lys	0,97	1	0,89	1	0,97	1
His	1,92	2	1,92	2	1,88	2
Arg	0,89	1	0,94	1	0,98	1
Asp	2,88	3	2,79	3	2,88	3
Ihr	1,91	2	1,89	2	1,95	2
Ser	2,64	3	2,64	3	2,64	3
Glu	7,00	7	7,00	7	7,00	7
Pro	0,96	1	1,09	1	0,97	1
Gly	3,81	4	3,68	4	3,67	4
Ala	0,90	1	0,91	1	1,82	2
Val	3,54	4	3,29	4	3,39	4
Ile	1,41	2	1,32	2	1,31	2
Leu	6,18	6	5,74	6	5,89	6
Tyr	3,88	4	3,78	4	3,77	4
Phe	3,02	3	2,90	3	2,97	3

Příklad 5

B3 0

Příprava des-Ala -insulinu z vepřového Zn-insulinu.

B3 0

Z vepřového insulinu s obsahem zinku 0,4 % hmot. byl připraven des-Ala -insulin stejným postupem jako je uvedeno v příkladě 4. Výtěžek des-Ala^B^^-insulinu po gelové chromatografií byl 89 % hmot., po ionexové chromatografií 62 % hmot., vzhledem k výchozímu množství vepřového insulinu. Preparát byl podroben aminokyselinové analýze, výsledek je uveden v tabulce I.

Příklad 6

Stanovení uvolněného alaninu a asparaginu.

Uvolňování alaninu a asparaginu při štěpení insulinu karboxypeptidasou A bylo sledováno aminokyselinovou analýzou reakční směsi. Z reakční směsi bylo odebráno přesné množství odpovídající odhadem 200 až 300 nmol alaninu, Deproteinace byla provedena přidáním 1 ml 20% kyseliny trichloroctové. Po odstředění byl odebrán přesný objem, obsahující odhadem 100 nmol alaninu a odpařen. Aminokyselinová analýza byla provedena metodou podle Moora a Steina (Moore

Stein W. H. : Methods Enzymol. 6. 819 (1963)., na přístroji T-339 (Mikrotechna)). Z plochy vrcholu, odpovídajícího alaninu, bylo provnáním s plochou vrcholu přidané standardní aminokyseliny vypočteno množství uvolněného alaninu. Ani v jednom případě nebylo detegováno uvolnění asparaginu. Časový průběh štěpení insulinu karboxypeptidasou A je zachycen v obr. 2. kde je ukázána elektroforetická analýza průběhu přípravy des-Ala-insulinu. Elektroforesa byla provedena v 17% polyakrylamidovém gelu pH 8,9 a jednotlivé vzorky odpovídají rozdělení:

- výchozí materiál - vepřový Zn-insulin; 2 - vepřový zinku prostý insulin; 3 - vepřový des-Ala-insulin, přečištěný ionexovou chromatografií.

Claims (2)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   1. Způsob přípravy des-alanin B30-vepřového insulinu vyznačený tím, že přirozený vepřový insulin s obsahem zinku 0,3 až 0,6 % hmot. se stepí karboxypeptidasou A v prostředí bázického pufru s výhodou hydrogenuhličitanu amonného v rozmezí pH 8,1 až 8,5, přičemž koncentrace insulinu v roztoku se pohybuje mezi 1 až 25 mg/ml a hmotnostní poměr insulinu k enzymu mezi 50 až 500:1, načež se produkt enzymové reakce izoluje.
2. 2. Způsob podle bodu 1 vyznačený tím, že izolace se provádí permeační a ionexovou chromatografií .