CS261027B1 - Způsob přípravy polyakrylamidového gelu zejména pro elektroforezu - Google Patents

Abstract

Řešení se týká oboru polymerů a analytické chemie. Je řešen technický problém přípravy polyakrylamidových gelů pro elektroforezu. Podstatou řešení je provedení polymerace 3,5 až 28% roztoku akrylamidu a N,N'-bis-methylenakrylamidu v molárním poměru 1 ku 0,01 až 0,05 v přítomnosti dihydrátu hydrosiřičitanu sodného a methylenové modři působením persíranu draselného nebo amonného. Řešení může být využito při přípravě gelů pro elektroforetická dělení polypeptidů, proteinů a jiných nabitých částic obecně.

Description

Vynález se týká způsobu přípravy polyakrylamidového gelu zejména pro elektroforetická dělení.

V rámci základního i aplikovaného výzkumu biologických systémů nalézá široké použití elektroforetická dělení polypeptidů, bílkovin, enzymů a jiných elektricky nabitých částic. Dělení se provádí obvykle ve vrstvě vodného gelu na bázi agaru, agaroz, škrobů, modifikované celulózy nebo polymerního akrylamidu. Relativně nej lepší výsledky dělení se dosahují zejména na polyakrylamidových gelech sítěných např. Ν,Ν'-bis-methylenakrylamidem. Tento gel se připraví bez větších nesnází i v laboratorních podmínkách, je dostatečně mechanicky pevný a lze na něm dosáhnout vyhovujícího dělicího efektu. Závažným nedostatkem je však kolísavá kvalita gelu připravovaného podle stávajícího stavu metodiky radikálovou polymeraci nejčastěji působením persíranu a sloučenin obsahujících terciární dusík. Částečně lze uvedené potíže snížit užíváním vysoce čistých složek polymeračního systému, ale hlavní příčina nedostatečné reprodukovatelnosti - inhibice polymerace vzdušným kyslíkem - zůstává.

Současný stav techniky nezná způsob dosažení takové reprodukovatelnosti kvality gelu, která je pro elektroforetické dělení nezbytná (vyjma polymerace v, inertním prostředí, která je však technicky velmi náročná).

Na základě experimentálních prací jsme nalezli nový způsob přípravy polyakryamidového gelu, který výše uvedené nedostatky způsobené difúzí vzdušného kyslíku vylučuje a dovoluje připravovat gely pro elektroforetické dělení s velmi dobrou reprodukovatelnosti. Způsob přípravy polyakrylamidového gelu podle vynálezu spočívá v tom, že 3,5 až 28% vodný roztok směsi 100 hmotnostních dílů akrylamidu a Ν,Ν'-methylen-bis-akrylamidu v molárním poměru 1 ku 0,01 až 0,05 se mísí s 1,0 až 10,5 hmotnostními díly 0,5% roztoku methylenové modři a přídavkem pufru obsahujícího 0,1 až 0,4% Ν,Ν,Ν',Ν'-tetramethylethylendiaminu se pH roztoku upraví na 8 až 9, načež se na roztok působí 0,4 až 1,0% roztokem hydrosiřičitanu sodného do odbarveni. K bezbarvému roztoku se přidá 0,2 až 0,6 hmotnostních dílů práškového dihydrátu hydrosiřičitanu sodného, načež se na homogenní roztok působí 500 hmotnostními díly persíranu draselného nebo amonného o koncentraci 0,1 až 0,5%.

Při pokojové teplotě proběhne polymerace do stadia gelu nejdéle do pěti minut a plné hustoty polymerní sítě dosáhne po 2 až 12 hodinách, závisle na teplotě.

Způsob podle vynálezu poskytuje velmi dobře reprodukovatelnou kvalitu gelů, což lze nejlépe dokázat vlastním elektroforetickým dělením. Aplikace jiných redox systémů polymerace akrylamidu, jako na příklad persíran-siřičitan, persíran-sirnatan atd. se způsobu polymerace podle vynálezu dosaženým technickým účinkem nevyrovnají. Redox systém podle vynálezu je při přípravě vodných gelů vysoce reaktivní a souběžně vylučuje nežádoucí efekt kyslíkové inhibice polymerace, který se v případě ostatních iniciačních systémů nekontrolované a nereprodukovatelně uplatňuje se známými důsledky. Použitý barevný indikátor dovoluje precisní kontrolu redox potenciálu polymeračního prostředí, jehož porušení se okamžitě projeví zmodráním. Význačnou výhodou způsobu podle vynálezu je skutečnost, že po skončení polymerace je v gelu dosažena opět více méně fyziologická hodnota redox potenciálu prostředí vlivem nestability hydrosiřičitanu. Nežádoucí látky (elektricky nabité) se snadno odstraní elektroforezou bez vzorku, tzv. pre-run.

Mezi neméně významné výhody uváděného způsobu patří i dosahované ostřejší dělení látek s velmi dobrou reprodukovatelnosti.

Příklad

Předem se připraví tyto čisté roztoky:

roztok A:

28,0 g akrylamidu a 0,735 g Ν,Ν'-methylen-bis-akrylamidu ve 100 ml deionisované vody, udržuje se při teplotě 0 až 4 °C.

roztok B:

36,6 g tris-(hydroxymethyl)aminomethan a 200 /ll Ν,Ν,Ν',Ν'-tetramethylethylendiaminu se rozpustí v ·40 ml deionisované vody, IN HC1 se pH roztoku upraví na 8,9 a deionisovanou vodou roztok doplní do celkového objemu 100 ml.

roztok C:

200 mg dihydrátu hydrosiřičitanu sodného ve 25 ml deionisované vody.

roztok D:

100 mg persíranu draselného v 50 ml deionisované vody.

Postup:

Smíchá se 6 ml roztoku A se 3 ml roztoku B a ředí se 10 ml deionisované vody. Roztok se obarví 1 kapkou 0,5% roztoku methylenové modři a za míchání.se přikapává roztok C do odbarve ní, načež se k bezbarvému roztoku přidá 7 mg práškového dihydrátu hydrosiřičitanu sodného a po rozpuštění 5 ml roztoku D. Krátce se míchá a reakčni směs se nalévá do prostoru elektro foretické desky či trubičky. Po 2 až 5 minutách roztok přechází do gelu, načež se nechá při 25 °C 12 hodin dozrát.

Claims (1)

1. Způsob přípravy polyakrylamidového gelu, zejména pro elektrofořezu, redoxní polymeraci akrylamidu a Ν,Ν'-bis-methylenakrylamidu ve vodném prostředí v přítomnosti pufru vyznačený tím, že 3,5 až 28% vodný roztok směsi 100 hmotnostních dílů akrylamidu a Ν,Ν'-bis-methylenakrylamidu v molárním poměru 1 ku 0,01 až 0,05 se mísí s 1,0 až 10,5 hmotnostními díly 0,5% roztoku methylenové modři a přídavkem pufru obsahujícího 0,1 až 0,4% Ν,Ν,Ν',N'-tetramethylethylendiaminu se pH roztoku upraví na 8 až 9, načež se na roztok působí 0,4 až 1,0% roztokem hydrosiřičitanu sodného do odbarvení, k bezbarvému roztoku se přidá 0,2 až 0,6 hmotnostních dílů práškového dihydrátu hydrosiřičitanu sodného, načež se na homogenní roztok působí 500 hmotnostními díly persíranu draselného nebo amonného o koncentraci 0,1 až 0,5% do ukončení polymerace.