CS261172B1 - Způsob stanovení proteolytických enzymů - Google Patents
Způsob stanovení proteolytických enzymů Download PDFInfo
- Publication number
- CS261172B1 CS261172B1 CS871673A CS167387A CS261172B1 CS 261172 B1 CS261172 B1 CS 261172B1 CS 871673 A CS871673 A CS 871673A CS 167387 A CS167387 A CS 167387A CS 261172 B1 CS261172 B1 CS 261172B1
- Authority
- CS
- Czechoslovakia
- Prior art keywords
- phe
- activity
- pepsin
- nitroanilide
- aminopeptidase
- Prior art date
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 14
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 title claims abstract description 9
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 title claims abstract description 9
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 title claims description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims abstract description 25
- 102000004400 Aminopeptidases Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108090000915 Aminopeptidases Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 239000003593 chromogenic compound Substances 0.000 claims abstract description 11
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 4-nitroaniline Chemical compound NC1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 TYMLOMAKGOJONV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 7
- 241000287828 Gallus gallus Species 0.000 claims abstract description 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims abstract description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 claims abstract description 4
- 230000007017 scission Effects 0.000 claims abstract description 4
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 claims abstract description 4
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 claims description 24
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 claims description 24
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 claims description 24
- 108090000746 Chymosin Proteins 0.000 claims description 10
- 229940080701 chymosin Drugs 0.000 claims description 8
- GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N n,n,5,7-tetramethyl-1,2,3,4-tetrahydronaphthalen-1-amine Chemical compound C1=C(C)C=C2C(N(C)C)CCCC2=C1C GNOLWGAJQVLBSM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- -1 2-oxoimidazolidine-1-carbonyl residue Chemical group 0.000 claims description 5
- COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N L-phenylalanine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-QMMMGPOBSA-N 0.000 claims description 4
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N L-aspartic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O CKLJMWTZIZZHCS-REOHCLBHSA-N 0.000 claims description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 3
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 claims description 3
- LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N L-norleucine Chemical compound CCCC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LRQKBLKVPFOOQJ-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 3
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 claims description 3
- COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N phenylalanine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=CC=C1 COLNVLDHVKWLRT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 5-oxo-L-proline Chemical compound OC(=O)[C@@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N Glutamic acid Natural products OC(=O)C(N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N L-glutamic acid Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O WHUUTDBJXJRKMK-VKHMYHEASA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N L-leucine Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-YFKPBYRVSA-N 0.000 claims description 2
- ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N Leucine Natural products CC(C)CC(N)C(O)=O ROHFNLRQFUQHCH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N Pyroglutamic acid Natural products OC(=O)[C@H]1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-GSVOUGTGSA-N 0.000 claims description 2
- ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N acide pyroglutamique Natural products OC(=O)C1CCC(=O)N1 ODHCTXKNWHHXJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 235000003704 aspartic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N beta-carboxyaspartic acid Natural products OC(=O)C(N)C(C(O)=O)C(O)=O OQFSQFPPLPISGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 2
- 235000013922 glutamic acid Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000004220 glutamic acid Substances 0.000 claims description 2
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 2
- 125000001500 prolyl group Chemical group [H]N1C([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C1([H])[H] 0.000 claims description 2
- 229940009098 aspartate Drugs 0.000 claims 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 claims 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 abstract description 15
- 235000013305 food Nutrition 0.000 abstract description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 abstract 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 20
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 20
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 20
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000282898 Sus scrofa Species 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 235000013330 chicken meat Nutrition 0.000 description 5
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 5
- 102000002704 Leucyl aminopeptidase Human genes 0.000 description 4
- 108010004098 Leucyl aminopeptidase Proteins 0.000 description 4
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 4
- 210000004051 gastric juice Anatomy 0.000 description 3
- 102000005600 Cathepsins Human genes 0.000 description 2
- 108010084457 Cathepsins Proteins 0.000 description 2
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 2
- 108090001072 Gastricsin Proteins 0.000 description 2
- 102000055441 Gastricsin Human genes 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 2
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 2
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 2
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 230000007071 enzymatic hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006047 enzymatic hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N glutaric acid group Chemical group C(CCCC(=O)O)(=O)O JFCQEDHGNNZCLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 2
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 210000002784 stomach Anatomy 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TYMLOMAKGOJONV-IDEBNGHGSA-N 4-nitroaniline Chemical group N[13C]1=[13CH][13CH]=[13C]([N+]([O-])=O)[13CH]=[13CH]1 TYMLOMAKGOJONV-IDEBNGHGSA-N 0.000 description 1
- 241000272814 Anser sp. Species 0.000 description 1
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 1
- 101000898643 Candida albicans Vacuolar aspartic protease Proteins 0.000 description 1
- 101000898783 Candida tropicalis Candidapepsin Proteins 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- 101000898784 Cryphonectria parasitica Endothiapepsin Proteins 0.000 description 1
- 241000252233 Cyprinus carpio Species 0.000 description 1
- 102000005593 Endopeptidases Human genes 0.000 description 1
- 108010059378 Endopeptidases Proteins 0.000 description 1
- 241000283073 Equus caballus Species 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 101000933133 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-1 Proteins 0.000 description 1
- 101000910082 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-2 Proteins 0.000 description 1
- 101000910079 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-3 Proteins 0.000 description 1
- 101000910086 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-4 Proteins 0.000 description 1
- 101000910088 Rhizopus niveus Rhizopuspepsin-5 Proteins 0.000 description 1
- 101000898773 Saccharomyces cerevisiae (strain ATCC 204508 / S288c) Saccharopepsin Proteins 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 1
- 101150047356 dec-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N ninhydrin Chemical compound C1=CC=C2C(=O)C(O)(O)C(=O)C2=C1 FEMOMIGRRWSMCU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000015277 pork Nutrition 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 108010087791 pyroglutamylhistidine Proteins 0.000 description 1
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 description 1
- 229940108461 rennet Drugs 0.000 description 1
- 108010058314 rennet Proteins 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 238000003307 slaughter Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000002699 waste material Substances 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Řešení se týká způsobu stanovení
aktivity proteolytických enzymů; v první
fázi se vychází z reakce vzorku s chromogenním
substrátem typu tetrapeptidických
derivátů p-nitroanilidu při pH nižším
než 5, v druhé fázi'pak štěpením vzniklého
p-nitroanilidu aminokyseliny působením
aminopeptidázy při pH vyšším než 7,5 a
spektrofotometrickým stanovením uvolněného
p-nitroanilinu při 405 nm. Novým znakem
řešení je použití sloučenin obecného vzorce
I jako chromogenního substrátu, zejména
pGlu-His-Phe-Phe-NAn a kuřecího séra jako
zdroje aminopeptidázy. Řešení má význam
v klinické praxi a v potravinářském
průmyslu.
Description
Vynález se týká způsobu stanovení aktivity proteolytických enzymů, tzv. aspartátových proteináz, zejména pepsinu nebo chymosinu.
Jak je známo, má stanovení aktivity některých proteolytických enzymů, na předním místě pepsinu, velkou diagnostickou hodnotu při klinických vyšetřovacích metodách. Aktivita chymosinu je především sledována v potravinářském, zejména mlékárenském průmyslu, při hodnocení tzv. syřidla (chymosinu).
Ze substrátové specifity pepsinu je známo, že tento enzym štěpí peptidickou vazbu mezi dvěma aromatickými aminokyselinami, zatímco chymosin (rennin) štěpí vazbu mezi fenylalaninem a methioninem, popřípadě norleucínem.
Ačkoliv pepsin patří mezi vůbec nejdéle známé enzymy, sledování jeho aktivity se zatím v širší míře neuplatnilo v diagnostické praxi, především proto, že známé metody byly pracné, málo citlivé nebo náročné na vybavení. Doposud se ke stanovení aktivity jmenovaných enzymů používaly přirozené (hemoglobin, kasein) nebo syntetické substráty, jejichž štěpné fragmenty byly detegovatelné v ultrafialové oblasti, a to přímou nebo diferenční spektrofotometrií, popřípadě barevnou reakcí, například ninhydrinem, ve viditelné oblasti.
Určitý pokrok v oboru stanovení aktivity pepsinu znamenalo použiti tzv. chromogenních substrátů, syntetických tri- nebo pentapeptidických derivátů p-nitroanilidu, typu pGlu-Phe-Phe-NAn nebo pGlu-Ala-Ala-Phe-Leu-NAn (Ε. N. Lysogorskaja se sp., Bioorgan. Chimija 9,
470 (1983); I. J. Filippova se sp., Bioorgan. Chimija 10, 390 (1984)). Toto stanovení je nepřímé a probíhá ve dvou fázích; pepsin jako endopeptidáza odštěpuje v první fázi (při hodnotě pH nižší než 5) z přítomného substrátu bezbarvý Leu-NAn, resp. Phe-NAn, který se v druhé fázi (pH okolo 7, po přídavku leucinaminopeptidázy kvantitativně štěpí a uvolní barevný p-nitroanilin. Intensita vzniklého zbarvení se hodnotí spektrofotometricky, množství uvolněného p-nitroanilinu je mírou aktivity pepsinu.
Tato metoda byla však pro širší klinické a diagnostické použití omezena především požadavkem na vysokou čistotu leucinaminopeptidázy, která je formě komerčního preparátu velmi drahá. Další omezení tkví v tom, že chromogenní substráty popsaného typu jsou použitelné jen pro stanovení aktivity pepsinu, pro stanovení aktivity dalších enzymů například chymosinu (rennánu) a některých katepsinů se nehodí. Dalším omezením použitelnosti těchto substrátů je jejich špatná rozpustnost ve vodě.
Cílem vynálezu bylo tedy odstranění zmíněných omezení a nalezení takových chromogenních substrátů a takových podmínek, které by umožnily aplikaci popsané metody kromě pepsinu i na další významné proteolytické enzymy. Vynález vychází z podobného principu, který byl popsán výše, ale s tím podstatným rozdílem, že jako chromogenní substráty slouží chemicky odlišné syntetické peptidické deriváty p-nítroanilidu, v jejíchž molekule jsou vestavěny hydrofilní zbytky, například histidinu; přednosti N-terminálniho hydrofilního zbytku, například pGlu-His byly prokázány již dříve u nechromogenního substrátu pro pepsin (AO 209 740). Navíc drahou leucinaminopeptidázu ve formě vysoce purifikovaného preparátu se podařilo úspěšně nahradit jinými zdroji aminopeptidáz, velmi levnými a snadno dostupnými, s nimiž lze dosáhnout přesných a reprodukovatelných výsledků, upotřebitelných v praxi.
Vynález se týká způsobu stanovení aktivity proteolytických enzymů, zejména pepsinu *
nebo chymosinu, v první fázi nejprve reakcí zkoumaného vzorku.se syntetickým chromogennlm substrátem typu tetrapeptidického derivátu p-nitroanilidu v prostředí s hodnotou pH nižší než 5, zastavením této reakce úpravou pH na hodnotu 7,5, v druhé fázi pak štěpením vzniklého p-nitroanilidu aminokyseliny působením aminopeptidázy v prostředí s hodnotou pH 7,6 a spektrofotometrickým stanovením uvolněného p-nitroanilinu při 405 nm; jeho podstata spočívá v tom, že se jako chromogenního substrátu používá sloučeniny obecného vzorce I
(I) ve kterém značí:
X atom vodíku, 3-karboxyalkankarbonylovou skupinu s 3 až 5 atomy uhlíku nebo alkankarbonylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku,
A zbytek kyseliny pyroglutámové, kyseliny asparágové, kyseliny glutámové, glycinu nebo 2-oxoimidazolidin-l-karbonyl,
B zbytek histidinu, glycinu nebo prolinu,
C zbytek fenylalaninu, leucinu, norleucinu, methioninu nebo S-alkylcysteinu, kde alkyl má 1 až 3 atomy uhlíku a jako zdroje aminopeptidázy kuřecího séra.
Látky obecného vzorce I, tj. p-nitroanilidy acylovaných nebo volných tetrapeptidů, upotřebitelné při realisací způsobu podle vynálezu, tvoří skupinu nových specifických chromogenních substrátů pro proteolytické enzymy, které štěpí v kyselé oblasti pH: pepsin, gastricsin, chymosin (rennin) a některé kathepsiny.
I když uvedené skupiny sloučenin obecného vzorce I je pro účely vynálezu upotřebitelných více látek, především podle místa štěpitelné vazby (primární interakce), pozornost se soustředila na výběr substrátů s N-terminálním hydrofilním zbytkem, tj. se zbytkem kyseliny glutarové, histidinem a 2-oxoimidazolidin-l-karbonylem, které významně ovlivňují rozpustnost substrátů, viz č. AO 209 740. Za tím účelem byl proveden časový průběh hydrolysy pepsinem substrátů: pGlu-His-Phe-Phe-NAn (I), Glt-Gly-Gly-Phe-Phe-NAn (II) a EUC-His-Phe-Phe-NAn (III), kde NAn značí zbytek 4-nitroanilinu, Git značí zbytek kyseliny glutarové a EUC značí 2-oxoimidazolidin-l-karbonyl, v časovém úseku 1 až 21 minut při počáteční koncentraci substrátů 0,2 mmol.l , při koncentraci enzymu 1 ,ug.ml a při koncentraci dimethylformamidu 7,25 %.
V tomto časovém úseku enzymatická hydrolysa substrátů má lineární průběh; nejrychleji byl štěpen substrát II, následoval substrát I a nejhůře byl štěpen substrát III. Přesto z praktických důvodů (lepší rozpustnost) byla v pokusné části dána přednost substrátu I, tj. pGlu-His-Phe-Phe-NAn; pro rutinní sériové analysy (s automatickou technikou) budou pravděpodobně vhodnější substráty s 3-karboxyalkankarbonylovým zbytkem (glutarylový zbytek).
Z praktických a zejména ekonomických důvodů nebylo pro rutinní klinickou, resp. výrobní praxi použití vysoce purifikované leucinaminopeptidázy v podobě komerčního preparátu únosné; a jak se později ukázalo, nebylo ani nutné.
Při hledání vhodného náhradního zdroje aminopeptidáz bylo zkoušeno krevní sérum více živočišných druhů (kráva, kůň, husa, kuře, kapr, člověk). Pro praktické účely se jako nejvhodnější a nejcitlivější ukázalo kuřecí sérum a sérum žen v IX až X lunárním měsíci gravidity.
Jak bylo experimentálně prokázáno, je kuřecí sérum velmi výhodným zdrojem aminopeptidáz.
Je k disposici v dostatečném množství jako odpad při jatečném zpracování kuřat a při vhodném uskladnění (teplota nejvýše +5 °C) vykazuje v minimálním objemu vysokou aktivitu aminopeptidáz, jejíž hodnota zůstává po dobu nejméně 5 dní beze změny.
Pro názornost lze způsob podle vynálezu vyjádřit tímto dvoufázovým reakčním schématem:
a) pGlu-His-Phe-Phe-NAn -EPSiSgiZŽický^ pGlu-His-Phe + Phe-NAn enzym c
b) Phe-NAn ^Ρ-ΡΡ-^ΡΑ1.?·4 za> phe + NAn (barevný)
Množství uvolněného p-nitroanilinu se stanoví spektrofotometrícky při 405 nm.
Metoda stanovení byla ověřována jak na čistém enzymu (pepsinu) tak i na enzymech v biologickém materiálu, tj. žaludeční enzymy člověka a vepře (viz Tabulku 1). V biologickém materiálu (žaludku) byla stanovována směs enzymů, pepsinu a gastricsinu, nebot oba enzymy štěpí vazbu Phe-Phe.
Byly stanoveny kinetické konstanty hydrolysy pGlu-His-Phe-Phe-NAn katalysované pepsi-3 -1 -1 -1 nem: K = 0,67 mmol.l , k . = 5,5 s a konstanta C, tj. k „,/K = 8 235 s .l.mol , m cat cat m kde K značí Michaelisovu konstantu a k . značí kinetickou konstantu, m cat
Následující příklady provedení způsob podle vynálezu pouze ilustrují, ale nijak neomezují.
Přikladl *
První fáze (a)
Do zkumavky se odpipetuje 1,8 ml 0,05 mol.l citrátový pufr pH 4,7 s obsahem 0,1 mol.l — 2 —1
NaCl; přidá se 0,1 ml 2.10 mol.l pGlu-His-Phe-Phe-NAn v dimethylformamidě; reakce se odstartuje přidáním 0,1 ml zkoumaného vzorku s obsahem enzymu; inkubuje se 20 minut při teplotě 37 °C. Potom se inkubační směs zneutralisuje (tj. zastaví se enzymatická hydrolysa) přidáním 1,9 ml Tris-HCl pufru pH 7,8 a nechá se stát 20 až 30 minut; vzniklá sraženina se odstraní centrifugací při 8 000 g.
Druhá fáze (b)
Odpipetuje se 1,8 ml supernatantu a přidá se 0,2 ml křecího krevního séra (s aminopeptidázovou aktivitou 77 U.l-1), čímž se odstartuje reakce katalysovaná aminopeptidázami, a inkubuje se 3 h při 37 °C. Hodnoty absorbance Α^θ,. odečítáme proti kontrolnímu vzorku, který připravíme následujícím způsobem: shodný postup s předcházejícím, pouze v první fázi (a) místo zkoumaného enzymového vzorku přidá se pufr pH 7,8.
Objemovou aktivitu enzymu v analysovaném vzorku vypočítáme podle vzorce II U = ·Ν6~ Qimol.min.l1) (II) , kde aA = hodnota absorbance analysovaného vzorku odečtená proti kontrole Vg= objem analysovaného vzorku v ml Vk= konečný objem enzymové směsi v ml d = šířka kyvety v cm £= absorpční molární koeficient p-nitroanilinu v l.mol ^.cm 1 at = doba inkubace (první fáze (a)) v minutách r = zředění produktu první fáze (a), ku kterému došlo v důsledku neutralisace (v našem případě r «2) .
Například při 20minutové inkubaci biologického materiálu se substrátem se objemová aktivita pepsinu vypočítá podle vzorce III
U.l-1 = δΑ.202 (III), kde ϋ značí aktivitu pepsinu. Pří přepočtu aktivity pepsinu na nkat.l 1 se aktivita vyjádřená jako U.l-1 násobí koeficientem 16,67. V závislosti od charakteru vyšetřovaného biologického materiálu je možné dobu první fáze (a) podle potřeby upravit, tj. prodloužit anebo zkrátit.
V takovém případě je však nutné přizpůsobit dobu inkubace druhé fázi (b).
Příklad 2
Praktické použití metody stanovení enzymů štěpících v kyselé oblasti pH bylo ověřeno ve vzorcích lidské žaludeční štávy a žaludečního obsahu vepřů, viz tabulku I.
Přesnost stanovení aktivity enzymů byla ověřena provedením 12 analys žaludečního obsahu vepřů a provedením 10 analys vzorků komerčního vepřového pepsinu. Při stanovení aktivity pepsinu v žaludečním obsahu vepřů při průměrné hodnotě enzymové aktivity X = 1 353 nkat.l-''' měla směrodatná odchylka S hodnotu + 146 nkat.l \ variační koeficient VK = 10 %. Při použití komerčního vepřového pepsinu o koncentraci 2,5 jug.ml v inkubační směsi byla průměrná hodnota enzymové aktivity stanovená X = 2 697 nkat.l , směrodatná odchylka S +115 nkat.l a VK = 4,3 %.
Tabulka I
Aktivita pepsinu stanovená v žaludeční štávě člověka a v žaludečním obsahu vepře.
Složení reakčních směsí: [s ]= 1 mmol.l 4, pH 4,7. Objem analysovaného vzorku V = 0,1 ml.
o o a
Konečný objem enzymatické směsi = 2,0 ml. Inkubační teplota 37 °C. Doba inkubace 20 minut (lidská žaludeční štáva) a 10 minut (žaludeční obsah vepře).
Aktivita pepsinu (nkat.l
Vzorek člověk vepř
| 1 | 590 | 875 |
| 2 | 993 | 2 525 |
| 3 | 960 | 5 658 |
| 4 | 1 112 | 3 704 |
| 5 | 875 | 4 579 |
| 6 | 0 | 3 367 |
| 7 | 1 437 | 3 166 |
| 8 | 1 077 | 3 771 |
| 9 | 1 684 | 3 906 |
| 10 | 1 034 | 1 885 |
| 11 | 472 | 337 |
| 12 | 740 | 498 |
| 13 | 1 845 | |
| 14 | 1 845 | |
| 15 | 1 684 | |
| 16 | 3 031 | |
| 17 | 1 954 | |
| 18 | 5 791 | |
| 19 | 8 217 | |
| 20 | 4 243 | |
| 21 | 7 206 | |
| 22 | 7 408 | |
| 23 | 2 020 | |
| 24 | 1 549 |
Claims (1)
- Způsob stanovení aktivity proteolytických enzymů, tzv. aspartátových proteináz, zejména pepsinu, gastriosinu nebo chymosinu, v první fázi nejprve reakcí zkoumaného vzorku se syntetickým chromogenním substrátem typu tetrapeptidického derivátu p-nitroanilidu v prostředí s hodnotou pH nižší než 5, zastavením této reakce úpravou pH na hodnotu nad 7,5, v druhé fázi pak štěpením vzniklého p-nitroanilidu C-terminální aminokyseliny působením aminopeptidázy v prostředí s hodnotou pH 7,6 a spektrofotometrickým stanovením uvolněného p-nitroanilinu při 405 nm, vyznačující se tím, že jako chromogenního substrátu se používá sloučeniny obecného vzorce IX-A-B-Phe -C-NH ve kterém značí:atom vodíku, 3-karboxyalkankarbonylovou skupinu s 3 až 5 atomy uhlíku nebo alkankarbonylovou skupinu s 1 až 5 atomy uhlíku, zbytek kyseliny pyroglutámové, kyseliny asparágové, kyseliny glutámové, glycidu nebo 2-oxoimídazolídín-l-karbonyl, zbytek histidinu, glycinu nebo prolinu, zbytek fenylalanínu, leucinu, norleucinu, methioninu nebo S-alkylcysteinu, kde alkyl má 1 až 3 atomy uhlíku a jako zdroje aminopeptidázy kuřecího séra.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS871673A CS261172B1 (cs) | 1987-03-12 | 1987-03-12 | Způsob stanovení proteolytických enzymů |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CS871673A CS261172B1 (cs) | 1987-03-12 | 1987-03-12 | Způsob stanovení proteolytických enzymů |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CS167387A1 CS167387A1 (en) | 1988-06-15 |
| CS261172B1 true CS261172B1 (cs) | 1989-01-12 |
Family
ID=5351689
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CS871673A CS261172B1 (cs) | 1987-03-12 | 1987-03-12 | Způsob stanovení proteolytických enzymů |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CS (1) | CS261172B1 (cs) |
-
1987
- 1987-03-12 CS CS871673A patent/CS261172B1/cs unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CS167387A1 (en) | 1988-06-15 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Kerbiriou et al. | Human high molecular weight kininogen. Studies of structure-function relationships and of proteolysis of the molecule occurring during contact activation of plasma. | |
| Harris Jr et al. | An endopeptidase from rheumatoid synovial tissue culture | |
| US5965699A (en) | Assay for the proteolytic activity of serotype a from clostridium botulinum | |
| Lojda | Studies on glycyl-proline naphthylamidase: I. Lymphocytes | |
| Szewczuk et al. | The use of α-(N-γ-DL-glutamyl)-aminonitriles for the colorimetric determination of a specific peptidase in blood serum | |
| Morales et al. | PZ-peptidase from chick embryos. Purification, properties, and action on collagen peptides. | |
| US4598043A (en) | Method for quantitatively assaying blood coagulation factor XII in human plasma | |
| KAWABATA et al. | Staphylocoagulase-binding region in human prothrombin | |
| WO2008073425A2 (en) | High-sensitivity proteolysis assay | |
| Nachlas et al. | An evaluation of aminopeptidase specificity with seven chromogenic substrates | |
| Keil | Some newly characterized collagenases from procaryotes and lower eucaryotes | |
| Tsu et al. | The substrate specificity of Uca pugilator collagenolytic serine protease 1 correlates with the bovine type I collagen cleavage sites. | |
| JPH0417640B2 (cs) | ||
| Barrett et al. | [29] Hatching enzyme of the sea urchin Strongylocentrotus purpuratus | |
| HAN et al. | Actions of urinary kallikrein, plasmin, and other kininogenases on bovine plasma high-molecular-weight kininogen | |
| Mykles et al. | Branched-chain-amino-acid-preferring peptidase activity of the lobster multicatalytic proteinase (proteasome) and the degradation of myofibrillar proteins | |
| DK162179B (da) | Reagens til ettrinsbestemmelse af den aktiverede partielle thromboplastintid samt reagensets anvendelse | |
| Lecroisey et al. | Hypodermin B, a Trypsin‐Related Enzyme from the Insect Hypoderma lineatum: Comparison with Hypodermin A and Hypoderma Collagenase, Two Serine Proteinases from the Same Source | |
| Swanson et al. | Lens exopeptidases | |
| Hill | Synthetic peptide and ester substrates for rennin | |
| Pletschke et al. | Ostrich pepsins I and II: a kinetic and thermodynamic investigation | |
| US7270976B2 (en) | Methods for measuring ADAMTS13 activity and protein on platelets and in plasma | |
| Sentandreu et al. | Partial purification and characterisation of dipeptidyl peptidase II from porcine skeletal muscle | |
| CS261172B1 (cs) | Způsob stanovení proteolytických enzymů | |
| Sugiura et al. | A new method for protease activity measurement |