CS262081B1 - Zařízení pro automatickou výrobu řady peptidů syntézou na pevné fázi - Google Patents

Abstract

Zařízení pro automatickou výrobu řady peptidů syntézou na pevné fázi, které se skládá ze zásobních lahví, ve kterých Je přetlak 20 až 50 kPa inertního plynu, spojených přes distribuční ventil se sériově zapojenými reaktory, které jsou spojeny přes čtyřcestný ventil s odpadem, a zásobník je propojen přes čtyřcestný ventil a peristaltické čerpadlo s distribučním ventilem a reaktory. Zařízení bylo s úspěchem využito pro syntézu řady peptidů současně.

Description

(54) Zařízení pro automatickou výrobu řady peptidů syntézou na pevné fázi

Zařízení pro automatickou výrobu řady peptidů syntézou na pevné fázi, které se skládá ze zásobních lahví, ve kterých Je přetlak 20 až 50 kPa inertního plynu, spojených přes distribuční ventil se sériově zapojenými reaktory, které jsou spojeny přes čtyřcestný ventil s odpadem, a zásobník je propojen přes čtyřcestný ventil a peristaltické čerpadlo s distribučním ventilem a reaktory.

Zařízení bylo s úspěchem využito pro syntézu řady peptidů současně.

Obr. <

Vynález se týká zařízení pro automatickou výrobu řady pepidů syntézou na pevné fázi.

V současné době je při základním výzkumu nových preparátů peptidového charakteru kladen požadavek získat k předběžnému testování velké soubory poměrně malých množství peptidů. Jak klasické provedení syntézy peptidů na pevné fázi v míchaném reaktoru, tak kontinuální průtočné zařízení, které vyžaduje aparaturu podobnou zařízení pro vysokoúčinnou kapalinovou chromatografií, tomuto trendu hevyhovují, protože syntetizují větší množství vždy jen jednoho peptidů. Připojování chráněných aminokyselin k polymernímu nosiči se provádí promývacími cykly, které většinou řídí automat. Aby bylo možné syntetizátor peptidů automaticky řídit, je nutné použít kompaktibilní cykly, takže všechny kroky syntézy jsou shodné s výjimkou připojování aminokyseliny. Tímto způsobem se syntetizují stále se opakujícími shodnými cykly jednotlivé peptidy. Současná zařízení však neumožňují přípravu několika různých peptidů vedle sebe, takže každé i sebemenší množství žádaných peptidů se musí připravovat samostatně. To je náročné hlavně časově, přitom spotřeba energie 1 surovin (zvláště rozpouštědel) je značná.

Uvedené nevýhody odstraňuje zařízení pro automatickou výrobu řady peptidů syntézou na pevné fázi, skládající se ze zásobních lahví pod tlakem, distribučního a vícecestného ventilu, průtočných reaktorů a peristaltického čerpadla podle vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že zásobní láhve, ve kterých je přetlak 20 až 50 kPa inertního plynu, jsou spojeny přes distribuční ventil se sériově zapojenými reaktory, které jsou spojeny přes vícecestný ventil s odpadem a zásobník je propojen přes vícecestný ventil a peristaltické čerpadlo s distribučním ventilem a reaktory.

Zařízení podle vynálezu umožňuje současnou výrobu řady různých peptidů a tím podstatně zkracuje dobu jejich přípravy. To má hlavní výhodu v tom, že je okamžitě k dispozici např. menší množství řady peptidů, potřebných třeba pro klinické zkoušky, další syntézu nebo výzkumné práce. Zařízením podle vynálezu dojde k efektivnějšímu využití všech surovin, energie i pracovní obsluhy, protože zvláště při miniaturizaci zařízení a jeho napojení na počítač je celá výroba řízena minimálním počtem lidí a z jednoho místa. Zařízení podle vynálezu podstatně zrychluje a zjednodušuje syntézu peptidů.

Na připojených výkresech je znázorněno zařízení podle vynálezu. Na obr. 1 je znázorněn v řezu jeden průtokový reaktor, na obr. 2 je schematicky nakresleno sériové zapojení řady reaktorů tak, jak bylo ověřeno v praxi autory vynálezu při přípravě řady nových peptidů.

Zařízení podle vynálezu se skládá ze zásobních lahví 1, ve kterých jsou připravena různá rozpouštědla a roztoky činidel jako např. DMF, DCM, DIEA v DCM, TFA v DCM apod. Ze zásobních lahví 1 jsou teflonovými hadičkami 7 přes distribuční ventil 2 napouštěny žádané roztoky do reaktorů 4, které jsou sériově propojeny a jejichž počet není omezen. V konkrétním případě je možno zařízení použít i jen pro jeden reaktor 4, přičemž velikost reaktorů 4 se řídí potřebou připravovaného množství peptidů. Z reaktorů 4 vedou teflonové hadičky 7 přes čtyřcestný ventil 3 do odpadu 8, kde se shromažďují již nepotřebná rozpouštědla. Zásobník 6, ve kterém je aktivovaná chráněná aminokyselina, je spojen teflonovými hadičkami 7, přes čtyřcestný ventil 3 a peristaltické čerpadlo 5 a distribuční ventil 2 s reaktory 4.

Zařízení podle vynálezu pracuje tak, že ze zásobních lahví 1, které jsou pod tlakem inertního plynu, jehož hodnota se vyrovnává pojistnými tlakovými ventily, nadávkuje příslušný roztok přes distribuční ventil 2 do reaktorů 4. V reaktoru 4 je polymerní nosič, upravený benzhydrylaminovými skupinami nebo chlormetylovanými skupinami esterifikovanými karboxyterminální aminokyselinou, na který se postupně přikondenzovávají aktivní chráněné aminokyseliny, které se předem mimo připraví a shromažďují v zásobníku 6. Tyto chráněné aminokyseliny se ze zásobníku 6 vedou přes čtyřcestný ventil 3 a peristaltické čerpadlo 5 a distribuční ventil 2 do reaktorů 4. Po nadávkování chráněné aminokyseliny se přepne čtyřcestný ventil tak, aby ACA recirkulovala v okruhu, který tvoří peristal-. tické čerpadlo 5, distribuční ventil 2, reaktor 4 a čtyřcestný ventil 3. Po ukončení reakce, která se sleduje ninhydrinovým testem, se čtyřcestný ventil přepne do původní polohy a ACA se vymyje z reaktorů 4 a příslušné kontaminované části zařízení rozpouštědlem přímo do odpadu 8. Reaktory jsou určeny typem chráněné aminokyseliny, kterou je nutné kondenzovat, a proto před každým reakčním cyklem se operativně mění počet sériově zapojených reaktorů 4.

Reaktor 4 je sériově vyráběná polypropylenová chromatografická kolonka, opatřená uvnitř dvěma síťkami, mezi kterými je polymerní nosič a zvenku má 2 kónické 'koncovky, které umožňují sériové zapojení reaktorů. Vlastní reaktor 4 je ovšem možné vyrobit ze skla či jiného vhodného materiálu, přičemž vždy je nutno splnit požadavek přesného zhotovení do sebe zapadajících koncovek. Velikost reaktorů je určena množstvím připravovaných peptidů.

V zařízení podle vynálezu se syntetizují peptidy na pevné fázi s použitím průtočných reaktorů zapojených do série, v kterých je umístěno malé množství polymerního nosiče a tak je možné připravit větší počet peptidů v množství dostatečném pro orientační biologické testy. Při vlastním ověřování zařízení podle vynálezu se osvědčily polypropylenové průtokové reaktory s dvojitými síťkami, zabraňujícími míšení nosiče, které se běžně používají k předchromatografii při vysokoúčinné kapalinové chromatografii (dále jen HPLC). V zařízení podle vynálezu se do reaktoru umístí polymerní nosič. Reaktory jsou opatřeny koncovkami, podobnými špičce jednorázové injekční stříkačky, které je možné do sebe zasunout. Takovouto sérií reaktorů lze protlačovat kapalinu oběma směry pouhým mírným přetlakem nosného plynu (vzduch, dusík). Syntézu je možno kdykoliv přerušit zrušením přetlaku.

Jednotlivé reaktory se mohou ze série vyřadit nebo naopak nový reaktor zařadit. Této přednosti se nejvíce používá právě při syntéze podobných peptidů, které se liší v jedné aminokyselině, případně vynecháním aminokyseliny nebo zařazením jedné aminokyseliny navíc. Principiálně lze však zařízení použít při syntéze velkého souboru peptidů (více než stoj. Reaktory se pak budou spojovat k zařazení žádané aminokyseliny nezávisle na počtu připojených aminokyselin.

Následující příklady provedení zařízení podle vynálezu pouze dokládají, ale nijak neomezují.

Příklad 1

Do polypropylenových reaktorů (20 X 4 milimetry, volný obsah 0,7 ml) se umístí 150 mg benzhydrylaminového polymerního nosiče (0,8 mmolu/g). Reaktory se označí a zapojí do série. Cykly syntézy sestávají z následujících promývacích kroků:

1. 50 % TFA v DCM,

2. DCM,

3. 10 % DIEA v chloroformu,

4. DCM,

5. DMF,

6. roztok 5 mmolů HOBt esteru aminokyseliny v DMF,

7. DCM.

První syntetický cyklus začíná krokem 2. V sérii jako poslední ve směru toku činidel byl zařazen reaktor, z kterého byly odebírány vzorky. V případě pozitivního· testu na volnou aminoskupinu po provedené kondenzaci byly kroky č. 6 a 7 opakovány a do roztoku aktivní komponenty bylo přidáno katalytické množství dimethylamidopyridinu (100 mg). V jednotlivých cyklech byly připojeny následující chráněné aminokyseliny:

BocLeu, Boc-Pro, Boc-Asn,

Boc-Arg(Tos), Boc-Ser(Bzl),

Boc-Asp( OBzl], Boc-Arg(Tos),

Boc-Tyr(Z), Boc-Tyr(Z) a Boc-Val.

Postupně byl vždy na jeden cyklus (zařazení jedné aminokyseliny) vyřazen jeden reaktor. Výjimku tvoří první a poslední reaktor ve směru toku činidel, který byl ponechán v sérii celou syntézu a na vyřazení tyrosinu ze sekvence byl použit pouze jeden reaktor. Hmotnostní přírůstek byl cca 100 miligramů na reaktor. Jednotlivé peptidyl-pryskyřice byly štěpeny kapalným fluorovodíkem s přídavkem 5 % p-kresolu, 1 horinu při 0 °C. Po odpaření fluorovodíku byl p-kresol extrahován chladným ethylacetátem a peptid byl rozpuštěn ve 20% kyselině octové. Po lyofilizaci byly surové produkty (20,2 až 47,2 mg] analyzovány na HPLC chromatografu a bylo zjištěno aminokyselinové složení. Výsledky jsou uvedeny v tabulkách č. 1 a 2.

TABULKA 1

Aminokyselinové analýzy jednotlivých nových peptidů

Peptid Ak Aminokyselinová analýza

č.	vynech.	Val	Tyr	Arg	Asp	Ser	Pro	Leu
1	Leu	0,91	1,83	2,13	2,08 2,15	1,04	1,01
2	Pro	0,94	1,74	2,07	1,00	—	1,10
3	Asn	0,91	1,71	2,09	1,08	1,04	1,08	1,10
4	Arg	0,94	1,88	0,95	2,08	0,97	1,04	1,12
5	Ser	0,97	1,84	2,06	2,05	—	1,01	1,06
6	Asp	0,90	1,78	2,10	1,15	1,02	1,09	1,12
7,	Arg	0,93	1,56	1,12	2,12	0,98	1,10	1,16
8	Tyr	0,88	0,84	2,06	2,08	0,97	1,06	1,10
9	Val	—	1,67	2,10	2,04	0,94	1,09	1,15
10	!-	0,87	1,78	2,04	2,08 2,10	0,97	1,13	1,14
11	/—	0,90	1,79	2,06	0,96	1,09	1,09

TABULKA 2
Analytická a	fyzikální data jednotlivých nových peptidů
Peptid č.	Ak vynech.	Výtěžek Rt (mg) (min.)	Obsah* (%)	Rt (min.)	Obsah** (%)

1	Leu	35,2	4,10	84,6	6,34	92,6
2	Pro	20,2	6,37	88,4	12,54	86,2
3	Asn	24,1	8,87	94,9	20,29	93,8
4	Arg	37,3	12,72	85,9	25,58	89,9
5	Ser	47,2	11,95	93,7	26,49	94,8
6	Asp	42,1	11,18	90,0	26,95	91,0
7	Arg	39,4	14,26	89,1	28,65	85,0
8	Tyr	21,4	8,34	93,6	19,61	86,3
9	Val	44,8	8,88	85,9	21,72	94,5
10***	—	35,0	12,63	88,4	27,09	89,3
H»»·	—	27,0	12,71	87,9	27,10	87,8
Retenční časy	(min.) a	obsahy peptidů	(%) získané	vysokoúčinnou kapalinovou	chro-

matografií za podmínek:

(*) isokraticky 40 % methanolu ve vodě obsahující 0,1 °/o TFA, průtok 25 ml/hod., kolona 150 x 3 mm plněná silikagelem s hydrofobními uhlíkatými zbytky, detekce UV při 220 nm, (**) gradientově fáze A methanol, fáze B voda obsahující 0,1 % TFA, profil gradientu:

čas (min) 0 15 35 36 obsah fáze A v B (%) 23 38 38 23 průtok 0,1 ml/min, kolona 150 x 2,1 mm, detekce UV 210 nm a 280 nm, (***) peptidy č. 10 a 11 byly syntetizovány v prvním a posledním reaktoru.

Vysvětlivky zkratek použitých v textu: Arg — arginin

Leu — leucin

ACA — aktivovaná chráněná aminokyselina Pro — prolin

DMF — dimetylformamid Ser — serin

DCM — dichlormetan Tyr — tyrosin

TFA — kyselina trifluoroctová Val — valin

DIEA — dlisopropyletylamin Boc — t-butyloxykarbonyl

HOBt — hydroxybenztriazol OBzl — benzyloxy

Asn — asparagin Z — benzyloxykarbonyl

Ašp — kyselina asparagová

Claims (1)

1. PŘEDMĚT

   Zařízení pro automatickou výrobu řady peptidů syntézou na pevné fázi, sestávající ze zásobních lahví pod tlakem, distribučního a vícecestného ventilu, průtočných reaktorů a peristaltického čerpadla, vyznačující sě tím, že zásobní láhve (1), ve kterých je přetlak 20 až 50 kPa inertního plynu,

   VYNALEZU jsou spojeny přes distribuční ventil (2) se sériově zapojenými reaktory (4), které jsou spojeny přes ětyřcestný ventil (3) s odpadem (8) a zásobník (6) je propojen přes ětyřcestný ventil (3) a peristaltlcké čerpadlo (5) s distribučním ventilem (2j a reaktory (4).