CS261172B1

CS261172B1 - Způsob stanovení proteolytických enzymů

Info

Publication number: CS261172B1
Application number: CS871673A
Authority: CS
Inventors: Dagmar Heinova; Michal Bartik; Evzen Kasafirek
Original assignee: Dagmar Heinova; Michal Bartik; Evzen Kasafirek
Priority date: 1987-03-12
Filing date: 1987-03-12
Publication date: 1989-01-12
Also published as: CS167387A1

Abstract

Řešení se týká způsobu stanovení aktivity proteolytických enzymů; v první fázi se vychází z reakce vzorku s chromogenním substrátem typu tetrapeptidických derivátů p-nitroanilidu při pH nižším než 5, v druhé fázi'pak štěpením vzniklého p-nitroanilidu aminokyseliny působením aminopeptidázy při pH vyšším než 7,5 a spektrofotometrickým stanovením uvolněného p-nitroanilinu při 405 nm. Novým znakem řešení je použití sloučenin obecného vzorce I jako chromogenního substrátu, zejména pGlu-His-Phe-Phe-NAn a kuřecího séra jako zdroje aminopeptidázy. Řešení má význam v klinické praxi a v potravinářském průmyslu.

Description

Vynález se týká způsobu stanovení aktivity proteolytických enzymů, tzv. aspartátových proteináz, zejména pepsinu nebo chymosinu.

Jak je známo, má stanovení aktivity některých proteolytických enzymů, na předním místě pepsinu, velkou diagnostickou hodnotu při klinických vyšetřovacích metodách. Aktivita chymosinu je především sledována v potravinářském, zejména mlékárenském průmyslu, při hodnocení tzv. syřidla (chymosinu).

Ze substrátové specifity pepsinu je známo, že tento enzym štěpí peptidickou vazbu mezi dvěma aromatickými aminokyselinami, zatímco chymosin (rennin) štěpí vazbu mezi fenylalaninem a methioninem, popřípadě norleucínem.

Ačkoliv pepsin patří mezi vůbec nejdéle známé enzymy, sledování jeho aktivity se zatím v širší míře neuplatnilo v diagnostické praxi, především proto, že známé metody byly pracné, málo citlivé nebo náročné na vybavení. Doposud se ke stanovení aktivity jmenovaných enzymů používaly přirozené (hemoglobin, kasein) nebo syntetické substráty, jejichž štěpné fragmenty byly detegovatelné v ultrafialové oblasti, a to přímou nebo diferenční spektrofotometrií, popřípadě barevnou reakcí, například ninhydrinem, ve viditelné oblasti.

Určitý pokrok v oboru stanovení aktivity pepsinu znamenalo použiti tzv. chromogenních substrátů, syntetických tri- nebo pentapeptidických derivátů p-nitroanilidu, typu pGlu-Phe-Phe-NAn nebo pGlu-Ala-Ala-Phe-Leu-NAn (Ε. N. Lysogorskaja se sp., Bioorgan. Chimija 9,

470 (1983); I. J. Filippova se sp., Bioorgan. Chimija 10, 390 (1984)). Toto stanovení je nepřímé a probíhá ve dvou fázích; pepsin jako endopeptidáza odštěpuje v první fázi (při hodnotě pH nižší než 5) z přítomného substrátu bezbarvý Leu-NAn, resp. Phe-NAn, který se v druhé fázi (pH okolo 7, po přídavku leucinaminopeptidázy kvantitativně štěpí a uvolní barevný p-nitroanilin. Intensita vzniklého zbarvení se hodnotí spektrofotometricky, množství uvolněného p-nitroanilinu je mírou aktivity pepsinu.

Tato metoda byla však pro širší klinické a diagnostické použití omezena především požadavkem na vysokou čistotu leucinaminopeptidázy, která je formě komerčního preparátu velmi drahá. Další omezení tkví v tom, že chromogenní substráty popsaného typu jsou použitelné jen pro stanovení aktivity pepsinu, pro stanovení aktivity dalších enzymů například chymosinu (rennánu) a některých katepsinů se nehodí. Dalším omezením použitelnosti těchto substrátů je jejich špatná rozpustnost ve vodě.

Cílem vynálezu bylo tedy odstranění zmíněných omezení a nalezení takových chromogenních substrátů a takových podmínek, které by umožnily aplikaci popsané metody kromě pepsinu i na další významné proteolytické enzymy. Vynález vychází z podobného principu, který byl popsán výše, ale s tím podstatným rozdílem, že jako chromogenní substráty slouží chemicky odlišné syntetické peptidické deriváty p-nítroanilidu, v jejíchž molekule jsou vestavěny hydrofilní zbytky, například histidinu; přednosti N-terminálniho hydrofilního zbytku, například pGlu-His byly prokázány již dříve u nechromogenního substrátu pro pepsin (AO 209 740). Navíc drahou leucinaminopeptidázu ve formě vysoce purifikovaného preparátu se podařilo úspěšně nahradit jinými zdroji aminopeptidáz, velmi levnými a snadno dostupnými, s nimiž lze dosáhnout přesných a reprodukovatelných výsledků, upotřebitelných v praxi.

Vynález se týká způsobu stanovení aktivity proteolytických enzymů, zejména pepsinu *

nebo chymosinu, v první fázi nejprve reakcí zkoumaného vzorku.se syntetickým chromogennlm substrátem typu tetrapeptidického derivátu p-nitroanilidu v prostředí s hodnotou pH nižší než 5, zastavením této reakce úpravou pH na hodnotu 7,5, v druhé fázi pak štěpením vzniklého p-nitroanilidu aminokyseliny působením aminopeptidázy v prostředí s hodnotou pH 7,6 a spektrofotometrickým stanovením uvolněného p-nitroanilinu při 405 nm; jeho podstata spočívá v tom, že se jako chromogenního substrátu používá sloučeniny obecného vzorce I

(I) ve kterém značí:

X atom vodíku, 3-karboxyalkankarbonylovou skupinu s 3 až 5 atomy uhlíku nebo alkankarbonylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku,

A zbytek kyseliny pyroglutámové, kyseliny asparágové, kyseliny glutámové, glycinu nebo 2-oxoimidazolidin-l-karbonyl,

B zbytek histidinu, glycinu nebo prolinu,

C zbytek fenylalaninu, leucinu, norleucinu, methioninu nebo S-alkylcysteinu, kde alkyl má 1 až 3 atomy uhlíku a jako zdroje aminopeptidázy kuřecího séra.

Látky obecného vzorce I, tj. p-nitroanilidy acylovaných nebo volných tetrapeptidů, upotřebitelné při realisací způsobu podle vynálezu, tvoří skupinu nových specifických chromogenních substrátů pro proteolytické enzymy, které štěpí v kyselé oblasti pH: pepsin, gastricsin, chymosin (rennin) a některé kathepsiny.

I když uvedené skupiny sloučenin obecného vzorce I je pro účely vynálezu upotřebitelných více látek, především podle místa štěpitelné vazby (primární interakce), pozornost se soustředila na výběr substrátů s N-terminálním hydrofilním zbytkem, tj. se zbytkem kyseliny glutarové, histidinem a 2-oxoimidazolidin-l-karbonylem, které významně ovlivňují rozpustnost substrátů, viz č. AO 209 740. Za tím účelem byl proveden časový průběh hydrolysy pepsinem substrátů: pGlu-His-Phe-Phe-NAn (I), Glt-Gly-Gly-Phe-Phe-NAn (II) a EUC-His-Phe-Phe-NAn (III), kde NAn značí zbytek 4-nitroanilinu, Git značí zbytek kyseliny glutarové a EUC značí 2-oxoimidazolidin-l-karbonyl, v časovém úseku 1 až 21 minut při počáteční koncentraci substrátů 0,2 mmol.l , při koncentraci enzymu 1 ,ug.ml a při koncentraci dimethylformamidu 7,25 %.

V tomto časovém úseku enzymatická hydrolysa substrátů má lineární průběh; nejrychleji byl štěpen substrát II, následoval substrát I a nejhůře byl štěpen substrát III. Přesto z praktických důvodů (lepší rozpustnost) byla v pokusné části dána přednost substrátu I, tj. pGlu-His-Phe-Phe-NAn; pro rutinní sériové analysy (s automatickou technikou) budou pravděpodobně vhodnější substráty s 3-karboxyalkankarbonylovým zbytkem (glutarylový zbytek).

Z praktických a zejména ekonomických důvodů nebylo pro rutinní klinickou, resp. výrobní praxi použití vysoce purifikované leucinaminopeptidázy v podobě komerčního preparátu únosné; a jak se později ukázalo, nebylo ani nutné.

Při hledání vhodného náhradního zdroje aminopeptidáz bylo zkoušeno krevní sérum více živočišných druhů (kráva, kůň, husa, kuře, kapr, člověk). Pro praktické účely se jako nejvhodnější a nejcitlivější ukázalo kuřecí sérum a sérum žen v IX až X lunárním měsíci gravidity.

Jak bylo experimentálně prokázáno, je kuřecí sérum velmi výhodným zdrojem aminopeptidáz.

Je k disposici v dostatečném množství jako odpad při jatečném zpracování kuřat a při vhodném uskladnění (teplota nejvýše +5 °C) vykazuje v minimálním objemu vysokou aktivitu aminopeptidáz, jejíž hodnota zůstává po dobu nejméně 5 dní beze změny.

Pro názornost lze způsob podle vynálezu vyjádřit tímto dvoufázovým reakčním schématem:

a) pGlu-His-Phe-Phe-NAn -EPSiSgiZŽický^ pGlu-His-Phe + Phe-NAn enzym ^c

b) Phe-NAn ^Ρ-ΡΡ-^ΡΑ¹.?·^{4 za}> phe + NAn (barevný)

Množství uvolněného p-nitroanilinu se stanoví spektrofotometrícky při 405 nm.

Metoda stanovení byla ověřována jak na čistém enzymu (pepsinu) tak i na enzymech v biologickém materiálu, tj. žaludeční enzymy člověka a vepře (viz Tabulku 1). V biologickém materiálu (žaludku) byla stanovována směs enzymů, pepsinu a gastricsinu, nebot oba enzymy štěpí vazbu Phe-Phe.

Byly stanoveny kinetické konstanty hydrolysy pGlu-His-Phe-Phe-NAn katalysované pepsi-3 -1 -1 -1 nem: K = 0,67 mmol.l , k . = 5,5 s a konstanta C, tj. k „,/K = 8 235 s .l.mol , m cat cat m kde K značí Michaelisovu konstantu a k . značí kinetickou konstantu, m cat

Následující příklady provedení způsob podle vynálezu pouze ilustrují, ale nijak neomezují.

Přikladl *

První fáze (a)

Do zkumavky se odpipetuje 1,8 ml 0,05 mol.l citrátový pufr pH 4,7 s obsahem 0,1 mol.l — 2 —1

NaCl; přidá se 0,1 ml 2.10 mol.l pGlu-His-Phe-Phe-NAn v dimethylformamidě; reakce se odstartuje přidáním 0,1 ml zkoumaného vzorku s obsahem enzymu; inkubuje se 20 minut při teplotě 37 °C. Potom se inkubační směs zneutralisuje (tj. zastaví se enzymatická hydrolysa) přidáním 1,9 ml Tris-HCl pufru pH 7,8 a nechá se stát 20 až 30 minut; vzniklá sraženina se odstraní centrifugací při 8 000 g.

Druhá fáze (b)

Odpipetuje se 1,8 ml supernatantu a přidá se 0,2 ml křecího krevního séra (s aminopeptidázovou aktivitou 77 U.l^-1), čímž se odstartuje reakce katalysovaná aminopeptidázami, a inkubuje se 3 h při 37 °C. Hodnoty absorbance Α^θ,. odečítáme proti kontrolnímu vzorku, který připravíme následujícím způsobem: shodný postup s předcházejícím, pouze v první fázi (a) místo zkoumaného enzymového vzorku přidá se pufr pH 7,8.

Objemovou aktivitu enzymu v analysovaném vzorku vypočítáme podle vzorce II U = ·Ν⁶~ Qimol.min.l¹) (II) , kde aA = hodnota absorbance analysovaného vzorku odečtená proti kontrole V_g= objem analysovaného vzorku v ml V_k= konečný objem enzymové směsi v ml d = šířka kyvety v cm £= absorpční molární koeficient p-nitroanilinu v l.mol ^.cm ¹at = doba inkubace (první fáze (a)) v minutách r = zředění produktu první fáze (a), ku kterému došlo v důsledku neutralisace (v našem případě r «2) .

Například při 20minutové inkubaci biologického materiálu se substrátem se objemová aktivita pepsinu vypočítá podle vzorce III

U.l^-1 = δΑ.202 (III), kde ϋ značí aktivitu pepsinu. Pří přepočtu aktivity pepsinu na nkat.l ¹ se aktivita vyjádřená jako U.l^-1 násobí koeficientem 16,67. V závislosti od charakteru vyšetřovaného biologického materiálu je možné dobu první fáze (a) podle potřeby upravit, tj. prodloužit anebo zkrátit.

V takovém případě je však nutné přizpůsobit dobu inkubace druhé fázi (b).

Příklad 2

Praktické použití metody stanovení enzymů štěpících v kyselé oblasti pH bylo ověřeno ve vzorcích lidské žaludeční štávy a žaludečního obsahu vepřů, viz tabulku I.

Přesnost stanovení aktivity enzymů byla ověřena provedením 12 analys žaludečního obsahu vepřů a provedením 10 analys vzorků komerčního vepřového pepsinu. Při stanovení aktivity pepsinu v žaludečním obsahu vepřů při průměrné hodnotě enzymové aktivity X = 1 353 nkat.l^-''' měla směrodatná odchylka S hodnotu + 146 nkat.l \ variační koeficient VK = 10 %. Při použití komerčního vepřového pepsinu o koncentraci 2,5 jug.ml v inkubační směsi byla průměrná hodnota enzymové aktivity stanovená X = 2 697 nkat.l , směrodatná odchylka S +115 nkat.l a VK = 4,3 %.

Tabulka I

Aktivita pepsinu stanovená v žaludeční štávě člověka a v žaludečním obsahu vepře.

Složení reakčních směsí: [s ]= 1 mmol.l ⁴, pH 4,7. Objem analysovaného vzorku V = 0,1 ml.

o o ^a

Konečný objem enzymatické směsi = 2,0 ml. Inkubační teplota 37 °C. Doba inkubace 20 minut (lidská žaludeční štáva) a 10 minut (žaludeční obsah vepře).

Aktivita pepsinu (nkat.l

Vzorek člověk vepř

1	590	875
2	993	2 525
3	960	5 658
4	1 112	3 704
5	875	4 579
6	0	3 367
7	1 437	3 166
8	1 077	3 771
9	1 684	3 906
10	1 034	1 885
11	472	337
12	740	498
13		1 845
14		1 845
15		1 684
16		3 031
17		1 954
18		5 791
19		8 217
20		4 243
21		7 206
22		7 408
23		2 020
24		1 549

Claims

Způsob stanovení aktivity proteolytických enzymů, tzv. aspartátových proteináz, zejména pepsinu, gastriosinu nebo chymosinu, v první fázi nejprve reakcí zkoumaného vzorku se syntetickým chromogenním substrátem typu tetrapeptidického derivátu p-nitroanilidu v prostředí s hodnotou pH nižší než 5, zastavením této reakce úpravou pH na hodnotu nad 7,5, v druhé fázi pak štěpením vzniklého p-nitroanilidu C-terminální aminokyseliny působením aminopeptidázy v prostředí s hodnotou pH 7,6 a spektrofotometrickým stanovením uvolněného p-nitroanilinu při 405 nm, vyznačující se tím, že jako chromogenního substrátu se používá sloučeniny obecného vzorce I

X-A-B-Phe -C-NH ve kterém značí:

atom vodíku, 3-karboxyalkankarbonylovou skupinu s 3 až 5 atomy uhlíku nebo alkankarbonylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, zbytek kyseliny pyroglutámové, kyseliny asparágové, kyseliny glutámové, glycidu nebo 2-oxoimídazolídín-l-karbonyl, zbytek histidinu, glycinu nebo prolinu, zbytek fenylalanínu, leucinu, norleucinu, methioninu nebo S-alkylcysteinu, kde alkyl má 1 až 3 atomy uhlíku a jako zdroje aminopeptidázy kuřecího séra.