CS261584B1 - Způsob získání klonů baktérií Escheriohia coli, vybavených protektivním antigenem 987P - Google Patents

Abstract

Řeší se způsob, který umožňuje získat klony baktérií Escheriohia coli, vybavené protektivním antigenem 987P, určené k přípravě imunopreparátů. Toho se dosáhne tak, že z uložených produkčních kmenů E. coli se naočkuje tekutá živná půda a inkubuje se stacionárně př| 37 °C az do vytvoření blanky na hladině. Část vytvořené blanky se přeočkuje na pevnou půdu. Drobné kolonie vyrostlé na teto půdě se vyšetří aglutinací se sérem 987P a v případě pozitivní aglutinaoe se zbytek kolonie přeočkuje do tekuté živné půdy.

Description

Vynález se týká způsobu získání klonů baktérií Escherichia coli, vybavených protektivním antigenem 987P, určených k přípravěimunopreparátů,k diagnostice, prevenci a léčbě specifického průjmového onemocnění selat.

Průjmová onemocnění novorozených selat ve velkochovech představují stále závažný ekonomický problém. Převážná část těchto onemocnění má infekční etiologii. Kromě epizooticky se vyskytující virové gastroenteritidy typu TGE (transmissible gastroenteritis of pigs) uplatňují se v komplexu průjmových onemocnění novorozených selat hlavně enzooticky probíhající enterální koliinfekce a infekce rotavirové.

Enterální koliinfekce selat ‘jsou vyvolávány enterotoxigenními typy baktérii Escherichia coli (ETEC), které mají dva podstatné faktory virulence:

a) Produkují enterotoxin bučí termolabilní - antigenní (LT), nebo termostabilní - neantigenní (ST), nebo oba, které svým účinkem na střevní sliznici (aktivací adenyl - nebo puanylcyklázy) narušují fyziologický transport iontů, čímž se zvýší střevní sekrece na úkor resorpce a dochází ke vzniku průjmů, vedoucích často k dehydrataci a hynutí.

b) Na svém povrchu jsou .vybaveny velmi jemnými vláknitými strukturami (fimbrie, pili), které jsou odpovědné za adhezi bakterií ke sliznici střeva. Tyto proteinové struktury, zvané adheziny nebo kolonizační faktory, umožňují svým nosiI v tělům kolonizacajsliznice tenkého střeva, zabraňují jejich odstranění střevní peristaltikou a tak umožňují působení enlerotoxinů vylučovaných do prostředí, tedy přímo na povrch sliznice.

Účinná obrana novorozených selat proti enterálním koliinfekcím je realizovatelná přísunem specifických protilátek proti kolonizačním faktorům (adhezinům) ETEC do lumen střeva.

261 S84

To je možné bučí sáním kolostra a mléka od imunizovaných matek, nebo perorálním podáváním specifických sér·

U kmenů ETEC ze selat jsou evidovány tří antigenně odlišné typy kolonizačníeh faktorů, nesoucích označení K88, K99 a 987P.

Přítomnost kolonizačníeh faktorů v kulturách ETEC závisí od kultivačních podmínek, nejsou např. produkovány při teplotě do 20 °C. Exprese antigenu K99 vyžaduje kultivační mé’dium s limitovaným kvantem živin a přítomností řady stopových prvků (Minca medium - minimální kaseinhydrolyzátové medium) . Produkce faktoru 9S7P podléhá variaci: P+ #—* P- se sklonem k převaze fáze P—, což znamená, že při pasážování kultur s původní přítomností 987P dochází ke ztrátě tohoto antigenu.

V současné době je komerčně vyráběna Vakcína proti koliinfekcím selat K88, K99, k jejíž produkci jsou používány ETEC tří sérotypů: O147'.K88ab, 0149:K88ac a 0101 :K99. Kmen s kolonizačním faktorem 987P v ní zařazen není. Při zavádění uvedené vakcíny do výroby v r. 1983 nebyly ještě překonány potíže podmíněné fenotypovou fázovou variací v produkci faktoru 987P.

Na odlišné postavení faktoru 987P ve srovnání s faktory K88 a K99 ukazují některáfadělení z poslední doby. GAASTRA a DE GRAAF (1982) uvádějí detailní genetickou mapu a sled aminokyselin u K88 a K99« Avšak u faktoru 987P tyto údaje chybějí; autoři uvádějí jen rozměr průměru fimbrií (7nm), molekulární hmotnost (18 900) a izoelektrický bod (3,7). R.E. ISAACSON, pracovník, který se po léta zabývá kolonizačními faktory ETEC a obzvláště faktorem 987P, uvádí ve sdělení z r. 1986 přípravu vakcíny proti enterálním koliinfekcím novorozených selat, která obsahuje izolované pili K88, K99 a 987?· Faktory K88 a K99 jsou získávány z bakteriálních kmenů připravených technikou rekombinace DNK. Tato technika je pro producenty obou typů fimbrií detailně popsána. U faktoru 987P je jen krátce uvedeno, že je získáván z kultury kmene E. coli, který jej vytvářel. Způsob, jak získat klony baktérií E. coli, vybavených protektivním antigénom 987P se neuvádí.

Z toho je zřejmé, že při produkci faktoru 987P jsou určité potíže. Tyto potíže byly překonány pracovním postupem, který je předmětem vynálezu, jehož podstata spočívá v tom, že inokulum z konzervy produkčního kmene E. coli se inkubuje stacionárně při 37 °C v tekutém živném mediu až do vytvoření blanky na hla- 3 261 584 dine a po IShodinové inkubaci při 37 °C se vyhledávají a vyšetřují drobné kolonie aglutinací se sérem anti 9871, přičemž zbytek pozitivně aglutinující kolonie se přeočkuje do tekutého živného media»

K inkubaci inokula z konzervy se může výhodně použít 2,5% masopeptonového bujónu s obsahem lOg masového výtažku, lOg peptonu a 5g chloridu sodného v. 1 litrů»

Část blanky z bujónu se může rozočkovat výhodně po. krevním agaru, po jehož inkubaci při 37 °C še získá směs velkých a drobných kolonií. Zbytek, drobné kolonie, pozitivně aglutinující se sérem anti 937P, se může výhodně přeočkovat do 2,5% masopeptonového bujónu.

Kultury ETEC s kolonizačním faktorem 9871 se vyznačují tím, že obsahují směs bakteriálních buněk vybavených faktorem 9S7P (fáze P+) a bakteriálních buněk bez tohoto faktoru (fáze P-)®

Při jejich běžném pasážování na živných půdách dochází k převládnutí fáze P— a vymizení fáze P+.Avšak pouze fáze P+ představuje protektivní antigen. Fáze P+ se vyznačuje hydrofobním charakterem, takže při stacionární kultivaci v tekutém mediu se její menší část boncentruje na povrchu media a vytváří jemnou blanku. Tomuto úkazu se věnuje v bakteriologických laboratořích pozornost zřídka. V daném případě je to však rozhodující bod. Tato blanka představuje důležitou fázi pro získání klonu bakteriálního kmene s převahou buněk vybavených kolonizačním’faktorem 987P. S kulturou v tekutém mediu s vytvořenou blankou je třeba zacházet velmi opatrně, jelikož i při nejmenším nárazu na zkumavku s kulturou klesne blanka do kultury»

Z blanky na povrchu kultury se opatrně' odočkuje do další tekuté půdy a na pevné půdy, např. na masopeptonový agar (I,TA) nebo krevní agar (KA) na Petriho miskách» Při rozočkování do izolovaných kolonií vyrůstají na pevných půdách rozdílné kolonie větší, bílé, obsahující jen fázi P-, kolonie menší, bílé, obsahující směs obou fází, a kolonie našedlé menší, které obsahuji převahu fáze P+.

Příklad 1

Ze zásobní kultury na Dorsetově půdě se naočkuje čo 2 zkumavek s masopeptonovým bujónem, na Petriho misku s krevním agarem (KA) a na Petriho misku s Endovou -půdou. Po IShodinové inkubaci (37 °C) se kultury v bujónu ve zkumavkách opatrně vyjmou z termostatu a prohlédnou se na tvorbu blanky na povrchu. Pokud se blanky nevytvo řila, vrátí se kultury do termostatu (37 °C) a prohlížejí se po další 2 dny, až se blanka na hladině bujónu vytvoří. Zpočátku je i

- 4 261 584 blanka velmi jemná bělavě našedlá, s postupnou inkubací sílí. Z vytvořené blanky se opatrně odočkuje na další KA. Po 18hodinové inkubaci inokulátu na KA (37 °C) se zkontroluje růst, který je tvořen většími a drobnými koloniemi. Z drobné našedlé kolonie na KA se klič kou odebere malý podíl a provede se vyšětření sklíčkovou aglutinací se sérem anti 987P« Ze zřetelně pozitivně reagujících kolonií se zbytek použije k založení zásobních kultur na Dorsetově půdě a k na očkování bujónu určeného k přípravě inokula k výrobě vakcíny nebo přímo k imunizaci zvířat k získání séra anti 987P· Po naočkování se Dorsetova půda i bujpn inkubují 18 hodin při 37 °C. Dorsetova půda s narostlou kulturou (zásobní kultura) se uloží při teplotě 4 °C a slouží jako konzerva. Kultura narostlá v bujónu je určena jako inokulum k výrobě vakcíny.

Příklad 2

Do fermentoru naplněného sterilní kaseinhyórolyzátovou půdou za hřátou na 37 °C se přenese kultura narostlá v bujónu podle příkladu 1 a kultivuje se submersně při 37 °C do dosažené koncentrace 2<IC>9 koloniformních jednotek v 1 ml. U narostlé kultury se provede zkouška čistoty vyočkováním na KA a Endovu půdu a provede se kontrola přítomnosti protektivního antigenu aglutinací se sérem anti 987P* Kultura se inaktivuje přidáním 0,5% formalínu. Po inaktivaci se přidá sterilní gel hydroxidu hlinitého jako adjuvans v množství 2 litry na 8 litrů bakteriální kultury a dobře se promísí.

Vakcína je určena k imunizaci březích prasnic, které chrání sající selata před infekcí prostřednictvím protilátek obsažených v sekretech mléčné žlázy.

Claims (4)

1. PŘEDMĚT VYNÁLEZU

   261 584

   1. Způsob přípravy klonů baktérií Escherichia coli produkujících antigen 987P, vyznačující se tím, že inokulum z konzervy produkčního kmene E. coli se inkubuje stacionárně pii 37 °C v tekutém živném mediu až do vytvoření blanky na hladině, část blanky se potom rozočkuje po pevné živné půdě a po 18hodinové inkubaci při 37 °C se vyhledávají a vyšetřují drobné kolonie aglutinací se sérem anti 9S7P, přičemž zbytek pozitivně aglutinující kolonie se přeočkuje do tekutého živného media.
2. 2. Způsob přípravy klonů baktérií Escherichia coli podle bodu 1,vyznačující se tím, že k inkubaci inokula z konzervy produkčního kmene se použije 2,5% masopeptonového bujónu s obsahem lOg masového výtažku, lOg peptonu a 5g chloridu sodného' na 1 litr.
3. 3. Způsob přípravy klonů baktérií Escherichia coli podle bodů 1 a 2/vyznačující se tím, že část blanky se rozočkuje po krevním agaru, po jehož inkubaci při 37 °G se získá směs velkých a drobných kolonií.
4. 4. Způsob přípravy klonů baktérií Escherichia coli !'·!?( I p

   Po

   1 sž vy f-n'-'.''i'jí <?:' se tím, že zbytek drobné kolonie pozitiv ne aglutinující se sérem anti 987P se přeočkuje do 2,58 ma sopeptonového bujónu s obsahem lOg masového výtažku, lOg pe ptonu a 5g chloridu sodného na 1 litr.